TEMA 3

El ciclo de Krebs

La reaccin del complejo piruvato deshidrogenasa. El ciclo de Krebs: reacciones y regulacin. Reacciones anaplerticas.

Las clulas aerobias obtienen la mayor parte de su energa de la respiracin, esto es, de la transferencia de electrones desde las molculas combustibles hasta el oxgeno molecular. La respiracin implica la mayora de las reacciones de la ruta glicoltica, hasta el piruvato, pero el proceso oxidativo contina hasta la transformacin en dixido de carbono y agua. En este tema comenzaremos con la descripcin de la reaccin catalizada por la piruvato deshidrogenasa, un complejo enzimtico que transforma el piruvato en acetil-CoA. ste es el compuesto por el que la mayora de los tomos de carbono procedentes del catabolismo de carbohidratos, cidos grasos y aminocidos entran en el ciclo de Krebs. El ciclo tiene como funciones primordiales, el ser la ruta final de la oxidacin de las molculas combustibles y el de proporcionar molculas precursoras para las rutas biosintticas. Cuando acta con este ltimo objetivo, requiere de reacciones denominadas anaplerticas que le proporcionan metabolitos y evitan que deje de funcionar.

LA REACCIN DEL COMPLEJO PIRUVATO DESHIDROGENASA

En el tema anterior hemos estudiado la va glicoltica en que la glucosa se convierte en piruvato. Para que este compuesto sea oxidado completamente a dioxido de carbono y agua en el ciclo de Krebs se requiere: a) Que el piruvato pase al interior de la mitocondria. b) Que se transforme en acetil-CoA.

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Las enzimas del ciclo de Krebs se localizan de forma ordenada en el interior de la mitocondria. La membrana mitocondrial es impermeable a los compuestos fosforilados y al acetilCoA, por lo que el piruvato de la ruta glicoltica, que se origina en el citosol, es transportado, mediante difusin facilitada, al interior de la mitocondria (Fig. 3.1). Posteriormente, el piruvato, a travs de una descarboxilacin oxidativa, se transforma en acetil-CoA, segn la ecuacin global: piruvato + NAD+ + CoA-SH acetil-CoA + + NADH + H+ + CO2 G0 = 8,0 kcal

La oxidacin del piruvato es una reaccin irreversible en la que intervienen tres enzimas y cinco coenzimas.

Figura 3.1. El piruvato procedente de la gliclisis atraviesa la membrana mitocondrial para ser oxidado y descarboxilado a acetil-CoA en la matriz mitocondrial.

La reaccin transcurre con una gran variacin negativa de energa libre estndar, lo que indica que en la clula viva es esencialmente irreversible. La reaccin est catalizada por el

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complejo piruvato deshidrogenasa (PDH) constituido por tres enzimas: piruvato deshidrogenasa, dihidrolipoil transacetilasa y dihidrolipoil deshidrogenasa y cinco coenzimas: pirofosfato de tiamina (TPP), cido lipoico, coenzima A (CoA-SH), nicotinamina adenina dinucletido (NAD+), y flavinadenina dinucletido (FAD+). Este complejo multienzimtico ha sido aislado y purificado de varios organismos. El de la especie humana tiene un peso de 8,5 106 daltons y est constituido por 30 molculas tetramricas de la piruvato deshidrogenasa, que contiene unida una molcula de TPP 60 molculas de dihidrolipoil transaceti, lasa cada una con una molcula de cido lipoico y seis de dihidrolipoil deshidrogenasa, cada una de las cuales se encuentra unida a una molcula de FAD+. El proceso enzimtico se esquematiza en la figura 3.2. Se ha postulado que la cadena lateral del cido lipoico (lipoil-lisina) acta como un brazo oscilante para transferir grupos acetilo y tomos de hidrogeno (o los electrones equivalentes), desde una enzima a la siguiente dentro del complejo enzimtico.

Figura 3.2. Descarboxilacin oxidativa del piruvato a acetil-CoA por el complejo piruvato deshidrogenasa. Las sustancias que entran y salen del complejo aparecen enmarcadas. Las enzimas que intervienen son: E1 = piruvato deshidrogenasa, E2 = dihidrolipiol transacetilasa, E3 = Dihidrolipoil deshidrogenasa.

