Purificacin parcial de fosfatasa alcalina de hgado de rata. Precipitacin fraccionada con sulfato de amonio.

Materiales. Hgado de rata Tampn Tris-HCL 0,01M; pH 8,0 --------------------p-Nitrofenil fosfato 0.003M Sulfato de amonio Reactivo de Bradford Metodologa de purificacin. Se entregar un trozo de hgado de rata (anote el peso en gramos) que debe colocar en un mortero. Agregar nitrgeno lquido y proceder a su trituracin. Una vez triturado vierta tampn fro en el mortero. Todos los procedimientos siguientes deben efectuarse en recipientes con hielo. 1. Usted dispone de un volumen de homogenizado de hgado de rata en tampn. 2. El homogenizado se lleva a tubos de centrfuga y se somete a 6.000rpm g por 20 min a 4C.

3. Terminada la centrifugacin descarte el sedimento y mantenga el sobrenadante en un

recipiente con hielo. Este es el homogenizado crudo soluble. 4. Mida el volumen del sobrenadante. Guarde poco ms de 1 ml para medir actividad enzimtica y concentracin de protenas. 5. Agregue al sobrenadante sulfato de amonio, con agitacin constante mientras agrega lentamente la sal. Este procedimiento lleva a 40% el porcentaje de saturacin de sulfato de amonio en la solucin. Calcule la cantidad de sal a agregar a partir de la tabla anexa. 6. Deje reposar por 10 min en un recipiente con hielo. 7. Centrifugue la suspensin a 6.000rpm por 15 min. Separe el sedimento del sobrenadante.

8. Mida el volumen de sobrenadante y disuelva el sedimento en un volumen de tampn

igual al volumen del sobrenadante. Guarde poco ms de 1 ml de sobrenadante (sobrenadante 40% sulfato de amonio) y 1 ml de sedimento disuelto (pp 40% sulfato de amonio), para medir actividad enzimtica y concentracin de protenas. 9. Agregue al sobrenadante sulfato de amonio con agitacin constante mientras agrega lentamente la sal. Este procedimiento lleva a 65% el porcentaje de saturacin de sulfato de amonio en la solucin. Calcule la cantidad de sal a agregar a partir de la tabla anexa.

10. Deje reposar por 10 min en recipiente con hielo. 11. Centrifugue la suspensin a 15.000g por 15 min.

12. Mida el volumen de sobrenadante y disuelva el sedimento en un volumen de tampn

igual al volumen del sobrenadante. Guarde poco ms de 1 ml de sobrenadante (sobrenadante 65% sulfato de amonio) y 1 ml de sedimento disuelto (pp 65% sulfato de amonio), para medir actividad enzimtica y concentracin de protenas. Determinacin de concentracin de protenas. Utilizar el mtodo de Bradford y la curva estndar de protenas obtenida anteriormente o la nueva curva que se har durante el laboratorio. Determinacin de actividad fosfatasa. El ensayo enzimtico utiliza la determinacin del aumento de absorbancia a 410 nm que resulta de la hidrlisis del sustrato p-nitrofenil fosfato a p-nitrofenol. Una unidad de enzima hidroliza un micromol de sustrato/min a 25C, pH 8. Coloque en un tubo de ensayo la siguiente mezcla: 0,003M p-nitrofenil fosfato 1.0 ml 0,1M Tris-HCl pH 8,0 2,0 ml Mezcle bien e incube a 25C en un bao por 5 min. Coloque la mezcla en una cubeta y lea la absorbancia durante 3 min. Esta es la velocidad de reaccin del blanco. Repita el procedimiento anterior y despus de la incubacin a 25C agregue 0,1 ml de enzima de la fraccin correspondiente. Esta es la velocidad de reaccin enzimtica de la fraccin correspondiente. Repita el procedimiento anterior para cada fraccin de purificacin de la enzima. Clculos: A410 / min x 106 M x 0.003L Unidades = --------------------------------------------------- = mol/min 1,62 x 104

D.D.O R.A.A. J.E.F