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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CINCIAS RURAIS PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM MEDICINA VETERINRIA

IDENTIFICAO DO PERFIL PLASMTICO E DIFERENCIAO DAS FRAES DE PROTENAS PLASMTICAS EM RATITAS.

DISSERTAO DE MESTRADO

Luciano de Oliveira Battisti

Santa Maria, RS, Brasil 2009

IDENTIFICAO DO PERFIL PLASMTICO E DIFERENCIAO DAS FRAES DE PROTENAS PLASMTICAS EM RATITAS

por

Luciano de Oliveira Battisti

Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria, rea de Concentrao em Medicina Veterinria Preventiva, da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obteno do grau de Mestre em Medicina Veterinria.

Orientadora: Prof Maristela Lovato Flres

Santa Maria, RS, Brasil. 2009

Universidade Federal de Santa Maria Centro de Cincias Rurais Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria Departamento de Medicina Veterinria Preventiva

A Comisso Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertao de Mestrado

IDENTIFICAO DO PERFIL PLASMTICO E DIFERENCIAO DAS FRAES DE PROTENAS PLASMTICAS EM RATITAS. Elaborada por Luciano de Oliveira Battisti

Como requisito parcial para obteno do grau de Mestre em Medicina Veterinria COMISSO EXAMINADORA:
Maristela Lovato Flres, Dra, (Presidente/Orientador)

Cybele Esteves Almeida, Dra, (UFSM)

Sonia Teresinha dos Anjos Lopes, Dra, (UFSM)

Santa Maria, 06 de agosto de 2009.

AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus, que sempre esteve ao meu lado, me dando fora e iluminando minha vida em todos os momentos alegres e difceis. Aos meus amados pais, pelo amor e confiana, e que mesmo fisicamente distantes, caminharam comigo de corao, me apoiando e investindo no meu crescimento em mais uma jornada de estudo e trabalho. minha irm e todos da minha famlia, que torceram por mim, me aconselharam e contriburam de vrias formas. minha orientadora, professora Maristela Lovato Flres, pelo incentivo e encorajamento, pela confiana, pelos conhecimentos e conselhos transmitidos e pela amizade demonstrada. s professoras Cybele Esteves Almeida e Brbara C. B. Rizatti, pelo fundamental auxlio e pela disponibilizao do Laboratrio de Imunologia para realizao do trabalho. Professora Sonia Terezinha dos Anjos Lopes pelo auxlio, disponibilizando o acesso ao LACVET, e colega Raqueli Frana, pela ajuda durante o experimento. s integrantes do Laboratrio de Anlises Clnicas do HUSM, pela utilizao do equipamento para o trabalho e pelos conhecimentos compartilhados. Ao professor Jos Henrique S. da Silva, pela disponibilidade e pacincia com que sempre me ajudou nas anlises estatsticas. Agradeo de forma geral aos colegas e companheiros do LCDPA e do NEPAS, por todas as ajudas, conselhos, aventuras, trabalhos e pela amizade que sempre demonstraram. Aos proprietrios dos estabelecimentos que abriram as portas para o nosso trabalho, pela acolhida e por proporcionarem o material necessrio s pesquisas. Aos amigos do grupo Emas e colegas de moradia, pela compreenso e apoio nos momentos difceis e por serem, muitas vezes, como integrantes da minha famlia. Finalmente, agradeo a todas as pessoas de todos os laboratrios e departamentos da Universidade e da Cidade de Santa Maria que contriburam para o meu trabalho e a todos, que de uma forma ou de outra, me auxiliaram nesta longa e rdua caminhada. Muito Obrigado!

A percepo do desconhecido a mais fascinante das experincias, o homem que no tem os olhos abertos para o misterioso passar pela vida sem ver nada. (Albert Einstein)

RESUMO Dissertao de Mestrado Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria Universidade Federal de Santa Maria IDENTIFICAO DO PERFIL PLASMTICO E DIFERENCIAO DAS FRAES DE PROTENAS PLASMTICAS EM RATITAS. AUTOR: Luciano de Oliveira Battisti ORIENTADORA: MARISTELA LOVATO FLRES Santa Maria, 06 de agosto de 2009.

A introduo de novas espcies dentro do setor pecurio vem crescendo e entre os animais que figuram, com importncia, est o avestruz (Struthio camellus). Essas atividades geram benefcios, mas, a velocidade com que evoluem dificulta o acompanhamento de estudos aprofundados e seguros sobre fisiologia, patologia e clnica desses animais. Muitos parmetros fisiolgicos no esto disponveis, sendo estes imprescindveis para o diagnstico de distrbios e enfermidades. Desse modo, o objetivo deste trabalho foi traar o perfil eletrofortico de protenas plasmticas de avestruzes, bem como identificar diferenas nas fraes dessas protenas entre determinadas faixas etrias. Para tanto, foram coletadas amostras de sangue de 72 avestruzes de diferentes criatrios do Rio Grande do Sul, distribudos em seis grupos, por idade e por sexo, sendo 2 de filhotes, 2 de juvenis e 2 de adultos. Essas amostras passaram pela realizao do mtodo de biureto e pela eletroforese, para a quantificao, separao e identificao das protenas. Dentro da mesma linha de estudo, foram processadas e analisadas 9 amostras de sangue de emas (Rhea americana) adultas e de um casal de emus (Dromaius novaehollandiae), animais esses que, junto com o avestruz, tambm pertencem ordem Struthioniformes. Foram encontrados e determinados os nveis de protenas plasmticas totais (PPT) e a relao entre albumina e globulinas (A/G), por meio da realizao do mtodo de biureto e da tcnica da eletroforese. Para o grupo de avestruzes filhotes fmeas, a mdia de PPT foi de 2.23 0.23g/dL, para os filhotes machos foi 2.40 0.30g/dL; para as fmeas juvenis a mdia foi de 3.67 0.42g/dL e para os machos juvenis foi 3.90 0.44g/dL; as fmeas adultas, por sua vez, apresentaram uma mdia de 4.11 0.65g/dL e os machos adultos, 4.07 0.69g/dL. Para o grupo das emas foram encontradas mdias de valores de 5.22 0.66 g/dL de protenas plasmticas totais e 0.97 0.24 para a relao entre a albumina e as globulinas. Para o casal de emus, por sua vez, obteve-se valores de 5,30 g/dL e 4,10 g/dL de protenas plasmticas totais e 0,67 e 0,81 para a relao entre a albumina e as globulinas, para a fmea e o macho respectivamente. As fraes proticas, nesse estudo, foram definidas como albumina, alfa-globulina, beta1-globulina, beta2globulina e gama-globulina, para as trs espcies. Palavras-chave: proteinograma, protenas, avestruz, ema, emu.

ABSTRACT Masters Dissertation Programa de Ps-Graduao em Medicina Veterinria Universidade Federal de Santa Maria IDENTIFICATION OF THE PLASMATIC PROFILE AND DIFFERENTIATION OF PLASMATIC PROTEIN FRACTIONS IN RATITES. AUTHOR: Luciano de Oliveira Battisti ADVISER: MARISTELA LOVATO FLRES Santa Maria, August, 06th, 2009.

The introduction of new species within the cattle sector has been growing and among the most representative animals in this sector is the ostrich (Struthio camellus). Although generating benefits, these activities are difficult to be deeply studied in terms of their physiology, pathology and clinics due to the speed they evolve. Many physiological parameters which are essential for the diagnosis of disturb and diseases are not available. Thus, the objective of this work was to outline the plasmatic protein electrophoresis profile of ostrich, as well as to identify differences among the fractions of these proteins among specific age groups. Blood samples of 72 ostriches were collected in different farms in Rio Grande do Sul. The samples were distributed in six groups, according to the animals age and gender, in which 2 were chick, 2 young and 2 adults. These samples were submitted to the biuret method and to the electrophoresis, for quantification, separation and identification of proteins. Along the same line of study, there were also processed and analyzed 9 blood samples of adult rheas (Rhea americana) and a couple of emus (Dromaius novaehollandiae), these animals that, along with the ostrich, which also belong to the Struthioniformes order. The levels of Total Proteins (PPT) and the relation between Albumin and Globulin (A/G) were found and determined through the biuret method and the technique of electrophoresis. For each group of female ostrich chick, the average PPT was 2.23 0.23g/dL, for male chick it was 2.40 0.30g/dL, for young females the average was 3.67 0.42g/dL and young males it was 3.90 0.44g/dL; the adult females presented an average of 4.11 0.65g/dL and the adult males, 4.07 0.69g/dL. For the group of adult rheas were found average values of 5:22 0.66 g / dL of total plasma proteins and 0.97 0.24 for the relationship between albumin and globulins. For a couple of emus, in turn, resulted in values of 5.30 g / dL and 4.10 g / dL of plasma total protein and 0.67 and 0.81 for the ratio of albumin and globulin, for female and male respectively. The protein fractions were defined as albumin, alpha-globulin, beta 1-globulin, beta2-globulin e gamma-globulin for the three species. Key-words: proteinogram, proteins, ostrich, rhea, emu.

LISTA DE FIGURAS
1. INTRODUO FIGURA 1. Exemplar de avestruz (S. camellus) macho adulto.............................................. 12 2. REVISO DE LITERATURA FIGURA 2. Vista parcial demonstrando fonte e cuba utilizadas para eletroforese................ 20 FIGURA 3. Eletroforese em gel de agarose apresentando bandas proticas tpicas.............. 21 3. CAPTULO 1 FIGURA 4. Municpios do Rio Grande do Sul de onde foram obtidas as amostras.............. 26 FIGURA 5. A - Coleta do sangue. B Avaliao do volume obtido.................................. 27 FIGURA 6. Interpretao grfica das bandas proticas encontradas na eletroforese em gel de Agar.................................................................................................................................... 29 FIGURA 7. Grfico de um dos animais amostrados, demonstrando as bandas encontradas (1 albumina, 2 alfa-globulina, 3 beta1-globulina, 4 beta2-globulina e 5 gamaglobulina)................................................................................................................................ 34 FIGURA 8. Eletroforetograma das protenas sricas de tartarugas cabeudas (C. caretta). A albumina, B alfa1-globulina, C alfa2-globulina, D beta-globulina, e E gamaglobulina.................................................................................................................................. 35 5. CAPTULO 3 FIGURA 9. Perfil eletrofortico e fraes proticas pr-albumina, albumina, , 1, 2, no macho (a) e na fmea (b) de meu....................................................................................... 59

LISTA DE TABELAS
3. CAPTULO 1 TABELA 1. Municpios de origem dos animais componentes dos grupos de idade e sexo........................................................................................................................................ 30 TABELA 2. Valores mdios de protenas totais (PPT) em g/dL, e da relao albumina/globulina (A/G) dos grupos de avestruzes ........................................................... 31 TABELA 3. Valores mdios das fraes proticas albumina, alfa-globulina, betaglobulina e gama-globulina, em g/dL dos grupos de avestruzes........................................... 36 TABELA 4. Valores das mdias das porcentagens de cada frao protica (albumina, alfa, beta e gama-globulinas), dentro do conjunto de protenas totais, dos grupos de avestruzes.............................................................................................................................. 37 4. CAPTULO 2 TABELA 5. Valores mdios das fraes proticas (albumina, alfa-globulina, betaglobulina e gama-globulina), em g/dL e em porcentagem comparada ao total de protenas plasmticas (PPT) do grupo das emas estudadas.................................................................. 47 5. CAPTULO 3 TABELA 6. Valores mdios da concentrao de protenas plasmticas totais, pralbumina, albumina, alfa-globulina, beta-globulina, gama-globulina e relao albumina/globulina em emus, fmea (F) e macho (M)......................................................... 58

LISTA DE APNDICES
APNDICE A Eletroforetograma obtido de uma das amostras de plasma de avestruz.................................................................................................................................. 65 APNDICE B Dados dos exames de protenas das avestruzes......................................... 66 APNDICE C Dados dos exames de protenas das emas.................................................. 68

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SUMRIO
1 INTRODUO.................................................................................................................. 11 2 REVISO DE LITERATURA......................................................................................... 15 2.1 Nutrio dos avestruzes e as taxas de protenas.......................................................... 15 2.2. As protenas plasmticas e sua importncia clnica................................................... 16 2.3. O mtodo do Biureto..................................................................................................... 19 2.4. A tcnica da eletroforese.............................................................................................. 20 3. CAPTULO 1. Identificao do perfil plasmtico e diferenciao das fraes de protenas plasmticas em avestruz (Struthio camellus).................................................... 22

Resumo.................................................................................................................................. 22 Abstract................................................................................................................................. 23 Introduo............................................................................................................................. 24 Material e Mtodos.............................................................................................................. 26 Resultados e Discusso......................................................................................................... 30 Concluso.............................................................................................................................. 38 Referncias............................................................................................................................ 38

4. CAPTULO 2. Perfil plasmtico e diferenciao de fraes de protenas plasmticas

em emas (Rhea americana) no Rio Grande do Sul............................................................ 43 Resumo.................................................................................................................................. 43 Abstract................................................................................................................................. 44 Introduo............................................................................................................................. 44 Material e Mtodos............................................................................................................... 46 Resultados e Discusso......................................................................................................... 47 Concluso.............................................................................................................................. 49

Referncias............................................................................................................................ 49
5. CAPTULO 3 Perfil eletrofortico e diferenciao de fraes proticas de emus

(Dromaius novaehollandiae) criados em cativeiro.............................................................