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La reaccin catalizada por el complejo piruvato deshidrogenasa se encuentra en una posicin clave del metabolismo, no slo porque sirve de conexin entre la ruta glicoltica y el ciclo de Krebs sino porque el piruvato y el acetil-CoA son componentes de varias rutas biosintticas y degradativas (Fig. 3.3). As, el piruvato, adems de ser el producto final de la ruta glicoltica, se forma en el catabolismo de aminocidos, en la oxidacin del lactato, y es un precursor de la sntesis de aminocidos, de la glucosa y del lactato. El acetil-CoA se forma en la degradacin de los cidos grasos y de aminocidos y es un precursor de la sntesis de cidos grasos, cuerpos cetnicos, colesterol y otros lpidos de gran importancia biolgica.

Figura 3.3. La reaccin catalizada por el complejo PDH se encuentra en una posicin clave del metabolismo. El piruvato y el acetil-CoA son productos finales de varias rutas catablicas y precursores de otras anablicas.

Figura 3.4. El complejo PDH est regulado de manera rpida por NADH y acetil-CoA que lo hacen como efectores negativos.

No es de extraar que, dada la posicin tan estratgica del complejo piruvato deshidrogenasa en el metabolismo, su actividad se encuentre regulada con precisin. Exiten dos niveles de regulacin sobre el complejo: uno rpido, en el que los productos de la reaccin (acetil-CoA y NADH) actan de inhibidores (Fig. 3.4) y otro lento mediante modificacin covalente y en el que participan dos enzimas ms: la PDH quinasa y la PDH fosfatasa (Fig. 3.5). Estas enzimas, que tambin constituyen parte integral del complejo PDH, regulan la actividad del mismo a travs de un mecanismo de fosforilacin y desfosforilacin. Va-

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Figura 3.5. El complejo PDH est regulado de manera lenta por un sistema de fosforilacin/desfosforilacin en el que intervienen la PDH-quinasa y la PDHfosfatasa.

lores elevados de las proporciones NADH/NAD, acetil-CoA/ CoA-SH y/o ATP/ADP actan como efectores positivos de la PDH quinasa, favoreciendo la formacin de la PDH activa, no fosforilada, en PDH fosforilada, poco activa. El resultado neto de este proceso es el descenso del ritmo en la transformacin piruvato-acetil-CoA.

EL CICLO DE KREBS: REACCIONES Y REGULACIN

El ciclo del cido ctrico, de los cidos tricarboxlicos, del cido tricarboxlico o, simplemente, de Krebs, en honor de su descubridor Hans Krebs, fue la consecuencia de propuestas, experimentos y deducciones brillantes que han marcado un hito en la historia y el desarrollo de la Bioqumica. Krebs bas sus estudios en los realizados previamente por Thumberg, Szent Gyorgyi, Martius, Knoop y Ochoa y sus primeros resultados los public en 1937 en las revistas Enzymologia y Lanzet. El carcter cclico se debe a que, despus de una serie de reacciones, se regenera el compuesto de partida, el oxalacetato. En cada vuelta del ciclo de Krebs una molcula de acetilo (del acetil-CoA) de dos tomos de carbono se condensa con una molcula de cido oxalactico de cuatro tomos de carbono para formar cido ctrico, un compuesto de seis tomos de carbono. Este ltimo se oxida mediante una secuencia de reacciones, de tal modo que se liberan dos molculas de CO2 y se regenera una molcula de cido oxalacetato. Este compuesto puede combinarse con otra molcula de acetilo, iniciando el ciclo otra vuelta. En cada vuelta se incorpora una molcula de
El ciclo de Krebs es la ruta de oxidacin de todos los combustibles metablicos en condiciones aerbicas.

