Influncia

da concentrao de substrato na fermentao alcolica

Relatrio de um trabalho prtico da disciplina de Biologia Celular 2011/12 Faculdade de Cincias da Universidade do Porto

Influncia da concentrao de substrato na fermentao alcolica de leveduras

Filipa Lemos1, Henrique Fernandes2, Ricardo Almeida3, Vnia Freire4

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fglaucia93@hotmail.com, info@fciencias.com, rjal@fciencias.com, vania_freire10@hotmail.com

Introduo

As leveduras pertencem ao reino Fungi e a produo de ATP conseguida

custa da fermentao alcolica. A fermentao compreende um conjunto de vias metablicas anaerbias que por oxidao de hexoses e pentoses leva fosforilao de ADP em ATP. Este processo corresponde a uma adaptao a condies de baixa concentrao de O2 ou ento apenas como forma de evitar o stress oxidativo resultante da utilizao do oxignio nas vias metablicas (Lus G. Pereira - 2012). As vias metablicas fermentativas so diversas
Figura 1 - Fermentao Alcolica (Alberts B., et al. 2002)

quando analisamos procariontes, no entanto os eucariontes baseiam a sua atividade

fermentativa na fermentao alcolica e lctica (Guia das Aulas Prticas de Biologia Celular 2011/2012). Este processo requer a interveno de duas enzimas, a piruvato descarboxilase que promove a ruptura de uma ligao CC na molcula de piruvato dando origem ao acetaldedo; e a lcool desidrogenase que catalisa a oxidao do acetaldedo a etanol. As molculas de piruvato que sofrem a descarboxilao e posterior oxidao a CO2 so obtidas a partir da glicose pela via glicoltica de Embden-Meyerhof que ilustra os mecanismos envolvidos para a produo do piruvato. Esta via metablica parte de uma molcula de glicose que fosforilada custa das desfosforilao de molculas de
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ATP, sendo portanto uma fase que requer consumode energia. Posteriormente ocorre a clivagem da hexose (molcula de glicose fosforilada) em duas molculas com 3 tomos de carbono cada. Ocorrem posteriormente vrias etapas que levam desfosforilao e oxidao das molculas de 3-fosfato gliceraldedo formando-se assim o piruvato (Alberts B. Et al. 2008). O etanol e o dixido de carbono so os produtos finais desta via metablica que pode ser facilmente traduzida pela seguinte equao geral, !! !!" !! 2!! !! !" + 2!"! Pela equao geral que traduz todo o processo metablico possvel inferir que a concentrao de glucose (substrato) um fator condicionante na fermentao alcolica das leveduras, portanto a concentrao de glucose ir condicionar a produo de etanol e dixido de carbono por parte das leveduras. Para comprovar que a glucose realmente um fator condicionante na atividade fermentativa das leveduras podem fazer-se estudos experimentais em que se varia a concentrao de substrato e se observam as diferenas quantitativas na produo dos produtos da reao da gliclise. Para isso pode usar-se a glucose como substrato com diferentes concentrao e leveduras do fermento de padeiro (Saccharomyces cerevisae). Assim pode incubar-se as leveduras durante um certo perodo de tempo e conferir, no final, a quantidade de produtos formados. Consegue-se assim inferir indiretamente acerca da atividade fermentativa das leveduras. A Saccharomyces cerevisae uma das leveduras mais usada industrialmente pois tanto pode ser uma soluo fermentativa para a indstria panificadora como tambm na indstria cervejeira e de outras bebidas alcolicas convertendo a glucose em etanol conferindo assim o teor alcolico destas bebidas e por vezes o prprio sabor caracterstico (Pelczar Jr. Et al. 1996). Este trabalho prope-se a estudar o efeito da concentrao de substrato (glucose) na fermentao alcolica de leveduras controlando a produo de dixido de carbono. Assim prev-se que a produo de CO2 seja crescente com o aumento da concentrao de substrato, mas que a partir de um determinado momento no varie e passe mesmo a diminuir pois para concentraes elevadas de substrato ocorre inibio da atividade fermentativa das leveduras.

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Material e Mtodos
Material utilizado: Fermento de padeiro (Maizena); Sacarose; Tubos graduados (de duas dimenses distintas); Parafilme; Garrafa de esguicho com gua destilada; Estufa; Balana de preciso; Esptula; Folha de alumnio. Metodologia: I) Determinao da massa de leveduras a utilizar Atravs de uma balana de preciso determinar 12g de leveduras. Para tal, deve-se recorrer a papel de alumnio, o que permite que o transporte das leveduras seja executado evitando perda de massa. Assim sendo, deve-se comear por colocar o papel de alumnio na balana. Seguidamente devemos tarar a balana e colocar leveduras at obter a massa pretendida. Por ltimo transfere-se a massa para um tubo. Este procedimento deve ser repetido cinco vezes, tendo em conta que se pretende realizar cinco ensaios. II) Ressuspenso das leveduras De modo a que as leveduras no fiquem depositadas no fundo do tubo, adiciona-se um pouco de gua e parafilme para homogeneizar a soluo.
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III) Prefazer o volume pretendido Concluda a ressuspenso das leveduras adicionar gua at perfazer o volume pretendido (neste caso em especifico, 17 ml). Por fim, coloca-se parafilme e inverte-se o tubo. IV) Determinao do volume da bolha gasosa Colocar um tubo de maior dimenso sobre o anterior, de modo que este ltimo esteja em contacto com o fundo do tubo maior. Para que se possa proceder leitura do volume da bolha gasosa deve-se inverter o tubo. Contudo, importante realar que estando a realizar cinco ensaios, os cinco tubos devem ser invertidos em simultneo, para que se diminua o erro associado experincia em questo. V) Incubao a 37C Colocar os tubos numa estufa temperatura de 37C e aguardar cerca de 45 minutos. VI) Leitura do volume da bolha gasosa Ao fim de 45 minutos retirar os tubos da estufa e proceder leitura do volume do espao vazio. VII) Determinao do volume de dixido de carbono libertado Atravs da diferena entre o volume final e o volume inicial da bolha gasosa, determinar a quantidade de dixido de carbono libertado.
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Clculos prvios:
Concentrao a 1 %(p/V) X= X= X= X=

