CONSERVACIN IN VITRO DE GERMOPLASMA VEGETAL

Conservacin
Vegetales: fuentes de energa Problemas: Tcnicas de explotacin, seleccin de variedades homogneas= erosin genticas Se recurre a fuentes genticas originales Conservacin de la integridad gentica

Germoplasma: variabilidad gentica intraespecfica o a los materiales genticos que pueden perpetuar una especie o una poblacin

Ubicar, recolectar, conservar y caracterizar el plasma germinal de las plantas

Conservacin de germoplasma
La estrategia depende de: Ciclo de vida Reproduccin Tamao Mtodos In situ Ex situ: semillas, in vitro, colecciones de plantas

Jardn botnico

Banco de semillas

Vivero

Ortodoxas

Banco de semillas

Recalcitrantes

Deshidratacin: 3-7% humedad Conservacin: -18 C

Bancos de germoplasma

Bveda Global de Semillas de Svalbard

Conservacin in vitro
Especies con semillas recalcitrantes 120 especies de 46 Familias (Juglans, Quercus, Coffea, Hevea, Elaeis, Carica, etc.) Especies de propagacin vegetativa (Dioscorea, Solanum, Musa, Manihot, Ipomea, etc) Conservacin de genotipos concretos: cultivares, clones, etc. Material producto de biotecnologa Especies raras y amenazadas

Totipotencia y regeneracin de plantas completas

Almacenamiento in vitro
Fases: 1. Obtencin del explanto de la planta donante. 2. Introduccin en cultivo de dichos explantos. 3. Almacenamiento. 4. Recuperacin de un cultivo viable. 5. Regeneracin de la planta completa

Mantenimiento in vitro Modificar el ambiento del cultivo Desacelerar el crecimiento de las clulas Evitar transferencias de cultivo seguidas. Fin: Crecimiento mnimo

Tipos de conservacin in vitro

1. Sin limitar el crecimiento 2. Limitando el crecimiento

3. Crio-conservacin

1. Sin limitacin del crecimiento

Programa de micropropagacin a partir de distintos explantos y mediante diferentes vas

Sin limitacin del crecimiento

PLANTA MADRE

INTRODUCCIN IN VITRO

PROLIFERACIN

Perodo de subcultivo variable, (tipo de cultivo, especie)

ENRAIZAMIENTO

PASO A TIERRA

Sin limitacin del crecimiento

Mucha mano de obra, coste elevado.

Riesgos de accidentes y contaminacin altos.

Problemas de estabilidad gentica. Perdida capacidad morfogentica.

Coleccin activa

2. Limitando el crecimiento

Objetivo: reducir la tasa de multiplicacin para distanciar los repicados.

Crecimiento limitado
Mtodos: 1. Baja temperatura e iluminacin durante la incubacin. 2. Modificacin de los componentes del medio de cultivo:

Medio con bajas concentraciones de azcar. Medio con bajas concentraciones de sales Reguladores de crecimiento. 3.Aumento del potencial osmtico: manitol, sorbitol, prolina, glicerol, sacarosa, etc.
4. Desecacin

5. Retardantes del crecimiento: CCC, ALAR, ABA

6. Modificacin de la atmsfera de cultivo COMBINACIN DE MTODOS

Crecimiento limitado
Reduccin de la temperatura. Prunus spp. Vitis spp. Musa spp. -3C 9 C 15C

La mayora 5C

Reduccin de la temperatura e iluminacin.

Brotes de esprrago en un medio de cultivo estndar a 5 C y oscuridad: 12 meses. Segmentos nodales de manzano a 4C, en oscuridad:18 meses Tallos de alcornoque a 5C en oscuridad: 24 meses. Brotes y callos de palmera datilera a 5 C en oscuridad: 12 meses.

Crecimiento limitado
Manitol (hasta 0,2 M), prolina, glicerol, sacarosa.

Brotes de esprrago a temperatura normal aadiendo manitol al medio: 12 meses. Microplantas de patata, a 6 C, en un medio MS con 40 g/l de sacarosa + 20 g/l de manitol, bajo un fotoperodo de 16 horas luz: ms de 30 meses.
Stress osmtico.

Crecimiento limitado
Stress osmtico.

Conservacin in vitro de embriones cigticos de cacao en medios con diferentes concentraciones de manitol

Crecimiento limitado
Reduccin de trabajo
Riesgos de accidentes y contaminacin. Estabilidad gentica y stress. Seleccin Alteraciones morfolgicas/fisiolgicas

Coleccin activa

CRIOCONSERVACIN

Objetivo: Paralizacin de la actividad metablica. Economa. Integridad gentica, Seguridad

CRIOCONSERVACIN
FASES
Obtencin del explanto Deshidratacin Aclimatacin: crioprotector, vitrificacin Almacenamiento: Congelacin en LN2 Recuperacin: descongelacin y rehidratacin Test de viabilidad

2. Deshidratacin
Silicagel
agentes osmticos

Eliminar el agua libre de los tejidos

flujos de aire

3. Aclimatacin
Colocar al explante sobre el NL con o sin crio-protectores
bajando la T gradualmente. Alcanzar -40 C y luego al NL.

Tratamiento crioprotector
Crioprotectores : anticongelantes Azcares: sacarosa, glucosa, etc.) Alcoholes: Glicerol, Polietilenglicol (PEG) Dimetilsulfxido (DMSO) Polivinilpirrolidona (PVP) Aminocidos (prolina, aspartato, glicina) Mezclas de los anteriores PVS2

Finalidad
Aumentar la viscosidad de soluciones intracelulares, evitando desecacin Evitar formacin de hielo Proteccin de membranas y orgnulos Proteccin ante desactivacin de protenas y cidos nucleicos

4. Almacenamiento
Sistemas secos: tejidos tolerantes a la desecacin. Menor preparacin.

Sistemas hidratados: tejidos que no toleran bajas T, requieren de proteccin: crioprotectores o vitrificantes. Suceptibles

5. Descongelamiento y rehidratacin

Descongelamiento bao Mara. Temperatura ambiente Flujo de aire

Cultivo: Recuperacin
Tratamiento 7 das sin amonio + 21 das con amonio

Tcnicas de almacenamiento en NL

1.Encapsulacin/desecacin

Crioproteccin en cuentas de alginato

Tratamiento crioprotector/ Congelacin programada

Crioconservacin de suspensiones celulares

PVS2: 30% Glicerol+15% EG+15% DMSO+0,4M sacarosa

3. Encapsulacin- Vitrificacin

Combinacin encapsulacin-deshidratacin y vitrificacin 30% de sobrevivencia (se reduce la toxicidad)

4. Desecacin
Embrioides de cafeto. Precultivo en sacarosa + 1mM ABA seguido de desecacin a 75% HR, a 24C , 7 das. Yemas axilares de genciana. Precultivo en MS + sacarosa 0,1 M, durante 8-13 das, con sacarosa 0,4 M 1 da, desecacin hasta un 10% de contenido en agua seguido de inmersin directa en LN

CONTROLES EN LOS PROCESOS CONSERVACIN

Material conservado debe representar la diversidad gentica de las poblaciones o cultivos. Erosin gentica/seleccin Variacin somaclonal

Gotita congelada
Pre-tatar con DMSO (2-3 horas). Tomar microgota Inmersin directa en NL

Almacenamiento
Hasta 6 meses 5 a -18C

Indefinido en
NL

(-196 C)