38 En el ciclo entran dos tomos de carbono con el acetil-CoA y se pierden dos en las reacciones 4 y 5 .

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acetilo y se eliminan dos de CO2. Cuando el ciclo est funcionando con fines energticos, una molcula de cido oxalactico sera suficiente para lograr la oxidacin de un nmero infinito de molculas de acetilo. En estas condiciones, por cada vuelta se liberan cuatro pares de hidrgeno (o sus electrones equivalentes), los cuales pasarn al oxgeno molecular para obtener energa en forma de ATP . El conjunto de reacciones del ciclo se muestra en la figura 3.6. Del funcionamiento del ciclo de Krebs se puede destacar los siguientes hechos: 1. La primera reaccin del ciclo es la condensacin de una molcula de acetil-CoA con otra de cido oxalactico por la accin cataltica de la citrato sintasa. La reaccin

Figura 3.6. Reacciones del ciclo de Krebs. Los nmeros corresponden a las siguientas enzimas: (1) Citrato sintasa. (2) Aconitasa. (3) Aconitasa. (4) Isocitrato deshidrogenasa. (5) Complejo -cetoglutarato deshidrogenasa. (6) -cetoglutarato deshidrogenasa. (7) Succinil CoA sintetasa. (8) Succinato deshidrogenasa. (9) Fumarasa. (10) Malato deshidrogenasa. Los tomos de carbono del acetil-CoA aparecen en color naranja para que pueda observarse que despus de las dos descarboxilaciones permanecen integrados en la molcula de succinato.

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2.

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4. 5. 6.

es irreversible porque la hidrlisis del enlace tioster del acetil-CoA implica la liberacin de una gran cantidad de energa (G0 = 7,5 kcal) (Fig. 3.6). Hay cuatro reacciones catalizadas por deshidrogenasas que reducen tres molculas de NAD+ y una de FAD+: isocitrato deshidrogenasa, complejo -cetoglutarato deshidrogenasa, succinato deshidrogenasa y malato deshidrogenasa. En las dos primeras tambin se producen descarboxilaciones. El complejo -cetoglutarato deshidrogenasa que cataliza la transfomacin del -cetoglutarato en succinil-CoA tiene una estructura similar al de la piruvato deshidrogenasa; como ste, est constituido por tres enzimas y las mismas coenzimas: TTP cido lipoico, CoA-SH, , FAD y NAD. La reaccin catalizada por la succinil-CoA genera un enlace fosfato de alta energa en forma de GTP (equivalente a ATP). Los tomos de carbono que se liberan en forma de CO2 por cada vuelta del ciclo no son los mismos que los captados como acetilos. Algunas sustancias inhiben el funcionamiento del ciclo de Krebs, generalmente porque compiten con los sustratos por las enzimas del ciclo. As, el malonato inhibe la succinato deshidrogenasa y el fluoracitrato la aconitasa. Las sales de arsnico inhiben el complejo -cetoglutarato deshidrogenasa.

La reaccin neta del ciclo es: acetil-CoA + 3 NAD+ + FAD+ + GDP + Pi + H2O 2CO2 + 3 NADH + FADH2 + GTP + 2H+ + CoA-SH Las tres molculas de NADH y la de FADH2 se oxidan en la cadena de transporte electrnico, como hemos visto en el tema 28 de Fundamentos de Bioqumica Estructural. El oxgeno molecular no participa directamente en el ciclo de Krebs, pero ste slo funciona en condiciones aerbicas porque el NADH y el FADH2 nicamente transfieren sus electrones al oxgeno molecular en la cadena respiratoria (Fig. 3.7). El ciclo est regulado por la accin de enzimas alostricas que responden a las concentraciones de metabolitos celulares y que son limitantes en la velocidad metablica del ciclo. En terminos estrictos, el complejo PDH no forma parte del ciclo, pero su regulacin potencia la sensibilidad del sistema de regulacin del ciclo al controlar la cantidad de acetil-CoA que se incorpora al mismo. En el ciclo existen tres reacciones que se pueden
Cada vuelta del ciclo de Krebs genera un fosfato de alta energa por una fosforilacin a nivel de sustrato, 3 del NADH y 1 del FADH2. Estos ltimos se reoxidarn en la cadena respiratoria.