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Resumo.................................................................................................................................. 52 Abstract................................................................................................................................. 53 Nota Cientfica...................................................................................................................... 52 Agradecimentos.................................................................................................................... 56 Referncias........................................................................................................................... 56 6. CONCLUSO.................................................................................................................. 60 7. REFERNCIAS............................................................................................................... 61 8. APNDICES.................................................................................................................... 64

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1 INTRODUO

Nos ltimos anos, vem crescendo consideravelmente no Brasil a criao de novas espcies animais, sendo algumas exticas nossa fauna. Estas atividades se desenvolvem tanto para finalidade conservacionista como para a produo comercial. Dentre elas, o avestruz (Struthio camellus) e a ema (Rhea americana) destacam-se devido aos seus altos potenciais reprodutivos, adaptabilidade, produtos e subprodutos de excelente qualidade, muito procurados no mercado mundial (ALMEIDA, 2006). O Ministrio do Meio Ambiente classificou no Brasil, segundo a Portaria No 36 de 15 de maro de 2002, o avestruz africano de animal selvagem e extico, para domstico (BRASIL, 2002). A ema continua classificada como animal selvagem da fauna brasileira, dificultando assim o desenvolvimento de criaes de emas. Esse quadro gerou, aliado a outros fatores, um aumento do interesse pela criao de avestruz e ajudou a impulsionar a atividade. Ambas as espcies pertencem ordem Struthioniformes. Segundo os critrios do Comit Brasileiro de Registros Ornitolgicos, essa ordem compreende as famlias Struthionidae (avestruzes), Rheidae (emas), Casuariidae (casuares), Dromaiidae (emus) e Apterygidae (kiwis). Todos os animais pertencentes a essa ordem so conhecidos como ratitas, por possurem caractersticas anatmicas especficas que os diferenciam das outras aves, como msculos peitorais pouco desenvolvidos, ausncia de quilha ou carena no osso esterno, clavculas pouco desenvolvidas ou ausentes, incapacidade de vo, pernas robustas, capacidade de separao de urina e fezes, ausncia de glndula uropigiana, entre outras (ALMEIDA, 2006). No Brasil observa-se que o avestruz vem ganhando destaque entre os produtores, sendo amplamente criado em todas as regies, comparando-se com outras ratitas e criaes silvestres ou exticas. Tambm em termos comerciais, a principal ratita do mundo, j que a maioria dos criatrios dessa espcie e, conseqentemente, grande parte dos produtos de ratitas do mercado dessa ave. Segundo Huchzermeyer (2000), o avestruz, a maior ave viva e, na natureza, atualmente, se restringe ao leste e sul da frica. a nica ratita cuja distribuio natural estende-se ao norte da linha do equador. Ao mesmo tempo em que um animal habitante de plancies e prados abertos ridos e semi-ridos, ele se adapta bem a uma grande variedade de climas em sua ampla distribuio geogrfica, desde os invernos chuvosos e algumas vezes com

12 neve na Cidade do Cabo, frica, at condies extremamente quentes dos veres no deserto. A umidade ocasionalmente alta nas reas chuvosas de vero tambm bem tolerada. Este animal (figura 1) caracteriza-se pelo pescoo comprido, sem penas em quase toda a extenso, provido apenas de uma penugem lanosa. As fmeas podem atingir entre 1,8 a 2m, e os machos atingem de 2,1 a 2,7m de altura. Quanto ao peso, esse pode variar entre 80 a 150kg, conforme a subespcie e sexo. Aos 12 meses de idade atingem a altura dos adultos e apenas 80% do peso adulto. O dimorfismo sexual na plumagem dos adultos um fato bastante evidente. As penas das asas so macias e soltas e, assim como as da cauda, so de cor branca nos adultos. A plumagem do tronco negra e brilhante nos machos e predominantemente parda nas fmeas (ALMEIDA, 2006).

Figura 1 - Exemplar de avestruz (S.camelus) macho adulto.

Outra caracterstica marcante, segundo Huchzermeyer (2000), que avestruzes possuem dois dedos nas patas, enquanto todas as outras ratitas possuem trs dedos, todos eles apontando para frente. Conforme Portella (2006), os registros mais antigos que do conta do relacionamento humano com essa ave datam de mais de 5.500 a.C. Outros registros tambm relatam a utilizao, no Antigo Egito, das plumas como smbolo de justia, em razo de sua perfeita simetria. A explorao da ave comea com a sua utilizao para trao e at monta. visto tambm que, posteriormente, no Imprio Romano, os oficiais legionrios utilizavam adornos

13 com plumas para serem reconhecidos como vencedores nos campos de batalha. A procura pela criao racional tambm antiga, sendo que em meados do ano 1100 d.C. tentou-se incubar ovos de avestruz, sem xito. A atividade atual de estruthiocultura se iniciou no sculo XIX na regio de Little Karoo, na frica do Sul. Nesse local comearam as exploraes comerciais do avestruz. Essa primeira fase comercial foi instigada pela demanda no continente europeu pelas plumas para a moda feminina. Em 1838 iniciaram-se as primeiras exportaes de plumas da frica do Sul para a Europa (PORTELLA, 2006). A partir de ento a atividade vem ampliando-se e melhorando tecnicamente. Alm do ponto de vista comercial, essa explorao tambm traz benefcios para a conservao das avestruzes como espcie, que vm sofrendo bruscas redues das populaes em suas reas de ocorrncia natural, principalmente em decorrncia da destruio abusiva de seu habitat natural e da caa predatria (ALMEIDA, 2006). A ema, por sua vez, originalmente endmica da regio Neotropical, sendo a maior ave da Amrica do Sul. Sua presena, na poca do descobrimento do Brasil pelos europeus, era abundante em todas as regies descampadas do Brasil Oriental e Central e em outros pases sulamericanos como Paraguai, Uruguai e principalmente Argentina. Atualmente tornou-se escassa nesses pases e na regio nordeste do Brasil, tendo praticamente desaparecido no Rio Grande do Sul e So Paulo. As maiores populaes naturais concentram-se nos estados de Mato Grosso e Gois, podendo ainda ser encontrada nos cerrados das regies oeste e nordeste do estado de Minas Gerais (ALMEIDA, 2006). As emas no possuem dimorfismo sexual acentuado, possuindo ambos, macho e fmea, de acordo com Almeida (2006), um corpo ovide, com a poro posterior cnica. A cabea e o pescoo tm penas de cor cinza pardo e a base do pescoo, o peito anterior e a parte mediana do dorso so negras. A base do pescoo encoberta por um tufo de penas laterais cinzas. A altura de uma ema adulta varia de 1,34 a 1,8m e o peso entre 26 e 52 kg. Seus ovos podem chegar a pesar 600 g e, conforme Silva (2001), um aspecto interessante do comportamento reprodutivo destas aves o papel desempenhado pelo macho, que faz a corte, constri o ninho, incuba os ovos e cuida dos filhotes, enquanto a fmea se limita cpula e postura. Sendo ambas as espcies introduzidas recentemente no setor pecurio brasileiro e tendo em vista a relativa escassez de literatura e trabalhos cientficos sobre esses animais, sobretudo em mbito nacional, em comparao com outras espcies j utilizadas na atividade pecuria, til e necessria a ampliao das pesquisas sobre seus parmetros fisiolgicos normais, como auxlio para criadores e mdicos veterinrios.

14 Neste contexto, os objetivos destes trabalhos foram traar o perfil eletrofortico das protenas plasmticas totais de avestruzes, fazendo a identificao das diferentes fraes dessas protenas, analisando tambm a existncia de diferenas entre os sexos e entre faixas etrias da espcie; traar o perfil eletrofortico das protenas plasmticas totais de um grupo de emas (R. americana) criadas no estado do Rio Grande do Sul , bem como identificar as diferentes fraes proticas no plasma desses animais e identificar o perfil eletrofortico das protenas plasmticas e diferenciar as fraes proticas do plasma de um casal de emus (D. novaehollandiae), provenientes de um zoolgico do Rio Grande do Sul.

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2. REVISO DE LITERATURA

2.1. Nutrio das avestruzes e as taxas de protenas

A grande maioria das protenas plasmticas sintetizada no fgado, a partir de aminocidos derivados do alimento ou do catabolismo dos tecidos. Os aminocidos entram no organismo pela circulao portal quase inteiramente em forma livre, mas nem todos os aminocidos absorvidos so derivados das protenas da ingesta. Como nos mamferos, o conjunto de aminocidos absorvidos pelo organismo das aves recebe tambm contribuies a partir da hidrlise de clulas epiteliais descamadas da mucosa intestinal e de enzimas digestivas (STURKIE, 1986). A presena destas protenas no plasma breve, sendo a reposio constante das mesmas, algo essencial, j que exercem presso coloidosmtica e essa age na preservao do volume sanguneo e auxilia na manuteno do pH dentro de uma faixa estreita (STURKIE, 1986). Vrias pesquisas sobre nutrio de avestruzes foram realizadas e, de acordo com Garcia Neto (2004), tm mostrado diferenas especficas para esta espcie de ave, assim sendo, o Setor de Zootecnia da Unesp, que elabora suas formulaes segundo recomendaes do National Research Council (NRC, 1994), indica formulaes com 18 % de protena bruta para animais na categoria inicial (0 a 8 semanas), 17 % para animais da categoria crescimento (8 a 25 semanas), 16 % para os animais da categoria manuteno e 16.5 % para os animais em reproduo. A empresa RTB Raes (RTB Raes, Bariri, So Paulo, Brasil), que produz produtos para avestruzes utilizados por criadores do Rio Grande do Sul possui, segundo material de divulgao da prpria empresa, formulaes contando com nveis de garantia de 22 % de protena bruta para animais de 5 a 45 dias (pr-inicial), 19 % para animais de 45 a 120 dias (inicial), 17 % para os de 120 dias at 10 meses (crescimento), 13 % para os com mais de 10 meses (manuteno) e 16 % para animais em fase de reproduo. Outro produto utilizado pelos criadores gachos o produzido pela empresa Guabi (Grupo Guabi, Campinas, So Paulo, Brasil). Segundo seu material de divulgao, os produtos possuem nveis de garantia de protena bruta de 20 % para animais da categoria pr-inicial, 18 % para os da categoria inicial, 16 % para animais em crescimento, 14 % para os animais em

16 fase de terminao, 12 % para os da fase de manuteno e 15 % para animais em fase reprodutiva.

