Captulo III

Teora Celular
Resumen
Desde que Robert Hooke observ en su microscopio la clula, se inici la revolucin cientfica rigurosa de investigaciones al subuniverso celular, en los campos de los mecanismos de ciclo celular, desarrollo, transcripcin de ADN y su control de reparacin, sus mecanismos de secuenciacin y redundancias, hasta la mitosis y su maquinaria citoesqueltica. Las enfermedades adquieren un matiz de inestabilidad sistmica dentro del ciclo celular y sus posibles soluciones parecen ms arquitecturas de circuitos bioqumicos y genmicos.

3.1. Intro oduccin a la clula

ue h iene ms de 75 billones de clulas, en la mayora d las formas de 7 e de Aunqu el cuerpo humano conti vida, la clula re ealiza todas las funciones necesarias p para existir d manera ind de dependiente. La mayor de las clu son muy pequeas par observarse a simple vist y se requie para ello d a ulas ra ta ere del uso de un alto pode ptico -microscopios el er lectrnicos pa el exame celular-. Po ejemplo, u ara en or una investigacin report tada sobre fot tosistemas en 1996, manej n jaba un micro oscopio (disponible en 199 96) na r de del odelo estructu ural con un resolucin de 4 , que represent la posibilidad d disponer d primer mo de una reaccin foto osinttica en el centro del sistema de un antena cose e s na echadora de u planta.1 una m l s estaban ante e descubrimi el iento del mun ndo Hasta mediados del decimosptimo siglo, los cientficos e celular No fue has r. sta 1665 qu un bilogo llamado R ue o Robert Hooke observando a travs de su os micros scopio que lo tejidos de la planta est os taban dividido en compa artimientos di iminutos que l e acu con el trmi ino "cellulae o clula. Sin embargo Pasaron ot e" o, tros 175 aos antes de q s, que icos empezara a entender la verdadera importancia de las clula En sus estu an r a a as. udios de plan ntas cientfi y clu ulas de anima ales durante principios del siglo XIX d X, el botn nico alemn Matthias Jak kob Schleid y el zolo alemn Theodor Schw den ogo T wann reconoc cieron las sim militudes fund damentales en ntre los dos tipos de cl s lulas. En 1839, ellos propu usieron que t todas las cosa vivientes s componen de as se clulas con esta teo se dio lug a la biolog moderna.2 s, ora gar ga

Fig.1. Matthias Jako Schleiden M ob

Desde esos tiempos, los bilogos han emprendido un gran estudio sobre la clula y sus partes; sus funciones, cmo crece y cmo se reproduce. Las preguntas que se prolongan hasta nuestros das y han conducido a rigurosas investigaciones, son:

3.1.1 Cmo las clulas vivientes se originaron de los qumicos bsicos que la constituyen?

Los experimentos de Urey y Molinero, considerando la importancia de sus hallazgos, que trastoca nuestra comprensin de cmo los aminocidos pueden haberse originado en la Tierra a partir de reacciones y procesos de sntesis de aminocidos causados por descargas (chispas elctricas) en mezclas de metano, amonaco, hidrgeno y agua.3

3.1.2 Cmo las clulas dieron origen al ncleo?

Partamos de la siguiente pregunta La endosimbiosis explica el origen del ncleo celular? Anthony Poole y David Penny del Institute of Molecular Biosciences, Massey University reportan en Agosto del 2001, Citando a Horiike et al. proporciona un anlisis bioinformtico excelente que muestra las relaciones entre genes de levadura que funcionan en el ncleo, genes de convergencia origen, adems entre genes de levadura que funcionan en el citoplasma y los genes bacterianos.4 Su conclusin del origen del ncleo corresponde a una hiptesis endosimbitica de convergencia origen, sin embargo, no explica los siguientes rasgos del ncleo: sobre la estructura nuclear; el complejo poro nuclear; los cromosomas lineales; la ausencia de bacterias fagocticas; la preservacin del ARN antiguo en eucariotes, y la reduccin de stos en procariotes. Adems, su explicacin contradice la tendencia general de prdida del gen reportada en parasitarios, endosimbiticos y genomas de organelos.5. Existe un claro paralelismo entre los entes bacterianos, mitocondrial, hidrogenosomal y membranas del cloroplasto. Ningn paralelo existe para el ncleo donde las membranas internas y exteriores son continuas. Igualmente, el complejo poro nuclear no guarda ningn parecido a los poros transmembranosos de procariticos. En diferentes organelos, y ultra estructuras no se est a favor del origen endosimbitico.6

En num merosas disc ciplinas cient ficas -- fsic geologa, qumica, y la biologa e ca, evolutiva-- e est usndo para expl ose lorar la pregu unta de evolu ucin celular, una teora e , especula que las substanc cias tuviero origen en el aire, por erupciones volcnicas, qu a su vez fue bombar on v ue rdeado este a aire ionizn ndose. Y la ra adiacin ultra avioleta, prod dujo molcula ms grand ms estab tales com as des, bles mo: los am minocidos y cidos nucle eicos. La lluv llev a es via stas molcula a toda la superficie de la as e Tierra donde ellas formaron una sopa primog fo nita de bloq ques celulares s.

Fig. 2. Oparin, Alex xander Ivnov 7 vich egunda teora propone que los bloques celulares se formaron en las aguas pr e s e n rofundas, en las Una se chimen neas hidrotrm micas; en par rticular en charcos trmic o lagos e la superfic de la Tier c cos en cie rra. Una te ercera teora especula que estos qumic important vinieron a la tierra en meteoritos d e cos tes n del espacio exterior. o ad ntelectuales a asumieron am mplia y fuert temente que las Desde la antigeda a la edad media, los in estrella estaban viv una cree as vas, encia que no slo otorg u posicin importante a cosmos en la una al n religin griega, sino tambin en discusiones de psicologa y antropolog humana. n o d d a b arecera ser s cuestin d tiempo an lo de ntes Dados los bloques bsicos y las condiciones correctas, pa e io, servado molc culas unindo ose de que las clulas se empezaran a formar. En el laboratori se han obs os ara e on na a ula. a lpido grasa- pa producir esferas que so similares a la membran del plasma de una clu Quizs a travs de millones de aos, es inevi s a itable que las colisiones d azar de es s del sferas de lpid dos con c cidos nucleico simples, co os omo ARN, produciran la primeras clulas primiti p as ivas capaces de repetir el proceso po s mismas. or Una re eciente suma de conocimie ento gentico y fisiolgico es el estudio de cmo las fuerzas fsic o o s cas dentro de la clula actan recpro a ocamente para formar una arquitectura biomecnica estable. Esto se o o originalmente acuadas p e por llama "tensegrity" ("integridad tensional"), un concepto y palabra o

Buckminster Fuller.8 La palabra se refiere a estructuras que son mecnicamente estables porque las tensiones son distribuidas y equilibradas a lo largo de la estructura entera, no porque los componentes individuales tengan gran fuerza. En el reino de clulas vivientes, la tensin superficial (tensegrity), est ayudando a explicar cmo las clulas resisten tensiones fsicas, cmo ellas son afectadas por los movimientos de organelos, cuando se da un cambio en el citoesqueleto comienzan reacciones bioqumicas o incluso influencias de las acciones de los genes. Algn da, se podr explicar la tensin superficial y sus reglas biomecnicas que causaron las primeras molculas y clulas para que pudieran congregarse. Existe un puente entre lo vivo y lo no viviente? La existencia de un mundo microscpico entero ante el microscopio, se vio como un puente de conocimiento entre estos dos mundos, entre la materia inanimada y los organismos vivientes9. Esto pareca apoyar en principio la vieja doctrina aristotlica de la generacin espontnea, otorgando, al agua de la tierra, el potencial generador espontneo para diferentes tipos de organismos. Esta teora, que hace implcita la continuidad entre la vida y la materia, se refut por los experimentos dominantes del naturista Lzaro, Spallanzani (17291799).10 l y otros investigadores, mostraron que un organismo deriva de otro organismo y eso crea un hueco de conocimiento entre la materia inanimada y la vida. Sin embargo, la idea de generacin espontnea fue definitivamente refutada por Louis Pasteur, 18221895,11 como una consecuencia, se desat la bsqueda para entender cules fueron los primeros pasos elementales que pudieron formar la clula, este pensamiento biolgico podra ser visto desde un escenario actual muy poco abstracto, pero la relevancia filosfica y su impacto nos conduce sin duda hasta los umbrales de la ingeniera gentica unidad que lleva el potencial para la vida?. La teora celular, surgi por tanto con las ideas indirectas de la clula planteada como el elemento esencial, el componente, unidad de los organismos vivientes surgi, se puede decir que la teora celular fue formulada oficialmente entre 1838-1839. Las clulas no se vieron sin embargo como estructuras diferenciadas. Se asumi que exista una organizacin no viviente por debajo de la materia viviente. Felice Fontana (17301805) vislumbra el ncleo en las clulas del epitelio en 1781, pero esta estructura probablemente haba sido observada en el animal y clulas de la planta en las primeras dcadas del siglo XIX.12,13 El botnico Robert Brown (1773-1858) fue el primero en reconocer el ncleo (un trmino que l introdujo) como un esencial contenedor de las clulas vivientes (1831).14

Entretanto, las mejoras tcnicas en

la microscopa estaban llevndose a cabo. La principal

desventaja de los microscopios de ese tiempo, era lo que actualmente llamamos aberracin cromtica, que quiere decir que disminuye el poder de la resolucin del instrumento en altas amplificaciones. En 1838, el botnico Matthias Jakob Schleiden (18041881) hizo pensar que cada elemento estructural de las plantas estaba compuesto de clulas o sus derivados.15 Al siguiente ao, una conclusin similar era elaborada para los animales por el zologo Theodor Schwann (1810 1882).16 Las conclusiones de Schleiden y Schwann se considera que representan la formulacin oficial de la teora celular y sus nombres ya estn estrechamente unidos a la teora celular como aquellos de Watson y Crick con la estructura de DNA.17 La aparicin de la teora de Matthias Jakob Schleiden (1804-1881),18, de la formacin celular libre - el crecimiento de las plantas, segn afirm en 1837, se produca mediante la generacin de clulas nuevas que, segn sus especulaciones, se propagaran a partir de los ncleos de las clulas viejas - era recordativo de la vieja doctrina de la generacin espontnea aunque con una variante intracelular, pero se refut en los 1850s por Robert Remak (18151865), Rudolf Virchow (1821 1902) y Alberto Klliker (18171905) quienes mostraron que las clulas se forman a travs de escisin celular pre-existente12. El patlogo y tambin estadista Rudolf Virchow (1821 1902), en su trabajo Patologa celular (1858), consider a la clula como la unidad bsica metablica y estructural. En ese mismo trabajo subray la continuidad de los organismos: todas las clulas provienen de otras clulas (preexistentes), aun cuando los mecanismos de divisin nuclear no eran entendidos en el momento19. Esta teora celular estimul un acercamiento a los problemas biolgicos y regres al paradigma estructural ms general en la biologa. Adems de ser considerada como la unidad fundamental de la vida, la clula tambin se vio como el elemento bsico de procesos patolgicos. Las enfermedades llegaron a ser consideradas -independientes del agente causativo- como una alteracin de clulas en el organismo. Hacia finales de los1800s, los principales organelos que se consideran ahora son identificados. El trmino ergastoplasma - retculo endoplsmico- se introdujo en 1897; la mitocondria se observ por varios autores y fue nombrada as por Carl Benda (18571933) en 1898, el mismo ao en que Camillo Golgi (18431926) descubri el aparato que lleva su nombre. El protoplasma no era la nica estructura que pareca tener una apariencia heterognea. En 1879, Walther Flemming empleando colorantes rojos -la hexomatina tea de negro solamente el ncleo-, ti unos pequeos grnulos que estaban en el interior del ncleo y los llam cromatinas

(griego=color). Fue el primero en observar y describir el comportamiento de los cromosomas en el ncleo celular durante la divisin normal de la clula y sintetiz as el proceso: al iniciarse la divisin celular, la cromatina se agrega para formar filamentos, la membrana parece disolverse y un tenue objeto se divide en dos. ste es el aster -griego=estrella-, con los filamentos como desprendindose de l, dndole ese aspecto. Luego de dividirse el aster, cada parte se desplaza hacia puntos opuestos de la clula y los filamentos se unen a la cromatina, que ocupa el centro de la clula. Entonces, el aster arrastra a la mitad de los filamentos de la cromatina hacia cada una de las unidades de la clula; como resultado de este proceso la clula se estrangula por la mitad y, finalmente, se divide en dos clulas. En cada una de ellas se desarrolla un ncleo celular, rodea el material cromtico, que luego se fragmenta de nuevo en pequeos grnulos. " Flemming llam a este proceso mitosis (griego=filamento). Flemming observ y descubri la divisin longitudinal cromosmica que ocurre durante el proceso de la mitosis pero el trmino cromosoma fue usado por primera vez por Wilhelm Waldeyer,1888 (18361921)20 durante la metafase. Volviendo a Schleiden y Schwann en 1838, ao en que Schleiden haba publicado una memoria en la que se describa el desarrollo del bolso embrionario de diversas clulas y en la que se explicaba la independencia de las clulas que componen al organismo y la funcin directora del ncleo. A raz de esta observacin, Schwann ha de descubrir la composicin celular de los tejidos animales y ha de localizar los ncleos de las diferentes clulas. Al ao siguiente, Schwann expona las bases de la teora celular.21 La teora celular de Schwann expona dos aspectos: 1) El reconocimiento de que el organismo compuesto se desarrolla de clulas; y 2) Una nueva filosofa inductiva, gentica y mecnica. Tanto Schleiden como Schwann afirmaban que el organismo era un agregado segn ciertas leyes de otros seres de orden inferior; contra la opinin vitalista de la unidad de la vida en el cuerpo orgnico y contra la fuerza vital unitaria. Schleiden aduca que la vida es el resultado de la colaboracin de muchas clulas. Schleiden, botnico, y Schwann, zologo, estudiaron muchos tipos de tejidos en sus respectivos campos. Ambos llegaron a la conclusin de que: La clula es la unidad estructural bsica de todos los organismos. La clula constituye la unidad fundamental de los seres vivos. Todo organismo vivo est constituido por una o por una multitud de clulas. Este es el enunciado bsico de la teora celular.

La Teora Celular, tal como se le considera hoy, puede resumirse en cuatro proposiciones: En principio, todos los organismos estn compuestos de clulas. En las clulas tienen lugar las reacciones metablicas del organismo. Las clulas provienen tan solo de otras clulas preexistentes. Las clulas contienen el material hereditario.

Una clula es un organismo autnomo que puede verse como un subuniverso, formado por sistemas que operan al borde del desorden absoluto.22 El ADN constantemente es ledo y la molcula mensajera ARNm especifica un juego particular de protenas informacin- que gobiernan su vida. El sistema biolgico es tan equilibrado que la clula no sufre cambios fsicos importantes, ni cambios estructurales en su funcin. Sin embargo, se trata de sistemas dinmicos23 importantes para la vida celular. Para abordar el fascinante mundo de la vida celular, una filosofa muy generalizada en los bilogos modernos, es examinar los cambios celulares en el curso de su vida, a manera de sistemas. El nacimiento podra considerarse cuando dos o una clula se dividen, como la fusin de un esperma y un vulo. En general, el nacimiento de una clula, como la anterior, depende de factores racionales, culturales24 y ambientales. Pero, dnde se encuentra el conocimiento celular en estos primeros aos del tercer milenio?. Un enfoque central de la investigacin postgenmica ser sin duda entender los fenmenos celulares sobre la conectividad de genes y protenas. Esta conectividad genera diagramas moleculares de red, que se parecen a los circuitos electrnicos que un ingeniero del rea manipula, para comprender la relacin gentica y bioqumica se requiere del desarrollo de una estructura matemtica, aun por describir. Los recientes adelantos experimentales en secuenciacin y la ingeniera gentica han hecho ste acercamiento factible a travs de la aplicacin de redes sintticas de genes al modelado matemtico y el anlisis cuantitativo. Estos desarrollos han sealado la urgencia de una emergente disciplina de circuitos genticos sobre la dinmica de procesos celulares. Podra decirse que hasta entonces se tendra una real ingeniera gentica con aplicaciones importantes en el genoma funcional, nanotecnologa y terapia gentica de la clula.25 Uno de los sistemas ms explorados sin duda es el de autorregulacin por generaciones mltiples. En este contexto de regulacin gentica, la regeneracin ocurre a travs de la autorregulacin, en donde una protena modifica directa o indirectamente su propia proporcin de produccin. Si tales interacciones incluyen la positiva o la negativa regeneracin depende de los detalles de la dinmica de la red. Entendiendo la naturaleza de

tal regeneracin de redes biolgicas, se constituir un paso importante en el esfuerzo por formular una disciplina de circuitos genticos.26,27

3.2. El tiempo de vida celular

Estudios en invertebrados han llevado a la identificacin de varios genes que regulan el tiempo de vida, algunos de los cuales ponen en cdigo componentes de la insulina o insulina como sealizadores del devenir biolgico.28,29 Para investigar si un gen llamado IGF-1R controla la longevidad en los mamferos, en una reciente investigacin francesa reportada por Martn Holzenberger (el 9 de enero del 2003), indica que se inactiv el gen de IGF-1R en los ratones (Igf1r). Report que los ratones viven 26% promedio ms que su pariente salvaje.- los ratones no desarrollan enanismo, su metabolismo de energa es normal, y su captacin nutriente, actividad fsica, fertilidad y reproduccin son normales. Los ratones despliegan mayor resistencia a la oxidacin, un conocido determinante de envejecimiento.30 Estos resultados indican que el receptor de IGF-1R puede ser un regulador central de la expansin de vida en los mamferos. Un programa gentico celular, normalmente involucra un perodo de crecimiento celular y el ADN se reproduce, seguido por la divisin celular. Si una clula dada crece y se divide, es una decisin favorablemente regulada en el ADN, para asegurar que un organismo adulto reemplazar las clulas gastadas en respuesta a una nueva necesidad. Para comprender la vida de las clulas, los bilogos han estudiado intensamente los mecanismos que controlan su crecimiento y divisin.

