Fig. Representacin esquemtica de un sistema de cromatografa de lquidos de alta precisin.

CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA PRECISIN CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA PRESIN (HPLC) Elucin por alta presin (hasta 500 atmsferas) Alta resolucin, rapidez y reproducibilidad Purificacin de molculas biolgicas de gran variedad de Propiedades y tamaos.

http://www.uv.es/~salgado/medicina/.files/Practica3.pdf

La cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) es, dentro de las tcnicas cromatogrficas, la mas utilizada. El proceso de separacin cromatogrfica puede definirse como la transferencia de masas entre una fase estacionaria y una mvil. La mezcla que contiene los compuestos a separar es disuelta e inyectada en una columna rellena de fase estacionaria a travs de la cual es forzada a pasar por una fase mvil impulsada por la bomba de alta presin. Dentro de la columna la mezcla se separa en sus componentes en funcin de su interaccin entre las dos fases. Esta separacin puede ser modificada eligiendo adecuadamente tanto la fase mvil como la estacionaria, el flujo de la fase mvil o la temperatura de la separacin. De esta forma la tcnica de HPLC adquiere un alto grado de versatilidad difcil de encontrar en otras tcnicas, siendo capaz de separar los componentes de una gran variedad de mezclas.

SISTEMAS DE BOMBEO Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen (1) la generacin de presiones por encima de 6.000 psi, (2) un flujo libre de pulsaciones, (3) un intervalo de caudales de 0,1 a 10 mL/min, (4) el control y la reproducibilidad del caudal mejor del 0,5 por 100 relativo y (5) componentes resistentes a la corrosin (juntas de acero inoxidable o Tefln). Debe subrayarse que las altas presiones que generan las bombas de HPLC no constituyen un riesgo de explosin, debido a que los lquidos no son muy compresibles. De este modo, la rotura de un componente del sistema slo supone una prdida de disolvente. Es evidente que esta prdida puede suponer un riesgo de incendio. Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas: bombas recprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumticas o de presin constante. BOMBAS RECPROCAS Las bombas recprocas, que se utilizan en aproximadamente el 90 por 100 de los sistemas de HPLC comerciales, consisten, por lo general, en una pequea cmara en la que el disolvente es impelido por el movimiento de vaivn de un pistn accionado por un motor de arrastre (vase Fig. 28-6). Dos vlvulas con cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia dentro y hacia afuera de un

cilindro. El disolvente est en contacto directo con el pistn. Tambin se puede comunicar la presin al disolvente mediante un diafragma flexible, el cual a su vez se bombea hidrulicamente por un pistn de vaivn. Las bombas recprocas tienen la desventaja de que producen un flujo pulsado, que se ha de amortiguar dado que su presencia se manifiesta como ruido en la lnea base del cromatograma. Entre las ventajas de las bombas recprocas se pueden citar su pequeo volumen interno (35 a 400 mL), sus altas presiones de salida (por encima de los 10.000 psi), su fcil adaptacin a la elucin con gradiente, y sus caudales constantes, que son prcticamente independientes de la contrapresin de la columna y de la viscosidad del disolvente.

BOMBAS DE DESPLAZAMIENTO Las bombas de desplazamiento consisten por lo general en unas grandes cmaras como una jeringa, equipadas con un mbolo que se activa por un mecanismo de tornillo accionado mediante un motor paso a paso. Las bombas de desplazamiento tambin producen un flujo que tiende a ser independiente de la viscosidad y de la contrapresin. Adems, el flujo que resulta est libre de pulsaciones. Las desventajas incluyen una capacidad de disolvente limitada ( 250 mL) y una notable incomodidad para el cambio de disolventes. BOMBAS NEUMTICAS En las bombas neumticas ms simples, la fase mvil se encuentra en un recipiente plegable colocado en un vasija que puede presurizarse mediante gas comprimido. Las bombas de este tipo son baratas y estn exentas de impulsos; aunque tienen una limitada capacidad y presin de salida, y adems el caudal depende de la viscosidad del disolvente y de la contrapresin de la columna. Adems, no son utilizables en la elucin con gradiente y estn limitadas a presiones menores de unos 2.000 psi. DETECTORES A diferencia de la cromatografa de gases, en la cromatografa de lquidos no hay detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionizacin de llama y de conductividad trmica descritos en el Apartado 2713-4. Uno de los mayores retos en el desarrollo de la cromatografa de lquidos ha sido el perfeccionamiento de los detectores. TABLA 28-1. CARACTERSTICAS DE LOS DETECTORES DE LC disponible LOD de masa comercialment (detectores e comerciales)a 100 pg-1 ng 1-10 pg 10 pg-1 ng LOD de masa (estado actual)b 1 pg 10 fg 100 fg