2.2. As protenas plasmticas e sua importncia clnica

As protenas, cujo nome vem da palavra grega protos que significa primeiro ou mais importante, so as macromolculas mais abundantes nas clulas vivas. Ocorrem em todas as partes de todas as clulas. Ocorrem tambm em grande variedade, existindo milhares, desde peptdeos de tamanho relativamente pequeno at enormes polmeros com pesos moleculares na faixa de milhes. Exibem uma grande diversidade de funes biolgicas, sendo os produtos finais mais importantes das vias de informao e so os instrumentos moleculares por meio do qual a informao gentica expressa. Alm dessa importante funo, notvel observar que a partir de combinaes do mesmo conjunto de 20 aminocidos, as clulas podem produzir protenas com propriedades e atividades extraordinariamente diferentes entre si, como enzimas, hormnios, fibras musculares, penas de pssaros, teias de aranhas, protenas do leite, anticorpos, entre outros (LEHNINGER; COX, 2002). As protenas so, portanto, compostos essenciais a todas as clulas vivas e esto relacionadas, praticamente, a todas as funes fisiolgicas, alm de desempenharem papis importantes na estrutura celular. So estruturas moleculares cujas unidades bsicas, os aminocidos, esto unidas entre si por ligaes peptdicas. Dentre suas funes biolgicas, que so influenciadas por sua estrutura e seqncia de aminocidos, destacam-se: catlise enzimtica, transporte, capacidade de contrao ou de movimento, suporte e estrutura, imunoproteo e defesa, coagulao sangunea, regulao do crescimento e diferenciao celular (SILVA et al., 2005). Assim como no resto do organismo animal, as protenas esto presentes tambm no sangue, desempenhando diversas funes. Para efeito didtico, pode-se dividir o sangue em duas fraes, uma frao composta pelas clulas sanguneas e a outra pelo plasma sanguneo. Segundo Swenson (1996), o plasma apresenta-se desde amarelado at incolor, dependendo da quantidade, espcie animal e sua dieta. A cor resulta principalmente da variao na concentrao do pigmento bilirrubina, embora o caroteno e outros pigmentos sejam fatores que tambm contribuam. Pode-se obter o plasma pela adio de um anticoagulante ao sangue total coletado, permitindo que as clulas permaneam soltas e sedimentem, por serem mais pesadas

17 do que o plasma. A centrifugao do sangue acelera a sedimentao e assim o plasma pode ser obtido mais rapidamente. Ainda conforme Swenson (1996), no animal adulto, o plasma contm 91 a 92% de gua e 8 a 9% de slidos. Mais de 7% do plasma consistem de protenas. As protenas plasmticas so identificadas como albumina, globulinas (, e ) e fibrinognio. As -globulinas produzidas por linfcitos e clulas plasmticas contm anticorpos normalmente chamados de imunoglobulinas. As imunoglobulinas so classificadas como IgM, IgG, IgA, IgD e IgE. A IgG a imunoglobulina mais abundante nos animais normais. Ela est presente no sangue e encontrada tambm nos tecidos. A IgE produzida por animais com vrios tipos de alergias. A IgA uma glicoprotena encontrada nas secrees externas como a saliva, lgrimas e colostro, estando tambm presente no plasma. A IgM o anticorpo natural que ocorre no sangue. A IgD est relacionada de algum modo com o reconhecimento dos linfcitos B contra alguns antgenos e a induo dessas clulas B para proliferar e formar clones. Segundo Warr et al. (1995) existe ainda a IgY, que o equivalente funcional de IgG em aves, rpteis e anfbios, entretanto, muitos aspectos da sua biologia so ainda pouco elucidados. Estudos esto obtendo novas informaes acerca da gentica e das funes desta molcula, e revelam a sua posio como ancestral dos anticorpos IgG e IgE de mamferos. Da mesma forma que a IgG, a IgY uma molcula de baixo peso molecular, sendo encontrada em maior quantidade no soro e o maior mecanismo de defesa contra infeces sistmicas (MORGULIS, 2002). A albumina plasmtica, o fibrinognio, parte das globulinas e a protrombina so formados no fgado. A sntese das protenas plasmticas est marcadamente reduzida nas alteraes hepticas graves ou dietas prolongadas, deficientes em protenas (SWENSON, 1996). Possuem vrias funes importantes no organismo e as alteraes em seus nveis e caractersticas podem auxiliar muito nos diagnsticos. O soro das galinhas em postura contm aproximadamente 5,40g/dL de protena. O soro de frangos e galinhas fora de postura contm menos (3,6g/dL) e, nos pintos, menor ainda. Simultaneamente com o aumento das protenas plasmticas das galinhas em postura, h um marcante aumento no clcio srico (SWENSON, 1996). De acordo com Kerr (2003), o aumento da concentrao de protenas totais pode indicar deficincia de gua, doenas inflamatrias crnicas, como cirrose do fgado, doenas imunomediadas e paraproteinemia. A diminuio das protenas totais, por sua vez, poderia ser causada por excesso relativo de gua, perda excessiva de protenas (perda renal, perda

18 intestinal, hemorragias, queimaduras), diminuio da sntese protica (dieta deficiente em protena, m absoro, insuficincia heptica, condies virais). Segundo Rupley (1999), nas aves, uma hiperglobulinemia pode resultar de aumentos nas -, - e -globulinas, que podem ocorrer no caso de inflamao aguda, micoses sistmicas, nefrite aguda e hepatite ativa. Um aumento nas globulinas pode ser policlonal (o que pode ocorrer em uma inflamao crnica, doena imunomediada, ou doena supurativa) ou monoclonal (que pode ocorrer no caso de discrasia plasmoctica). Uma falta ou perda de globulinas pode indicar um estado imunodeficiente. A concentrao da protena srica total (ou plasmtica) nas aves menor quando comparada a dos mamferos, variando entre 3,0 e 6,0g/dL (CAMPBELL; DEIN, 1984). Normalmente, resultados abaixo de 3,0g/dL significam hipoalbuminemia, porque a albumina a maior frao protica individual do plasma. A hipoproteinemia pode ocorrer na doena renal crnica ou heptica, m nutrio e absoro ou perda sangnea crnica. Os valores menores que 2,5g/dL indicam prognstico grave, e na hipoproteinemia severa raramente as aves sobrevivem. Os valores acima de 6,0g/dL ocorrem nos quadros de desidratao ou devido ao aumento nas globulinas totais e a hiperglobulinemia pode estar associada a doenas, tais como: tuberculose, aspergilose, clamidiose, septicemias bacterianas ou infeco bacteriana crnica (CAMPBELL; COLES, 1986). O perfil eletrofortico destas protenas no fornece informaes especficas, mas til no diagnstico quando alteraes nos valores normais so analisadas e associadas ao quadro clnico, sendo importantes para o diagnstico, o prognstico e o curso de algumas enfermidades, podendo-se citar, por exemplo, a relao albumina/globulina nas aves, que um indicador de alta significncia clnica, para se avaliar a resposta inflamatria em caso de enfermidade (KANEKO, 1997). Existem algumas situaes clnicas comuns em que a eletroforese se torna til como auxlio diagnstico, entre elas incluem-se infeces, neoplasias, intoxicaes, distrbios comportamentais e doenas nutricionais (TATUM et al., 2000). Entretanto, um grande nmero de variveis influencia o padro eletrofortico das protenas, tais como: espcie, sexo, idade, manejo dos animais, condies ambientais e tipo de meio, e tcnica utilizados na eletroforese.

19 2.3. O mtodo do Biureto

Muitos mtodos espectrofotomtricos, ao longo dos anos, tm sido propostos para a determinao de protenas totais, mas no existe uma metodologia considerada de uso universal para todos os meios. Os mtodos geralmente mais utilizados so o do biureto, de Lowry, do Coomassie brilliant blue BG-250 ou reagente de Bradford, do BCA ou reagente de Smith12, e de absoro de protenas no ultravioleta (ZAIA et al., 1998). No presente trabalho, o mtodo empregado foi o de determinao de protenas totais atravs do uso do reagente biureto. De acordo com Zaia et al. (1998) as origens do mtodo do biureto podem ser traadas desde a proposta inicial de Autenrieth, em 1915; posteriormente diversos autores propuseram modificaes do mesmo, sendo a proposta metodolgica de Gornall et al. (1949) a mais utilizada. O mtodo se baseia na reao do reativo do biureto, que constitudo de uma mistura de cobre e hidrxido de sdio com um complexante que estabiliza o cobre em soluo, sendo o tartarato de sdio o recomendado por Gornall et al. (1949). O cobre, em meio alcalino, reage com protenas formando um complexo quadrado planar com a ligao peptdica. O produto da reao apresenta duas bandas de absoro, uma em 270nm e outra em 540nm. Apesar da banda na regio de 270nm aumentar em seis vezes a sensibilidade do mtodo do biureto, a banda na regio de 540nm a mais utilizada para fins analticos, porque diversas substncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na regio de 270nm causando muita interferncia no mtodo. O mtodo de biureto tem sido aplicado para determinar a concentrao de protenas totais em diversos meios, sendo eles: soro ou plasma sangneo, lquido crebro espinhal (lqor), urina, alimentos, saliva, fibrinognio e tecido animal. O mtodo de biureto tem sido, tambm, utilizado em anlise por injeo em fluxo, assim como em alguns mtodos cinticos. Apesar deste mtodo no ser muito sensvel, como foi destacado por autores, colocandoo em certa desvantagem, em relao a outras metodologias, e por isto estar sendo, ao longo dos anos, substitudo por mtodos mais sensveis, por ser rpido, utilizar reagentes de baixo custo e no apresentar grande variao da absortividade especfica para diferentes protenas, continua em uso em diversas pesquisas. O mtodo de biureto continua sendo recomendado para a determinao da concentrao de protenas totais em plasma sangneo pela Associao Americana de Anlises Clnicas e por diversos autores, bem como para a determinao de protenas totais em saliva e leite (ZAIA et al., 1998).

20 2.4. A tcnica da eletroforese

As protenas usualmente tm uma carga lquida positiva ou negativa, que reflete a mistura de aminocidos carregados que elas contm. Se um campo eltrico aplicado a uma soluo contendo molculas de protenas, estas migraro a uma velocidade que depende da sua carga lquida e do seu tamanho. Essa tcnica, conhecida como eletroforese, foi originalmente usada para separar misturas de protenas em solues aquosas ou em solues presas a uma matriz slida porosa, como amido (ALBERTS et al., 1997). A eletroforese , portanto, uma metodologia utilizada para a separao de molculas, em funo de suas cargas eltricas, de sua conformao e de suas massas, sob influncia de um campo eltrico (figura 2). A velocidade e a distncia de migrao de uma molcula so dependentes da carga eltrica da molcula, do potencial eltrico do meio e do coeficiente de frico. As condies fsico-qumicas do meio eletrofortico so mantidas em funo do sistema-tampo utilizado (MADRUGA et al., 2001).

Figura 2 - Vista parcial demonstrando fonte e cuba utilizadas para eletroforese.

De acordo com Lehninger e Cox (2002), essa tcnica especialmente til como mtodo analtico. Sua vantagem que as protenas podem ser visualizadas e separadas (figura 3), permitindo a um pesquisador estimar rapidamente o nmero de protenas distintas em uma mistura ou o grau de pureza de uma preparao protica particular.

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Figura 3 Eletroforese em gel de agarose apresentando bandas proticas tpicas.