3.3. Mode de divisi celular en eucariotes elo n

d ar Fig. 3. Modelo de divisin celula en eucariotes. e del lar Gap Las clulas pueden encontrarse en una de cuatro etapas d ciclo celul (ver Fig.3) Fase G1 (G ervalo entre la mitosis y la replicacin del ADN, se caracteriza po el crecimie a a d or ento celular. En 1): inte G1 exi un momento crtico en el que la cl iste n lula puede sal o permane lir ecer detenida su proliferati ivo en G0. La prosecuc . cin de G1 depende de la presencia d seales fa d de avorables com mitgenos o mo s factore de crecimie es ento. Entonce en presenci de estas se es ia ales, la clul entra en la fase S (sntes la sis) en don ocurrir la replicacin del ADN. A este perodo l sigue la fas G2 (Gap 2) durante la cu nde a d e le se ) ual aparece eventos de transforma en d acin en la ar rquitectura ce elular, como la ruptura d la membra de ana nuclear la condens r, sacin de la cromatina y la reorganiz zacin del cit toesqueleto. E ciclo celu El ular culmin con la segr na regacin de los cromosom duplicad en las cl mas dos lulas hijas du urante la fase M (mitosi is). l es do campo del co onocimiento de la divisi in Entre los principale hallazgos que han dad forma al c celular (ver http://w r www.cellsaliv ve.com/cell_cy ycle.htm), el exordio se d con el trab da bajo del bilo ogo

celular alemn Theodor Boveri, Boveri fue el primero en acuar los trminos centrosoma y centriolo, y ya en 1887 se determin que los elementos de la herencia y hereditarios estaban ntimamente relacionados con los cromosomas. Los centriolos son estructuras con forma de barril que son esenciales para la formacin de los centrosomas, los cilios y flagelos. La desregulacin de los nmeros del centrosoma ha sido propuesta para contribuir a la inestabilidad del genoma y la formacin de tumores, mientras que las mutaciones en las protenas centrosomas, recientemente se han relacionado genticamente con microcefalia y enanismo31. No es hasta 1951 que escribi Gunnar Ostergren en su trabajo seminal en Hereditas32; un estudio que arroja luz sobre uno de los procesos fundamentales de la biologa celular, pero que haba desconcertado a los cientficos durante dcadas, el movimiento de los cromosomas en la meiosis, Ostergren lo llam polarizacin mittica y cinetocoros no polarizados. Los cinetocoros son una estructura proteica donde se anclan los microtbulos durante la mitosis y la meiosis. En 1953 James Watson y Francis Crick hacen la descripcin de la estructura del ADN y con ello abrieron la puerta a explicar la replicacin del ADN; en 1950, la idea de que los cromosomas estn hechos de ADN se convino en general, Hewson Swift la consider un componente esencial de la gentica. Sin embargo, el nmero de molculas por cromosoma y la naturaleza de su rgimen sigue siendo un misterio hasta ese momento. Esta duplicacin del ADN se estudi con ms detalle por Alma Howard que puso de manifiesto que la sntesis de ADN slo se produce dentro de un determinado perodo de tiempo limitado - el medio de la interfase - al principio del proceso de divisin celular33. Este descubrimiento en ltima instancia condujo al modelo de divisin del ciclo celular eucariota en las fases S , G1, G2 y M. Un gran avance se produjo en 1968, cuando Weisenberg y sus colegas identificaron la tubulina como la subunidad de la protena de los microtbulos34. Para ello, se aprovecharon de la afinidad de la colchicina - un inhibidor conocido de la mitosis - para una protena asociada con el huso mittico y los microtbulos. Este descubrimiento finalmente proporciona la base necesaria para estudiar la organizacin de microtbulos en el nivel molecular. Sin embargo, se desconoca exactamente cmo actuaba la tubulina polimerasa en los microtbulos, en 1984 se introduce el concepto de inestabilidad dinmica, propuesto por Tim Mitchison y Marc Kirschner35. Estos investigadores proponen una serie de ensayos in vitro de microtbulos de polimerizacin que les permiti medir la longitud y el nmero de microtbulos individuales en lugar de las poblaciones a granel. Para su gran sorpresa, encontraron un estado que acuaron como la "inestabilidad dinmica". Para explicar sus resultados, los autores propusieron que la mayora de los microtbulos crecen lentamente en el estado estacionario, mientras que una minora se reduce rpidamente, permitiendo que la masa neta

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de polmero permanezca constante. Las transiciones entre el crecimiento y la contraccin son poco frecuentes, pero pueden ocurrir en un amplio rango de concentraciones de tubulina, en consonancia con la observacin de estos autores de que los microtbulos individuales crecen de forma transitoria, incluso en concentraciones por debajo de la concentracin de tubulina en estado estacionario. La inestabilidad dinmica gobierna el crecimiento de los microtbulos de los centrosomas. La nica diferencia es que en los centrosomas, se nuclean los microtbulos de tubulina en concentraciones que estn muy por debajo de la concentracin en estado estacionario. Pero para empezar siquiera a comprender los centrosomas, los cientficos tuvieron que esperar hasta 1989, cuando Oakley y sus colegas descubrieron la tubulina-Y sus propiedades de microtbulos nucleantes36. Datos recientes han revelado que la familia de protenas de tubulina es mucho ms grande de lo que se pensaba. Seis familias distintas dentro de la tubulina se han descubierto y podra descubrirse ms37. Para 1970 se identifica la existencia de que el ciclo celular podra depender de un conjunto de genes, los llamados genes de ciclo de divisin celular o cdc genes, cuya funcin es requerida en los puntos de tiempo especficos en el ciclo38. Para 2001 ya se haban identificado ms de 100 genes cdc por Leland H. Hartwell y colegas, trabajo que le vali ser reconocidos por el premio Nobel de Medicina y Fisiologa del ao 2001. Uno de esos genes, el CDC28, o gen de inicio, controla la primera etapa en la fase G1. Las investigaciones de Hartwell tambin aclararon ciertos mecanismos de defensa del ciclo celular contra la irradiacin o contra la alteracin del orden correcto entre las diferentes fases del ciclo. Sin embargo, en 2010 se ratifica que la accin de control de los genes cdc no est sola, se ha identificado la interrupcin de la multiplicacin celular por campos elctricos oscilantes39. En resumen, hemos visto hasta aqu, que la divisin celular se produce por una serie ordenada de cambios metablicos y de morfognicos que se denominan colectivamente el ciclo celular. Como ya hemos mencionado, este ciclo se divide en cuatro fases distintas. La replicacin de los cromosomas se produce en la fase S (sntesis), mientras que la divisin celular se lleva a cabo en la M (fase mittica). La brecha (G) entre la finalizacin de la fase M y el comienzo de la fase S se denomina la fase G1, y el perodo entre el final de la fase S y el comienzo de la fase M se llama la fase G2. Es importante destacar qu mecanismos de control actan para regular el inicio de cada fase y para evitar que las transiciones entre las fases sean incorrectas. Las claves importantes sobre la naturaleza de la regulacin del ciclo celular se establecieron por Rao y Johnson en 1970, por una serie de seales qumicas que pueden difundirse libremente entre el ncleo y el citoplasma40. La

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identificacin de estos factores a nivel bioqumico ha sido un foco principal de la investigacin cientfica desde entonces.(ver. http://mcb.berkeley.edu/courses/bio1a/Spring2007/Lecture/Mayfield_6.pdf ). Durante la mitosis y la meiosis en el ciclo celular se detiene, en los puntos de tiempo determinado, por ejemplo, cuando las clulas de los animales esperan la fertilizacin. Hasta 1971 Yoshio Masui y Clemente Markert identificaron el factor de promocin de la maduracin (MPF). A continuacin, tom otros 17 aos antes de que este factor fue purificado por Manfred Lohka, Marianne Hayes y James Maller41. Se determin que MPF es tambin el factor clave que regula el inicio de la mitosis en todas las clulas eucariotas y que ahora se conoce como el factor de promocin de la mitosis. Es interesante pensar que, 40 aos despus del primer artculo mencionado MPF, la mayora de los objetivos de este complejo son an desconocidos42. En la dcada de 1970, la naturaleza y duracin de la fase G0 eran una fuente de controversia, de hecho, algunos propusieron incluso que G0 en realidad no exista. En 1974, sin embargo, en la presentacin de informes Actas de la Academia Nacional de Ciencias, Arthur Pardee argumento que las clulas no entran en un estado G0 y que se trata de un estado equivalente con independencia de los medios por los que se induce. l demostr que las clulas reentran en el ciclo celular en trnsito, una restriccin -despus de que se han comprometido con el ciclo celular- y argument que este interruptor est defectuoso en las clulas cancerosas y se activa cuando las condiciones no son ptimas para el crecimiento celular43. La clulas siempre se dividen exactamente en el mismo tamao. En 1975 se puso a la luz esta regulacin estricta de la divisin mittica, encontrando que depende de dos fuerzas opuestas que controlan la actividad de las quinasas (o cinasas) dependientes de ciclinas (Cdk), por cdc244. Durante la mitosis y la meiosis, todos los cromosomas duplicados debern separarse para las clulas hijas. Este proceso se basa en una porcin del cromosoma mittico donde las cromtidas hermanas se unen, conocido como el centrmero. Pero no fue hasta 1980 que pudo calificarse el papel de los centrmeros, cuando Louise Clarke y John estudiaron la levadura en ciernes.45 En 1983, Evans, T. estudi la sntesis de protenas en el erizo de mar. Descubri que estaban presentes varias protenas acumuladas a un alto nivel durante la interfase, para declinar abruptamente poco antes de que los huevos se dividan. Se acu el nombre de ciclinas para estas protenas que mostraron comportamiento en el ciclo celular46. Posteriormente, las ciclinas se identificaron en una variedad de organismos, lo que demuestra la universalidad de este fenmeno47.

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Todas las clulas vivas deben replicar su ADN una vez y slo una vez antes de dividirse, y debern hacerlo con una precisin implacable para garantizar que su herencia gentica se mantenga intacta. Los estudios clsicos a partir de 1987 en sistemas bacterianos y virales nos han formado en la idea de que la replicacin del ADN consiste en complejos de la ADN polimerasa, que se mantienen bidireccionalmente desde un punto fijo - el origen de replicacin-.48 Las clulas eucariotas poseen normalmente varios cromosomas grandes, lineales, la rplica de la que es probable se plantea grandes problemas logsticos adicionales y topolgicos, pero el ADN y los componentes de protena implicada en la determinacin de los pasos de la replicacin del DNA eucaritico han sido definidos poco a poco en las ltimas dos dcadas.49 Las clulas deben estar protegidas de una andanada de ataques con el fin de sobrevivir. Cada da se encuentran productos qumicos y rayos ultravioleta que daan su ADN y puede conducir a la muerte. qu es lo que las protege de este mundo peligroso? La respuesta es sorprendentemente simple, las clulas poseen puestos de control de detencin en la G2, por lo que les da tiempo para reparar los daos. El primer paso en la elucidacin de esta va fue tomada en 1988 por Ted Weinert y Hartwell Leland, con el descubrimiento de RAD9.50 La protena de punto de control del ciclo celular RAD9A es una protena codificada en humanos por el gen RAD9A, requerida para que se produzca un alto total del ciclo celular.51 El gen del retinoblastoma, (RB), fue el primer gen supresor de tumores que se identific en los nios con la hereditaria retinoblastoma. Su producto proteico, RB, se declar ms tarde ser funcionalmente inactivo en varios otros tipos de tumores humanos. Durante la dcada de 1980 y principios de 1990, RB fue identificado como un objetivo celular para oncoprotenas virales y los pasos significativos realizados en la comprensin de la funcin de RB en la regulacin de la proliferacin celular y la formacin de tumores. Para los estudios del ciclo de divisin celular la familia de la va de RB, as como las seales que inciden en la misin de fomentar o bloquear la proliferacin celular sean vuelto de relevancia cientfica para la salud humana. Es decir, una de las funciones principales de Rb es la inhibicin de la progresin del ciclo celular antes de la entrada en mitosis, de manera que la clula no entra en divisin hasta que est preparada para ello y se dan las condiciones adecuadas: Rb impide por tanto la proliferacin celular.52 A lo largo de la dcada de 1980, las supresiones y las mutaciones en TP53 ( el gen que codifica a p53) se inform de que un p53 defectuoso podra permitir que las clulas anormales proliferen

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dando por resultado cncer. Baker y colegas llegaron a la conclusin de que las clulas en las fases pre-malignas de la progresin del tumor, tales como las clulas del adenoma, son menos sensibles a los efectos inhibidores del p53 en las clulas malignas. Esto condujo a la hiptesis de que las alteraciones genticas que ocurren durante la progresin de los tumores colorrectales podran aumentar la sensibilidad de las clulas para la inhibicin de p53, p53 es un factor limitante de la velocidad de progresin del tumor.53 El gen p53 tambin llamado el "guardin del genoma", se encuentra en el brazo corto del cromosoma 17 y codifica un factor de transcripcin nuclear de 43.7 KDa.54 Las clulas no son islas aisladas del cuerpo, cmo pocas clulas eucariotas se dividen de forma aislada, es imprescindible saber qu regula, cundo y dnde las clulas se dividen en todo el organismo durante el desarrollo. Cmo, por ejemplo, es la divisin celular, junto a eventos como la determinacin de clulas destinas? Durante la dcada de 1980, el trabajo de Bruce Edgar y Pat O'Farrell hizo avanzar nuestro entendimiento en la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, dado por stg ARNm.55 Durante el ciclo celular, una clula se somete a una serie de eventos secuenciales -un paso tiene que ser completado antes del que el prximo se inicie. Esta progresin lineal se puede lograr de dos maneras: cada paso puede someter un producto como el paso anterior para su iniciacin, o puede haber mecanismos de regulacin de retroalimentacin que garanticen que un paso posterior en el ciclo celular no se inicia sin un acontecimiento crucial. Conocido como puesto de control, en 1991, dos estudios publicados en la revista CELL, dirigidos por Andrew Hoyt y Andrew Murray, identificando el puesto de control del huso, mostraron la existencia de un mecanismo de retroalimentacin de control que evita que las clulas abandonen la mitosis si su huso mittico se ha reunido incompletamente.56,57 La progresin a travs del ciclo celular es altamente regulada. En todas las clulas eucariotas, la entrada en fase M est regulada por un complejo de la cinasa dependiente de ciclina (CDK) cdc2 y ciclina B (tambin conocida como MPF). La entrada en la fase S se regula de forma similar tanto en la fisin y la levadura en ciernes. Pero en 1991, un mecanismo diferente fue descubierto en los vertebrados, lo que lleva a la identificacin de una nueva clase de protenas.58,59 Se estableci posteriormente que la ciclina E es -junto con la ciclina A- la subunidad reguladora de la quinasa CDK2 en la fase S. Tambin se determin que la ciclina D funciona como regulador de la CDK4 y CDK6 en G1, y en la regulacin de la expresin de la ciclina E. Sin embargo , veinte aos despus de la publicacin de este trabajo, la funcin exacta de ciclina C an no se ha establecido.60 Recientemente en 2010, se identifica que para CDK8 y sus socios ciclina C forman parte del

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complejo mediador que une a la maquinaria de transcripcin basal para las protenas reguladoras, estn activas durante el desarrollo en respuesta a seales extracelulares y los niveles de estas protenas son importantes para controlar la sincronizacin de los procesos de desarrollo61. En 1991 , cinco grupos de forma independiente informaron la identificacin de una nueva clase de ciclinas, y otros dos grupos identificados relacionados con un CDC2 quinasa, CDK2. Juntas, CDK2 y estas nuevas ciclinas E, A, D regulan G1 y S como puesto de control en los vertebrados62. Conocemos desde 1971 que la actividad de promocin de maduracin depende de un factor, ms tarde identificado como ciclina B -CDC2 -, que oscila durante todo el ciclo celular, pero el controlador de estas oscilaciones tom mucho ms tiempo para ser identificado. El descubrimiento de que la protelisis es un regulador clave de la ciclina, los niveles B mediados por un complejo ubiquitn ligasa grande, que ahora llamamos la anafase de promocin de complejo APC o ciclosoma; esto no slo cambi nuestra visin del ciclo celular, sino que tambin tena enormes implicaciones para entender la regulacin de procesos celulares medidos por protelisis ubiquitn. Aunque la mayora las subunidades del APC han sido identificadas y sus funciones individuales reveladas. Pero a pesar de que la ciclina B fue una de las primeras protenas que se reconoce con un objetivo regulado de ubiquitinacin, (un proceso que nosotros ahora sabemos que es tan importante como la fosforilacin en la regulacin celular) la enzima que cataliza este proceso an se queda con algunos de sus secretos.63,64 En la dcada anterior a 1993, una rfaga de actividad en el campo del ciclo celular ha dado lugar a la identificacin de las protenas quinasas dependientes de ciclinas (CDK) y sus asociados ciclina regulador. Estos complejos se haba demostrado su participacin en la regulacin de las transiciones del ciclo celular para permitir la replicacin del ADN (fase S ) y la entrada a la mitosis. El supresor de tumores retinoblastoma (RB). Esta protena tambin entr en la ecuacin, en la que haba demostrado ser un importante objetivo para ciclina / CDK fosforilacin, lo que lleva a la inhibicin y, por tanto, a la progresin del ciclo celular. 1993 fue un ao emocionante de la investigacin convergente: varios grupos de forma independiente y a travs de vas muy diferentes - identificaron el primero de los importantes reguladores del ciclo celular , llamadas colectivamente los inhibidores de CDK: p21, p27Kip1,p53,p120.65,66 Un hecho emocionante se dio en 1994, cuando Kim Nasmyth y sus colegas, trabajando en la levadura en formacin Saccharomyces cerevisiae, mostr que la protelisis tambin se requiere

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para que las clulas comiencen la replicacin del ADN. La ubiquitn ligasa responsable de esto fue identificada posteriormente como SCF. Skp1 , Cdc53 y Cdc4, se reconoce y degrada Sic1. A diferencia de la APC, SCF reconoce especficamente las protenas que son fosforiladas. As que el SCF proporciona un vnculo entre los reguladores de protenas que estn implicadas en la fosforilacin y la protelisis eucariota.
67,68

reuniendo una va central en la regulacin del ciclo celular

El momento de separacin lo es todo en la divisin celular. Por ejemplo, despus de que una clula en divisin se ha duplicado sus cromosomas, se necesita mucho cuidado de no separar las copias hasta que est seguro de que la duplicacin se ha realizado correctamente y que las copias han sido alineados correctamente. De lo contrario, cada clula hija recin formada se cargar con un complemento incorrecto del material gentico. Los cromosomas se duplican en la fase S, pero los dos ejemplares (cromtidas hermanas) se mantienen juntos hasta mucho ms tarde, la transicin metafase -anafase - durante la mitosis. Sin embargo, como Frank Uhlmann del Imperial Cancer Research Fund de Londres dice: "Desde el punto de vista del cromosoma, parece una tarea paradjica, donde la primera aparece estrechamente vinculada a la copia que hermana, pero luego la deja ir, y en la clula hija pas lo contrario".69 Cmo funciona esto? mostraron que Esp1 est obligado a destruir Scc1 en el inicio de la anafase. Descubrieron que Scc1 se divide en el inicio de la anafase pero no cuando est mutado Esp1. Tambin genera una ancla Scc1, y encontraron que las clulas que expresan esta protena no poda separar las cromtidas hermanas70. En 2010 es revelada la dinmica de adhesin clula a clula, gobernada por al E-cadherin y el p120, permiten modelar la divisin celular en el espacio tiempo corporal, revelando las uniones de estabilidad y dinmica celular.71 En resumen nuestro estudio comenz en 1902 y concluye en 2010, intenta explicar la divisin celular desde a dentro, a continuacin expresaremos los detalles ms ntimos de este fascinante proceso esencial para la vida.

