Mdulo Prctico 5

ADQUISICIN DE MULTICELULARIDAD
Da 1: ANLISIS DE ALGUNOS PARMETROS DEL CICLO CELULAR Objetivos:
Reconocimiento al microscopio ptico de clulas en interfase y en las distintas etapas de la mitosis. Estimacin del ndice mittico de una poblacin celular. Estimacin de la duracin de las fases del ciclo celular en base a datos tomados de la literatura, obtenidos mediante la tcnica de autorradiografa.

Introduccin Parte 1)
El ciclo de vida de la clula, visto al microscopio, se divide en dos grandes fases, la interfase y la fase M, etapa de divisin compuesta por la mitosis (divisin nuclear) y la citocinesis (divisin del citoplasma). A su vez, la interfase se subdivide tpicamente en las fases G1, S y G2. La fase S corresponde a la etapa de duplicacin del ADN, la fase G1 es el intervalo entre la salida de la fase M y la entrada en fase S, y la fase G2 es el intervalo entre la fase S y una nueva fase M:

M G2 G1 S

CICLO CELULAR

La duracin de estas fases es variable y depende de distintos factores, en particular la duracin de G1. Al microscopio, las clulas en interfase se reconocen por la presencia de un ncleo que se tie difusamente, sin que sea posible individualizar cromosomas, aunque s puede observarse dentro del ncleo un punto oscuro, el nucleolo. Por otra parte, la mitosis tambin se subdivide en etapas, claramente distinguibles al microscopio: Profase. La cromatina en el ncleo comienza a condensarse en cromosomas bien definidos, visibles al microscopio. Cada cromosoma se ha duplicado y consiste en dos cromtidas hermanas. Cada una de ellas posee una regin especializada, el centrmero, y ambos centrmeros las mantienen apareadas. Hacia el fin de la profase los 54

microtbulos citoplasmticos se desensamblan y comienzan a formar el huso mittico. Prometafase. La prometafase comienza con la desintegracin de la membrana nuclear. Los microtbulos del huso mittico pueden entrar ahora a la regin nuclear. En los centrmeros, comienzan a formarse complejos proteicos denominados cinetocoros. A ellos se adhieren parte de los microtbulos del huso, y permiten que los cromosomas empiecen a moverse. Estos microtbulos reciben el nombre de microtbulos cinetocricos, mientras que los restantes microtbulos del huso mittico se denominan microtbulos polares. Metafase. Los microtbulos cinetocricos desplazan a los cromosomas a lo largo del huso y terminan por alinearlos en la lnea media del huso mittico, la placa metafsica. Esta organizacin ayuda a asegurar que en la prxima fase, cuando los cromosomas se separan, cada nuevo ncleo recibir una copia de cada cromosoma. Anafase. La anafase comienza cuando los cinetocoros en cada cromosoma se separan, permitiendo que las dos cromtidas hermanas se desapareen y se desplacen hacia polos opuestos. A partir de este momento cada cromtida pasa a ser considerada un cromosoma. El movimiento de los cromosomas se divide en dos etapas. Durante la anafase A, los microtbulos cinetocricos se acortan, acercando los cromosomas a los polos del huso mittico. Durante la anafase B, los microtbulos polares se alargan, aumentando la separacin entre los polos. La citocinesis usualmente comienza en esta fase y luego contina durante la telofase. Telofase. Una nueva envoltura nuclear se forma alrededor de cada grupo de cromosomas hijos, que vuelven a descondensarse y ya no son ms visibles al microscopio ptico. En clulas vegetales, se puede observar en esta fase un surco en el espacio entre ambos ncleos hijos. Este surco se denomina placa celular, y es el precursor de la nueva pared celular que va a separar a las clulas hijas. Una poblacin de clulas que se dividen activamente puede dividirse en dos categoras: En una poblacin sincrnica, las clulas van atravesando las distintas etapas del ciclo a la vez, y en particular se dividen al mismo tiempo. Las clulas de los embriones tempranos de la mayora de los animales son un ejemplo de poblacin sincrnica. En una poblacin asincrnica, en cambio, las clulas atraviesan el ciclo desfasadamente, y a cada momento pueden encontrarse clulas en todas las etapas del ciclo celular. El ndice mittico de una poblacin celular es la proporcin de clulas en mitosis que hay en esta poblacin: IM = n de clulas en mitosis / n de clulas totales. En una poblacin asincrnica, el nmero de clulas en mitosis va a depender de la proporcin que ocupe la mitosis dentro de la duracin del ciclo celular. Por ejemplo, si para cierta poblacin celular la mitosis ocupa un 5 % del total del ciclo celular, cabra esperar, por una cuestin de probabilidad, que aproximadamente un 5 % de las clulas estuviera en mitosis en un momento dado. A la inversa, al obtener el ndice mittico de una poblacin celular asincrnica, se obtiene la proporcin que ocupa la mitosis dentro del ciclo celular para esa poblacin. Adems, puesto que en la mayora de las clulas la mitosis dura aproximadamente una hora, 59