As protenas plasmticas podem ser separadas por eletroforese em duas fraes principais, sendo uma a frao de albumina e a outra constituda pelas globulinas, as quais se diferenciam da albumina por apresentarem maior tamanho e peso molecular (SILVA et al., 2005). As protenas sanguneas so ento separadas, devido s suas caractersticas de carga, peso molecular e solubilidade em albuminas e globulinas. Essa separao visualizada pela formao de picos ou focos formados durante a migrao das molculas em direo ao nodo. Alguns desses picos representam dezenas a centenas de diferentes protenas plasmticas, que tm velocidades de migrao semelhantes. Entretanto, certas protenas predominam em cada pico e a variao em suas quantidades relativas caracterstica de certas doenas (DEVLIN, 1998). Conforme Naoum (1990) a albumina, tambm conhecida como soroalbumina, a mais abundante das protenas sricas (3,5 a 5,5g/dL), sendo sintetizada no fgado a uma taxa de aproximadamente 12g/dia, o que representa 25% da sntese protica total do fgado e a metade de toda a protena exportada pelo rgo. A frao globulnica uma mistura muito complexa, sendo dividida em 05 subfraes: alfa 1, alfa 2, beta 1, beta 2 e gama-globulinas. Dentre as globulinas a frao de migrao eletrofortica mais rpida a alfa 1 e a mais vagarosa a gama-globulina que, geralmente, sintetizada pelas clulas do sistema macrofgico, principalmente pelos linfcitos B. As imunoglobulinas localizam-se no pico , isto , so gamaglobulinas, sendo assim denominadas por muito tempo at que se preferiu a denominao atual de imunoglobulinas (SCROFERNEKER; POHLMANN, 1998).

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3. CAPTULO 1

Identificao do perfil plasmtico e diferenciao das fraes de protenas plasmticas em avestruz (Struthio camellus).

Identification of the plasmatic profile and differentiation of plasmatic protein fractions in ostrich (Struthio camellus)

RESUMO

No Brasil o avestruz tem destaque, sendo amplamente criado pela facilidade de manejo e excelente adaptabilidade ao clima brasileiro. Entretanto, como espcie introduzida recentemente no setor pecurio brasileiro e em vista da escassez de trabalhos cientficos sobre o animal, til e necessria a ampliao das pesquisas sobre seus parmetros fisiolgicos normais. Neste sentido, o objetivo desse trabalho foi traar o perfil eletrofortico das protenas plasmticas totais de avestruzes, bem como identificar as diferentes fraes proticas e diferenas entre sexos e entre determinadas faixas etrias da espcie. Foram coletadas amostras de sangue de 72 avestruzes de criatrios do Rio Grande do Sul, dos quais obteve-se plasma. Essas amostras passaram pela realizao do mtodo de biureto e pela eletroforese, para a quantificao, separao e identificao das protenas. Foram encontrados e determinados os

23 nveis de protenas plasmticas totais (PPT) e a relao entre albumina e globulinas (A/G). Para o grupo de filhotes fmeas, a mdia de PPT foi de 2.23 0.23g/dL, para os filhotes machos foi 2.40 0.30g/dL; para as fmeas juvenis a mdia foi de 3.67 0.42g/dL e para os machos juvenis foi 3.90 0.44g/dL; as fmeas adultas apresentaram uma mdia de 4.11 0.65g/dL e os machos adultos, 4.07 0.69g/dL. As fraes proticas foram definidas como albumina, alfaglobulina, beta1-globulina, beta2-globulina e gama-globulina. Os nveis em g/dL de protenas totais e de albumina foram significativamente menores nos grupos de filhotes em comparao com os demais.

Palavras Chaves: proteinograma, protenas, ratitas.

ABSTRACT

In Brazil, the ostrich stands out and is widely established due to ease of handling and excellent adaptability to the climate of Brazil. However, as a recently introduced specie in the Brazilian cattle sector and given the scarcity of scientific studies on the animal, especially at the national level, it is useful and necessary to extend the research on their normal physiological parameters. In this sense, the objective of this study was to determine the electrophoretic profile of total plasma proteins of ostriches, as well as identify the different protein fractions and differences between sexes and between the age groups of the species. We collected blood samples from 72 ostrich farms in Rio Grande do Sul, from which plasma was obtained. These samples passed through the completion of the biuret method and by electrophoresis for the quantification,

24 separation and identification of proteins. The levels of total plasma proteins (TPP) and the relationship between albumin and globulin (A/G) were found and determined. For the group of young females, the average TPP was 2.23 0.23g/dL, for the male offspring it was 2:40 0.30g/dL, for juvenile females, the average was 3.67 0.42g/dL and for male juveniles was 3.90 0.44g/dL, adult females had an average of 4.11 0.65g/dL and adult males, 4.07 0.69g/dL. The protein fractions were defined as albumin, alpha-globulin, beta1-globulin, beta2globulin and gamma globulin. Levels in g / dL of total protein and albumin were significantly lower in groups of pups in comparison to the others.

Key words: proteinogram, proteins, ratites.

INTRODUO

A crescente demanda por cuidados veterinrios na estrutiocultura e a freqente limitao do exame semiolgico na clnica das aves, sugerem que os exames laboratoriais so importante auxlio no diagnstico das enfermidades nos avestruzes (PALOMEQUE et al., 1991; MUSHI et al., 1998; TREVELIN et al. 2008). Entre parmetros fisiolgicos de importncia, figura o perfil plasmtico de protenas, bastante til quando alteraes so analisadas e associadas a quadros clnicos, sendo importante para auxlio diagnstico, prognstico e determinao do curso de algumas situaes clnicas comuns, como infeces, neoplasias, intoxicaes, distrbios comportamentais e doenas nutricionais (TATUM et al., 2000). Pode-se citar, tambm, a utilidade do conhecimento da

25 relao albumina/globulina nas aves, que indicador de alta significncia clnica, na avaliao da resposta inflamatria em caso de enfermidade (KANEKO, 1997). Em diversas espcies animais, as protenas plasmticas so identificadas como albumina, globulinas (, e ) e fibrinognio. As -globulinas produzidas por linfcitos e clulas plasmticas contm anticorpos normalmente chamados de imunoglobulinas. As imunoglobulinas so classificadas como IgM, IgG, IgA, IgD e IgE. A IgG a imunoglobulina mais abundante nos indivduos normais, estando presente no sangue e tambm nos tecidos. A IgE produzida por animais com vrios tipos de alergias. A IgA uma glicoprotena encontrada nas secrees externas como a saliva e lgrimas, estando tambm presente no plasma. A IgM o anticorpo natural que ocorre no sangue. A IgD est relacionada de algum modo com o reconhecimento dos linfcitos B contra alguns antgenos e a induo dessas clulas B para proliferar e formar clones (SWENSON, 1996). Sabe-se que a equivalente funcional de IgG em aves, rpteis e anfbios a IgY, entretanto, muitos aspectos da sua biologia so ainda pouco elucidados (WARR et al., 1995). Da mesma forma que a IgG, a IgY uma molcula de baixo peso molecular, sendo o maior mecanismo de defesa contra infeces sistmicas (MORGULIS, 2002). A albumina plasmtica, o fibrinognio, parte das globulinas e a protrombina so formados no fgado. A sntese das protenas plasmticas est marcadamente reduzida nas alteraes hepticas graves ou dietas prolongadas, deficientes em protenas (SWENSON, 1996). Possuem vrias funes importantes no organismo e as alteraes em seus nveis e caractersticas podem auxiliar muito nos diagnsticos. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi traar o perfil eletrofortico das protenas plasmticas totais de avestruzes, bem identificar as diferentes fraes proticas, analisando tambm as diferenas entre os sexos e entre determinadas faixas etrias da espcie.

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MATERIAL E MTODOS

Foram coletadas amostras de sangue de 72 avestruzes, hgidos, de diversas idades e de diferentes criatrios do Rio Grande do Sul, para evitar que os animais utilizados fossem provenientes de criatrios com consanguinidade e/ou criados sob condies idnticas de manejo. Os indivduos foram escolhidos de acordo com a disponibilidade de acesso, sendo que todos estavam aparentemente saudveis, no apresentando sinais clnicos de enfermidades. Os criatrios dos quais foram obtidos os animais para as coletas localizavam-se nos municpios de Jlio de Castilhos, Porto Alegre, Rio Grande, Santa Maria e Santiago, conforme mapa da figura 1. Em Jlio de Castilhos, foram obtidas 10 amostras, em Porto Alegre obteve-se amostras de 13 animais, em Rio Grande, 10 indivduos foram amostrados, no Municpio de Santa Maria, 15 avestruzes foram utilizados para coletas e em Santiago, 24 indivduos foram utilizados.

Figura 4 Municpios do Rio Grande do Sul de onde foram obtidas as amostras. Fonte: http://br.viarural.com (modificado)

27 Nesses locais foram coletadas amostras de sangue, por puno da veia braquial, conforme a figura 2. Aps as coletas, as amostras foram acondicionadas em tubos com anticoagulante heparina. O sangue total foi submetido centrifugao por 3 minutos a 3900xg, para a separao do plasma.

Figura 5 A - Coleta do sangue. B Avaliao do volume obtido

Anlises bioqumicas podem ser conduzidas usando o plasma ou soro sanguneo. Soro e plasma so similares, no entanto o plasma contm fatores coagulantes e anticoagulantes que no esto presentes no soro. Em medicina aviria, o plasma frequentemente usado para anlises bioqumicas porque mais fcil de ser coletado do que o soro e propicia um volume de amostra maior (CLSI, 2009). HRUBEC et al., (2002) aps estudo comparativo entre as vantagens e desvantagens do uso de soro ou plasma, indicam que recomendado que valores qumicos do sangue sejam determinados a partir do plasma. Amostras de plasma podem ser colhidas e processadas rapidamente para separar os componentes lquidos dos celulares, permitindo uma determinao mais exata dos nveis analisados. O plasma tambm prefervel para a eletroforese sangunea em aves porque amostras coletadas em tubos sem anticoagulante, que originam amostras de

28 soro, tendem a tornar-se um pouco viscosas e perdem a sua fluidez, tornando a anlise difcil (LUMEIJ; DEBRUIJE, 1985; LUMEIJ et al., 1990). As amostras plasmticas foram armazenadas sob congelamento e encaminhadas para mensurao da concentrao das protenas plasmticas totais utilizando-se o mtodo de biureto, e, para a diferenciao da albumina e das fraes de globulinas, foi aplicada a tcnica da eletroforese. As determinaes de quantidade de protena total foram feitas atravs do mtodo de biureto, utilizando-se o kit Protenas Totais, Marca Labtest (Labtest Diagnstica, Lagoa Santa, MG, Brasil), as amostras foram processadas de acordo com as instrues do fabricante. Utilizou-se 1,0mL de reagente biureto e 0,02mL da amostra-plasma. Misturou-se e incubou-se a amostra e o reagente por 10min a 37C e posteriormente foi realizado o ensaio colorimtrico. A eletroforese foi realizada pela tcnica que emprega o gel de agarose como meio suporte. Este gel, aps as aplicaes de 10L das amostras plasmticas, foi embebido em uma soluo tampo de tris veronal (pH 8,6). Em sequncia, aplicou-se uma corrente eltrica de 90V ao meio suporte, por 20min, depois de submerso ao tampo. Aps a migrao das protenas atravs da rede do gel, sob ao da corrente eltrica, o gel foi secado, corado e escaneado atravs do Software para densitometria SDS-60, a fim de produzir o traado em bandas, tpico da eletroforese, produzindo um grfico para leitura, com formato aproximado ao modelo da figura 6.

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Figura 6 Interpretao grfica das bandas proticas encontradas na eletroforese em gel de agar. (HERNANDEZ, 2009)

Para a anlise dos dados, os animais foram agrupados em seis categorias de animais semelhantes entre si, com separao por idade e sexo. So eles: grupo 1 (animais fmeas com menos de trs meses), grupo 2 (animais machos com menos de 3 meses), grupo 3 (animais fmeas com mais de trs meses e no ativas reprodutivamente), grupo 4 (animais machos com mais de trs meses e no ativos reprodutivamente), grupo 5 (fmeas adultas ou ativas reprodutivamente) e grupo 6 (machos adultos ou ativos reprodutivamente). Alm destes grupos de avestruzes, foram montados tambm dois grupos comparativos: grupo das emas adultas e grupo dos emus. O conjunto completo dos animais integrantes dos grupos estudados e suas procedncias apresentado na tabela 2.

