Medios de cultivo para el crecimiento de bacterias

2000 Kenneth Todar, University os Wisconins-Madison Medios de cultivo para el crecimiento de bacterias Para cada bacteria a ser cultivada para cualquier propsito es necesario proveer el ambiente bioqumico y biofsico apropiado. El ambiente bioqumico (nutricional) se hace disponible como medio de cultivo, y dependiendo de las necesidades especiales de cada bacteria particular se ha desarrollado una gran variedad y tipos de medios de cultivo con diferentes propsitos y utilizaciones. Los medios de cultivo son empleados para el aislamiento y mantenimiento de cultivos puros de bacterias y tambin son utilizados para la identificacin de bacterias de acuerdo a sus propiedades bioqumicas y fisiolgicas. El modo en que las bacterias son cultivadas, y el propsito de los medios de cultivo, varan ampliamente. Los medios lquidos son utilizados para el crecimiento de lotes de cultivos puros mientras que los medios slidos son ampliamente utilizados para el aislamiento de cultivos puros, para la estimacin de poblaciones de bacterias viables, y una variedad de otros propsitos. El agar, agente glido ms utilizado para medios slidos o semislidos, es un hidrocoloide derivado de las algas rojas. El agar es utilizado por sus propiedades fsicas nicas (se funde a 100 grados y permanece lquido hasta enfriarse a 40 grados, la temperatura a la que se vuelve gel) y porque no puede ser metabolizado por la mayora de las bacterias. Por lo tanto, como un componente del medio es relativamente inerte, simplemente mantiene (geliza) los nutrientes que se encuentran en la solucin acuosa. Los medios de cultivo pueden ser clasificados en varias categoras dependiendo de su composicin o uso. Un medio qumicamente definido (sinttico) (Tabla 4 y 4b) es un medio en el que se conoce la exacta composicin qumica. Un medio complejo (indefinido) (Tabla 5 y 5b) es un medio en el que no se conoce la composicin qumica exacta. Los medios definidos estn habitualmente compuestos por bioqumicos puros sacados del stock; los medios complejos habitualmente contienen materiales complejos de origen biolgico tales como la sangre, la leche, el extracto de levadura o el extracto de carne, cuya composicin qumica exacta es obviamente indeterminada. Un medio definido es un medio mnimo (Tabla 4) si provee slo los nutrientes exactos (incluyendo algunos factores de crecimiento) necesarios para el crecimiento del organismo. La utilizacin de medios mnimos definidos requiere que el investigador conozca los requerimientos nutricionales exactos de los organismos en cuestin. Los medios definidos qumicamente son de valor para el estudio de los requerimientos nutricionales mnimos de los microorganismos, para cultivos enriquecidos, y para una amplia variedad de estudios fisiolgicos. Los medios complejos habitualmente proveen la gama completa de factores de crecimiento que pueden ser requeridos por un organismo por lo que pueden ser utilizados ms prcticamente para cultivar bacterias desconocidas o bacterias cuyos requerimientos nutricionales son complejos (por ejemplo, organismos que requieren muchos factores de crecimiento). Otros conceptos empleados en la construccin de medios de cultivo son los principios de seleccin y enriquecimiento. Un medio selectivo es aquel que tiene agregados componentes que inhibirn o prevendrn el crecimiento de ciertos tipos o especies de bacterias y/o promovern el crecimiento de las especies deseadas. Uno puede