20%(p/V) 1% (p/V) 17,0 mL X

171 20

X = 0.85 mL

Concentrao a 2 %(p/V)

20%(p/V) 2% (p/V) 17,0 mL X

172 20

X = 1.7 mL

Concentrao a 4 %(p/V)

20%(p/V) 4% (p/V) 17,0 mL X

174 20

X = 3.4 mL

Concentrao a 8 %(p/V)

20%(p/V) 8% (p/V) 17,0 mL X

178 20

X = 6.8 mL

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Tabela A Composio dos tubos para testar a concentrao de sacarose na fermentao alcolica de leveduras.

Tubo 1 (controlo) 2 3 4 5
NOTA

Massa de leveduras (g) 0.12 0.12 0.12 0.12 0.12

Volume de soluo de sacarose (mL) 0 0.85 1.7 3.4 6.8

Volume final Concentrao (mL) final %(p/V) 17.0 17.0 17.0 17.0 17.0 0 1 2 4 8

Tempo de incubao: 45 minutos. Temperatura de incubao: 37C

Resultados
Tabela B Influncia da concentrao de sacarose na fermentao alcolica de leveduras

(1)

Tubo 1 (controlo) 2 3 4 5

Volume inicial (mL) 1.4 1.5 2.1 1.7 1.8

Volume final (mL) 1.7 2.6 5.7 5.7 3.7

Volume de CO2 libertado (mL) 0.3 1.1 3.6 4.0 1.9

! !(1) (mL) 0.1 0.9 3.4 3.8 1.7

Diferena entre a variao do volume de CO2 libertado e a mdia (!) dos valores dos tubos controlo dos outros grupos (!= 0.2 mL).

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Inuncia da concentrao de sacarose na fermentao alcolica de leveduras

4,1 Volume de CO2 libertado (mL) 3,6 3,1 2,6 2,1 1,6 1,1 0,6 0,1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Concentrao %(P/V)
Figura 2 Influncia da concentrao de sacarose na fermentao alcolica de leveduras. A figura representa o grfico que relaciona o volume de CO2 libertado medida que a concentrao de sacarose aumenta. Para concentraes prximas de 0% o volume libertado muito baixo, na ordem da dcima do mililitro. medida que a concentrao aumenta, aumenta tambm o volume de CO2 libertado, at atingir o seu pico prximo dos 4%. Para concentraes superiores a 4%, o volume de CO2 libertado comea a diminuir.

Discusso
Os resultados obtidos vo de encontro hiptese formulada, pelo que se verificou um aumento do volume de dixido de carbono (CO2) libertado com o aumento da concentrao de sacarose. Como seria de esperar, a partir de uma concentrao de sacarose de 4% (p/V) a produo de CO2 diminui fruto da dificuldade manifestada pelas leveduras em suportar concentraes mais elevadas de sacarose. Contudo, no seria de esperar uma diminuio to precoce, isto , no era espectvel o decrscimo na produo de CO2 para esta gama de concentraes de substrato. Estudos publicados na literatura comprovam que as leveduras suportam concentraes de substrato superiores sem que isto condicione a sua atividade fermentativa. Todavia, o comportamento obtido experimentalmente vai de encontro com o

publicado excepto no que diz respeito aos valores de concentrao de substrato

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utilizados que deveria ser muito superiores para se observar tal diminuio na produo de CO2. Provavelmente esta discrepncia ocorreu como consequncia das condies em que a levedura se encontrava antes de se iniciar o trabalho, uma vez que todos os microorganismos apresentam uma fase de adaptao ao meio (lag) o que condiciona o crescimento e o normal metabolismo das leveduras durante esta fase. Assim como as leveduras estavam liofilizadas esta fase de adaptao superior, podemos inferir que para concentraes de substrato no to elevadas j so suficientes para limitar a atividade fermentativa (Prescott L, et alia). O facto da diminuio acontecer para concentraes muito baixas tambm pode estar relacionada com o uso do dissacardeo de glucose (sacarose) em vez do respectivo monossacrido, visto que as leveduras crescem menos no substrato do dissacardeo pelo que manifestam uma atividade fermentativa inferior (Maiorella B, et alia). Os resultados obtidos diferem dos demais e portanto a experincia deveria ser repetida de modo a ser possvel tirar concluses relativamente ao comportamento das leveduras.

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Bibliografia
Guia das aulas prticas de Biologia Celular 2011/2012, FCUP, 2011/12 Pelczar Jr, MJ, Chan, ECS e Krieg, NR. Microbiologia, vol. II, 2a edio - So Paulo: Makron Books, 1996 Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K and Walter P, 2008, Molecular Biology of the Cell, 5th edition, Marjorie Anderson and Sherry Granum, United States of America Pereira LG, Vias metablicas de converso de energia Biologia Celular FCUP, 2011/12 Prescott L, Harley J and Kleins, 2002, Microbiology, 5th edition, McGraw-Hill Maiorella B, Blanch H and Charles R, 1983, By-Product Inhibition Effects on Ethanolic Fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Department of Chemical Engineering, University of California, Berkeley, California

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