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3.4. Interruptores del ciclo celular

El crecimiento de la clula humana es controlado por un juego de protenas que actan como interruptores moleculares. Estos interruptores se encienden o se apagan por la orden de varias protenas y aseguran que la clula slo crece cuando es apropiado. En el cncer, las alteraciones genticas causan a menudo la prdida de restricciones de estos interruptores y llevan al crecimiento desenfrenado de la clula. Estos interruptores se les conoce como CDKs. En el estudio de eucariotes, CDK es parte de la maquinaria de la divisin celular, gran parte de los eventos del ciclo celular estn regulados por las ciclinas, CDK (Cyclin Dependent Kinase) por ejemplo, los inhibidores de CDK4. Las ciclinas son protenas cuya concentracin y actividad vara en cada etapa del ciclo celular. Las CDK y sus inhibidores, que pueden ser de la familia de los KIP (Kinase Inhibitor Protein) o INK4 (inhibidor CDK4)72, se encuentran en un nivel constante a lo largo del ciclo celular. Las ciclinas se unen a la quinasa, produciendo su activacin; una vez activadas, stas cumplen funciones especficas actuando sobre otras protenas nucleares, lo que condiciona la progresin de la clula a otros estados del ciclo celular. Diferentes ciclinas estn envueltas en distintas fases del ciclo y se sabe que todas ellas pueden ser blancos de cambios genticos o pueden ser alteradas en el proceso de ontognesis.73 La prdida de la sensibilidad a la inhibicin del proceso de crecimiento es el resultado de la prdida del control positivo de las ciclinas o prdida de la funcin de los inhibidores CDKs. As tambin la inestabilidad gnica, determinada por la habilidad de la clula tumoral de saltarse los mecanismos de restriccin presentes al inicio de la fase S (fase de sntesis) del ciclo celular, conduce a la perpetracin de una lnea celular con DNA defectuoso. La sobreexpresin de ciclinas ha sido demostrado que genera cnceres como el de colon y mama, donde est desregulada la expresin de la ciclina E74 y POM121 est involucrado en la fusin de las membranas nucleares interna y externa durante la interfase75. La entrada al ciclo celular, en las clulas de mamferos es determinada por la actividad de la ciclinas CDKs, que consisten en un centro quinasa y subunidades ciclinas asociadas. Para entrar en la fase S -la sntesis de ADN(E1 y E2).76 los jugadores importantes son en G1 CDK4 y CDK6 que son los complementos con las ciclinas tipo D (D1-3), y CDK2 que es el complemento con ciclinas tipo E

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Se sostiene ampliamente que la ancha gama de clulas de mamferos es producto de una serie de decisin comandos- en la fase G1 de la divisin celular para proceder a travs del ciclo celular; para la diferenciacin y para cesar el crecimiento o divisin. Se prev actualmente que las clulas toman una decisin en la fase de G1 del ciclo de la divisin al diferenciarse. Despus de la diferenciacin las clulas permanecen en la fase G1 y no se dirigen a iniciar la sntesis de DNA. Clulas que estn sufriendo la diferenciacin y que no entran en la fase S, G2, o M escalonada. Clulas que estaban detenidas en S, G2, y M escalonada cuando el comando de iniciacin fue recibido atraviesa estas fases. G0. La existencia de un punto de decisin en el proceso de una fase G1, provee soporte para la idea general de que all reside un importante control del ciclo celular. La propuesta de un punto de restriccin introduce a la clula en G0. Idea general de una fase de control G1 detenida, que soporta la idea de ms de un comando para iniciar la diferenciacin.77 Por otro lado, puede suceder que las clulas cesen de proliferar, pero retengan la capacidad de dividirse posteriormente, es la denominada quiescencia celular, tambin se denomina a esta detencin del proceso en G1 como fase G0 . Estas clulas pueden entrar de nuevo en fase G1 por estmulos externos y proliferar, por ello se denomina control externo del ciclo celular, se realiza por molculas a las que se han denominado factores de crecimiento.78 Los procesos de proliferacin, diferenciacin y apoptosis celular utilizan sistemas de transmisin de seales similares que en ocasiones incluso comparten sus componentes estructurales bsicos. La seal, codificada en forma de factor difusible, interacciona y activa un receptor especfico en la clula efectora. Como consecuencia, se pone en marcha un complejo sistema de transmisin de seales intracelulares que a travs de diversas enzimas citoplsmicas, concluye en la activacin de factores de transcripcin especficos. Los principios bsicos de este proceso son compartidos en la regulacin de la proliferacin, diferenciacin y apoptosis. El que una clula inicie la fase G1 est determinado por la protena retinoblastoma (Rb) que une y atrapa al factor transcripcional E2F. ste controla la sntesis de protenas necesarias en G1. Esta inhibicin desaparece cuando la CDK4 se activa y fosforila a Rb activndose la capacidad transactivante de E2F. La presencia de mitgenos reduce los niveles de la protena p16 inhibidora de la CDK4 y a su vez induce la aparicin de ciclina D, acciones que aumentan la actividad CDK4.

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Uno de los sustratos ms importantes de esta kinasa es la proteina retinoblastoma (Rb). La CDK4 hiperfosforila a Rb liberando el factor transcripcional E2F. Este se une a secuencias especficas del ADN para promover la sntesis de enzimas requeridas en la sntesis del ADN (Polimerasas, Dehidrofolato reductasa y ciclinas E y A). La aparicin de la ciclina E permite la activacin de CDK2 que promueve la desaparicin de su inhibidor p27 a travs de fosforilacin y activa la maquinaria de replicacin79. En resumen, los actores principales del ciclo celular son las CDKs, un grupo de serina / treonina quinasas que forman complejos heterodimricos activos, son subunidades reguladoras. Varios CDK principalmente CDK4, CDK6, CDK2 y CDK3 cooperan para conducir las clulas a travs de G1 a la fase S. CDK4 y CDK6 se implican en G1 temprana, mientras que CDK2 es necesaria para completar G1 e iniciar la fase S.80 CDK4 y CDK6 forma complejos activos con las ciclinas de tipo D (ciclinas D1, D2 y D3).81 Estas quinasas son muy relacionadas y, hasta ahora, se han resistido a la diferenciacin funcional, a excepcin de su patrn distinto de activacin82. CDK reguladores. Al controlar el nivel de actividad CDK, reguladores CDK tambin puede controlar el bucle del ciclo celular. Estos incluyen activadores, principalmente las ciclinas, e inhibidores, conocidos genricamente como CKIs (CDK inhibidores de quinasas). CDK tambin son reguladas por la fosforilacin: deben ser fosforiladas en un residuo de treonina (T172 en CDK4 y T160 en CDK2) -situados en su bucle T- para la actividad cataltica adecuada.83 Esto se lleva a cabo por el complejo ciclina-CDK7-H (tambin conocida como CAK; CDK-que activa la cinasa o tambin llamada quinasa), una serina / treonina quinasa que tambin est implicada en la transcripcin y la reparacin del ADN, fosforilacin inhibitoria de treonina adyacentes y los residuos de tirosina (T14/Y15 en CDK1) est mediada por quinasas de doble especificidad (como WEE1 y MYT1)84,85. Esta inhibicin se alivia cuando la fosfatasa CDC25 (CDC25A, CDC25B y CDC25C) desfosforiliza estos residuos, lo que desencadena la entrada en mitosis86. CKIs. CKIs son de dos tipos. Los cuatro miembros de la familia de INK4 - INK4a (tambin conocido como P16), INK4B (tambin conocido como P15), INK4C (tambin conocido como P18) y INK4D (tambin conocido como P19) - ejercen su actividad inhibitoria al unirse a la CDK4 y CDK6 quinasas y la prevencin de su asociacin con las ciclinas de tipo D. Aunque las protenas INK4 son bioqumicamente indistinguibles entre s in vitro, la generacin de ratones dirigida de genes que son deficientes para cada una de estas protenas ha revelado importantes diferencias funcionales87. Los tres miembros de la WAF familia de KIP - WAF1 (tambin conocido como p21),

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Kip1 (tambin conocido como P27) y KIP2 (tambin conocido como P57) - forman complejos heterotrimricas con el G1 / S CDK88. Sin embargo, en cantidades estequiomtricas, slo inhiben la actividad quinasa de los complejos CDK2-ciclina E. CKIs se inducen en respuesta a diferentes procesos celulares. Por ejemplo, WAF1 es uno de los efectores de P53, un supresor de tumores que es importante en el puesto de control de daos del ADN - un proceso crucial para el cncer humano.89 Los substratos de CDK. Los substratos primarios CDK4/6 y CDK2 en el desarrollo de G1 son los miembros de la familia de la protena retinoblastoma - RB, P10790 y P130.91,92 regulan la expresin de las P130, P107 y E2F-4 en clulas humanas.93 Estas molculas cercenan los sitios para una serie de protenas que deben regularse hermticamente a lo largo del ciclo celular. Por ejemplo, las protenas de RB envuelven a la familia E2F de la transcripcin, para asegurar que ellos permanezcan inactivos durante fase M y G0. Adems, los complejos de RB-E2F participan en la represin activa de algunos promotores: un mecanismo que involucra a otras familias de protenas, como las histonas deacetilasa y los remodelares cromosomticos, complejos SWI/SNF.94,95 Hasta ahora, ms de 100 son las protenas de RB que han sido identificadas96, pero la relevancia fisiolgica de la mayora de estas interacciones no se ha establecido. RB tambin puede regularse por acetilacin, por medio de las histonas acetilasa asociadas a P300/CBP97. Estos acetilasas estn bajo el comando del ciclo celular y previenen la fosforilacin de RB por CDK2-cyclin E.98 Ciclinas tipo-D. Las ciclinas del tipo-D son integradores importantes de la sealizacin mitognica pues su sntesis es uno de los puntos finales y principales de las vas RAS/RAF/MAPK99. Si la disponibilidad de suficientes cantidades de ciclinas tipo-D hace que las clulas se vuelvan independientes de estmulos mitognicos. Para las clulas que carecen de ciclinas D1, stas pueden proliferar indicando que esta molcula no es terminantemente necesaria para G1.100 Las tres ciclinas tipo D, sin embargo, es evidente que la sobreexpresin ciclina D1 facilita el paso en G1 y promueve la proliferacin de la clula. Ciclina D1. Adems la ciclina D1 es esencial para formar tumores superficiales oncognicos.101

3.5. Mutaciones en el ciclo celular

El anlisis molecular de tumores humanos ha mostrado que reguladores del ciclo celular frecuentemente deforman en neoplasia humana (ver figura 4), este anlisis subraya como

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import tante el mante enimiento del ciclo celular en la preven l r ncin del cnc humano. L alteracion cer Las nes incluye la sobreexp en presin de ci iclinas (princi ipalmente D1 y E1) y CDK (principalmente CDK4 y 1 Ks 4 CDK6) as como la prdida de CKI (princip ), a palmente INK K4A, INK4B y KIP1) y ex xpresin de R RB. Los ca ambios asociados a tumo ores en la ex xpresin de e estos regulad dores frecuen ntemente son el resultado de las alte eraciones del cromosoma (la amplificac ( cin de ciclin D1 o CDK permutaci na K4, in de CDK y supresi de proten INK4 o RB) o inactiva K6 n nas R acin epignti (la metila ica acin de INK4 o 4 promot tores RB) las mutaciones en CDK4 y CDK6.102 e C

Fig. 4. La mutaci de regulad .n dores en G1 o S en el c 1 cncer human Se han co no. onsiderado s lo alteraciones que ocu urren en ms de 10% de los tumores. L nmeros representan e porcentaje de Los el es eraciones en cualquiera de los regulado e ores del ciclo o-celular list tados. Los sitios tumore con las alte de especificidad ge entica o la alteracin que causan tum a e mores se ha d definido en c color rosa. L Las alteraciones sin nin nguna explic cacin mecn nica se ha m mantenido en amarillo. L alteracion n Las nes entes para la prognosis del tumor se indi por los ast p ica teriscos.103 pertine

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Fig. 5. Punto de con ntrol de restric ccin y transi G1-S. ito Los av vances recien ntes en biolog molecular permiten a ga agrupar a los genes del cncer en var rias categor de acuer a sus fun ras rdo nciones conoc cidas. Una vi sin simplificada reduce a dos, los tip pos fundam mentales de genes relacio g onados con la aparicin d proceso t a del tumoral: onco ogenes y gen nes supreso 104 ores. ncin normal es la regula acin de las r rutas de sea alizacin de la proliferaci in Oncogenes. Su fun r, ndose proto-o oncogenes. Tras su altera T acin se acti ivan de form constitutiv ma va, celular denominn manten niendo la seal mitognica permanente a emente activa Las funcion de cada g a. nes grupo se pued den resumi siguiendo el esquema de funcionamiento de lo genes nor ir os rmales de lo que derivan, os involuc crados en la regulacin de la transmisi de seales 105 El diseo de nuevos a r e n s. o antitumorales se s basa pr recisamente en el bloqueo selectivo de su funcin m e o e mediante mol lculas que in nterrumpan e esta cascada de seales en cada uno de sus puntos conocidos. L niveles d sealizacin y mensajer e d s Los de ros primar rios, fundamen ntalmente fac ctores de crecimiento y hor rmonas. uya es proliferacin. Su funcin se Genes supresores. Son genes cu funcin primordial e frenar la p ontexto de la regulacin de ciclo celula siendo la p r el ar, prdida de su funcin duran nte realiza dentro del co el proc ceso de carci inognesis, la que contrib a buye a la apa aricin de tum mores al perd derse el cont trol sobre el freno de la proliferacin Se conocen una decena d genes supr e n. n de resores como retinoblastom o ma

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(Rb), P53, los genes de la neurofibromatosis tipo 1 y 2 (NF1, NF2), el gen de la poliposis adenomatosa colnica (APC),106 el gen del sndrome de von Hippel-Lindau (VHL) y del tumor de Wilms (WT-1). Los genes mejor caracterizados son el gen del Rb y P53.107 En el caso de Rb, su regulacin se produce mediante un proceso de fosforilacin/desfosforilacin actuando como modulador de la funcin del factor de transcripcin E2F-DP. La fosforilacin de Rb est claramente asociada con su inactivacin como protena supresora de la proliferacin. Cuando est hipofosforilada, en las fases G0 y G1 temprana, la protena Rb secuestra al factor E2F impidiendo su actividad. Tras la fosforilacin, que se produce en la fase media de G1 y se mantiene a lo largo de las fases S, G2 y gran parte de la M, Rb libera al factor E2F,108 permitindose su actividad transcripcional. La desfosforilacin se produce en la salida de la fase M y entrada en la fase G0, secuestrndose de nuevo al factor E2F.109 En conclusin parcial, observamos que la falla en los interruptores del ciclo celular, con frecuencia deriva en cncer, es considerado como una enfermedad del ciclo celular. Aunque muchos mecanismos especficos de regulacin del ciclo celular han sido estudiados en profundidad in vitro, an no est claro como los diversos procesos celulares estn desregulados con la divisin celular en el cncer humano. Una visin integrada de los estudios bioqumicos y el anlisis de las mutaciones del cncer, sin duda, ayudar a explotar este conocimiento en los enfoques teraputicos. La investigacin futura exigir explicar aspectos cruciales de la regulacin del ciclo celular in vivo, como las vas de sntesis y protelisis de protenas esenciales, de control posteriores a la traduccin y, sobre todo, la especificidad funcional o redundancia entre clulas familiares. Del mismo modo, explicar cmo las clulas coordinan el crecimiento celular y la proliferacin celular, y cmo decidir si o no activar ciclo a ciclo la reparacin celular, es un desafo an mayor. En ltima instancia, es observable en la literatura referida que el diseo de frmacos contra el cncer especfico debe provenir de enfoques multidisciplinares que combinen, entre otras estrategias: patologa molecular110, para identificar todas las mutaciones/alteraciones presentes en los tumores humanos, genmica funcional111, para seleccionar los objetivos ms importantes, estructurales y biologa computacional112, para predecir la estructura de las protenas y las interacciones de inhibidores; la qumica combinatoria asistida por ordenador113, para el diseo de inhibidores y modelos animales con un valor muy predecible, para aumentar las posibilidades de xito de los candidatos de la droga principal en la clnica.