Detector LC

Absorbancia Sc Fluorescencia Sc Electroqumica Sc

ndice de refraccin Conductividad Espectrometra de masas FT-IR Dispersin de la luze Actividad ptica Selectivo de elementos Fotoionizacin TIPOS DE DETECTORES

S S Sd S S No No No

100 ng-1 **fig** 500 pg-1 ng 100 pg-1 ng 1 **fig** 10 **fig** -

10 ng 500 pg 1 pg 100 ng 500 ng 1 ng 10 ng 1 pg-1 ng

Los detectores en cromatografa de lquidos son de dos tipos bsicos. Los detectores que se basan en la medida de una propiedad de la disolucin responden a una propiedad del efluente, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos. Por el contrario, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto, como la absorbancia en el UV, fluorescencia, o corriente lmite, que no son inherentes a la fase mvil. En la Tabla 28-1 se indican los detectores ms comunes empleados en HPLC y algunas de sus propiedades ms importantes. Una revisin de 1982 sobre 365 artculos publicados en los que la cromatografa de lquidos tena un papel importante, revel que el 71 por 100 utilizaban la deteccin de la absorcin UV, el 15 por 100 la fluorescencia, el 5,4 por 100 el ndice de refraccin, el 4,3 por 100 empleaba medidas electroqumicas y el 4,3 por 100 restante otras medidas'. De los detectores de absorcin UV, el 39 por 100 utilizaban una de las lneas de emisin del mercurio, el 13 por 100 la radiacin filtrada de una lmpara de deuterio y el 48 por 100 la radiacin despus de pasar por un monocromador de red.

DETECTORES DE ABSORBANCIA
La Figura 28-9 muestra el esquema de una celda de flujo en forma de Z para las medidas de la absorbancia de los efluentes de una columna cromatogrfica. A fin de minimizar el ensanchamiento de banda extracolumna, el volumen de estas cubetas ha de ser lo menor posible, de modo que los volmenes se limitan por lo comn de 1 a 10 ML y las longitudes de la cubeta de 2 a 10 mm. La utilizacin de cubetas de este tipo est restringida, en la mayor parte de los casos, a presiones no mayores de unos 600 psi. En consecuencia, a menudo es necesario un dispositivo para reducir la presin. Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en los que uno de los haces pasa por la cubeta de flujo y el otro a travs de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las intensidades de los dos haces se utilizan detectores fotoelctricos contrastados. Alternativamente, en combinacin con un solo fototubo se utiliza un sistema de corte haz semejante al mostrado en la Figura 9-13b. En cualquier caso, el cromatograma consiste en una representacin del logaritmo del cociente de las dos seales detectadas en funcin del tiempo. Tambin se utilizan instrumentos de un solo haz. En este caso, las medidas de intensidad del disolvente se almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el clculo de la absorbancia.

Cromatografia de Gases

La cromatografa de gases es una tcnica cromatogrfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no interacta con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC): la cromatografa gas-slido (GSC) y la cromatografa gas-lquido (GLC), siendo esta ltima la que se utiliza ms ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografa de gases (GC). En la GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su nica aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria molculas de lquido inmovilizadas sobre la superficie de un slido inerte. La GC se lleva a cabo en un cromatgrafo de gases. ste consta de diversos componentes como el gas portador, el sistema de inyeccin de muestra, la columna (generalmente dentro de un horno), y el detector.

El gas portador cumple bsicamente dos propsitos: Transportar los componentes de la muestra, y crear una matriz adecuada para el detector. Un gas portador debe reunir ciertas condiciones: -Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase estacionaria) -Debe ser capaz de minimizar la difusin gaseosa -Fcilmente disponible y puro -Econmico -Adecuado al detector a utilizar El gas portador debe ser un gas inerte, para prevenir su reaccin con el analito o la columna. Generalmente se emplean gases como el helio, argn, nitrgeno, hidrgeno o dixido de carbono, y la eleccin de este gas en ocasiones depende del tipo de detector empleado. El almacenaje del gas puede ser en balas normales o empleando un generador, especialmente en el caso del nitrgeno y del hidrgeno.