tambin ajustar las condiciones fsicas del medio de cultivo, como el pH y temperatura, para hacerlo selectivo para organismos capaces de crecer bajo esas condiciones. Un medio de cultivo puede tambin ser un medio diferencial si permite al investigador distinguir entre diferentes tipos de bacterias basado en algn rasgo observable de su pauta de crecimiento en el medio. As, un medio selectivo, diferencial para el aislamiento de Staphylococcus aureus, el patgeno bacteriano ms comn en los humanos, contiene una concentracin muy alta de sal (que el estafilococo tolerar) que inhibe a la mayora de las otras bacterias, mannitol como fuente de azcar fermentativo, y un tinte de indicador de pH. De los especimenes clnicos, slo el estafilococo crecer. S. aureus es diferenciado de S. epidermidis (un componente no patgeno de la flora normal) por su capacidad de fermentar el mannitol. Las colonias fermentadoras de mannitol (S. aureus) producen cidos que reaccionan con el tinte indicador formando un halo coloreado alrededor de las colonias; las no fermentadoras del mannitol (S. epidermidis) utilizan otros sustratos no fermentadores en el medio para el crecimiento y no forman un halo alrededor de sus colonias. Un medio enriquecido emplea un giro algo diferente. Un medio enriquecido (Tabla 5a y 5b) contiene algunos componentes que permiten el crecimiento de tipos o especies especficas de bacterias, habitualmente porque ellas solas pueden utilizar el componente de su ambiente. Sin embargo, un medio enriquecido puede tener caractersticas selectivas. Un medio enriquecido para bacterias no simbiticas fijadoras de nitrgeno omite la fuente de nitrgeno agregado al medio. El medio es inoculado con una fuente potencial de esta bacteria (por ejemplo, una muestra de suelo) e incubado en la atmsfera en donde la nica fuente de nitrgeno disponible es es N2. Un medio selectivo enriquecido (Tabla 5b) para el crecimiento de la haloflica extrema (Halococcus) contiene cerca de un 25% de sal [NaCl], que es requerido por la haloflica extrema y que inhibe el crecimiento de otros procariotes. Tabla 4a. Medio mnimo para el crecimiento de Bacillus megaterium. Un ejemplo de medio qumicamente definido para el crecimiento de bacterias heterotrficas. Componente Cantidad Funcin del componente sucrose 10.0 g C y fuente de energa K2HPO4 2.5 g buffer pH; fuente de P y K KH2PO4 2.5 g buffer pH; fuente de P y K (NH4)2HPO4 1.0 g buffer pH; fuente de N y P MgSO4 7H2O 0.20 g fuente de S y Mg++ FeSO4 7H2O 0.01 g fuente de Fe++ MnSO4 H2O 0.007 g fuente de Mn++ agua 985 ml pH 7.0

Tabla 4b. Medio definido (tambin medio enriquecido) para el crecimiento de Thiobacillus thiooxidans, una bacteria litoautotrfica. Componente Cantidad Funcin del componente NH4Cl 0.52 g fuente de N KH2PO4 0.28 g fuente de P y K MgSO4 7H2O 0.25 g fuente de S y Mg++ CaCl2 2H2O 0.07 g fuente de Ca++ Azufre elemental 1.56 g fuente de energa C02 5%* fuente de C agua 1000 ml

pH 3.0 * Aerear el medio en forma intermitente con aire conteniendo 5% de CO2. Tabla 5a. Medio complejo para el crecimiento de bacterias fastidiosas. Componente Cantidad Funcin del componente Fuente de vitaminas y otros factores Extracto de carne 1.5 g de crecimiento Fuente de vitaminas y otros factores Extracto de levadura 3.0 g de crecimiento Peptona 6.0 g Fuente de aminocidos, N, S, y P Glucosa 1.0 g C y fuente de energa Agar 15.0 g Agente inerte solidificante agua 1000 ml pH 6.6 Tabla 5b. Medio selectivo enriquecido para el crecimiento de haloflicas extremas. Componente Cantidad Funcin del componente Acidos Casamino 7.5 g Fuente de aminocidos, N, S y P Extracto de 10.0 g Fuente de factores de crecimiento levadura Citrato trisdico 3.0 g C y fuente de energa KCl 2.0 g fuente de K+ MgSO4 7 H2O 20.0 g fuente S y Mg++ FeCl2 0.023 g fuente Fe++ fuente de Na+ para haloflicas e NaCl 250 g inhibidor para no haloflicas agua 1000 ml pH 7.4

Medios de cultivo RESUMEN Esta prctica consiste en elaborar distintos medios de cultivo, el Mc Conkey, el Kliger, el Mueller-Hinton, el agar nutritivo y el caldo nutritivo. Despus sembraremos en cada medio varios microorganismos y lo dejaremos incubar para observar si existe crecimiento o no. INTRODUCCIN Sobre cada medio sabemos que:

Mc Conkey > se elabora en placa, se han de hacer 10 placas, un total de 250 ml. Es un medio selectivo y diferencial. Es selectivo porque tiene mucha concentracin de sales biliares que solo permiten que crezcan las enterobactericeas (bacterias acostumbradas a vivir en el intestino). Es diferencial porque aquellas enterobactericeas que fermenten la lactosa formarn colonias de color rosa. Las que no fermentan la lactosa sern colonias incoloras.