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3.6. Puntos de control

La E2F en G1/S, familia de factores de transcripcin, determina si una clula se divide por el control de la expresin de los reguladores clave del ciclo celular. Las E2Fs individuales se pueden dividir en subgrupos distintos que actan en oposicin directa entre s para promover tanto la proliferacin celular o en ciclo celular, la diferenciacin terminal de salida.114 Cul es la base molecular de estos interruptores de control? y cules son sus consecuencias biolgicas? El ciclo celular en mamferos es un proceso altamente regulado que est influido por seales tanto positivas como negativas de regulacin del crecimiento durante la etapa G1. Estas seales actan en el control de la actividad transcripcional de un factor celular llamado E2F. La activacin de E2F es suficiente para que la participacin sea irreversible en las clulas al someterse a la replicacin del ADN, por lo que E2F es crucial en el control de la proliferacin celular en clulas normales y tumorales115.

En la ltima dcada, la actividad de E2F se ha demostrado que surgen de la accin concertada de una familia de protenas que tienen distintas propiedades biolgicas de los dems. La forma E2F fue identificada y relacionada con el control del ciclo celular y el cmo la actividad del E2F individual est influenciada por su interaccin con los miembros de la familia de protenas de retinoblastoma.116 Da lugar a papeles opuestos, tanto en la activacin o inhibicin de la proliferacin celular. E2F fue descubierta originalmente como una actividad celular que se requiere para la regin 1A (E1A), la transformacin de las protenas de los adenovirus para mediar la activacin transcripcional del promotor viral E2; E2F controla la transcripcin de genes celulares que son esenciales para la divisin celular.117 Estos reguladores del ciclo celular codifican por ejemplo, a la ciclina E, ciclina A, Cdc2, Cdc25A, la protena retinoblastoma (pRB) y E2F1), enzimas que participan en la biosntesis de nucletidos y en los principales componentes de la maquinaria de replicacin del ADN (Cdc6, ORC1 y en protenas de mantenimiento minicromosoma (MCM)). En una elegante serie de experimentos en la dcada de 1990, Joe Nevins y colegas deducen cmo E2F est regulado en las clulas normales, determinando el mecanismo de activacin por E2FE1A.118 Factores de transcripcin E2F desempean un papel crtico en el control de la progresin

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del ciclo celular, regulando la expresin de genes implicados en la replicacin del ADN, la reparacin del ADN, mitosis y el destino celular.119 La asociacin del factor E2F de transcripcin con la pRb y protenas p107 parecen regular la actividad de E2F y, a su vez , afectan a la progresin del ciclo celular. Esto los llev a mostrar que E2F es inhibida por su asociacin con pRB, una protena conocida E1A-asociada y que estimula E1A a la entrada del ciclo celular por el pRB y la induccin de la liberacin de E2F transcripcionalmente activa.120 Al mismo tiempo, La Thangue identific una actividad celular llamada factor de diferenciacin de transcripcin regulada 1 (DRTF1), durante la diferenciacin de carcinoma embrionario F9 en clulas madre121. El sitio de unin al ADN de DRTF1 result ser el mismo que el de E2F, y DRTF1 tambin interactu con pRB. Ahora est claro que DRTF1 y E2F son el mismo factor. Es importante destacar que la afinidad de DTRF1 en microsecuenciacin condujo a la identificacin de un componente clave de la llamada protena DRTF1/E2F llamada DRTF protena 1 (DP1)122. pRb fue el primer supresor tumoral en ser identificado, y est ausente o mutado en al menos un tercio de todos los tumores humanos123. En las clulas no transformadas, la capacidad de pRb para unirse a E2F est regulada por la fosforilacin de su ciclo celular dependiente. pRB es hiperfosforilado durante G0 y G1 temprana, y se une e inhibe a E2F. Factores de crecimiento mitognico inducen a la activacin secuencial de los complejos quinasa dependiente de del ciclo celular Cdk4/Cdk6-ciclina D y Cdk2-ciclina E, que luego de fosforilar pRB provoca la liberacin de E2F. La activacin resultante de los genes E2F durante el final de G1 parece ser suficiente para que las clulas inicien la replicacin del ADN. Ocho genes humanos han sido identificados como componentes de la actividad transcripcional E2F124. Sobre la base de la homologa de secuencia y propiedades funcionales, estos genes se han dividido en dos grupos distintos: los E2Fs (E2F1 - E2F6), y las DPs (DP1 y DP2). Los productos proteicos de estos dos grupos heterodimerizan para dar lugar a la actividad funcional E2F, y todas las combinaciones posibles de los complejos de E2F-DP existen in vivo125. La completa secuencia del genoma humano no ha detectado a genes E2F adicionales DP. As, el reto ahora es comprender el papel especfico de los complejos individuales E2F-DP.

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La activacin de E2F. El miembro fundador de esta subclase, E2F1, se clon en virtud de su capacidad para unirse PRB126,127. E2F1 se demostr que se unen al ADN, de forma DP-dependiente, y el complejo resultante es un potente activador transcripcional de E2F promotor128. Posteriormente, dos grupos aislados ADN complementario de codificacin de E2F2 y E2F3 humano129. Estos dos E2F son altamente homlogos a E2F1 - especialmente en los mbitos que son responsables de unin al ADN, dimerizacin DP y PRB vinculante - y manifestaciones similares de unin al ADN y las propiedades de transactivacin. Estudios han demostrado que el lugar E2F3 expresa dos distintos transcripciones130. La transcripcin codifica las especies originales de E2F3 original, ahora designado E2F3A. La transcripcin segundo, llamado E2F3B, se transcribe a partir de un promotor reconocido previamente en el primer intrn del E2F3A, y su producto es idntico a la protena E2F3A excepto que carece del dominio amino-terminal131. Las propiedades de E2F3B an no se han descrito completamente. E2F1, E2F2 y E2F3a podra contribuir a la represin de los genes E2F-respuesta mediante PRB. Sin embargo, la determinacin de la sobreexpresin y modelos de ratn mutante indican que el papel fundamental de estos tres E2Fs es la activacin de genes que son esenciales para la proliferacin celular y la induccin de apoptosis. En consecuencia, nos referimos a este subgrupo como el E2F activos. Rol en el desarrollo normal. Cepas mutantes de ratn se han utilizado para investigar el papel de la activacin en E2Fs en el desarrollo normal132. E2F1 y E2f3 en ratones mutantes mostraron problemas de desarrollo completamente diferentes133. Con una proporcin significativa del E2f3-/-, los ratones mueren en el tero y la mayora de los sobrevivientes adultos mueren prematuramente de insuficiencia cardaca congestiva. Por ejemplo, la neurognesis es un proceso altamente regulado por el cual los precursores neurales se dividen y diferencian, dando lugar a las clulas que producen el sistema nervioso. El retinoblastoma (Rb) supresor de tumores es un regulador clave de ciclo celular, junto con otros han demostrado jugar una serie de papeles en el desarrollo neurolgico, incluyendo la proliferacin, supervivencia y ms recientemente, la migracin neuronal. La familia E2F de factores de transcripcin se compone de E2Fs 1 a 8 , sin embargo, E2F1, E2F2 y E2F3, la E2Fs llamadas activas, son la clave, objetivos de la interaccin Rb- mejor conocido por su papel en la promocin de la progresin del ciclo celular. Ambos E2F1 y E2F3 son candidatos probables implicados en Rb- que median la regulacin de la neurognesis. E2F1 y E2F3 son funcionalmente relevantes en la proliferacin de precursores neurales, clulas de salida del ciclo, laminar y

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patrones. Cada parte tambin interviene en la Rb requisito para la supervivencia neuronal. La migracin neuronal, sin embargo, est especficamente mediada a travs de E2F3, ms all de su papel en la regulacin del ciclo celular.134 Por el contrario, E2F1-/- ratones son viables y frtiles, pero tienen diferentes tejidos especficos anormales,135 estos incluyen un exceso de clulas T, que resulta de un defecto en la seleccin negativa, y el desarrollo de la atrofia testicular entre los 9 y 12 meses de edad. Por ltimo, y lo ms sorprendente, los ratones con deficiencia de E2F1 desarrollar un amplio espectro de tumores que se presentan entre 8 y 18 meses de edad. Tres posibles mecanismos han sido propuestos para las propiedades de supresin de tumores de E2F1. Inicialmente, esto se pens que era debido a la capacidad de E2F1 para participar en la represin de los genes E2F mediante la negociacin de pRB136. Sin embargo, la ausencia de tumores en ratones que son deficientes para E2F4, el E2F principal in vivo, plante sus dudas acerca de este modelo137. En la actualidad, muchos investigadores creen que E2F1 acta como un supresor del tumor a travs de su capacidad de inducir apoptosis.138 Sin embargo, otros estudios indican que E2F1 tambin podran estar implicados en la va ADN respuesta a daos139,140. Lo ms desconcertante es E2F1, se ha informado que asociado con NBS1 y la recombinacin Mre11/complejo de reparacin. Los autores proponen que E2F1 es necesario para el objetivo del complejo Mre11 cerca de los orgenes de replicacin del ADN para suprimir el despido de estos orgenes cuando el ADN est daado141. Una cuestin clave es preguntarnos si el E2Fs tiene diferentes funciones especficas o que se superponen. El campo ha comenzado a abordar esta cuestin mediante la generacin de cepas de ratones mutantes que carecen de las combinaciones de los genes E2F1 y E2F2, cooperan en la regulacin de la proliferacin celular y la diferenciacin hematopoytica y tambin en la supresin de tumores142. As como sus funciones se superponen en la induccin de la proliferacin y la apoptosis, E2F1, E2F2 y E2F3 parecen tener funciones fundamentales y se superponen en el desarrollo143. Por lo tanto, la supresin del tumor parece ser una propiedad especfica de E2F1 y E2F2, pero no E2F3. Las E2Fs represivas. La subclase segunda de la familia E2F es E2F4 y E2F5. Estos fueron identificados originalmente por el clonado en virtud de su asociacin con p107 y p130144. En consonancia con esta observacin, E2F4 y E2F5 estn regulados de manera diferente desde el E2Fs

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activo in vivo. En primer lugar, niveles significativos de E2F4 y E2F5, se detectan en reposo (G0) a las clulas, mientras que E2F1, E2F2 y E2F3a se restringe fundamentalmente en clulas en divisin cativa145. En segundo lugar, se unen a las protenas E2F subgrupos diferentes de bolsillo in vivo146. Considerando que la activacin de E2Fs estn especficamente reguladas por el pRB, E2F5 est regulado principalmente por p130 y E2F4 asociados con cada una de las protenas en diferentes puntos del ciclo celular. Como E2F4 se expresa en niveles ms altos que los dems miembros de la familia E2F, representa al menos la mitad de la pRb, p107 y p130-E2F actividad asociada in vivo. Regulacin por localizacin subcelular. En contraste con la activacin de E2Fs, E2F4 y E2F5 estos son pobres activadores transcripcionales en ensayos de sobreexpresin, y no pueden conducir a las clulas en reposo a volver a entrar en ciclo celular147. La actividad diferencial de los dos subgrupos E2F resulta de las diferencias en su localizacin subcelular: E2F1, E2F2 y E2F3 son constitutivamente nucleares, mientras que E2F4 y E2F5 son predominantemente citoplasmtica148. Estudios de mutagnesis han identificado la base subyacente de esta diferencia. El E2Fs activa una seal de base cannica de localizacin nuclear (NLS) en su dominio amino-terminal que es suficiente para mediar su localizacin nuclear149. Por el contrario, E2F4 posee seales hidrofbicas de exportacin nuclear (NES) y su localizacin citoplasmtica depende del factor de exportacin nuclear CRM1150. El DP-endgeno E2F4 y E2F5 DP-complejos son consistentemente detectado en el citoplasma, que indica que E2F4 y E2F5 no puede activar genes E2F in vivo, debido a su localizacin citoplasmtica. Significativamente, la asociacin con el pRB o p130 es suficiente para inducir la localizacin nuclear de estos E2Fs en vivo151. De hecho, en las clulas G0/G1, E2F4 y E2F5 se encuentra para la mayora de los complejos nucleares E2F-DP-protena. En estos complejos asociados con HDACs in vivo152, E2F4 y E2F5 se cree que son cruciales para la mediacin de la represin transcripcional de los genes E2F. La mutacin de los sitios E2F vinculantes, con conocidos promotores E2F-sensibles (tales como Bmyb, cdc2 y E2F1) conduce a la transcripcin de estos promotores en G0/G1153. En ensayos in vivo se demuestra que la viruta en niveles significativos de E2F4, p107 y p130 ocupan los promotores de muchos genes E2F durante las etapas del ciclo celular154. A medida que avanzan las clulas a travs del ciclo, los niveles de los complejos E2F4-DP-p107/p130 que se asocian con disminucin de los promotores, parece que se sustituye por el E2Fs activador. De manera significativa, la prdida de los complejos asociados promotor E2F4 se correlaciona con la disociacin de los complejos E2F4DP-protena y las exportaciones nucleares de los complejos libres E2F4-DP. Por ltimo, in vivo se muestran que los sitios E2F de la B-myb, cdc2 ciclina A2 y los promotores estn ocupados

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principalmente durante G0/G1155. Algunos grupos han interpretado esto como evidencia de que estos genes estn regulados exclusivamente por la asociacin / disociacin de los complejos de represin E2F. Sin embargo, como los bajos niveles asociados activan E2Fs, se detectan en la viruta y la prdida de E2F3 en gran medida perjudica la induccin del ciclo celular dependiente de estos objetivos genes, se concluye que la activacin de la transcripcin tambin tiene una funcin importante en la regulacin de estos genes. Induccin de la salida del ciclo celular y la diferenciacin terminal. Anlisis de MEFs que se derivan de E2F de protenas mutantes de ratn han proporcionado una visin bastante buena de las funciones biolgicas de la represin de los complejos E2F. MEFs que son mutantes para E2f4 y E2f5 o p107 y p130 tienen defectos en su capacidad para salir del ciclo celular en respuesta a diversas seales de detencin del crecimiento, incluyendo la sobreexpresin de p16 y contacto inhibidor156. Esto se correlaciona con la expresin inapropiada de un subconjunto de genes de respuesta a E2F157. Sin embargo, estas clulas mutantes todas pueden responder adecuadamente a las seales estimuladoras del crecimiento y no hay ningn cambio detectable en su capacidad proliferativa158. Por lo tanto, la prdida de los complejos de represin E2F-DP afecta slo la represin de los genes de respuesta a E2F y por lo tanto la capacidad para salir del ciclo celular. Los complejos E2F4/E2F5-DP tambin parecen ser cruciales para la regulacin de la diferenciacin. La sobreexpresin de E2F4 es suficiente para la diferenciacin de las neuronas159. Por otra parte, los defectos del desarrollo en el E2f4, E2f5 y p107; p130 cepas de ratones doble mutantes parecen ser el resultado de la diferenciacin celular defectuosa de diversos linajes160. Por ejemplo, el defecto primario en el E2f4-/- en ratones es la anemia fetal, que resulta de la maduracin aberrante la ltima etapa de la eritrocitis139. La transferencia adoptiva en los ensayos de progenitoras in vitro muestran que el defecto no est en la produccin de las clulas precursoras, sino en su diferenciacin terminal. Por el contrario, la p107-/-, p130-/- en ratones tienen un defecto en el desarrollo de los huesos largos que parece ser el resultado de un condrocito defectuoso162. Los condrocitos no salen del ciclo celular en la etapa de desarrollo correcta, y al someterse a varias rondas de divisin celular inapropiada antes de que finalmente inicie la diferenciacin. Estos estudios establecen un vnculo claro entre el E2Fs represivas y la regulacin de la salida del ciclo celular y la diferenciacin terminal. Pero todava hay preguntas que siguen sin resolverse. En primer lugar, cules son los papeles relativos de los miembros de la familia pRb en la regulacin de la represin? considerando que p107 y p130 se han detectado en asociacin con diversos promotores E2F-sensible, pRB es notablemente ausente. Es interesante especular que esto podra implicar la asociacin diferencial de las diversas enzimas de modificacin de histonas. Por ejemplo, la detencin temporal en G0/G1

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podra ser mediada a travs de la asociacin de p107/p130 y sus HDACs asociados, mientras que la liberacin permanente del ciclo celular podra ser forzada a travs de la unin de la propagacin pRB-SUV39H1-HP1 compleja y seguida del efecto silenciador. En segundo lugar, cul es el papel de los complejos de protenas E2F represivas en la diferenciacin terminal? Son necesarios simplemente para hacer cumplir una detencin del ciclo celular que es esencial para la diferenciacin, o tienen una funcin ms directa? Varios estudios proporcionan apoyo a este ltimo modelo. Por ejemplo, el CCAAT factores adipognica / potenciador de las protenas de unin (C/EBP) y proliferativa peroxisoma activados por los receptores Y (PPAR-Y) se ha demostrado que se unen a E2F y provocan diversas respuestas biolgicas161. Por otra parte, PRB tambin interacta con varios factores de transcripcin especficos de tejido, incluyendo C/ EBP y un factor de transcripcin llamado factor de osteoblastos vinculante bsico 1 (Cbfa1)162. En esta situacin, el PRB parece potenciar la actividad transcripcional de estos factores y por lo tanto promover el proceso de diferenciacin. E2F6 es el miembro ms recientemente identificado de la familia E2F y sus propiedades

biolgicas, slo ahora estn comenzando a emerger. Los residuos que son cruciales para la unin al ADN y las actividades de la dimerizacin E2Fs se conservan en E2F6, pero carece de las secuencias carboxi-terminal que son responsables tanto de la unin a protenas y la transactivacin163. Los estudios demostraron que la sobreexpresin E2F6 puede reprimir la respuesta de los genes E2F164. Se ha observado que la "represin de dominio" de E2F6 une RING1 y YY1 unin a protenas (RYBP), un componente de los mamferos Polycomb (PcG)165. En consonancia con esta observacin, los socios de E2F6 con numerosas protenas PcG conocidos in vivo, incluyendo la oncoprotena Bmi-1. Esto sugiere que las propiedades transcripcionalmente represivas de E2F6 estn mediados por su capacidad de reclutar el complejo PcG. Estn presentes muchas de las protenas PcG E2F6-asociadas de control de la expresin del desarrollo de los genes Hox, y en consecuencia la formacin de la axial esqueleto166. Adems, Bmi1 est implicada en la regulacin de la senescencia y tumorigenicidad. De hecho, Bmi-1 fue identificado originalmente como un sitio de insercin comn en la leucemia murina, Moloney virus (MoMLV) induce linfomas de clulas B en ratones transgnicos E-Myc167. La actividad transformadora de Bmi-1 parece depender de su capacidad de reprimir la p16INK4a y los genes supresores de tumores p19ARF, que se formulan desde el INK4168. En general, se infiere a que Bmi-1 media la represin directa de la transcripcin de INK4 a travs de su participacin en el complejo PcG. Sin embargo, no est claro si el Bmi-1 contiene asociados PcG con este locus. Como p19ARF