conocer el ndice mittico permite calcular la duracin total aproximada del ciclo celular. En el ejemplo anterior, el ciclo celular durara 20 horas (1 hora * 100/5). La poblacin celular que utilizaremos en la parte 1 es un meristemo de raz de cebolla. Un meristemo es un tejido vegetal no diferenciado, en el cual las clulas se dividen activamente para luego diferenciarse, y por lo tanto es ideal para reconocer clulas en interfase y en distintas etapas de la mitosis, as como para calcular el ndice mittico.

Actividad Prctica: Parte 1

Observe al microscopio un preparado de corte longitudinal de raz de cebolla. Seleccione una regin del meristemo y cuente en ella por lo menos 100 clulas totales, clasificndolas en interfsicas y mitticas. Determine los porcentajes de clulas en cada fase.

Parte 2
La autorradiografa es una tcnica que permite localizar en tejidos y clulas un istopo radioactivo, que puede haberse incorporado de diversas maneras. Consiste en cubrir al tejido o clulas que contienen al istopo radioactivo con una delgada capa de emulsin fotogrfica, dejndolo en oscuridad por un cierto tiempo, para que la emulsin quede expuesta a la radiacin emitida por el espcimen. Los sitios en la emulsin que estn exactamente arriba de las zonas que contienen radioactividad van a velarse, y luego del revelado se van a ver al microscopio como granos plateados. En la tabla I se muestran datos obtenidos mediante autorradiografa. Un cultivo de clulas de mamfero en crecimiento rpido fue incubado por 30 minutos con 3 H-timidina. La timidina es la base timina unida a desoxirribosa, y es un precursor del ADN. La 3H-timidina contiene tritio, el istopo radioactivo del hidrgeno. La 3H-timidina va a incorporarse al ADN de las clulas, pero solo al de las clulas que estn en la fase de sntesis de ADN, es decir en la fase S del ciclo celular. Luego de la incubacin, la 3H-timidina fue removida del medio de cultivo y se extrajeron muestras a intervalos regulares de 3 horas, que fueron procesadas para autorradiografa. Posteriormente, las muestras fueron teidas con hematoxilina, para visualizar los ncleos de las clulas que no incorporaron timidina marcada. En cada muestra, se cont el nmero de clulas mitticas, y se las clasific en marcadas y no marcadas, calculndose el porcentaje de mitosis marcadas sobre mitosis totales, tal como aparece en la tabla. Por ltimo, se grafic este porcentaje en funcin del tiempo. Para entender cmo puede obtenerse la duracin de las fases del ciclo celular a partir de este tipo de grfico, consideraremos una situacin simplificada. Un cultivo celular tpico es una poblacin asincrnica, en la que las clulas entran y salen de la fase M a distintos tiempos. Ms an, la duracin de cada fase, en particular G1, va a ser distinta para cada clula. Para hacer ms sencillo el anlisis, consideraremos una poblacin asincrnica, pero en la cual las fases del ciclo celular duran lo mismo para todas las clulas. Tambin asumiremos que la fase M es tan corta comparada con las dems fases que puede tomarse como instantnea. La pregunta a resolver es: qu forma tendra una grfica de mitosis marcadas sobre mitosis totales en funcin del tiempo, 60

en esta situacin? Veamos en primer lugar como se distribuyen las clulas a T = 0, o sea al final del pulso de 3H-timidina:

T=T0

G2

G1 S

A este tiempo, las clulas marcadas estn todas en fase S, porque solo las clulas que sintetizan ADN pueden incorporar 3H-timidina y marcarse. Por lo tanto, a T0 el porcentaje de mitosis marcadas ser igual a 0. Cuando las primeras clulas marcadas lleguen a la fase M, a T = T1, la distribucin ser la siguiente:

T = T1 G2

G1 S

Como las clulas atraviesan el ciclo a la misma velocidad (porque la duracin de cada fase es igual para todas), cuando las clulas marcadas llegan a fase M, las clulas que a T0 estaban en G2 ya pasaron la fase M y ahora estn en G1. Por lo tanto, a T1, en fase M solo hay clulas marcadas, y el porcentaje de mitosis marcadas es 100%. A medida que vayan llegando clulas marcadas a fase M, el porcentaje de mitosis marcadas se mantendr en 100%.

Cuando la ltima clula marcada salga de fase M, a T = T2, el porcentaje de mitosis marcadas volver a caer a 0. Eventualmente, a T = T3, las clulas marcadas volvern a llegar a fase M, repitindose el esquema correspondiente a T1. 61

T = T2
G2 M

G1 S

Por lo tanto, la grfica de mitosis marcadas sobre mitosis totales en funcin del tiempo, para esta situacin, tendr la siguiente forma:

Mitosis marcadas

100%

T0

T1

T2

T3

Tiemp

El 100% de mitosis marcadas se alcanza a T1, cuando las primeras clulas marcadas llegan a fase M. A su vez, las primeras clulas marcadas en llegar a fase M son clulas que a T0 estaban al final de la fase S, y por ende slo les queda recorrer G2 para llegar a fase M (ver esquema a T = T0). Por lo tanto, en este grfico, T1 es igual a G2. El 100% de mitosis marcadas se mantiene hasta que llegan a fase M las ltimas clulas marcadas. Estas son clulas que a T0 estaban al comienzo de S. Por lo tanto, el tiempo que transcurre entre que llegan a fase M las primeras y las ltimas clulas marcadas es igual a la duracin de la fase S. Este tiempo es igual a T2 T1. Por ltimo, el tiempo entre T1 y T3 es igual a la duracin total del ciclo celular. En suma, de esta grfica se obtienen la duracin de G2, de S y del total del ciclo celular. Si conocemos la duracin de la fase M (en general igual a 1 hora), podemos adems obtener la duracin de G1. El anlisis de la grfica obtenida con los datos de la tabla I es muy similar.

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TABLA I Tiempo (horas) % mitosis marcadas tiempo (horas) % mitosis marcadas 3 0 21 19 6 16 24 17 9 69 27 22 12 94 30 45 15 83 33 70 18 47 36 52

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INFORME: Mdulo 5, Da 1.
a) Construya un diagrama de todas las etapas de la mitosis de acuerdo a lo observado por Ud. al microscopio ptico.

b) Calcule: el ndice mittico de la poblacin celular del meristema de raz de cebolla:__________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ c) Complete el siguiente cuadro con los datos que obtuvo

Intefase N clulas Porcentaje

Profase

Metafase

Anafase

Telofase

Total

d) Suponiendo que la mitosis dura 1 hora, indique la duracin total del ciclo, y la duracin de la metafase

_______________________________________________________________________

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Parte 2
a) Construya la grfica del porcentaje de clulas mitticas marcadas (mitticas marcadas/mitosis totales) en funcin del tiempo.

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b) A qu atribuye la ausencia de clulas mitticas marcadas en las primeras 3 horas luego del pulso de 3H-timidina? _______________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ c) Cul es el mximo porcentaje de clulas mitticas marcadas sobre mitticas totales que se alcanza? ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ Por qu no se llega a alcanzar el 100%? Justifique brevemente su respuesta._______________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ d) Si se sabe que M tiene una duracin aproximada de una hora, determinar: tiempo total de ciclo: _____________________________________________________________________ duracin de G1, G2 y S: ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________

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