Kliger > se elabora en tubo, se han de preparar 10 tubos, un total de 100 ml. Es un medio diferencial. Para sembrar primero se hace una picadura (clavando el asa de siembra en el interior del tubo) y otra siembra en la superficie. Este medio tiene poca glucosa y mucha lactosa. Si una bacteria solo puede fermentar glucosa (no la lactosa) solo hay cambio de color en medio del tubo, se vuelve amarillo. Si

fermentan la lactosa o la lactosa y la glucosa, el viraje se produce tanto en la superficie como en el interior, que tambin se vuelven de color amarillo. Tambin detecta si la bacteria fabrica cido sulfhidrico (SH2), en ese caso de produce un precipitado negro.

Mueller-Hinton > se elabora en placa, se han de preparar 10 placas, un

total de 250 ml. Se usa para antibiograma porque es un medio donde los antimicrobianos difunden muy bien.

Agar nutritivo > se elabora en placa, necesitaremos 20 placas, un total

de 500 ml. Es el medio mnimo que necesitan para crecer, excepto los anaerobios estrictos.

Caldo nutritivo > se elabora en tubo, se han de preparar 5 tubos, un total

de 50 ml. Es lo mismo que el anterior pero le falta el agar, es un medio liquido, no est solidificado. MATERIAL Y MTODOS Material:

-placas de petri -tubos -polvos de los medios de cultivo -balanza -incubadora -gradilla -asas de siembra -fuego -matraz erlenmeyer -pipetas -autoclave

Mtodo: Esta prctica la hemos dividido en diferentes partes, porque hacerlo todo en un mismo da era imposible. Primero hemos mirado la composicin de los medios de cultivo y el proceso para elaborarlos: -Mc Conkey > su composicin s: peptonas (20gr/l), lactosa (10gr/l), sales biliares (5gr/l), cloruro sdico (5gr/l) y rojo neutro (0.075gr/l). Para elaborarlo primero disolvemos 40gr de polvo en 1l de agua destilada calentando si es preciso. Distribuimos en tubos con campana de Durham y esterilizar al autoclave durante 15 minutos a 121C. Luego le aadiremos 15gr de agar para hacerlo solidificar.

-Kliger > su composicin s: extracto de carne (3gr/l), extracto de levadura (3gr/l), peptonas (20gr/l), lactosa (10 gr/l), destrosa (1gr/l), cloruro sdico (5gr/l), citrato amonico y Fe2+ (0.50gr/l), rojo fenol (0.03gr/l) y agar (15gr/l). Para elaborarlo primero suspendemos 58gr del polvo en 1l de agua destilada y lo llevamos a ebullicin. Lo distribuimos en los 10 tubos y los esterilizamos al autoclave durante 15 minutos a 121C. Luego lo dejamos enfriar en cua. -Mueller-Hinton > su composicin s: peptonas (17.5gr/l), extracto de vaca (4gr/l), almidn (1.5gr/l), agar (15gr/l). Para elaborarlo primero aadimos 38gr de polvo en 1l de agua destilada. Luego calentamos hasta que se diluya totalmente. Esterilizamos al autoclave durante 15 minutos a 121C. -Agar nutritivo > su composicin s: extracto de carne (1gr/l), extracto de levadura (2gr/l), peptonas (5gr/l), cloruro sdico (5gr/l) y agar (15gr/l). Para elaborarlo primero suspendemos 28gr de polvo en 1l de agua destilada y lo llevamos a ebullicin. Luego esterilizamos al autoclave durante 15minutos a 121C. -Caldo nutritivo > su composicin s: extracto de carne (1gr/l), extracto de levadura (2gr/l), peptonas (5gr/l) y cloruro sdico (5gr/l). Para elaborarlo disolvemos 13 gr de polvo en 1l de agua destilada, calentando si es preciso. Luego lo distribuimos en los recipientes y esterilizamos durante 15 minutos a 121C. Para averiguar cuantos gramos de cada polvo del medio necesitbamos hemos tenido que hacer unos clculos que sn: -Mc Conkey > 250ml x 40gr/1000ml =10gr de polvo del medio Mc Conkey + 250ml de agua destilada. -Kliger > 100ml x 58gr/1000ml = 5.8gr del polvo del medio Kliger + 100ml de agua destilada. -Mueller-Hinton > 250ml x 38gr/1000ml = 9.5gr de polvo del medio Mueller-Hinton + 250ml de agua destilada. -Agar nutritivo > 500ml x 28gr/1000ml = 14gr de polvo del medio Agar nutritivo + 500ml de agua destilada. -Caldo nutritivo > 50ml x 13gr/1000ml = 0.65gr de polvo del medio de Caldo nutritivo + 50ml de agua destilada. Al da siguiente que hemos continuado con la prctica:

Antes de disolver los medios hemos calentado el agua, y luego los hemos disuelto poco a poco. Una vez disueltos se tienen que verter en un matraz Erlenmeyer que sea del doble de capacidad. Luego lo tapamos con papel de aluminio, y le pondremos la tira del autoclave (es como un esparadrapo que al llegar a 121C cambia de color) y lo pondremos en el autoclave. Lo dejaremos en el autoclave entre 1 hora y media y 2 horas. Hemos de tener cuidado porque cuando lo saquemos del autoclave an estar caliente. Cuando la temperatura empiece a bajar de 45C se empezar a solidificar, por eso lo tenemos que poner en las placas de petri o en los tubos antes de que se enfrie. Una vez en las placas y tubos lo dejamos enfriar.
Al da siguiente que hemos retomado la prctica, nos hemos repartido las placas y tubos con medios entre los grupos. Y hemos empezado a sembrar. Cada grupo ha de tener y sembrar:

2 placas Mc Conkey donde sembrar en una E.coli y en la otra micrococcus. 2 tubos de Kliger donde en uno sembrar E.coli y en el otro micrococcus.

Al sembrar lo haremos por estria por agotamiento horizontal. Haremos 2 tipos de siembra en cada tubo: -por picadura -por estria por agotamiento horizontal

2 placas Mueller-Hinton donde sembrar en uno E.coli y en el otro micrococcus.

Con este medio haremos el antibiograma. Tenemos que tener bacterias por toda la superficie del medio, por eso pipetearemos 0.7ml del cultivo y lo pondremos encima de la placa. Y con el asa de siembra triangular lo repartiremos bien por todo el medio.

4 placas Agar nutritivo donde en una sembrar E.coli, en la otra micrococcus, en otra toseremos y en la otra pondremos las huellas de nuestros dedos. En algunas placas tambin han sembrado yogur de fresa y yogur de melocotn. Sembraremos por estria escocesa, para intentar separar al mximo las bacterias. Se van haciendo lneas rectas con el asa de siembra en los lados de la placa de petri, formado un cuadrado.

1 tubo de caldo nutritivo donde sembraremos el bacillus cereus.

Para sembrar tomamos la muestra del bacilo y lo resuspendemos en el caldo nutritivo. Una vez tenemos las bacterias sembradas en todos los medios, lo dejamos incubando todo 24 horas a 37C. RESULTADOS Al da siguiente hemos sacado los medios de la incubadora para observar su crecimiento:

Mc Conkey > E.coli si que ha crecido y se observa que es capaz de fermentar la lactosa y en micrococcus no se ve creciemiento. Kliger > E.coli si que ha crecido, lo sabemos porqu se ha roto el agar debido al CO2 que necesitaba salir. Tambin vemos un cambio de color de rojo a naranja, esto indica que la bacteria fermenta la glucosa y la lactosa.

Mueller-Hinton >E.coli vemos que es muy sensible a la gentomicina, que es sensible intermediamente a la amoxicilina y que es resistente a la penicilina. En la placa de micrococcus no se ve nada, lo miraremos otro da.

Agar nutritivo > E.coli si que se ve crecimiento y micrococcus tambin.9

Caldo nutritivo > si que hay crecimiento, aparece un precipitado blanco en el fondo del tubo. Pasado 24 horas hemos vuelto a observar los medios:

Mc Conkey > E. coli si que hay crecimiento, micrococcus no. Kliger > E.coli si que hay crecimiento y micrococcus tambin.

Mueller-Hinton > E. Coli no ha variado desde el da anterior y en micrococcus no ha habido crecimiento Caldo nutritivo > Bacillus si que ha crecido. Agar nutritivo > E.coli si que ha crecido y micrococcus tambin. En las placas que hemos sembrado yogur ha habido crecimiento en las dos. En las placas que hemos puesto las huellas de los dedos tambin ha habido crecimiento de la flora propia del cuerpo y en las placas que hemos tosido tambin ha habido crecimiento, se pueden observar placas blancas.