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es un conocido gen E2F de respuesta, es tentador especular que los actos E2F6 como el componente de secuencia especfica de unin al ADN de la Bmi-1 contienen complejos PcG. Modelos de ratones mutantes E2f6 sern cruciales en el establecimiento del cmo E2F6 contribuye a la regulacin de los patrones de desarrollo y senescencia por el complejo PcG. Conclusiones parciales. En la actualidad existe considerable evidencia de que en los mamferos los subgrupos E2F (E2F1, E2F2 y E2F3, E2F4 y E2F5) actan en la oposicin entre s para mediar la activacin o la represin de los genes E2F-respuesta y de ese modo promover ya sea la entrada del ciclo celular o su detencin. Los estudios realizados en Drosophila melanogaster brindan gran apoyo a este modelo "push-me-pull-you. Drosophila tiene slo dos protenas E2F: dE2F1, un potente activador transcripcional y dE2F2, que reprime la transcripcin de E2F-dependiente169. Sorprendentemente, los defectos que resultan de la prdida dE2f1 son casi completamente suprimidos por la mutacin de dE2f2, lo que indica que estas dos protenas antagonizan entre s in vivo171. En clulas de mamferos, el equilibrio entre la represin y la activacin de E2Fs parece ser controlada principalmente por el estado de fosforilacin de las protenas asociadas en respuesta a la detencin del crecimiento proliferativo. Sin embargo, dos cuestiones importantes por resolver. En primer lugar, no est claro cmo diferenciar las seales de interfaz con la regulacin de estos subgrupos E2F. Utilizan la misma maquinaria del ciclo celular al inhibir la fosforilacin de las protenas de poket y fomentan la salida del ciclo celular, o los cambios adicionales necesarios para cumplir detencin permanente del ciclo celular? En segundo lugar, todava tenemos que entender cmo E2F6 encaja en este cuadro. A falta de datos el circuito no est completo, no est claro si E2F6 regula todos o incluso un subconjunto especfico de los genes conocidos E2F-respuesta y si esto sucede en cada ciclo celular o se limita a una fase determinada de desarrollo. Por ltimo, tenemos que establecer cmo influye en la actividad E2F6 y la regulacin de los miembros de la familia, y para determinar las consecuencias biolgicas de su recurso. 3.7. Fase S

3.7.1.

Replicacin de ADN

Naturaleza helicoidal. El documento de investigacin biolgica ms famosos de 1953 - y, posiblemente, de todos los tiempos fue el de James Watson y Francis Crick donde reportan la descripcin de la estructura del ADN170. Esta doble hlice de bases apareadas en una estructura, explic cmo la replicacin del ADN podra ocurrir de manera tan precisa y, segn los autores, con

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cautela, declararon: "No escapa a nuestra atencin que el apareamiento especfico que hemos postulado sugiere inmediatamente un posible mecanismo de copia del material gentico". Sin embargo, fue otro documento, tambin publicado en 1953, pero ahora en gran parte olvidado, que sent las bases para el modelo del ciclo celular como la conocemos hoy en da. En 1944 Mac McCarty demostr por primera vez que el ADN es el material de la herencia, la materia llamada de la vida. Hasta entonces, los bilogos pensaban que los genes, las unidades de la herencia, estaban hechas de protenas171. En la dcada de 1950, la idea de que los cromosomas estn hechos de ADN se convino en general. De hecho, Hewson Swift coment que "el ADN se ha demostrado que poseen interesantes caractersticas que han llevado a varios trabajos como para considerarlo un componente esencial de la gentica"172. Sin embargo, el nmero de molculas por cromosoma y la naturaleza de su rgimen sigui siendo un misterio. Swift trat esta cuestin en 1950173, con un estudio para calcular la cantidad de ADN por ncleo en los tejidos vegetales. Pregunta si, como se haba encontrado a partir de estudios sobre los tejidos de los animales, todas las clulas vegetales contienen la misma cantidad de ADN (con los gametos contienen la mitad de ese valor), o si no hay patrones cuantitativos tales. Swift hizo mediciones fotomtricas en el maz Feulgen teido y los ncleos de Tradescantia para demostrar que "el ADN se produce en unidades bien caractersticas de la raza o especie". Tambin concluy que existe una duplicacin de este nmero en la mitosis y una reduccin en la meiosis. Esta duplicacin del ADN se estudi con ms detalle por Alma Howard y Stephen Pelc en 1953173. El uso de 3H-timidina como marcador biolgico no se introdujo hasta 1957 (por J. Herbert Taylor y sus colegas)174, por lo que Howard y Pelc tuvieron que conformar con
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P -una etiqueta

insatisfactoria, ya que ilumin todos los compuestos que contienen fsforo-. Por casualidad, sin embargo, los autores encontraron que con la extraccin con cido clorhdrico a 60 C eliminaban todas las etiquetas de fsforo no-ADN, lo que les permite seguir los cambios en los niveles celulares de ADN. Howard y los estudios de autorradiografa Pelc puso de manifiesto que la sntesis de ADN slo se produce dentro de un determinado perodo de tiempo limitado - el medio de la interfase - al principio del proceso de divisin celular. Este descubrimiento en ltima instancia condujo a la divisin del ciclo celular eucariota S, G1, G2, M y fases. El mecanismo detrs de la sntesis de ADN se desenred cinco aos ms tarde por Matthew Meselson y Franklin Stahl175.

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Propusieron que una etiqueta radioisotpica que aumenta la densidad del ADN podra permitirles el uso de tcnicas de sedimentacin para estudiar la distribucin del ADN. Para ello, desarrollaron un mtodo para detectar pequeas diferencias en la densidad de las macromolculas. Los autores utilizan la sedimentacin de gradiente de densidad en seguimiento de la distribucin del 15N istopo pesado del nitrgeno entre las molculas de ADN despus de una 15N-etiquetados en crecimiento exponencial de la bacteria escherichi, fue transferido a un medio de cultivo que contiene el istopo
14

N nitrgeno ordinario.

Meselson y Stahl encontraron que cada molcula de ADN consiste en dos subunidades, dos de los cuales contenan la misma cantidad de nitrgeno. Se descubri entonces que, una vez despus de la adicin de 14N, todas las molculas de ADN contenidas eran la mitad de la cantidad original de la etiqueta, y concluy que, "Despus de la replicacin, cada molcula hija ha recibido una subunidad parental". Tomando los dos resultados juntos, se declar adems que "el hecho resulta en una duplicacin de replicacin molecular". Meselson y Stahl resumieron sus resultados: "exactamente de acuerdo con las expectativas del modelo de Watson y Crick de la duplicacin del ADN", con la advertencia siguiente: "debe hacer hincapi en que no se ha demostrado que las subunidades moleculares que se encuentran en el presente experimento son cadenas de polinucletidos nica o incluso que las molculas de ADN estudiados corresponden a las molculas de ADN de una sola propuesta por Watson y Crick". En el transcurso del tiempo se ha demostrado, sin embargo, que sus predicciones resultaron ser correctas. Origen de replicacin. Un origen de replicacin es el lugar del cromosoma donde se inicia la replicacin de la cadena de ADN. Ya hemos dicho que un principio de la teora celular, es que todas las clulas vivas deben replicar su ADN una vez y slo una vez antes de dividir, y debern hacerlo con una precisin dura para garantizar que su herencia gentica se mantiene intacta. Los estudios clsicos en sistemas bacterianos y virales nos han educado en la idea de que la replicacin del ADN consiste en complejos de la ADN polimerasa, que se mantienen bidireccionalmente desde un punto fijo (el origen de replicacin). Las clulas eucariotas poseen normalmente varios cromosomas grandes, lineales, la rplica de la que es probable plantea grandes problemas logsticos adicionales y topolgicos, pero el ADN y los componentes de protena implicada en la determinacin de los pasos de la replicacin del ADN eucaritico, han sido definidos poco a poco en las ltimas tres dcadas. Los primeros trabajos de Stinchcomb, Struhl y Davis, junto con estudios posteriores por Brewer y Fangman y por Huberman y colegas utilizando experimentos plsmidos manejables, los condujo a

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la identificacin de la replicacin autnoma (ARS) de secuencias176. Estos son elementos cortos de ADN que son capaces de dirigir la replicacin de las molculas de ADN ligadas y que, por tanto, revela las propiedades esperadas de los orgenes de replicacin. El pensamiento actual es que el origen de numerosas posiciones a intervalos de aproximadamente 30 kilobases sirven para orquestar la replicacin completa del genoma de la levadura. Los orgenes varan en su eficacia y se dividen en clases que son activos en diferentes puntos de la fase S, lo que indica que an queda mucho por aprender sobre cmo la replicacin de los cromosomas eucariticos se organizan. La caracterizacin de los orgenes de replicacin de levadura proporcionan los reactivos necesarios para identificar las protenas celulares que se unen a estos sitios. Un complejo de seis protenas, conocidas como ORC o complejo de reconocimiento del origen, fue demostrado por Bell y Stillman, al obligar a los orgenes de replicacin de la levadura en una forma dependiente de ATP177, proporcionando una plataforma esencial sobre cmo se basa la replicacin del ADN. Diffley Cocker present pruebas de que un complejo multiproteico pre-replicativo monta sobre los orgenes de replicacin de la levadura en la fase G1 del ciclo178, y ahora sabemos que esto incluye junto con el ORC genticamente definidos componentes Cdc6 y el MCM6 (implicadas en el mantenimiento minicromosoma). Este complejo incluye factores de replicacin de licencias, que sirven para garantizar que la replicacin exista slo una vez por ciclo celular. El inicio de la replicacin es disparado en la fase S por la activacin de CDK, despus de que las protenas se asocian para comenzar la fase de elongacin de la sntesis de ADN. Aunque los orgenes de replicacin de ADN de mamferos siguen estando sin concluir, no hay razn para creer que el paradigma de los orgenes pre-programados no ser verdad en los eucariontes superiores. Parece probable que los enfoques genmicos y post-genmicos llevarn al progreso en la definicin de la ubicacin y las propiedades de los orgenes de replicacin en el sistema eucariota, y que una mayor caracterizacin de los componentes proteicos de los aparatos de reproduccin, con el tiempo, ofrecern una imagen ms completa de los mecanismos fundamentales que permiten la replicacin del ADN precisa y ordenada en organismos eucariotas, actualmente se desarrollan molculas de ADN circular con un origen de replicacin condicional, su procedimiento de preparacin y su utilizacin es vital en terapia gnica. La invencin de una nueva molcula de ADN con replicacin condicional, utilizable en terapia gnica o para la produccin de protenas recombinantes ya es una realidad179.

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Para obtener ideas sobre la regulacin de los inicios de la replicacin, sistemticamente se asigna replicacin origen a lo largo del 1% del genoma humano en clulas HeLa. Hasta 2008 se han identificado 283 orgenes, 10 veces ms de lo que se conocan. Origen es la densidad que se correlaciona fuertemente con los paisajes genmicos, con racimos de pocos espaciados orgenes en las regiones ricas en GC y no orgenes en las grandes regiones GC- pobres. Origen, son secuencias evolutivamente conservadas y la mitad de ellos mapea dentro o cerca de las islas CpG. La mayora de los orgenes se superponen a elementos reguladores de la transcripcin, proporcionando una prueba ms de una conexin con la regulacin gnica. Por otra parte, se identific c-Jun y c-Fos como importantes reguladores del origen de seleccin. La mitad de los sitios de inicio de replicacin identificados no tienen una configuracin de la cromatina abierta, mostrando la ausencia de un vnculo directo con la regulacin gnica. Mapas de orgenes sugieren que una relativamente estricta programacin origen, regula la replicacin del genoma humano180. Pausa impregnante RAD9. La detencin de G2 es seguida del dao en el ADN, por lo que los cientficos buscaron en una levadura mutante en ciernes, defectos para esta detencin. Al contar el nmero de brotes presentes en una microcolonia, 10 horas despus de la irradiacin, los investigadores demostraron que la mayora de las clulas fueron detenidas luego de los daos al ADN. Las clulas que se dividen seguidas a la presencia del dao, una gran proporcin de ellas murieron181. La fase de una clula se detiene en cuando se encuentra con agentes perjudiciales. Clulas haploides nativas G1 no tienen cromtida hermana, ni un cromosoma homlogo, por lo que son ms sensibles al dao del ADN de la fase S y G2, utilizan la paridad de ADN para reparar roturas de doble cadena. Como tal, estas clulas G1 detenidas mueren despus de la irradiacin. Si la funcin principal de RAD9 es la de mediar esta detencin como punto de control, en lugar de reparar el dao en el ADN directamente, RAD9 todava debe tener la capacidad para reparar - dado el tiempo suficiente, (ver http://www.yeastgenome.org/cgi-bin/locus.fpl?locus=RAD9 ). Cuando las clulas humanas incurren en daos en el ADN, dos respuestas fundamentales puede seguir, detencin del ciclo celular o apoptosis. En humanos RAD9 (hRAD9) la funcin de p53 est presente en ambos procesos, pero la relacin mecanicista entre sus actividades se desconoce; p53 media el control en G1 por la regulacin transcripcional de p21. Se ha reportado que hRAD9 y p53, tambin pueden regular a p21 a nivel transcripcional, se demostr que la sobreexpresin de hRAD9 lleva a un aumento p21 ARN, se demostr que hRAD9 puede controlar la transcripcin de genes. Se sugiere que hRAD9 y p53 co-regulan a p21 directamente en la progresin del ciclo celular por mecanismos molecular similares.

35

hRAD9

se

identific

originalmente

como

un

homlogo

estructural

de

la

levadura

Schizosaccharomyces pombe RAD9 y es capaz de complementar parcialmente la radio sensibilidad, la sensibilidad hidroxiurea y control de defectos de RAD9; adems, hRAD9 tambin funciona como un mediador de muerte celular. El gen supresor tumoral P53 juega un papel fundamental en el control del ciclo celular, la apoptosis y la estabilidad gentica182. p53 acta como una secuencia especfica de unin al ADN y activa la transcripcin por unin de secuencias distintas de ADN. P53 es un regulador negativo de la progresin del ciclo celular y los controles de transicin de G1a la fase S del ciclo celular. P53 es necesaria para la respuesta del ciclo celular al dao del ADN causado por la exposicin a la radiacin183. P53 de tipo nativo controla estos procesos mediante el control de la transcripcin de genes, mediante su unin a sitios consenso de ADN en las regiones promotoras184. P21 es un inhibidor universal de la ciclinas/CDK y funciona como un freno para la progresin del ciclo celular mediante la inhibicin de las ciclinas y las quinasas dependientes de ciclinas, como CDK4 y CDK6185. P21 es necesario para la detencin del ciclo celular mediada por P53, en la radiacin inducida para causar daos186. Debido a que P21 es un factor clave en el control del ciclo celular, la regulacin de P21 es un paso crtico para la respuesta del ciclo celular al dao del ADN y otros tipos de estrs ambiental. En sntesis, hRAD9 y p53 tienen un papel importante en el control del ciclo celular y la apoptosis, lo que sugiere que estas dos protenas podra funcionar coordinadamente. Estos resultados proporcionan evidencia de que hRAD9 y p53 co-regulan a p21 para controlar la progresin del ciclo celular de G1 a S. Usando la tecnologa de micromatrices de ADN, se ha demostrado que hRAD9 puede regular la expresin de otros genes, adems de p21. Esto sugiere que la modulacin de la transcripcin gnica podra ser un mecanismo por el cual hRAD9 controla mltiples procesos celulares. E2F y RB. El E2F (un heterodmero de E2F y protenas DP) de la familia de factores de

transcripcin, son reguladores importantes de la transicin G1 / S del ciclo celular, debido a que E2F puede activar la expresin de los genes en fase S, necesarias para la concesin de replicacin de ADN119. Tambin ya hemos dicho que E2F es un represor actuando con un miembro del retinoblastoma (RB). E2F-RB complejos ADN-vinculados reprimen la transcripcin al ocluir el dominio de transactivacin de E2F y mediante la asociacin de la histona deacetilasa (HDAC) que

36

altera la actividad de la estructura de la cromatina187. La fosforilacin de RB resultante en la transcripcin de genes activos E2F impulsa a las clulas a la fase S119. Los estudios de clulas de mamferos han sugerido que E2F y RB tambin regulan negativamente la fase S, pero su papel exacto en el control de la replicacin del ADN todava no se ha dilucidado. Del mismo modo, los estados de fosforilacin RB son importantes para la finalizacin de la fase S en forma independiente del gen E2F188.

3.7.2.

Reparacin de ADN

Un axioma fundamental de la herencia gentica es el requisito de estabilidad gentica excepcional sobre muchas generaciones de clulas y organismos. Sin embargo, las clulas tienen que lidiar con ambientes intra y extracelulares que constantemente desafan la estabilidad qumica del genoma. Adems, aunque la normalidad en las transacciones metablicas de ADN como la replicacin, la recombinacin y la reparacin son generalmente de gran precisin, hay lmites a la fidelidad de estos procesos, dndose el modo de inestabilidad genmica. La evolucin darwiniana clsica es, por supuesto, estrictamente dependiente de las muchas fuentes de variabilidad gentica que se presentan en las poblaciones de las clulas germinales, as que la nocin de "estabilidad gentica excepcional es relativa. A pesar de la inestabilidad gentica (es decir, las mutaciones) en la lnea germinal, se proporciona el escenario en el que la historia de la evolucin biolgica se desarrolla constantemente, las consecuencias de las mutaciones en las clulas somticas - como resultado de dao en el ADN causado por la exposicin a agentes ambientales - suelen ser nocivas, como el cncer en el ser humano. Cmo son las clulas en los organismos de mamferos protegidos contra las consecuencias perjudiciales de estas mutaciones? Las respuestas a esta pregunta se derivan en parte de nuestra comprensin del fenmeno de la reparacin del ADN en clulas humanas normales, as como de una enfermedad hereditaria humana llamada xeroderma pigmentosum (XP), que se caracteriza por la reparacin del ADN defectuoso y un riesgo notablemente mayor de cncer de piel que est asociado con la exposicin a un carcingeno ambiental en particular, la radiacin ultravioleta.