30 Tabela 1 Municpios de origem dos animais componentes dos grupos de idade e sexo Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Grupo 6 fmeas Jlio de Castilhos Porto Alegre Rio Grande Santa Maria Santiago Total 11 11 machos 6 6 fmeas 3 3 machos 2 5 7 fmeas 5 7 5 5 7 29 machos 5 6 3 2 16

No trabalho foi adotado o delineamento experimental inteiramente casualizado, com nmero varivel de repeties. Para a anlise estatstica foram utilizados os mtodos da anlise de varincia, o teste F, teste de Tukey e estudos de contraste. O nvel crtico de significncia foi de 5% de probabilidade. As anlises foram efetuadas com o auxlio do Programa estatstico SAS, verso 9.1.

4. RESULTADOS E DISCUSSO

Aps o processamento das amostras, a realizao dos exames e as anlises dos dados obtidos, foi possvel identificar os nveis de protena total do plasma (PPT), a relao entre as quantidades de albumina e de globulinas (A/G), bem como os nveis de cada frao componente das protenas plasmticas, sendo elas albumina, alfa (), beta () e gama () globulinas, dos animais amostrados, representados nas tabelas 2, 3, 4, 5, 6, 7, e 8, a seguir. Os valores mdios de protenas totais e da relao entre albumina e globulinas dos avestruzes amostrados, obtidos pelos exames realizados so apresentados na tabela 2.

31 Tabela 2 - Valores mdios de protenas totais (PPT) em g/dL, e da relao albumina/globulina (A/G) dos grupos de avestruzes. Grupo PPT A/G 1 2 3 4 5 6 X 2.23 a 0.23 2.40 a 0.30 3.67 b 0.42 3.90 0.44 4.11 b 0.65 4.07 b 0.69 3.39 0.45
b

0.72 0.18 0.72 0.12 0.73 0.14 0.75 0.15 0.87 0.14 0.94 0.25 0.78 0.16

* Letras diferentes indicam diferena significativa (P<0,05; teste de Tukey).

Obtidos os valores mdios destes parmetros bioqumicos observou-se que os grupos 1 e 2 diferiram estatisticamente dos demais grupos, referindo-se aos valores de PPT (p < 0,05) e no diferiram entre si. Para os valores de A/G, no houve diferenas estatsticas entre os grupos. Estes valores concordam, em parte, com PALOMEQUE et al. (1991) em estudo realizado com avestruzes do zoolgico de Barcelona, na Espanha, onde encontraram uma mdia de 6.22 0.92g/dL de protenas totais para animais juvenis e 3.87 0.58g/dL para animais adultos, sem ser feita distino de sexo dos indivduos analisados. Os nveis de protenas totais dos adultos, neste caso, diferiram estatisticamente dos valores encontrados para os juvenis. Os valores encontrados para animais adultos so muito prximos em ambos os estudos. Tambm KHAZRAIINIA et al. (2006), em pesquisa feita no Iran, encontraram nveis de PPT semelhantes para avestruzes, obtendo valores mdios para os animais de 3.35 0.61g/dL. Sem distino de sexo, para avestruzes com at 2 anos de idade, encontraram valores de 3.22 0.66g/dL de PPT e para os maiores de 2 anos, 2.86 0.99g/dL. Para as fmeas, os valores foram de 3.38 0.72g/dL e para os machos, 3.39 0.69g/dL. Observa-se que, ao contrrio do presente estudo, foram obtidos por estes pesquisadores, valores superiores de protenas totais nos animais mais jovens. Talvez esta diferena esteja

32 ocorrendo devido a diferentes dietas fornecidas para os animais em outras reas de criao. Entretanto, os nveis nutricionais dos animais avaliados por PALOMEQUE et al. (1991) e KHAZRAIINIA et al. (2006), no foram relatados em seus trabalhos. Os resultados deste estudo mostraram uma estrutura de fraes proticas no comumente relatada para os animais. Pela localizao das bandas proticas nos exames de eletroforese, foi possvel concluir que das 72 avestruzes amostradas, 71 apresentavam as fraes albumina, alfa-globulina, beta1-globulina, beta2-globulina e gama-globulina (tabelas 4 e 5 e figura 10). A maioria dos estudos de animais e os estudos em seres humanos apontam a presena de alfa1-globulina, alfa2-globulina e apenas uma beta-globulina. POLAT et al. (2004) em experimento realizado com avestruzes fmeas adultas na Turquia, encontraram entre as fraes proticas, albumina, alfa1-globulina, alfa2-globulina, beta-globulina e gama-globulina. KHAZRAIINIA et al. (2006) tambm encontraram estas fraes para avestruzes no Iran, entretanto utilizaram fitas de acetato de celulose em vez de gel de agarose. TATUM et al. (2000), em pesquisa com aves de rapina tambm apontaram a existncia das duas fraes de alfa-globulina e apenas uma frao beta-globulina nestas aves e CONRADO et al. (2007) encontraram a mesma configurao para emas. Entretanto alguns estudos demonstram traados diferentes, como os de HILL et al. (2007) em bezerras do estado do Paran, onde no apontaram nenhuma frao protica em duplicata, apresentando apenas uma alfa-globulina e uma beta-globulina. LANZAROT et al. (2005) tambm, em trabalho com uma espcie de cegonha (Ciconia nigra), no relatam a presena de duas fraes alfa, sendo apenas alfa-globulina e beta-globulina. Variaes nestes perfis de fraes so possveis e esto de acordo com SWENSON (1996) e com NAOUM (1990), que admitem que entre as protenas plasmticas animais, tm sido identificadas albumina, 1, 2, 1-, 2- e -globulinas.

33 Algumas diferenas de resultados podem estar ocorrendo por possveis diferenas fisiolgicas e nutricionais regionais entre os animais. Outra possvel causa poderia ser o fato de muitas vezes os aparelhos de leitura dos gis para formulao dos grficos (densitmetros) estarem calibrados para o uso na espcie humana ou em outros mamferos e assim talvez induzirem a uma leitura de duas fraes de alfa-globulina. As localizaes das bandas proticas, obtidas pela eletroforese e interpretadas nos grficos de muitos dos estudos que apresentam duas fraes e apenas uma frao entre o grupo das globulinas, normalmente se encaixam no padro de posicionamento j demonstrado no grfico modelo da figura 4. Nestes casos, as bandas identificadas como alfa1-globulina e alfa2-globulina encontramse muito prximas grande banda de albumina, e formam dois picos bem marcados, sendo 1 quase adjacente albumina. Diferentemente, no presente estudo, observou-se que para 71 das 72 amostras examinadas no ocorreu a formao deste padro, aparecendo o pico de albumina seguido pelas protenas na regio das alfa-globulinas apresentando-se excessivamente escassas e geralmente no formando picos bem definidos no grfico. Os picos normalmente iniciaram na regio das beta-globulinas, formando dois picos no grfico (figura 5).

34

Figura 7 Grfico de um animais estudado, demonstrando as bandas encontradas (1-albumina, 2 alfa-globulina, 3 beta1globulina, 4 beta2-globulina e 5 gama-globulina).

possvel observar a diferena existente entre o perfil protico do presente trabalho e entre grficos de estudos onde aparecem claramente as duas fraes de alfa-globulina. Este o caso do grfico apresentado por PIRES et al. (2008), que trabalharam com tartarugas cabeudas (Caretta caretta) e encontraram as duas bandas de alfa-globulina e apenas uma banda de betaglobulina. Nota-se a presena das fraes tanto pelos picos no grfico como pela existncia das bandas, visualizadas no fragmento de gel, como aparece na figura 8.

35

Figura 8 Eletroforetograma das protenas sricas de tartarugas cabeudas (C. caretta). A albumina, B alfa1-globulina, C alfa2-globulina, D betaglobulina, e E gama globulina. Fonte: PIRES et al., 2008.

O perfil encontrado no presente estudo, apresentando uma frao e duas fraes , para avestruzes concorda, em parte, com os achados de GODOY et al. (2006) que encontraram, alm da albumina, duas fraes , duas fraes e gama-globulina, em pesquisa feita a partir do sangue do cordo umbilical de ces nascidos em Jaboticabal, SP e est em conformidade com o que foi encontrado, para galinhas (Gallus gallus domesticus), por HASEGAWA et al. (2002). Estes por sua vez, em sua pesquisa com matrizes pesadas encontraram albumina, alfaglobulina, beta1-globulina, beta2-globulina e gama-globulina nos animais amostrados, sendo que alguns deles apresentaram tambm pr-albumina, que no foi encontrada para os avestruzes neste trabalho.

36 Os valores mdios obtidos da diferenciao das fraes proticas para os grupos de avestruzes so mostrados em gramas por decilitro (g/dL) na tabela 4 e em porcentagem comparada ao nvel de protenas totais na tabela 4.

Tabela 3 Valores mdios das fraes proticas albumina, alfa-globulina, beta-globulina e gama-globulina, em g/dL dos grupos de avestruzes. Grupo Albumina Alfa () Beta 1 () Beta 2 () Gama () 1 2 3 4 5 6 0.89 a 0.19 1.00 a 0.15 1.54 b 0.32 1.65 b 0.22 1.91 0.35 1.93 b 0.41
b

0.12 0.06 0.17 0.06 0.11 0.05 0.11 0.05 0.15 0.07 0.12 0.04

0.33 ab 0.08 0.29 b 0.06 0.58 a 0.08 0.59 a 0.17 0.58 0.16 0.52 ab 0.26
a

0.59 a 0.16 0.61 a 0.12 1.03 b 0.16 1.01 b 0.13 0.97 0.13 1.03 b 0.26
b

0.30 0.12 0.33 0.09 0.39 0.03 0.44 0.10 0.45 0.15 0.42 0.11

* Letras diferentes indicam diferena significativa (P<0,05; teste de Tukey).

Pela anlise estatstica dos dados, para albumina, houve diferena estatisticamente significativa (p < 0.05) entre os valores em g/dL dos grupos 1 e 2 contra os demais grupos. Para a frao alfa-globulina, em g/dL no houve diferena estatisticamente significativa entre os grupos. A frao beta1-globulina, por sua vez, apresentou diferena significativa (p < 0.05) em g/dL, do grupo 2 em relao aos grupos 3, 4 e 5 e na frao beta2-globulina, detectou-se diferena estatstica (p < 0.05) dos grupos 1 e 2 em relao aos demais.

37 Tabela 4 Valores das mdias das porcentagens de cada frao protica (albumina, alfa, beta e gama-globulinas), dentro do conjunto de protenas totais, dos grupos de avestruzes. Grupo Albumina Alfa () Beta 1 () Beta 2 () Gama () 1 2 3 4 5 6 40.37 6.16 41.75 4.10 41.80 4.85 42.59 5.05 46.36 4.07 47.47 7.59 5.64 ab 2.53 6.88 2.00 2.87 c 1.08 2.93 c 1.47 3.62 bc 1.45 2.99 c 1.16
a

14.87 3.98 12.35 2.78 16.03 2.80 14.87 2.90 14.03 2.98 12.38 3.87

24.52 3.05 25.10 3.01 28.30 4.92 25.97 3.70 23.97 3.17 25.12 3.61

12.52 3.93 13.92 3.45 10.80 0.66 11.20 2.22 10.76 2.74 10.52 2.73

* Letras diferentes indicam diferena significativa (P<0,05; teste de Tukey).

Para a frao albumina, em termos de porcentagem em relao s demais protenas plasmticas, no houve diferena significativa entre os grupos. Dentro da frao alfa-globulina, foi encontrada diferena estatstica (p < 0.05) em termos de porcentagem entre o grupo 1 e os grupos 3, 4 e 6 e tambm entre o grupo 2 e os grupos 3, 4, 5 e 6. Para as fraes beta1-globulina e beta2-globulina no houve diferena entre os grupos, em termos de porcentagem. Os valores mdios para a frao gama-globulina, por sua vez, se mostraram muito semelhantes entre os grupos, no apresentando diferena estatstica nem em g/dL e nem nas porcentagens de protenas. Nem todos os animais encontrados durante o estudo enquadraram-se no perfil relatado pelo trabalho. Um dos animais amostrados, como j foi mencionado, no apresentou o perfil de bandas proticas como os demais avestruzes em geral. Este animal era um filhote (menos de 3 meses) macho, do municpio de Santiago e apresentou um traado de bandas incomum ao estudo, podendo ter duas fraes e duas nas globulinas.