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considerar claves en la regulacin y que son catalizadas por las siguientes enzimas (Fig. 3.8): Citrato sintasa. Cuando aumentan los niveles de NADH y/o ATP por encima de lo normal, actan disminuyendo la actividad de la enzima y, por tanto, la formacin de citrato. Isocitrato deshidrogenasa. Esta enzima alostrica es, como la anterior, inhibida por el NADH y ATP y estimulada por NAD+, ADP y Ca2+. -Cetoglutarato deshidrogenasa. Este complejo enzimtico, como se ha indicado, es anlogo en su estructura al del piruvato deshidrogenasa. Como este, es inhibido por los productos finales de la reaccin que cataliza, que en el caso del complejo -cetoglutarato deshidrogenasa, son: el succinilCoA y el NADH. Se puede subrayar que la velocidad metablica del ciclo est regulada de forma general por el producto final de las reacciones de obtencin de energa de la respiracin, el ATP y el producto , final de las etapas de deshidrogenacin del ciclo, el NADH.

REACCIONES ANAPLERTICAS
Figura 3.7. El ciclo de Krebs y la cadena respiratoria estn acoplados por los electrones que fluyen desde los intermediarios del ciclo a travs de la cadena al oxgeno molecular. El ciclo de Krebs se controla fundamentalmente por tres reacciones y por las concentraciones intramitocondriales de NAD+ y NADH.

Aunque el ciclo de Krebs es la va degradativa ms importante para generar ATP el ciclo es esencial para la biosn, tesis de compuestos celulares. As, muchos aminocidos derivan del -cetoglutarato y del oxalacetato, y la mayora de los tomos de carbono de las porfirinas proceden del succinil-CoA. Cuando esos metabolitos son extrados del ciclo de Krebs, ste deja de funcionar, puesto que se interrumpe la formacin de oxalacetato.

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Figura 3.8. Regulacin del flujo metablico a travs del ciclo de Krebs. Las tres enzimas alostricas estn controladas por los niveles de varios efectores positivos y negativos.

Para que el ciclo siga actuando a un ritmo normal, existen reacciones denominadas anaplerticas (de relleno) que reestablecen los niveles de los intermediarios del ciclo. La ms importante es la carboxilacin del cido piruvico para formar cido oxalactico; catalizada por la piruvato carboxilasa
carboxilasa piruvato + CO2 + ATP oxalacetato + ADP + Pi G0 = 0,5 kcal piruvato

La piruvato carboxilasa, que se encuentra en el hgado y rin, es una enzima alostrica de peso molecular elevado (alrededor de 650.000 daltons) y un elevado nmero de subunidades proteicas. Su modulador positivo es el acetil-CoA (Fig. 3.9). Cuando esta sustancia alcanza un nivel por encima de lo normal, activa la reaccin favoreciendo la formacin de oxalacetatato, el cual se condensa con el acetil-CoA acumulado para formar citrato y de esta forma permitir que el ciclo siga funcionando. En el corazn y en el tejido muscular acta principalmente la enzima mlica (malato deshidrogenasa dependiente de NADP+) y que cataliza la reaccin: piruvato + CO2 + NADPH + H+ L-malato + NADP+
enzima malica

Los intermediarios del ciclo de Krebs que se utilizan en otras rutas biosintticas deben reponerse para que el flujo metablico a travs del ciclo no se detenga.

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Figura 3.9. La reaccin anaplertica catalizada por la piruvato carboxilasa permite la reposicin de intermediarios del ciclo de Krebs para que ste contine funcionando. En condiciones biosintticas, al aumentar el nivel de acetilCoA, este compuesto acta como un efector positivo de la piruvato

De estas dos reacciones anaplerticas, la que tiene ms importancia cuantitativamente es la catalizada por la piruvato deshidrogenasa, cuya actividad aumenta con el ejercicio, el ayuno y la diabetes. Curiosamente la actividad de la enzima mlica se encuentra disminuida en diabetes y aumentada tras la administracin de insulina.