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El dao y la reparacin del ADN. Un simple nucletido (un punto) mutado, suele ser generado por la replicacin del ADN que ha adquirido algn tipo de base daada189. El dao de base, a su vez, se deriva de diversos mecanismos intracelulares (dao base espontneo), as como agentes extracelulares (dao base del medio ambiente) que alteran la qumica y/o la secuencia de las bases nitrogenadas en ADN190. T. Lindahl estima que en conjunto, las diversas fuentes conocidas de daos base espontneas que es alrededor de 25.000 bases alteradas para el genoma humano por clula al da, de los 3x109 bases en el genoma. Con respecto al dao del ADN del medio ambiente, la radiacin ultravioleta es una fuente potente que nos expone en todas partes y el dao del ADN se manifiesta ms en la piel. Otra fuente son los carcingenos qumicos, que causan dao al ADN en las clulas que son accesibles para ellos (sobre todo el tracto aerodigestivo) despus de su ingestin, inhalacin o su entrada en el cuerpo por medio de otras vas192. Existe la real posibilidad de que las mutaciones causadas por el dao base se realicen mediante la replicacin del ADN defectuoso a travs de estas lesiones191. Pero el dao base tambin puede dar lugar a la replicacin del ADN permanentemente detenido y/o en la transcripcin, dando lugar a clulas muerte192. De hecho, la carga de dao base de origen natural y fuentes relacionadas con el ambiente sera incompatible con la vida a menos que las clulas estn dotadas de mecanismos especficos para la reparacin de daos en el ADN y las mutaciones puedan ser mantenidas a niveles razonables. En los ltimos aos hemos sido testigos de avances impresionantes en nuestra comprensin de los muchos mecanismos por los cuales las clulas mitigan las consecuencias potencialmente letales y mutagnicas de dao en el ADN. Una de las principales respuestas biolgicas al dao del ADN es la reparacin del ADN - por vas bioqumicas- por ejemplo, la presencia de uracilo en el ADN y bases mispaired se restauran a su estado nativo193. Por lo tanto, uno puede ver la carga mutacional en un momento dado, tanto en la lnea germinal y en clulas somticas como el resultado de un equilibrio dinmico entre el grado de dao en el ADN, la eficiencia de reparacin del ADN (y otras vas celulares que regulan y modulan la reparacin del ADN), y en clulas en divisin, la proximidad fsica de la replicacin del ADN daado avanzan a los sitios por delante del dao. Reparacin por excisin del nucletido daado. La reparacin de la excisin de nucletido (NER) es uno de varios mecanismos de reparacin del ADN por el cual las bases daadas se eliminan del genoma193. El proceso incluye la extirpacin de dichas bases, como parte de un fragmento de oligonucletidos, a diferencia de la reparacin por escisin de bases (BER)194, por el que el dao o bases inapropiadas son extirpadas como base libre o de reparacin de genes (MMR)195, por la que se

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extirpa mispaired bases de nucletidos indiv a b viduales. Mien ntras NER en las clulas humanas es un n proceso bioqumico complejo que requiere varias proten 196. Las pr o o q v nas rotenas hum manas necesar rias para el NER se mon ordenada de forma escalonada en los sitios de dao base qu son sustratos l ntan as, e n e ue de la NER197,198. Es conjunto genera un co N ste omplejo mult tiproteico gra ande (algunas veces referi s ido como la escisin de nucletid dos repairoso oma)199. Los estudios e la levadu s en ura, un mode elo mativo de muc chos aspectos de la NER en humanos, indican que algunos de e s estos complej jos inform podra ser preensam mblados en las clulas, deli s iberadamente no expuesto a daos en el ADN200. S e, os n Sin go, os ostrado contr roversia201. E complejo de El embarg las conclusiones de estos estudio han demo reparac cin es una verstil "mqu v uina NER" qu pueden rec ue conocer much tipos de d hos dao base que a menud tienen poc o ninguna semejanza estructural o qumica, una incisin (ni do ca e a N ick) de ADN a distanc cias precisas a cada lado del dao ba exclusiva ase amente en la daada cade de ADN, y ena fragme entos de oligo onucletidos especiales que incluyen el dao base ( v Figura 5). In vitro los tr e e ver res eventos bioqumico han sido re os eproducidos con el uso de protenas pu c urificadas NER humanos o la R ura levadu 202.

Fig. 5. Las caracter sticas esencia de repara ales acin por exci isin de nucle etidos

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Los primeros pasos de NER en ADN transcripcionalmente en silencio. Los tres eventos que son especficos de NER se entienden con bastante detalle203,204: el reconocimiento del dao, la incisin bimodal de ADN y la extirpacin de los fragmentos de oligonucletidos. La capacidad de la maquinaria NER a reconocer muchos tipos de dao base y discriminar estos del ADN en buen estado, as como el ADN de posibles tipos de dao base que no son sustratos de la NER, ha planteado un reto formidable. Este problema an no se ha resuelto completamente. Sin embargo, se sabe que varias subunidades de la mquina multiproteica NER se requieren especficamente para este proceso205. Estos incluyen una protena llamada XPC206, que se encuentra mutado en personas con xeroderma pigmentoso genticos de complementacin GRUPO C (XP-C)207, una segunda protena XP, XPA y un complejo de tres protenas, conocidas colectivamente como la replicacin de la protena A (RPA)208. Proteico purificado XPC se une preferentemente a ADN que contiene varios tipos de dao de base que son sustratos de NER (ver Figura 5). Sin embargo, los determinantes moleculares precisas que promueven esta unin no se conocen. Tambin hay evidencia de estudios in vitro que la unin de protenas en el ADN daado XPC es limitante para el proceso de NER, lo que indica que esta unin es una de las primeras, si no el evento inicial, bioqumicos en NER209. El genoma humano contiene dos ortlogos relacionados pero no idnticos del gen RAD23 levadura NER. Las protenas codificadas por los genes humanos estn llamados HHRAD23A y HHRAD23B (por homlogo humano de RAD23)210. Cuando purificada a partir de clulas humanas, XPC es un complejo con HHRAD23B211. In vitro, la tasa neta de matrcula puede proceder en ausencia de HHRAD23B, pero la eficiencia de la reaccin in vitro es mejorado mucho gracias a su presence213. Una tercera protena llamada centrin2/caltractin1, presente en el centrosoma de varios organismos, ha sido identificada recientemente en el complejo XPC/HHRAD23B y se muestra para ayudar a la estabilizacin de la protena por XPC HHRAD23212. Esta asociacin plantea interesantes posibilidades para las relaciones normativas entre NER y la divisin celular. XPA es una metaloprotena que tambin se une preferentemente a muchos tipos de ADN daado in vitro y el RPA (antes llamado cadena simple unin a protenas) se une con avidez a una sola cadena de ADN. Los tipos de dao de base que promueven la NER generando algo de anulacin de los dplex de ADN, promoviendo as la unin de la RPA. XPA y el RPA se cree que se unen al ADN despus de la unin de XPC-HHRAD23. Un modelo con el apoyo de experimentos bioqumicos indica que el reconocimiento de todos los tipos de dao base en NER requiere dos elementos fundamentales: la interrupcin de la base normal de Watson y Crick, y la qumica alterada en el

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apartado de daos, que suele implicar a las bases213. Una discusin detallada del reconocimiento de daos de la base durante el NER est fuera del alcance de esta revisin tutorial, sigue siendo un reto importante para explorar. El reconocimiento especfico de los sitios de sustrato para la NER es seguido por el ensamble gradual del resto de la maquinaria de NER, que incluye al menos los polipptidos que se muestran en la figura 5. Entre ellos est uno llamado ncleo subcomplejo factor de transcripcin IIH (TFIIH), compuesto por seis subunidades214. Estas seis subunidades (junto con las protenas adicionales) constituyen uno de los varios ARN polimerasa II BASALES factores de transcripcin, que son necesarios para la iniciacin de la transcripcin por la maquinaria de transcripcin RNA polimerasa II202. Sigue siendo una pregunta intrigante evolutiva en cuanto a cmo este factor de transcripcin basal particular, se convirti en parte del complejo multiproteico NER. En el centro de este proceso de reparacin estn las dos helicasas del ADN: XPB y XPD, subunidades de TFIIH, que se cree que favorecen esta funcin durante la transcripcin y el NER215. Durante la transcripcin, en el proceso de desenrollado (formacin de burbujas) facilita la iniciacin de nuevos transcriptos de ARN mensajero216. Por el contrario, la correccin de ADN durante la NER por TFIIH genera uniones discretas entre doble cadena y una sola cadena de ADN en los bordes de las estructuras de burbuja217. Estas uniones son fundamentales para la incisin correcta de ADN durante la NER. Otras tres subunidades del complejo NER son integradas por dos endonucleasas que cortan las uniones de doble cadena y una sola cadena de ADN con la polaridad definida. La actividad endonucleasa de XPG corta el ADN daado cadena 3' a los sitios de base daados, mientras que la actividad endonucleasa de la protena ERCC1-heterodimrica XPF corta la cadena daada 5'. La distancia entre estas incisiones en la cadena de ADN daado es de 30 nucletidos. La base daada siempre se encuentra ms cerca de la incisin de 3' que a la incisin de 5'. Sin embargo, la distancia exacta entre las incisiones vara de un tipo de dao base a otro, as como la ubicacin exacta de la base daada con respecto a cada incisin.218 La presencia de incisiones de ADN complementarias bases daadas genera un fragmento de oligonucletidos que se separa del ADN. El mecanismo exacto de esta escisin no se ha establecido. Es casi seguro que no es un proceso pasivo, como base simple de vinculacin una distancia de 27-30 nucletidos se oponen a ello. Tambin es probable que la escisin de oligonucletidos es temporal, y posiblemente de manera mecnica, ligada a la reparacin de sntesis de ADN, de modo que la formacin de grandes lagunas de cadena simple que

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podran ser suscepti n ibles al ataqu de nucleasas, lo que efe ue fectivamente c corta el geno oma, es evitar la r excisi durante el oligonucletido (ver Figur 6)198. n o ra

Fig. 6. Algoritmo NER. N

3.8. GAP 2 P ercera fase de ciclo celula preparaci para mitos o fase M. En G2 se da la ruptura de la el ar, n sis e Es la te membr rana nuclear, la condensac cin de la cro omatina y la r reorganizaci del citoesq n queleto. Prime ero precisa aremos algunos conceptos. El citoplasm formado p el citosol y citoesquel ma por l leto, tiene com mo funcin albergar a los orgnulo celulares y contribuir al movimien de los m n os nto mismos. Adem ms contien una com ne mpleja red de estructura mecnica de microtb d a bulos que constituyen el citoesq queleto. El ci itosol o hialo oplasma es el medio ac cuoso (85% a agua) del cit toplasma don nde ocurren muchos pro n ocesos metab blicos que se dan en las clulas, se d e divide en ecto oplasma (regi in

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exterior) y endoplasma (regin interna). El citoesqueleto, estructura tridimensional interna de la clula, mantiene a otras estructuras unidas entre s, y a otras estructuras celulares por diversas protenas accesorias; adems de responder a movimientos mecnicos, da forma a la clula y transportan sustancias.

3.8.1.

Ruptura de la membrana nuclear.

El ncleo separa los contenidos del citoplasma con una estructura de membranas nucleares, donde el ncleo se comporta como un sistema independiente bioqumicamente hablando. La comunicacin ncleo y citoplasma es a travs del complejo de poro nuclear, controlando selectivamente el paso de RNAs y protenas. El ncleo se forma por un sistema de doble membranas concntricas -interna y exterior-. La membrana nuclear exterior es continua con el E-R. Adems, la membrana nuclear exterior es funcionalmente similar a las membranas E-R y delimita la superficie citoplsmica. La envoltura nuclear consiste en dos membranas recorridas por los complejos de poro nuclear. En la mitosis el poro complejos nuclear se desmantela y se dispersan las membranas. El mecanismo de dispersin es controvertido: un punto de vista es que se alimentan de las membranas en el retculo endoplasmtico. Con el uso de extractos de xenopus, los ncleos han sido ensamblados y posteriormente inducidos a la interrupcin por la adicin de extracto de metafase. Con ayuda de la emisin de campo de microscopa electrnica de barrido se estudia el desmontaje. Sorprendentemente, el retculo endoplasmtico, formado por tbulos y membranas de la superficie nuclear, despus de la adicin de los extractos de la metafase, se observaron vesculas. Los inhibidores de los microtbulos se desaceleraron, pero no evitaron la remocin de la membrana, mientras que Brefeldin A, que inhibe la formacin de vesculas, detiene el desmontaje de membrana, lo que sugiere que es necesaria la vesiculacin. Las estructuras que parecan capullos recubiertos observaron brotes, fueron etiquetados como beta-COP. Se ha demostrado que los complejos nucleares del poro se desmantelan y el poro se mantiene cerrado con anterioridad a la ruptura de membrana, lo que sugiere que la ruptura es un proceso activo ms que un resultado de la ampliacin de los poros nucleares APN. (NE, la envoltura nuclear; el INM, la membrana nuclear interna; ONM, la membrana nuclear externa; NPC, complejo poro nuclear; ER, el retculo endoplsmico).219 Las membranas nucleares son bicapas fosfolpidas que slo son permeables a las molculas no polares pequeas e impermeables impidiendo el paso a otras molculas. Las membranas nucleares internas y exteriores se unen en el complejo de poro nuclear220. Mirando por debajo de las membranas nucleares encontramos las lminas nucleares, constituidas por protenas

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lmina La lmina nuclear es de unos 10 nm de espes estructura 221 formadas por una ma as. a sor al s asa
222 nuclear entre los 60 y 80 KDa kb, kiloDalto pertenece a la familia d filamentos intermedios2 . r on-, e de s

Se pie ensa que la lmina nucle sirve com un sitio d atadura d la cromati l ear mo de de ina, adems de
3 propor rcionar el apo estructura al ncleo223. Las nuevas ideas se apo oyo al s oyan en modelos basados en

que los cromosoma y la cromat s as tina crean un interfase en torno al am na n mbiente nuclea que regula la ar a activid del gen, no slo dur dad rante el ciclo celular, tam o mbin sirve para produc la estructu cir ura funcion que se llam interfase nuclear.224 nal ma n

Fig. 7. Dominios nu ucleares225 3.8.2. Condens sacin de la c cromatina.

En 199 Haaf y Sc 91, chmid afirman la existenci de un orde de patrones que organiz el ncleo de n ia en s zan la clu 226. Se ha propuesto que repetitiva secuencias actan com centro es ula q as s mo structural de la
7 extensi y conden in nsacin de la cromatina227. Por lo tanto la compar o, rtimentacin d la cromati de ina

podra proporciona un marco estructural para explic ar el eficien tratamien de suces ar o nte nto sos nuclear 228. En la base de esta hiptesis, la naturaleza es res specfica de l compartim la mentacin pod dra
2 reflejar el estado fisiolgico de una clula229. Sin emba r f e argo, cabe de estacar que u principio de un

validez universal de cromosoma no existe228. z el a La idea de la organi a izacin territo orial de los cro omosomas fu primero pro ue opuesta por R C. en 188 Rabl 85. Rabl predijo que los cromosoma conservan la integridad estructural, y especula sobre la identid as dad gentic de todo el ciclo celular postul que el territorio de cada crom ca l r, e mosoma ocup para una regi in concreta del ncleo, manteniendo su propia co , o oherencia, y e evita mezclars con los dem territorio se ms os.

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Ahora, como resultado del desarrollo y los avances tcnicos de los mtodos in situ, los cromosomas individuales o regiones cromosmicas pueden ser visualizados directamente en el interior del ncleo y sus posiciones pueden ser seguidas en todo el ciclo celular. Por medio de hibridaciones in situ de ADN del cromosoma especfico; inmunofluorescencia y microscopa electrnica, es posible su reconstruccin en tres dimensiones, y dems debido a alta resolucin en autorradiografa in situ que se han empleado con xito para estudiar la distribucin espacial y funcional de la organizacin del ncleo en la interfase228. Cremer y colegas en 1993 propusieron un modelo de prediccin para la superficie de los territorios cromosmicos y un espacio formado entre ellos proporciona una red similar en tres dimensiones nucleares para la expresin de genes, ARNm y el transporte, llamado el compartimento dominio intercromosmicas (ICD)230.

3.8.3.

Reorganizacin del citoesqueleto

Salida G2 la banda preprofase PPB. El citoesqueleto tiene la apariencia de un gel por su estado ms o menos viscoso, su constitucin recae bsicamente en tres tipos de protenas: los filamentos de actina, los microtbulos y los filamentos intermedios. Estos polmeros favorecen el desarrollo de estructuras geomtricas perfectas, permiten sufrir cambios: deformaciones y reorganizaciones. El ensamblaje y la reorganizacin de los filamentos intermedios est ligada a la actina y los microtbulos a la plectina. El citoesqueleto tiene un papel fundamental en la mitosis, que es la etapa del ciclo celular en donde los cromosomas duplicados se separan fsicamente y forman dos nuevos ncleos, y en la citocinesis durante la particin de una clula en dos. Ambos procesos son llevados a cabo por elementos del citoesqueleto y existen diferencias importantes entre clulas animales y de plantas. Las plantas no tienen centrosomas y tampoco centriolos. En plantas la estructura del huso mittico consiste de cientos de microtbulos y de protenas que se asocian a stos. Citocinesis es el fenmeno por el cual se reorganiza el citoesqueleto. Las clulas vegetales estn rodeadas por muros que definen sus formas y fijan sus posiciones con los tejidos. En consecuencia, el establecimiento de un marco celular de la planta durante el desarrollo depende en gran medida de las posiciones en que nuevos muros se forman durante la citocinesis. Los experimentos con diversos enfoques sobre la base de los estudios clsicos arrojan luz sobre los mecanismos que subyacen el control espacial de la citocinesis.