38

5. CONCLUSES

A concluso do trabalho nos permitiu traar um perfil de protenas plasmticas para avestruzes provenientes de criatrios do Rio Grande do Sul, em trs faixas etrias de animais, sendo filhotes, juvenis e adultos, com separao por sexo em ambos os grupos. Nestes perfis, foi possvel identificar os nveis de protenas plasmticas totais (PPT), a relao entre as quantidades de albumina e globulinas (A/G) bem como diferenciar as fraes de globulinas (, , ). Observou-se, pela tcnica utilizada, a presena de um perfil de fraes de globulinas, que foram agrupadas em , 1, 2 e . Os nveis em g/dL de protenas totais e de albumina foram significativamente menores nos grupos de filhotes em comparao com os demais, no havendo diferenas de valores, tanto para protenas totais como para as fraes proticas, entre os sexos em nenhuma das faixas etrias.

REFERNCIAS

CLSI,

Clinical

and

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Standards

Institute,

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43

4. CAPTULO 2

PERFIL PLASMTICO E DIFERENCIAO DE FRAES DE PROTENAS PLASMTICAS EM EMAS (Rhea americana) NO RIO GRANDE DO SUL.

ELECTROPHORETIC PROFILE AND PROTEIN FRACTIONS DIFFERENTIATION OF RHEAS (Rhea americana) IN RIO GRANDE DO SUL

RESUMO

Os setores pecurios de diversos pases vm se diversificando a cada dia e a utilizao de novas espcies animais, algumas vezes at mesmo de origem silvestre, torna-se algo relativamente comum. No Brasil pode-se citar a ema (Rhea americana) como uma espcie com certo destaque entre produtores, sendo amplamente criada. Entretanto, observa-se uma escassez de trabalhos cientficos sobre o animal, sendo importante a ampliao das pesquisas sobre seus parmetros fisiolgicos normais. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi traar o perfil eletrofortico das protenas plasmticas totais de um grupo de emas (R. americana) criadas no estado do Rio Grande do Sul , bem como identificar as diferentes fraes proticas no plasma desses animais. Para tanto, foram coletadas amostras de sangue de 9 emas de 2 criatrios do Rio Grande do Sul, das quais obteve-se plasma. Essas amostras passaram pela realizao do mtodo de biureto e pela eletroforese, para a quantificao, separao e identificao das protenas. Foram encontrados e determinados os nveis de protenas plasmticas totais (PPT) e a relao entre albumina e globulinas (A/G). Foram encontradas mdias de valores de 5.22 0.66 g/dL de protenas plasmticas totais e 0.97 0.24 para a relao entre a albumina e as globulinas, para o grupo de animais. Na diferenciao das fraes, encontrou-se a presena de pr-albumina, albumina, uma frao alfa-globulina, duas fraes beta-globulina, e uma frao gama-globulina, para o grupo. Palavras chave: proteinograma, eletroforese, emas.

44

ABSTRACT

The livestock sectors of several countries have been diversifying every day and the use of new animal species, sometimes even of wild origin, is becoming relatively common. In Brazil one can cite the rhea (Rhea americana) as a species with a certain prominence between producers and being widely created. However, there is a shortage of scientific studies on the animal, which makes it important to expand research on their normal physiological parameters. Thus, the objective of this study was to determine the electrophoretic profile of total plasma proteins of a group of rheas (R. americana) created in the state of Rio Grande do Sul, as well as to identify the different protein fractions in the plasma of these animals. To this end, we collected blood samples from 9 rheas from 2 rhea farms in Rio Grande do Sul, from which plasma was obtained. These samples passed through the completion of the biuret method and by electrophoresis for the quantification, separation and identification of proteins. The levels of total plasma proteins (TPP) and the relationship between albumin and globulin (A / G) were found and determined. We found average values of 5:22 0.66 g / dl of total plasma proteins and 0.97 0.24 for the ratio of albumin and globulin, for the group of animals. In the differentiation of fractions, we found the presence of prealbumin, albumin, a globulin fraction of alpha-two globulin fractions, and a gamma globulin fraction, for the group. Key Words: proteinogram, electroforesis, rheas

INTRODUO

As ratitas so aves corredoras com caractersticas anatmicas e fisiolgicas diferenciadas das carenatas (aves voadoras), ou seja, no so capazes de voar, no possuem musculatura no peito para vo e nem quilha sobre o osso esterno (SICK, 1997; PEREIRA et al, 2006). A criao destes animais, com destaque para o avestruz, a ema e o emu, surge como alternativa para a agropecuria. Estes animais utilizam alimentos de baixa qualidade, existentes em solos fracos, pois apresentam potencial para transform-los em protena animal de alto valor biolgico (GIANNONI, 1998; COSTA et al., 2008).

45 As emas pertencem famlia Rheidae e so endmicas da regio Neotropical. Possuem semelhanas morfolgicas, genticas e comportamentais com o avestruz, tendo um corpo ovide, altura entre 1,34 a 1,80m, peso entre 26 e 52kg e penas em tonalidades cinzentas e negras (ALMEIDA, 2006). A criao e a comercializao de carne de emas esto ainda em fase relativamente inicial, sendo que pouco se conhece sobre as doenas que afetam esta espcie em criaes intensivas (PEREIRA, et al., 2008) e tambm pouco se sabe sobre parmetros fisiolgicos normais destas espcies. Entre parmetros importantes para a clnica, figura o perfil plasmtico de protenas, til quando associado a quadros clnicos, auxiliando no diagnstico, prognstico e determinao do curso de situaes clnicas comuns, como infeces, neoplasias, intoxicaes, distrbios comportamentais e doenas nutricionais (TATUM et al., 2000). Pode-se citar, tambm, a utilidade do conhecimento da relao albumina/globulina nas aves, que indicador de alta significncia clnica, na avaliao da resposta inflamatria em caso de enfermidade (KANEKO, 1997). A albumina plasmtica, o fibrinognio, parte das globulinas e a protrombina so formados no fgado. Em outras espcies animais a sntese das protenas plasmticas mostra-se reduzida em alteraes hepticas graves ou dietas prolongadas, deficientes em protenas (SWENSON, 1996). Possuem vrias funes importantes no organismo e as alteraes em seus nveis e caractersticas podem auxiliar nos diagnsticos. Entre as protenas plasmticas, encontram-se as globulinas (, e ) que possuem marcada importncia. As -globulinas contm os anticorpos tambm chamados imunoglobulinas. Essas so classificadas como IgM, IgG, IgA, IgD e IgE. A IgG , comumente, a mais abundante em animais normais, estando presente no sangue e tecidos. A IgE produzida por animais com vrios tipos de alergias. A IgA encontrada nas secrees externas como a saliva e lgrimas, encontrando-se tambm no plasma. A IgM o anticorpo natural que ocorre no sangue. A IgD est relacionada com o reconhecimento dos linfcitos B contra alguns antgenos e a induo dessas clulas para proliferar e formar clones (SWENSON, 1996). Nas aves em geral existe tambm a IgY, equivalente funcional de IgG, encontrada tambm em rpteis e anfbios, entretanto, muitos aspectos da sua biologia so ainda pouco elucidados (WARR et al., 1995). Tendo em vista a escassez de maiores informaes sobre os valores de referncia para a avaliao das protenas plasmticas totais e das fraes proticas para espcies do grupo das ratitas, particularmente para as emas, este trabalho teve por objetivo relatar o perfil

46 eletrofortico em um grupo de emas adultas, criadas em cativeiro no estado do Rio Grande do Sul.

MATERIAL E MTODOS

Foram coletadas amostras de sangue de 9 emas. Este grupo foi composto por 8 animais adultos (acima de 1 ano de vida) oriundos de um parque de visitaes do municpio de Gravata e 1 animal, tambm adulto de um criatrio de Santa Maria. As amostras foram coletadas por puno da veia braquial e, posteriormente, acondicionadas em tubos com anticoagulante heparina. O sangue total foi submetido centrifugao por 3 minutos a 3900xg, para a separao do plasma. Nesse estudo optou-se pelo uso do plasma em vez do soro sanguneo. Anlises bioqumicas podem ser conduzidas usando o plasma ou soro sanguneos, pois so similares. No entanto o plasma contm fatores coagulantes e anticoagulantes que no esto presentes no soro. Em medicina aviria, o plasma frequentemente usado para anlises bioqumicas porque mais fcil de ser coletado do que o soro e propicia um volume maior de amostra (CLSI, 2009). As amostras plasmticas foram armazenadas sob congelamento e encaminhadas para mensurao da concentrao das protenas plasmticas totais atravs do mtodo de biureto, e, para a diferenciao da albumina e das fraes de globulinas, foi aplicada a tcnica da eletroforese. Para a determinao pelo mtodo de biureto, foi utilizado o kit Protenas Totais, Marca Labtest (Labtest Diagnstica, Lagoa Santa, MG, Brasil), as amostras foram processadas de acordo com as instrues do fabricante. Utilizou-se 1,0mL de reagente biureto e 0,02mL da amostra-plasma. Misturou-se e incubou-se a amostra e o reagente por 10min a 37C e posteriormente foi realizado o ensaio colorimtrico. A eletroforese foi realizada pela tcnica que emprega o gel de agarose como meio suporte. Este gel, aps as aplicaes de 10L das amostras plasmticas, foi embebido em uma soluo tampo de tris veronal (pH 8,6). Em sequncia, aplicou-se uma corrente eltrica de 90V ao meio suporte, por 20min, depois de submerso ao tampo. Aps a migrao das protenas atravs da rede do gel, sob ao da corrente eltrica, cada gel foi secado, corado, escaneado e analisado atravs do Software para densitometria SDS-60,

47 a fim de produzir o traado em bandas, tpico da eletroforese, produzindo um grfico para leitura. No trabalho foi adotado o delineamento experimental inteiramente casualizado, com nmero varivel de repeties. Para a anlise estatstica foram utilizados os mtodos da anlise de varincia, o teste F e o teste de Tukey. O nvel crtico de significncia foi de 5% de probabilidade. As anlises foram efetuadas com o auxlio do Programa estatstico SAS, verso 9.1.

RESULTADOS E DISCUSSO

Aps o processamento das amostras, a realizao dos exames e as anlises dos dados, foi possvel identificar os nveis de protena total do plasma (PPT) e a relao entre as quantidades de albumina e globulinas (A/G) e obter seus valores mdios. Para PPT a mdia foi de 5.22 0.66 g/dL e para a relao A/G foi de 0.97 0.24. Os nveis de PPT e A/G encontrados neste grupo foram prximos aos encontrados por CONRADO et al. (2007), que apresentaram valores mdios de PPT de 4.45 0.27 g/dL e 1,360,22 para a relao entre albumina e globulinas para emas com de 1 ano de idade. Atravs da tcnica da eletroforese foi possvel observar tambm as fraes componentes das protenas plasmticas, divididas entre albumina e globulinas. Estas ltimas foram agrupadas em uma frao alfa (), duas fraes beta () e uma frao gama (), nos animais amostrados. Os valores encontram-se na tabela 1.