RESUMEN
La reaccin catalizada por el complejo piruvato deshidrogenasa conecta las rutas glicoltica y el ciclo de Krebs, ya que transforma el cido pirvico en acetil-Co. El complejo est formado por tres enzimas y cinco coenzimas, y est regulado por modificacin covalente. El ciclo cumple con dos funciones importantes: 1) Es la ruta degradativa final para la oxidacin de molculas combustibles.

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2) Es fuente de molculas precursoras para las rutas biosintticas. El ciclo est constituido por una serie de reacciones que comienzan con la condensacin del grupo acetilo del acetil-CoA con el cido oxalactico, de cuatro tomos de carbono, para formar cido ctrico de seis tomos de carbono. En cada vuelta del ciclo, despus de una secuencia de reacciones que generan nuevamente cido oxalacetato, se liberan dos tomos de carbono en forma de CO2 y se originan tres molculas de NADH, una de FADH2 y otra de GTP El ritmo del ciclo est controlado, principalmente, por . ATP y NADH, que actan como moduladores negativos sobre tres enzimas alostricas: citrato sintasa, isocitrato deshidrogenasa y -cetoglutarato deshidrogenasa. Cuando el ciclo funciona con fines biosintticos, la reposicin de los intermediarios se realiza mediante reacciones anaplerticas. Las ms importantes son las catalizadas por la piruvato carboxilasa y la enzima mlica.

APLICACIONES CLNICAS
Los casos clnicos derivados de una disfuncin del complejo piruvato deshidrogenasa, ciclo de Krebs y de las reacciones anaplerticas son consecuencia de una insuficiente actividad enzimtica debido a una deficiencia en una coenzima o a un defecto estructural de la protena. Entre los primeros, el caso ms conocido es el de la deficiencia en vitamina B1, y entre los segundos, la reducida actividad de las enzimas del complejo piruvato deshidrogenasa, de la fumarasa y de la citrato sintasa.

Deficiencia vitamnica B1
La deficiencia vitamnica B1 ocasiona una enfermedad neurolgica y cardiovascular descrita en 1630 por J. Bonitus que la denomin beriberi (cordero), porque las personas que padecian esa enfermedad andaban como los corderos. El problema contina siendo grave en el Extremo Oriente, donde el arroz que es el alimento bsico, contiene niveles muy bajos de tiamina y practicamente nulos cuando el arroz se descascarilla. Los pacientes con esta enfermedad suelen tener niveles altos de piruvato, lactato y alanina en sangre, y baja actividad de los complejos piruvato deshidrogenasa y de -cetoglutarato deshidrogenasa.

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Los sntomas de esta enfermedad se originan como consecuencia de una hipoavitaminosis B1 o tiamina. La tiamina en el organismo se fosforila a pirofosfato de tiamina (TPP), que es una de las coenzimas del complejo piruvato deshidrogenasa, y del -cetoglutarato deshidrogenasa, por eso las actividades de estas enzimas en sangre estn disminuidas en el beriberi. Una terapia lgica es una dieta baja en carbohidratos y la administracin de tiamina. La administracin de TPP no es ms eficaz que la de la tiamina, dado que la coenzima, al ser un compuesto fosforilado, no atraviesa las membranas. En ocasiones la terapia no es tan sencilla ya que la baja actividad del PDH puede tener un origen gentico. Una deficiencia en piruvato carboxilasa produce tambien un aumento de piruvato y alanina en sangre, ya que el piruvato no puede convertirse en oxalacetato, que es el aceptor de grupos acetilo en el ciclo de Krebs.

Deficiencia en la actividad fumarasa

Las deficiencias en la actividad fumarasa del tejido cerebral y del musculo esqueletico ocasionan miopatia mitocondrial. Los pacientes con encefalomiopata mitocondrial mueren a los pocos meses de edad. Presentan cantidades anormalmente altas de fumarato en sangre. Las mitocondrias de msculo esqueltico y de hgado, obtenidas mediante biopsias, muestran una actividad en fumarasa prcticante nula. Sin embargo, mientras las primeras oxidan lentamente el glutamato y el succinato, las de hgado oxidan ambos sustratos a velocidad normal. La administracin de sustratos gluconeognicos, como el lactato o la alanina, alivian los efectos de la enfermedad.