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Hace ms de 100 a los bilog de plantas reconociero que la orien m os, gos on ntacin de la divisin para la a mayor de las clu a ulas se podr predecir po sus forma En 1863, Hofmeister o a or as. observ que las paredes de clulas nuevas se for n rman en un plano perpend dicular al eje principal de la expansin de
31 clulas - es decir, perpendicular al eje longitu lula madre23 . En 1888, H s udinal de la c Herrera formu ul

la regla de que el ej de la divis a je sin para la mayora de la clulas veg m as getales se corr responde con la n trayect toria ms cor que reduc rta cir a la mit el volum de los m tad men madres clulas La evidencia s. experim mental apoya la idea de un relacin directa entre l forma celular y el plano de la divisi a na d la o n, que pro oviene de estu udios en los que las forma se han alter q as rado mediant la aplicaci de una fuer te n rza de com mpresin, clu esfricas en grupos multicelulares o aislada p la suspen ulas s m s, por nsin de clu ulas individ duales en med semi-sli 232, se div dios idos viden en las or rientaciones a azar. Sin em al mbargo, cuan ndo se com mprime en for rmas ovaladas las clulas se vuelven m sesgadas hacia la divis s, muy sin en el pla ano perpen ndicular, al eje mayor del valo. e

Fig. 8. Reorganizaci del citoes in squeleto. lamentos de actina se distr a ribuyen por to la corteza celular dura oda a ante la profas pero algun se, nos Los fil estn claramente alineados con los microt c a n bulos del P PPB. Cuando los PPB m o microtbulos se desmon a la entrada en mitosi el compon ntan is, nente de la act tina del PPB t tambin desa aparece, dejan ndo tras de s una zona de actina emp d pobrecido en la corteza de la clula que persiste y m e marca el lugar de isin a lo lar de la mi rgo itosis y la ci itocinesis. De espus de la terminacin de la mitos a n sis, la divi microt bulos y filam mentos de act se inician entre los nc tina n cleos hijos, qu gua el mo ue ovimiento de las vescul de Golgilas -derivados qu contienen materiales de la pared ce ue e elular de la p placa celular. A medida que avanz la citocine a za esis, se expa ande centrfu ugamente ha asta que se fusiona con la

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membr rana plasmt tica de los padres y la pared celul en el lug de la d p lar gar divisin cortical anterio ormente ocupa por PPB. ado En el inicio de la mitosis, los microtbulos corticales en la mayora de las clul vegetales se m n a las nsan en un estrecho anillo alrededor del ncleo, la b banda preprof fase (PPB)233. Que determi ina conden el plan de divisin celular en el futuro. Junt con los mi no n e to icrotbulos y filamentos c citoplsmicos se mueven en el plano de divisin celular para crear un do o n a ominio citoplasma - enriq quecido en e esta ubicaci in, la forma acin de PPB se acompa de un au B aa umento dram tico en la d densidad de los microt bulos perinu ucelar, que despus se re d eorganizan en el huso mit n ttico. El PP en vegeta PB ales desapa arece por com mpleto durant la cariocin te nesis, que es mediada p un huso mittico cuy st por yos polos, en ausencia de centrosoma no son tan bien enfocad como en las clulas an d as, n dos nimales y care ece os D se a ura de los microtbulo astrales. Despus de la anafase, s desintegra el huso y una estructu microtu ubular involu ucrada en la generacin de una pared celular, la placa celula entre los d d ar dos ncleos hijos recin formado dur n rante la citoci inesis. Inicial lmente, se col loca en el cen de la clu ntro ula isin y tiene la forma de un pequeo cil l n lindro. Sus co omponentes p principales so dos conjuntos on en divi opuesto de microt os bulos paralelos que se ali inean a lo lar del eje de cilindro y l superposici rgo el la in en un plano centr ral, donde se inicia la formacin d chasis d la clula. La formaci s del de in asmtica es le enta durante la citocinesis En la telof s. fase, la envo oltura nuclear se reforma, se r citopla descon ndensan los cr romosomas, el huso mittico se rompe y se forma el fragmoplasto 234 e o. 3.9. Fase M F

3.9.1.

La nano omquina cito oesqueltica.

os Las clulas eucarion dependen de los polm ntes n meros citoesq quelticos y lo motores m moleculares pa ara ecer sus form asimtric mas cas, transpor rtar a los co omponentes i intracelulares y manejar su s estable motilid dad. Los bi logos celula ares y biof sicos se est tn acercand experimen do ntalmente a la

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compre ensin de la base molecula del movim b ar miento celular y a explicar q defectos en las proten qu nas causan las enfermed n dades. La ma ayora de la maquinaria m m molecular para motilidad h evoluciona a ha ado desde el eucarionte primitivo, comprender un juego lim e c u mitado de prin ncipios gener rales que pue ede explica la motilidad de la mayor de las clu ar d ra ulas. Tres polmeros citoesqueltico 235 - los filamentos de actina (microfilame p c os ento), tubuli ina (microtbulo) y fila amentos interm medios (ver Tabla 1) par T rticipan para mantener la i integridad fsica ulas tes; c res res, nto. de clu eucariont y junto con los motor molecular permiten a las clulas el movimien Aunqu la motilida celular co ue ad omo campo de investigaci y aplicac d in cin en mate de salud es eria relativa amente muy reciente, su empleo se ha extendido como resul o ltado de mod delos sobre los mecani ismos moleculares, la pa articipacin citoesqueltica y molcula de motilid en much c a as dad hos aspecto de la funci celular, in os in ncluso embrio ologa, aprend dizaje y mem moria, la expan nsin del cnc cer y la patognesis microbiana. El ensambl cuidadosam p le amente regul lado de los polmeros d del citoesq queleto y la accin de los motores asoc a ciados, es pri incipalmente responsable de establecer la r arquite ectura celular y as la estruc ctura del tejid do.

omponentes de citoesquele el eto. Tabla 1. Co

Tabla 2.- Pr rincipales frm macos de acci sobre los microfilamen y microt in ntos bulos.

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Este apartado pretende introducirnos al fascinante mundo del movimiento mecnico celular. Se explica cmo ensamblaje y desmontaje de microtbulos transportan algunas molculas intracelulares, cromosomas y organelos.236 Las clulas de locomocin son caracterizadas por una polaridad anterior-posterior externa e interior pronunciada, se cree que esta posicin es de importancia estratgica para el movimiento celular direccional y polaridad de la clula,237 adems los motores moleculares que actan recprocamente con los filamentos actina y microtbulos para generar la tensin en el citoesqueleto, as como para mover cargas tan grandes como los ncleos y tan pequeas como las molculas de ARN.238 Surgen preguntas del cmo las clulas usan polmeros citoesquelticos y motores moleculares para generar la asimetra o, interactividad con la dinmica del aparato de Golgi.239,240,241 Se aprovecha para intentar contestar esta pregunta, que los organismos infecciosos pueden secuestrar el sistema de motilidad para sus propios propsitos;242 sobre la segregacin de cromosomas durante la mitosis y citocinesis.243 Cuando estudiamos ingeniera observamos una extraordinaria similitud con la geometra de campos magnticos con limaduras y los polmeros citoesquelticos, adems de los motores que congregan las mquinas complejas temporalmente, para llevar a cabo los procesos vitales con una alta precisin. Las mquinas usadas para la locomocin celular, el transporte intracelular, mitosis y citocinesis consisten en millones de molculas que se mantienen unidas por relativos enlaces dbiles, enlaces no covalentes unen y permite a estas mquinas desmontar y reciclarse. Las investigaciones citan mutaciones de ankyrin (parte del esqueleto de la membrana) que causa un tipo de arritmia cardaca,244 titin en cardiopatas245,246 y en myosin-II en los defectos congnitos del cerebro,247 adems de otras enfermedades como las de rin, y diabetes.248,249,250 Sin duda la investigacin de la divisin celular crece porque las posibilidades de aplicacin gracias al conocimiento de sus mecanismos pudieran llevar a mejoras en el tratamiento de enfermedades como el cncer, Alzheimer 251,252,253 y por supuesto la nanomquina que es responsable para el huso mittico y citocinesis.254,255 Pero para entender este camino de enorme esfuerzo y talento hemos agrupado algunos hitos que dieron forma camino a la Biotecnologa, ver tabla 3.

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Tabla 3. El camino a la Biotecnologa.

Decimosexto siglo 1590 El microscopio se inventa por Zacharias Janssen, un fabricante del espectculo holands Decimosptimo siglo 1663 La primeras clulas son descritas por Robert Hooke 1675 Antony Leeuwenhoek, un relojero holands, descubre las bacterias. 1796 Cientfico britnico Edward Jenner inocula a un nio para protegerlo de la viruela, el nacimiento de la vacuna de la viruela Decimonoveno siglo 1800 Karl Friedrich Burdach acua el trmino biology denota el estudio de la morfologa humana, la fisiologa y psicologa. 18334 Anselme Payen y Jean-Franois Persoz aslan el diastase ( amilasa) en la forma de polvo de la malta cebada y postula la importancia central de enzimas en la biologa 1838 Gerardus Johannes Mulder acua el trmino protena 1854 Louis Pasteur descubre la fermentacin microbiana 1855 Coli Escherichia (E.coli) la bacteria se descubre; sta se vuelve el caballo de trabajo durante los das modernos de la gentica de diseo 1863 Gregor Mendel descubre los rasgos hereditarios ms tarde determina los genes 1864 Ernst Flix Emmanuel Hoppe-Seyler realiza la primera cristalizacin de una protena, la hemoglobina, 1866 Ernst Heinrich Hckel supone que el ncleo de una clula transmite la informacin hereditaria 1871 Johann Friedrich Miescher asla una sustancia de los ncleos de las clulas de la sangre que l llama nuclein, qu viene mas tarde a ser llamado cido nucleico o ADN 1875 Eduard Strasburger describe los procesos mitticos con precisin en la divisin celular 1877 Wilhelm Friedrich Khne propone el trmino enzima (significando levadura) y distingue las enzimas de los microorganismos que las producen 1878 Carl de Laval inventa la primer centrfuga 1888 Heinrich Wilhelm Gottfried Waldeyer nombra el cromosoma 188090 Walther Flemming, Eduard Strasburger, Edouard, Beneden y otros elucidan la esencia de los hechos de divisin celular y enfatizan la importancia de la igualdad cualitativa y cuantitativa de cromosoma en la distribucin en clulas hijas 1890 Emil Adolfo Von Behring descubre los anticuerpos 1892 Dmitri Iosifovich Ivanovski descubre el virus, agente de enfermedad, ms pequeo que las bacterias 1893 Wilhelm Ostwald demuestra que las enzimas son los catalizadores 1897 John Jacob Abel y Alberto C. Crawford aslan la primer hormona, la epinefrina, despus nombrada por Jokichl, Takamine. Vigsimo siglo 1900 Hugo DeVries (Holanda), Jarl Correns (Alemania), y Von de Erich Tschermak-Seysenegg (Austria) demandan haber descubierto independientemente (verificado) Los principios de Gregor Mendel, marcando el principio, de las genticas modernas 1902 Emil Fischer y Franz Hofmeister demuestran que esas protenas son los polipptidos 1903 Carl Neuberg usa por primera vez el trmino bioqumica 1906 C.W.Woodworth y William Ernest Castle introducen la Drosophila como un nuevo material experimental para los estudios genticos Mikhail Semenovitch Tsvett usa primero la tcnica de cromatografa mientras los pigmentos de la planta se separan de su nombre 1908 Archibald Edward Garrod reconoce que los productos de un gen son las protenas 1911 El primer virus causante de cncer lo descubre Francis Peyton Rous 1912 Alexis Carrel desarrolla la tcnica del cultivo de tejido in vitro El Seor William Henry Bragg y Seor William Lawrence Bragg desarrollan la tcnica de cristalografa de Radiografa, que se usar despus en ella elucidacin 3-D de las estructuras de protenas y los cidos nucleicos 1913 Alfred Henry Sturtevant desarrolla el primer trazo gentico usando las frecuencias crossover como los dimensiones de distancias relativas 1914Se usan bacterias para tratar el alcantarillado la primera vez para en Manchester, Inglaterra 1915 Frederick Twort descubre un virus capaz de infectar y que destruye las bacterias 1917 Flix Hubert D'Herelle, independientemente de Fredelerick Twort, descubre un virus capaz de infectar y destruir bacterias, l llama un bacteriophage 1920 La hormona de crecimiento humana se descubre por Evans 1925 Theodor Svedberg inventa la ultra centrfuga y l determina las proporciones de la sedimentacin de protenas 1928 El seor Alejandro Fleming descubre la accin antibacteriana de la penicilina 1932 M.Kroll y Ernst August Friedrich Ruska construyen el primer microscopio electrnico 1937 George William Marshall Findlay y F.O. MacCullum descubren el interfern 1938 el trmino biologa molecular es acuado

1941 Selman Abraham Waksman acua el trmino antibitico para describir compuestos producidos por los microorganismos, bacteria de muerte. El trmino ingeniera genticaes usado por el microbilogo dinamarqus A.Jost en una conferencia sobre la sexualidad, reproduccin en la levadura, en el Instituto Tcnico en Lwow, Polonia, 1944 Oswald Avery, Colin MacLeod, y Maclyn McCart demuestran que la tranformacin bacterial es causa del ADN 1945 Brand informa del primer anlisis del aminocido completo de una protena,

1956 Joe-Hin Tjio y Johan Alberto Levan revisan la estimacin de Walther Flemming 1898 de la cuenta de cromosomas humanos de 24 pares, hasta 23 Arthur Kornberg descubre la polimerasa I, de ADN qu lleva a la comprensin de la replicacin de ADN 1957 Mahlon Bush Hoagland, Paul Charles Zamecnik, y M.L.Stephenson aslan el ARNm y postula su funcin 1958 Francis Harry Compton Crick enuncia el dogma central de la gentica molecular, es decir, los flujos de informacin de ADN a ARN a la protena

1975 Una conferencia internacional se emplaza en Asilomar, CA, instando las pautas estrictas para regular la recombinacin. La investigacin de ADN da los primeros anticuerpos monoclonal. Southern demuestra el eficiente mtodo de hibridacin DNADNA. 1977 Genentech (San Francisco Sur CA), La primer compaa de la ingeniera gentica se funda para usar la recombinacin de ADN para producir importantes medicamentos drogasLas primeras recombinaciones en el ADN

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beta-lacto oglobulina, por m todos qumicos y microbi iolgicos. 1946 El primer ejemplo de recombinacin p e gentica se registra, combinando el c entes virus para material gentico de difere n rus formar un nuevo tipo de vir 1947 B rbara McClintoc descubre el ck elemento transposable o g saltador en gen maz. njamn Minge Dug ggar descubre el 1948 Ben aureomic cina, el primer antibitico tetraciclin na 1949 Lin Carl con mues nus stras de Pauling muestra las propiedades electroforesis s s diferentes para hemoglobina normal; esto demuestr ra que mutacio ones genticas conllevan cambios qumico especficos en n o las molc culas de la protena a. 1950 Inse eminacin artificia de ganado, se al usa el sem helado y es substancialmente men cumplido o 1952 Alf fred Day Hershey y Martha Chase demuestr ran, en base a su investigacin s bacteriofa ago, deducen que el ADN solo e lleva la in nformacin gentic ca. 1953 Jam mes Dewey Watson y Francis Harry Compton Crick describen la C estructura molecular de ADN con a el precisin 19534 Vincent du Vignea lleva a cabo V aud en labor ratorio la prime era sntesis de oxitocina de hormonas pptidos y a vasopresi ina 1955 Se evero Ochoa y M. GrunbergManago descubren la fos sforilacin del etido y con xito sintetizan ARN s polinucle

1961 Franois Jacob y Jacque s Lucien in postulan la funci del mensajero RNA 1965 Genes que llevan la resisten e ncia a los antibiticos en las bacterias se e encuentra e omas en para residir en los cromoso superpequeos llamados plsmid l dos 1966 El cdig gentico se descifra, go mientras se dem muestra as que una sucesin a de tres nucletidos consistiend en un do codn cada uno determina los 20 aminocidos ma 1969 Una enzim se sintetiza por primera r vez in vitro ra eta 1970 La primer sntesis comple de un gen es cumplida a Howard Martin Temin y David B Baltimore ente descubran l los virus: independienteme retrovirusesRN capaz de tran NA nscripcin inversa, es deci la sntesis de ADN de ir, una plantilla de ARN A La primera enzim de restriccin s asla ma se 1972 La compos sicin de ADN de humanos se descubre, r 99% similar al de orilas. chimpancs y go 1973 Stanley Norman Cohen y Herbert N Wayne Boyer ue s demuestran qu esas enzimas de la restriccin pued den usarse para transferir los genes de una especie a otra; a Se implantan lo plsmidos de A os ADN con xito en las clu de E.coli, dem ulas mostrando la posibilidad as de clonar lo genes os as nas extranjeros en la clulas bacterian

ecular incorporan ADN mamfero, se mole duce en las bacteri ias introd Se de esarrollan los proc cedimientos para u una rpid secuenciacin de las seccion da nes larga de ADN Genom as maLa vi iruela se erradica m mundialmente 1978 Somatostatin es producida con el s odo mto de recombinacin de ADN 9 mona de crecimien nto 1979 La primera horm ana huma se sintetiza 1980 La Corte Suprem americana aprue 0 ma eba principio de las formas de vi s ida el p gent ticamente diseadas, para patente 1981 La Anemia de la clula Sickle se ve ermedad gentica en vuelv la primera enfe ser d diagnosticada direc ctamente a nivel d del gen, por anlisis de re estriccin enzimti ica DN de AD El pr rimer animal transg genico, un ratn 2 ndrome severo es 1982 Un nuevo sn cterizado, el det terioro del sistem ma carac inmu unolgico, se rec conoce y dado el nomb de Sndrome d inmunodeficienc bre de cia Adqu uirida (AIDS m conocido com s mo SIDA A) La primera prote na genticamen nte ada, Humulin , e aceptada para es dise el tra atamiento de diabe etes 1983 Kary B. Mullis in nventa un mtodo, la , cin en cadena de la polimera asa reacc (PCR un mtodo p clonar rpida y R), por a fcilm mente El pr rimer cromosoma a artificial se sintetiz za 4 o V 1984 El genoma entero del virus de HIV se a clona y se secuencia.