Tabela 5 - Valores mdios das fraes proticas (albumina, alfa globulina, beta globulina e gama globulina), em g/dl e em porcentagem comparada ao total de protenas plasmticas (PPT), para o grupo de emas estudadas. Unidade Alb. 1 2 g/dL % 2.52 0.42 48.46 6.26 0.17 0.05 3.22 0.92 0.76 0.14 14.68 1.89 0.84 0.23 16.17 4.48 0.84 0.28 15.89 4.38

48 interessante notar tambm que a frao pr-albumina, observada por CONRADO et al. (2007) para todas as emas de at 15 dias de vida e por HASEGAWA et al. (2002) em algumas galnhas (Gallus gallus domesticus) de seu estudo, no foi observada para as emas desta pesquisa. Apesar de ser relatada a ausncia de explicao tcnica e cientfica para essas observaes (SWENSON, 1996), as emas deste estudo eram todas adultas, com mais de um ano de vida, sendo que esta frao j foi isolada e sequenciada em avestruzes, estando ligada funo da tireide de aves ainda em crescimento (CHANG et al.,1999; CONRADO et al., 2007). A mdia para a frao albumina tambm foi muito semelhante com a encontrada por CONRADO et al. (2007). As demais fraes, no entanto, variaram bastante entre estudos, e ocorreu diferena entre as fraes e , j que neste estudo foram determinadas uma frao alfa e duas fraes beta para as globulinas, diferentemente de outros autores que encontraram duas fraes e uma . O perfil encontrado no presente estudo, apresentando uma frao e duas fraes , concorda, entretanto, em parte, com os achados de GODOY et al. (2006) que encontraram, alm da albumina, duas fraes , duas fraes e uma -globulina, em pesquisa feita a partir do sangue do cordo umbilical de ces nascidos em Jaboticabal, SP e est em conformidade com o que foi encontrado, para galinhas (Gallus gallus domesticus), por HASEGAWA et al. (2002). Estes por sua vez, em sua pesquisa com matrizes pesadas encontraram albumina, alfaglobulina, beta1-globulina, beta2-globulina e gama-globulina nos animais amostrados, sendo que alguns deles apresentaram tambm pr-albumina, que no foi encontrada para os avestruzes neste trabalho. Entretanto, alguns estudos demonstram traados diferentes, como os de HILL et al. (2007) em bezerras do estado do Paran, onde no apontaram nenhuma frao protica em duplicata, apresentando apenas uma alfa-globulina e uma beta-globulina. LANZAROT et al. (2005), em trabalho com uma espcie de cegonha (Ciconia nigra), no relatam a presena de duas fraes alfa, sendo apenas alfa-globulina e beta-globulina. FONTEQUE et al. (2009), em trabalho realizado com cascavis (Crotalus durissus terrificus), apesar de identificarem mais fraes proticas, agruparam as encontradas em 4 grandes bandas, albumina, , e globulinas, Variaes nestes perfis de fraes so possveis e esto de acordo com SWENSON (1996) e com NAOUM (1990), que admitem que entre as protenas plasmticas animais, tm sido identificadas albumina, 1, 2, 1-, 2- e -globulinas.

49 Algumas diferenas de resultados podem estar ocorrendo por possveis diferenas fisiolgicas e nutricionais regionais entre os animais. Outra possvel causa poderia ser o fato de muitas vezes os aparelhos de leitura dos gis para formulao dos grficos (densitmetros) estarem calibrados para o uso na espcie humana ou em outros mamferos e assim talvez induzirem a uma leitura de duas fraes de alfa-globulina.

CONCLUSO

Atravs do trabalho foi traado perfis de protenas plasmticas para um grupo de emas adultas do Rio Grande do Sul. Nestes perfis, foi possvel identificar os nveis de protenas plasmticas totais (PPT), a relao entre as quantidades de albumina e globulinas (A/G) bem como diferenciar agrupamentos de fraes de globulinas (, , ). Observou-se, pela tcnica utilizada, a presena das globulinas, que foram agrupadas em quatro fraes distintas , 1, 2 e . Observou-se tambm a ausncia da frao pr-albumina no grupo estudado, frao esta que j foi observada em outras aves e tambm em emas por outros autores.

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51 NAOUM, P.C. Eletroforese: tcnicas e diagnsticos. 2 ed. So Paulo: Santos,1990. PEREIRA A. V.; ROMANELLI P. F; SCRIBONI A. B; ORLANDINI F. P., Rendimentos do abate e composio da carne de ema (Rhea americana), Cincia e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 26, n. 3, jul. 2006. SICK, H. Ordem Rheiformes emas: famlia Rheidae. In: SICK, H. (Ed.). Ornitologia Brasileira. Rio de Janeiro: Nova Fronteira, p. 168-171, 1997. SWENSON, M. J. Propriedades Fisiolgicas e Constituintes Qumicos e Celulares do Sangue. In: SWENSON M.J., REECE W.O. DUKES. Fisiologia dos Animais Domsticos, Rio de Janeiro: Guanabara-Koogan, p. 19-43, 1996. TATUM, L. M. et al., Protein Electrophoresis as a Diagnostic and Prognostic in Raptor Medicine. Journal of Zoo and Wildlife Medicine, White Oak Road, v.31, n.4, p.497-502, 2000. WARR G. W.; MAGOR K. E.; HIGGINS D. A., IgY: clues to the origins of modern antibodies, Immunology Today, Londres, v.16, n.8, p. 392-8, ago. 1995.

52 5. CAPTULO 3

Perfil eletrofortico e diferenciao de fraes proticas de emus (Dromaius novaehollandiae) criados em cativeiro

Electrophoretic profile and protein fractions differentiation of emus (Dromaius novaehollandiae) bred in captivity

Luciano de Oliveira BattistiI Larissa Quinto PereiraI Cybele Esteves AlmeidaII Maristela LovatoI*

NOTA -

RESUMO Emus so encontrados em quase todas as regies da Austrlia e tem sido criados em cativeiro em vrios outros pases. No estado do Rio Grande do Sul, estima-se que existam seis exemplares. As protenas plasmticas so utilizadas como auxiliares no diagnstico clnico das enfermidades. O objetivo deste trabalho foi identificar o perfil eletrofortico das protenas plasmticas e diferenciar suas fraes proticas. Foram utilizadas amostras de plasma coletadas de um casal, processadas pela tcnica do biureto e eletroforese em gel de agarose. Foram encontrados valores de 5,30 g/dL e 4,10 g/dL de protenas plasmticas totais e 0,67 e 0,81 para a relao entre a albumina e as globulinas, para a fmea e o macho respectivamente. Na diferenciao das fraes, encontrou-se a presena de pr-albumina, albumina, uma frao alfaglobulina, duas fraes beta-globulina, e uma frao gama-globulina, para ambos os animais. Palavras-chave: protenas plasmticas, ratitas, Dromaius novaehollandiae.

53

ABSTRACT
Emus are found in almost all regions of Australia and have been bred in captivity in several other countries. In the state of Rio Grande do Sul, it is estimated that there are six birds. Plasma proteins are used as aids in clinical diagnosis of diseases. The objective of this study was to identify the electrophoretic profile of plasma proteins and differentiate the protein fractions of emus. Samples of plasma collected from a couple, processed by the biuret technique and polyacrylamide gel electrophoresis. Found values of 5.30 g/dL and 4.10 g/dL of total plasma proteins and 0.67 and 0.81 for the relationship between albumin and globulins, for the female and male respectively. At the differentiation of fractions, we found the presence of prealbumin, albumin, one alpha-globulin, two beta-globulin fractions and one gamma globulin fraction, for both animals.

Key words: plasmatic proteins, ratites, Dromaius novaehollandiae.

Emus so encontrados em quase todas as regies semi-ridas da Austrlia, excluindo os desertos. Eles esto muito reduzidos em nmero e as subespcies que viviam na Tasmnia, Ilhas Kangoroo e no Estreito de Bass esto extintas. Esses animais comearam a ser criados fora da Austrlia e em 1989 foi fundada a AEA (American Emu Association), nos Estados Unidos (DRENOWATZ et al., 1995). No estado do Rio Grande do Sul estima-se que existam em cativeiro seis exemplares (dados no publicados). Entre as aves, somente os psitacdeos e as aves de rapina possuem padres eletroforticos definidos, essas informaes em ratitas so escassas e necessitam de estudos (GARCA-MONTIJANO, 2002; CONRADO et al., 2007).

54 O perfil eletrofortico das protenas plasmticas sozinho, no fornece informaes especficas, como o diagnstico de uma determinada doena, mas os resultados da eletroforese quando devidamente interpretados, podem ser teis como prognstico e diagnstico auxiliar na avaliao clnica (CONRADO et al., 2007; FONTEQUE et al., 2009). Devido ausncia de informaes sobre valores de referncia de protenas plasmticas e fraes proticas este trabalho teve por objetivo relatar o perfil eletrofortico em dois exemplares adultos de emu criados em cativeiro, representando 33% da populao existente no estado. Foram coletadas amostras sanguneas, por puno da veia metatrsica medial, de 2 emus (Dromaius novaehollandiae), sendo um macho e uma fmea adultos. As amostras foram acondicionadas em tubos com anticoagulante heparina. Esse material foi obtido de emus em um parque zoolgico localizado no municpio de Gravata, Rio Grande do Sul. O sangue total foi submetido centrifugao por 3 minutos a 3900xg, para a separao do plasma. As amostras plasmticas foram armazenadas a -20C e encaminhadas para mensurao da concentrao das protenas plasmticas totais utilizando-se o mtodo de biureto, e, para a diferenciao da albumina e das fraes de globulinas, foi aplicada a tcnica da eletroforese. A determinao da quantidade de protenas totais atravs do mtodo de biureto foi realizada por meio do kit protenas totais (Labtest Diagnstica, Lagoa Santa, MG, Brasil), as amostras foram processadas de acordo com as instrues do fabricante. Utilizou-se 1,0mL de reagente biureto e 0,02mL da amostra-plasma. Misturou-se e incubou-se a amostra e o reagente por 10min a 37C e posteriormente foi realizado o ensaio colorimtrico. A eletroforese foi realizada pela tcnica que emprega o gel de agarose como meio suporte. Este gel, aps as aplicaes de 10L das amostras plasmticas, foi embebido em uma soluo tampo de tris veronal (pH 8,6). Em sequncia, aplicou-se uma corrente eltrica de 90V ao meio suporte, por

55 20min, depois de submerso ao tampo. Aps a migrao das protenas atravs da rede do gel, o gel foi secado, corado, escaneado e analisado atravs do software para densitometria (SDS-60). Os valores de protenas plasmticas totais e fraes proticas esto representados na tabela 1. Os valores mdios de protenas plasmticas totais para fmeas adultas encontrados na literatura foram de 4,8g/dL variando de 3,1 a 6,5g/dL e para machos de 4,6g/dL variando de 3,6 a 5,7g/dL (TEARE, 2002). Os resultados encontrados nesse trabalho foram semelhantes, sendo observada tambm a variao existente entre sexos. As protenas observadas foram agrupadas em seis fraes (Figura 1a e 1b) pralbumina, albumina, , 1, 2, . A frao pr-albumina encontrada nos emus foi tambm descrita em emas, cegonhas, galinhas e aves de rapina (MONTESINOS et al., 1997; GARCAMONTIJANO et al., 2002; HASEGAWA et al., 2002; LANZAROT et al., 2005; CONRADO et al., 2007), essa frao tambm isolada em avestruzes, acredita-se estar ligada funo da tireide de aves em crescimento (CHANG et al., 1999) Diferentemente de outros autores (MONTESINOS et al., 1997; GARCAMONTIJANO et al., 2002; POLAT et al., 2004; LANZAROT et al., 2005; CONRADO et al., 2007) que descreveram duas fraes e uma -globulina, nesse trabalho foram encontradas uma frao de -globulina e duas fraes das -globulinas, o mesmo foi descrito por HASEGAWA (2002) em galinhas de postura. Atualmente valores bioqumicos em diferentes espcies de aves tm sido descritos (QUINTAVALLA et al,. 2001; VERSTAPPEN et al., 2002; BOUDA et al., 2004; MIRANDA et al, 2008), mas a determinao do perfil eletrofortico e o fracionamento das globulinas ainda escasso Devido a pouca literatura disponvel, sugere-se que novos perfis eletroforticos de protenas sejam realizados nessa espcie, visto que a determinao da concentrao das protenas plasmticas totais e das principais fraes proticas em animais saudveis, alm da

56 determinao dos valores de referncia, tambm auxiliam o clnico em diagnsticos e no acompanhamento do estado sanitrio das aves mantidas em cativeiro.

AGRADECIMENTO (S) Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), pela Bolsa de Mestrado do autor L. Q. Pereira.