1985 To omando las hue ellas dactilares gentico se introduce en las salas del n a tribunal americano. Las pla antas genticame ente diseadas resistente a los insectos, los virus se e prueban en campo . e 1987 La primera prueba en campo de una n bacteria genticamente alte g erada que inhibe la formac cin de escarcha en la cosecha de e las planta de fresa y patata en California as a 1988 Co ongreso aprueba el fondo del Proyecto Genoma. 1989 El gen responsable para la fibrosis s cstica es descubierto 1990 Un esfuerzo internac cional por trazar todos los genes en el cue s erpo humano se lanza baj el patrocinio del Proyecto de jo d Genoma Humano. er tal El prime gen experiment federalmente aprobado para el tratamien de la terapia o nto es un asu unto humano con xito realizado La prime vaca de lecher transgnica se era a crea p ncer de pecho se 1994 El primer gen de cn descubre e 1995 El primer trasplante de mdula de m e hueso mandril-humano se realiza en un paciente con SIDA c 1996 Un gen asociado con la enfermedad n nson se descubre de Parkin 1997 Es clonando un animal, una oveja, se c

1998 La secue encia del genom de un ma animal, -C. elega es completada ans, a Primer cultivo in vitro clula madre as umanas embrionarias hu 1999 La secu uencia del gen noma de Drosophila se co ompleta Vigsimo prime siglo er 2000 Se produc cerdos clonad de las cen dos clulas de cerdo. yecto de la suce esin del El primer proy genoma humano es completado o 2001 El Proye ecto de Genoma Humano estima que el genoma contiene aproximadamente 30,000 genes protenacodificada. d 5 de diciembre del 2002 Inicia el compar rativo del genoma del ratn y el humano. 25 Abril 2002

T Tecnolog glos de ADN qu pueden ue a de Microarreg descubrir la pre esencia o la expr resin de

25 Ju 2002 ulio Prote eger el vasto nm mero de compuest tos qum micos para hallar un poco que pue eda volve erse las drogas de futuro, es la tar el rea de lo laboratorios cln os nicos del siglo XX XI, esta t tecnologa desafa el ensayo, much a hos ensay gran velocidad y bajo costo.256 yos, 24 de Abril 2003 e Dato s tiles extrados de la sucesin d del n ero genom humano es un desafo mayor pe ma Lisa Melton examina los pasos hacia el genot tipo personal.257 17 de julio del 2003 e Una n in nueva escala de estudios de expresi de g genes en los gu usanos nos perm mite vislum mbrar la bioqum mica compleja el rango de vida - lifespan 258 o n-. 8 de j julio del 2010 VRC C01 en conta acto con gp1 120 princ cipalmente, a trav de las regiones V s

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informa por cientficos escocs

miles de genes simultneamente son una herramienta importante en la interpretacin de la masa de informacin gentica que sale de los programas de secuenciacin del genoma.

derivados de genes alterados sustancialmente a partir de sus precursores genmicos, facilita la neutralizacin del VIH -1 por anticuerpos humanos naturales259

3.10.

Mitosis

La mitosis es una serie ordenada de eventos fundamentalmente mecnicos en que se mueven copias idnticas del genoma a dos lugares discretos dentro de la clula en divisin (ver figura 10). Las vas para coordinar los microtbulos base-MT (huso mittico) y base-Actina (anillo contrctil) durante la mitosis y citocinesis, ya la investigacin cientfica las revela260 y en las ciencias de la salud aplica este conocimiento para combatir las enfermedades. En la divisin celular, la estructura citoesqueltica formada por microtbulos organiza dentro de un huso bipolar los cromosomas, polarizacin que segrega los cromosomas reproducidos en dos clulas. La exactitud de la segregacin se basa en la atadura de todos los cromosomas antes de que la anafase inicie, en la atadura de la segregacin ocurren dos mecanismos, uno de bsqueda y otro de captura al encoger y crecer los microtbulos que emanan del centrmero, ste ltimo acta como separadores recprocamente con los cromosomas condensados.261 Algunos microtbulos alcanzan una regin llamada proteinaceous especializada y localizada en el centrmero al azar (cinetocoro, Fibra-K), se reclutan progresivamente otros microtbulos fijando el cromosoma eficazmente al polo del huso. La accin similar entre la Fibra-K hermana y el polo opuesto lleva a la biorientacin del cromosoma con microtbulos que no participan en formacin de K-Fibras recprocamente o actan como brazos del cromosoma. Cuando todos los eventos tienen lugar cada

cromosoma de la clula en divisin se sujeta simultneamente a fuerzas polares que actan en la cinetocoros con la fuerza antipolo.262 La combinacin de estos resultados de fuerzas en movimiento de los cromosomas, contribuye su biorientacin y su alineacin en la metafase. En la mayora de las clulas, una va favorablemente de transduccin sealada, llamada punto de chequeo' del huso, supervisa estos eventos e impide a las clulas entrar en la anafase, y a los cromosomas segregar y emigrar hacia los polos opuestos prematuramente.263 El estudio de la Mitosis data de 1880,264 (ver tabla 3), durante este tiempo las especulaciones sobre las fuerzas polares de eyeccin han planteado: son generadas simplemente por el impacto del crecimiento de microtbulos en los cromosomas, los microtbulos amitticos son muy inestables y

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la crom matina mitt tica es muy elstica, ap poyados en i investigacin con microp n pipetas.265 O Otra posibil lidad que ha sido consider s rada y ahora muy aceptada es que los motores mol a, leculares que se localizan a lo largo de los brazos del cromoso s oma podran g generar estas fuerzas. Dura mos ante los ltim aos, esta idea se ha reforzado con la ident e h tificacin de algunas prot tenas como kinesin (KLP Ps) asociad con los brazos del cro das omosoma. Inic ciando el sigl XXI un bu candidato para un mo lo uen o otor de eyeccin polar fue identificad Este moto es Xenopu (human Kid kinesin-lik DNA bindi fu do. or us d, ke ing
66 n) on somas durante la mitosis.26 e protein asociado co los cromos

Fig. 10 Eventos Mi 0. itticos En figu 9, Xkid no se requier para la reu ura n re unin del hus pero es ese so encial para la alineacin d a del cromos soma, mueve los brazos de los cromo e d osomas hacia el ecuador d huso, em a del mpezando en las fases tempranas de la mitosis y continuando hasta metaf o fase. Juega un papel en la alineacin d n a del cromos soma, Xkid debe degrada d arse a travs de una send ubiquitin-d da dependiente p para permitir la r migrac cin de crom tidos a los po durante la anafase. olos

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8 Fig. 9. Fuer rzas de eyecci polares.268 in

3.10.1. Motores moleculares s o edades intrnsecas, los mot tores molecul lares han sido considerados los candidatos o Debido a sus propie ideales por generar las fuerzas in s nvolucradas en los movim e mientos del cro omosoma dur rante la mitos sis. De hec cho, durante los ltimos a se han encontrado va l os, arios motores moleculares que localizan a n los cro omosomas y median las clases diferen c ntes de intera acciones crom mosomamicr rotbulo que se perfil anteriorment 267 te. En la luz de recien ntes resultad 269 nosotro repasamos el conocim dos, os s miento actual de los pape eles os otores cromo osoma-asociad durante l mitosis. In dos la nteresantemen algunos de nte, jugado por los mo ellos no funcionan convencion n n nalmente, es decir, por la carga de t a tranlocacin a lo largo d del microt bulo, pero los papeles relacionaron a la atadura del microtb l r bulo, reunin del huso y la n activid de punto de control de huso. dad d

uctuaciones de los motores actina cereb 268 y crom s bral matina-asociad llevan a la alineacin d dos del Las flu cromos soma a la met tafase. Las flu uctuaciones No-equilibrad abstractas como stas, p N das pueden mane ejar el transporte vector a lo largo de una estru rial o uctura anistr ropa en un m medio isoterm torciendo el mal o mal m os os n pio, efecto de ruido term (kBT). Se llaman a menudo a esto mecanismo basados en este princip mecani ismo Brown niano ratchet y se han invocado c t como una posible explic cacin para el
269 funcion namiento de motores biomoleculares y bombas.2 No preten s ndiendo hace una profun er nda

discusi in termodin nmica y cintica para el funcionam c miento Brow wniano ratchet microscpico, t

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podemos asegurar que la mitosis bajo las condiciones pertinente a la biologa es un movimiento Browniano.270 Adems Winds sugiere que bombas moleculares como las Na, K-ATPasa y los motores moleculares como la quinesina kinesin-271 y miosina myosin-272 puedan compartir un mecanismo subyacente comn. Timothy C. Lestn, explica la correlacin en la flexibilidad de movimientos de protenas a lo largo de una exhaustiva vida en la investigacin cientfica en este importante campo, adems da algunos ejemplos de motores se moleculares recomienda (http://elston.med.unc.edu/index.php?option=com_content&view=category&layout=blog&id=48&Itemid=61,

apreciable lector, revisar este fascinante trabajo-.273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285 Las fuerzas de eyeccin polares son investigadas en laboratorios altamente tecnificados, se generan por microtbulos que actan recprocamente con los brazos del cromosoma (ver imgenes microscpicas 3D en http://www.wadsworth.org/databank/cells.htm).286,287,288 La proporcin de estos microtbulos es inconstante entre las especies y cosas correlativas con la eficacia de alineacin del cromosoma y estabilizacin en el plano metafase.289,290 Esta observacin apoya la idea de que la fuerza de eyeccin polar juega un papel importante en la alineacin del cromosoma en el plano metafase y errores a partir de puntos de control generan enfermedades como el cncer.291 Punto de control del huso, supervisa el cumplimiento de requisitos especficos antes de que la clula pueda entrar en la anafase. Estos requisitos incluyen la atadura de microtbulos a cada cinetocoro, la formacin de las K-fibras y el establecimiento de tensin entre el cinetocoro de los defectos en cualquiera de estos eventos previenen el punto de control del huso de volverse inactivos y as impiden a las clulas entrar en la anafase. Los recientes datos sugieren que algunos motores del cinetocoro pueden cumplir las funciones de punto de control. La microinyeccin celular de anticuerpos dirigidos contra el dominio CENP-E no daa la alineacin del cromosoma pero inhibe la transicin a la anafase, implicando que adems de su funcin estabilizadora las interacciones del cinetocoromicrotubular, CENP-E est envuelto en el mando de abordaje de la anafase.292 Este freno requiere BUBR1, un componente de la maquinaria del punto de control. CENP-E acta recproca y directamente con BUBR1 BUB1 un gen de levadura exigido para asegurar la progresin correcta de la reunin del huso mittico, son dos las protenas quinasas relacionadas en humanos BUB1 y BUBR1. Se localizan en el cinetocoro durante la anafase, en las cuales se especula el papel de retardo de la anafase hasta que todos los cromosomas logren la atadura correcta del huso bipolar- pero no se requiere para la localizacin del

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cinetocoro de BUBR1 o Mad2, otro componente de punto de control de huso esencial.293 As, CENP-E no se requiere para la activacin de punto de control de huso y probablemente acta bajo el flujo de la maquinaria de punto de control de huso, bajo el mando de BUBR1, y puede exigir imponer el punto de control del huso en alto. Es posible que, en estos extractos, CENP-E cumple funciones de punto de control diferentes que se llevan a cabo por motores distintos en las clulas somticas. La reciente identificacin de CENP-E en Drosophila presta el apoyo a esta idea.294 Se pensaba inicialmente que Dynein, era el primer motor en ser encontrado en cinetocoro, era un primer candidato para las fuerzas polares generadoras que mueve el microtbulo hacia los extremos enfocados a los polos del huso. De hecho, Dynein puede controlar el movimiento de cromosoma en la corriente dominante que ocurre inmediatamente despus de la primera interaccin entre un microtubulo y un cinetocoro.295 La importancia de este evento es el papel extenso que este motor juega en la alineacin del cromosoma en plano metafase, sin embargo, incierto. De hecho, ni la inhibicin de Rough Deal (Vara) ni de Z-blanco 10 (Zw10), las protenas conservadas que Dynein designa al cinetocoro daa la alineacin del cromosoma.296,297 Dynein parece ser principalmente activa durante la anafase en el punto que realmente se requiere para el movimiento del cromosoma a los polos.298 La exactitud de la segregacin de los cromosomas descansa en la eficiencia de los motores moleculares asociados. Las fuerzas ejercidas sobre los cromosomas y las molculas importantes ya descritas en lneas atrs. Dynein y Xkid son los nicos motores en actividad convencional, manejando cromosomas como actividad convencional, es decir, manejando cromosomas como carga a lo largo del microtbulo. Alternativamente, los movimientos durante la mitosis pueden ser principalmente impulsados por la dinmica microtubular, que parece ser regulada por los motores ya identificados. En el cinetocoro, CENP-E y Xkcm1/MCAK pueden funcionar cooperativamente. Es factible que estas actividades combinadas puedan ser suficientes para generar una corriente polar de movimiento durante la mitosis. Aunque especulativo a estas alturas del desarrollo cientfico, podramos pensar que un mecanismo similar podra permanecer oculto a las herramientas tecnolgicas del laboratorio del umbral del siglo XXI, a nivel de los brazos del cromosoma. Motores moleculares acoplados a factores que promueven el crecimiento microtubular podran estar contribuyendo a las fuerzas de eyeccin polar y migracin de cromosomas hacia el plano metafase. Un trabajo con una mayor integracin multidisciplinar, requiere la caracterizacin de todos los motores interactuando y los modos de

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regulacin que permiten los movimientos coordinados de los cromosomas a lo largo del curso de la mitosis. Los hechos expuestos en los reporte de investigacin ya referidos mantienen la idea de que motores cinetocoros descansan en un aspecto mecnico del control del huso, esto abre nuevas lneas de investigacin en el campo de motores moleculares. Los puntos de control y sealizacin, el objetivo y el estmulo de actividad ya son en alguna manera identificados. Los motores moleculares estn emergiendo como el eslabn perdido entre los estmulos y las vas de sealizacin. Sin embargo, los motores involucrados y sus modos exactos de accin, actividad y la imposicin de silencio al punto de control del huso todava tienen que ser caracterizados totalmente. Como conclusin nos surgen muchas preguntas irresolutas acerca de las contribuciones respectivas de tensin y atadura de Fibras-K en la actividad de punto de control. Sin duda un aspecto orientador es el hecho de que los motores cinetocoros moleculares son importantes para el extenso y complejo proceso mittico. El desarrollo del huso mittico y el anillo contrctil, la seleccin natural ha diseado con precisin fascinante, movimientos mecnicos generados por un conjunto de protenas citoesquelticas. Estas mquinas ya se mencion que segregan los cromosomas y dividen la clula con una enorme exactitud. Tambin mencionamos como corrientes de investigacin cientficas actuales se centran en los mecanismos, regulacin morfognesis del huso, motilidad de cromosomas y la citocinesis, dando nfasis en cmo los dinmicos conjuntos de polmeros del citoesqueleto y los motores moleculares cooperan para generar las fuerzas que guan la clula a travs de la mitosis y citocinesis. Durante el siglo dcimo, el descubrimiento de la reproduccin celular, por divisin, iluminaron el mismo origen celular y se volvieron estos conocimientos; la piedra angular de la teora celular. En este escenario aparecen los esfingolpidos, son componentes ubicuos de membranas eucariontes y se requieren particularmente en la membrana del plasma. Clsicamente se ha considerado juegan un papel estructural en las membranas, para la va metablica, adems, se reconoce ahora como un sistema de sealizacin importante. Metabolitos derivados del rompimiento del complejo esfingolpido o algunas veces por la sntesis novo, son favorablemente molculas bioactivas que se implican como segundos mensajeros que median diversas funciones celulares. El metabolito ms estudiado es la ceramidasa, un componente central de la va esfingolpida. Ceramidasa no slo es un

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ladrillo para la sntesis del esfingolpido, se cita adems un papel de mensajero en stress en muchos sistemas biolgicos, incluso en respuesta al golpe de calor o vas apoptosis, senescencia celular, el ciclo celular y diferenciacin.299 Ver MCRI Molecular Motors Group Publications http://www.mcri.ac.uk/Research+Groups/

Terminologa

Aberracin cromtica, ADN reparacin, ADN replicacin, APC, ARS, VER, Biomecnica, Biorientacin, Brefeldin A, Browniano ratchet, BUB1, CDC 2, Cdc 28, Cdc genes, CDC53, Cdc8, CDK, CDK2, CDK4, CDK6, CDK8, clula, Clula somtica, Centrmero, Centrosomas, CEWP-E, Ciclina E, Ciclinas, Ciclo celular, Cinetocoro, Circuito gentico, Citocinesis, Citoesqueleto, Citoplasma, Cromatina, DTRF1, Dynein, El huso, Endosimbiosis, ER, Esp1, Fase M, Fibra K, Fotosistema, Fragmoplasto, G0, Gap1, Gap2, Gen, Hereditas, Hidrotrmicas, Hrad9, ICD, IGF-1R, Ingeniera gentica, INK, INM, Mad2, MAPK, MCM, MCRI, Metafase, Microscopa, Microtbulos, Mitocondria, Mitosis, MMR, Motores moleculares, MPF, mRNA, NER, NF1,NF2, NPC, ONM, P120, P300, p53, PcG, Polaridad celular, Polmero citoesqueltico, PPB, Protoplasma, Puntos de chequeo, RAD23, RAD9, Radiacin ultravioleta, RAF, RAS, RB, Regulacin gentica, Robert Brown, Robert Hooke, RPA, Scc1, SCF, Sistema dinmico, Subuniverso, T160, T172, Tensin superficial, TFIIH, Theodor Schwann, Tubulina, Ubiquitn, Urey y Malmero, WAF, Walter Flemming, Xenopus, Xkid, XP.

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