REFERNCIAS

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58 Tabela 6 - Valores da concentrao de protenas plasmticas totais, pr-albumina, albumina, alfa-globulina, beta-globulina, gama-globulina e relao albumina/globulina em emus, fmea (F) e macho (M). Grupo Emu (F) Emu (M) Unidades (g/dL) (%) (g/dL) (%) 4,10 0,81 0,17 PPT 5,30 A/G 0,67 Pr-alb. 0,24 Albumina 2,13 40,2 1,83 44,7 0,91 17,1 0,49 11,9 1 0,28 5,2 0,14 3,4 2 0,92 17,4 0,73 17,8 0.82 15,5 0.71 17,3

59

Legenda Figura 9 Perfil eletrofortico e fraes proteicas pr-albumina, albumina, , 1, 2, no macho (a) e na fmea (b) de emu.

60

6. CONCLUSO

A realizao destes trabalhos nos permitiu traar perfis de protenas plasmticas para grupos de ratitas provenientes de criatrios do Rio Grande do Sul, sendo avestruzes, emas e emus. Nestes perfis, identificou-se os nveis de protenas plasmticas totais (PPT), a relao entre as quantidades de albumina e globulinas (A/G) bem como diferenciar as fraes de globulinas (, , ). Observou-se que, nos grupos amostrados, para as trs espcies, foram encontradas, compondo o grupo das globulinas, as fraes alfa () beta1 (1), beta2 (2) e gama (). Houve algumas diferenas de fraes proticas e valores encontrados neste estudo em comparao com outros autores. Dessa forma, sugere-se que novos perfis eletroforticos de protenas sejam realizados nessas espcies, para aprimorar o conhecimento j existente, visto que a determinao da concentrao das protenas plasmticas totais e das principais fraes proticas em animais saudveis auxiliam muito o clnico em diagnsticos e no acompanhamento do estado sanitrio das aves mantidas em cativeiro.

61

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64

8. APNDICES

65 APNDICE A Eletroforetograma obtido de uma das amostras de plasma de avestruz.

66 APNDICE B Dados dos exames de protenas das avestruzes.

Grupo 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 Animal 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 PPT 2.40 2.20 . 2.40 2.00 2.40 2.20 2.40 1.90 2.50 1.90 2.50 2.60 1.90 2.20 2.70 2.50 3.80 4.00 3.20 3.90 4.70 3.80 3.20 3.90 3.80 4.00 3.80 3.60 4.90 4.00 4.50 4.80 4.50 5.00 4.20 3.80 4.40 4.30 4.30 4.50 5.40 3.30 4.00 4.00 3.60 2.80 2.80 3.80 3.30 A/G 0.78 . . 0.72 0.66 0.72 0.71 1.09 0.70 0.40 0.71 0.64 0.54 0.80 0.74 0.88 0.74 0.86 0.74 0.58 0.59 0.56 0.89 0.66 0.79 0.95 0.83 0.60 0.71 0.73 0.86 0.62 0.97 0.91 0.93 0.80 0.82 0.96 1.05 0.85 0.87 0.95 0.90 1.00 1.06 0.86 0.81 0.82 0.95 1.17 Alb % 43.9 40.4 31.5 42.0 39.7 41.7 41.5 52.2 41.3 28.5 41.4 39.2 35.1 44.3 42.6 46.8 42.5 46.2 42.6 36.6 37.0 35.9 47.2 39.8 44.0 48.7 45.5 37.6 41.4 42.3 46.2 38.3 49.2 47.6 48.1 44.3 45.0 48.9 51.3 45.8 46.5 48.8 47.5 50.1 51.4 46.3 44.6 45.2 48.8 53.9 Alb g/dL 1.05 0.89 0.57 1.01 0.79 1.00 0.91 1.25 0.78 0.71 0.79 0.98 0.91 0.84 0.94 1.26 1.06 1.76 1.70 1.17 1.44 1.69 1.79 1.27 1.72 1.85 1.82 1.43 1.49 2.07 1.85 1.72 2.36 2.14 2.40 1.86 1.71 2.15 2.21 1.97 2.09 2.64 1.57 2.00 2.06 1.67 1.25 1.27 1.85 1.78 Alfa % 2.2 2.3 3.6 9.0 5.0 6.2 9.2 5.3 8.5 6.7 4.0 7.5 9.1 3.3 7.4 6.1 7.9 2.4 4.1 2.1 3.9 3.5 2.0 5.4 1.5 1.3 2.9 5.2 4.2 5.9 5.2 2.8 1.2 4.7 4.1 1.7 3.0 5.5 4.7 2.7 5.1 2.1 3.0 4.1 3.1 2.7 2.1 4.7 2.4 2.0 Alfa g/dL 0.05 0.05 0.06 0.22 0.10 0.15 0.20 0.13 0.16 0.17 0.08 0.19 0.24 0.06 0.16 0.16 0.20 0.09 0.16 0.07 0.15 0.16 0.08 0.17 0.06 0.05 0.12 0.20 0.15 0.29 0.21 0.13 0.06 0.21 0.21 0.07 0.11 0.24 0.20 0.12 0.23 0.11 0.10 0.16 0.12 0.10 0.06 0.13 0.09 0.07 Beta1 % 12.06 15.6 . 18.3 21.0 15.0 18.3 7.8 11.2 12.5 16.9 12.7 9.0 16.7 9.7 13.5 12.5 17.7 12.8 17.6 14.7 19.3 13.8 11.8 13.3 18.5 12.7 14.0 16.9 14.7 10.8 20.0 14.6 12.2 16.6 18.4 17.2 10.2 12.7 20.0 14.6 14.5 11.7 10.9 9.6 12.0 15.9 13.0 16.6 10.7 Beta1 g/dL 0.30 0.34 . 0.44 0.42 0.36 0.40 0.19 0.21 0.31 0.32 0.32 0.23 0.32 0.21 0.36 0.31 0.67 0.51 0.56 0.57 0.91 0.52 0.38 0.52 0.70 0.51 0.53 0.61 0.72 0.43 0.90 0.70 0.55 0.83 0.77 0.65 0.45 0.55 0.86 0.66 0.78 0.39 0.44 0.38 0.43 0.45 0.36 0.63 0.35 Beta 2 % 28.4 26.3 21.7 19.6 23.5 25.0 21.6 26.2 23.9 29.9 23.6 25.6 28.3 20.4 25.3 23.0 28.0 22.8 29.8 32.3 25.0 24.4 28.3 31.7 25.7 19.7 27.0 26.2 19.7 23.2 18.3 25.6 23.0 22.0 21.5 22.8 25.4 24.0 22.2 22.7 21.7 19.5 28.8 22.2 25.3 27.0 26.2 29.5 22.8 28.2 Beta2 g/dL 0.68 0.58 0.98 0.47 0.47 0.60 0.48 0.63 0.45 0.75 0.45 0.64 0.74 0.39 0.56 0.62 0.70 0.87 1.19 1.03 0.98 1.15 1.08 1.01 1.00 0.75 1.08 1.00 0.71 1.14 0.73 1.15 1.10 0.99 1.08 0.96 0.97 1.06 0.95 0.98 0.98 1.05 0.95 0.89 1.01 0.97 0.73 0.83 0.87 0.93 Gama % 11.8 14.3 10.8 10.1 10.5 11.3 8.8 8.5 15.1 22.4 14.1 15.0 18.5 15.3 15.0 10.6 9.1 10.9 10.1 11.4 9.9 12.0 8.7 10.6 15.5 11.8 9.9 10.2 12.0 10.4 15.5 12.1 9.4 11.0 8.2 10.1 8.6 9.1 8.6 8.2 10.8 15.1 9.0 12.7 10.6 12.0 11.2 7.6 9.4 5.2 Gama g/dL 0.28 0.31 0.49 0.24 0.21 0.27 0.19 0.20 0.29 0.56 0.27 0.38 0.48 0.29 0.33 0.29 0.23 0.41 0.40 0.36 0.39 0.56 0.33 0.34 0.60 0.45 0.40 0.39 0.43 0.51 0.62 0.54 0.45 0.50 0.41 0.42 0.33 0.40 0.37 0.35 0.49 0.82 0.30 0.51 0.42 0.43 0.31 0.21 0.36 0.17

67
5 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 3.10 4.80 4.60 4.10 4.60 4.30 3.10 4.50 3.30 5.60 3.70 3.50 4.20 4.40 3.60 4.50 4.30 3.30 5.00 4.60 4.10 3.50 0.85 1.04 0.70 0.70 0.78 1.10 0.72 0.69 0.72 0.38 1.33 0.80 1.07 1.12 1.23 1.21 0.90 0.95 1.11 1.09 0.94 0.76 46.0 51.0 41.2 41.2 43.7 52.3 41.7 40.7 41 27.6 57.0 44.5 51.6 52.9 55.1 54.8 47.4 48.8 52.6 52.1 48.5 43.2 1.43 2.45 1.90 1.69 2.01 2.25 1.29 1.83 1.38 1.55 2.11 1.56 2.17 2.33 1.98 2.47 2.04 1.61 2.63 2.40 1.99 1.51 1.8 2.5 6.4 5.7 3.2 3.3 4.2 4.8 4.6 1.7 3.8 2.6 1.9 2.8 1.3 2.0 4.4 2.9 1.6 2.7 2.5 4.1 0.06 0.12 0.29 0.23 0.15 0.14 0.13 0.22 0.15 0.10 0.14 0.09 0.08 0.12 0.05 0.09 0.19 0.10 0.08 0.12 0.10 0.14 12.6 10.1 15.3 14.9 16.2 10.0 11.9 12.3 13.7 26.0 12.1 10.2 12.3 10.5 14.4 9.6 11.4 11.9 11.0 9.8 9.9 11.1 0.39 0.48 0.70 0.61 0.75 0.43 0.37 0.55 0.45 1.46 0.45 0.36 0.52 0.46 0.52 0.43 0.49 0.39 0.55 0.45 0.41 0.39 29.9 20.8 19.9 24.0 29.0 23.8 25.7 26.5 25.2 29.3 18.5 33.1 23.7 24.9 18.0 26.6 25.8 22.9 27.3 25.1 25.7 23.6 0.93 1.00 0.92 0.98 1.33 1.02 0.80 1.19 0.83 1.64 0.68 1.16 1.00 1.10 0.65 1.20 1.11 0.76 1.36 1.15 1.05 0.83 9.7 15.6 17.2 14.2 7.9 10.6 10.1 9.2 8.8 11.5 7.8 9.6 10.5 8.9 11.2 7.0 11.0 13.5 7.5 10.3 13.4 18.0 0.30 0.75 0.79 0.58 0.36 0.46 0.31 0.41 0.29 0.64 0.29 0.34 0.44 0.39 0.40 0.32 0.47 0.45 0.38 0.47 0.55 0.63

68 APNDICE C Dados dos exames de protenas das emas

Anim al 1 2 3 4 5 6 7 8 9 PPT 5.80 4.90 5.70 5.90 4.20 5.80 4.30 4.90 5.50 A/G 0.96 0.76 1.29 0.72 0.99 0.78 1.32 0.70 1.17 Alb % 49.0 43.3 56.4 41.7 49.8 43.7 56.9 41.3 54.0 Alb g/dL 2.84 2.12 3.21 2.46 2.09 2.53 2.45 2.02 2.97 Alfa % 2.2 4.6 4.1 2.8 3.5 4.3 2.2 2.6 2.7 Alfa g/dL 0.13 0.23 0.23 0.17 0.15 0.25 0.09 0.13 0.15 Beta1 % 15.3 15.7 10.0 15.9 15.3 15.2 13.7 16.2 14.8 Beta1 g/dL 0.89 0.77 0.57 0.94 0.64 0.88 0.59 0.79 0.81 Beta2 % 15.2 14.0 13.0 17.6 13.4 16.9 19.5 25.6 10.3 Beta2 g/dL 0.88 0.69 0.74 1.04 0.56 0.98 0.84 1.25 0.57 Gama % 17.0 20.7 15.1 19.8 16.0 17.8 6.2 12.5 17.9 Gama g/dL 0.99 1.01 0.86 1.17 0.67 1.03 0.27 0.61 0.98