ENZIMOLOGIA e BIOQUMICA CLNICA

PUCPR 2009 Profa. Mauren Isfer

Protenas catalisadoras que aumentam a velocidade das reaes sem serem, elas prprias, alteradas nesse processo

[S] + [E]

[ES]

[P]

1. No geram sub-produtos indesejveis; 2. Atuam em condies brandas de pH, temperatura e presso; 3. Especificidade pelo substrato; 4. Controle das vias metablicas.

ENZIMAS
ESTRUTURA das ENZIMAS Todas possuem estrutura 1, 2, 3 A maioria possui estrutura 4 (associao de subunidades ou protmeros) A alterao da estrutura acompanha-se de perda de atividade irreversvel)

ENZIMAS
ISOENZIMAS

Enzimas com estrutura primria (seqncia de AA) diferente, catalisando a mesma reao (mesma funo), codificadas por genes estruturais diferentes. Formas moleculares mltiplas de uma enzima.
Isoenzimas diferentes podem originar-se de tecidos diferentes, e sua determinao especfica pode fornecer pistas em relao ao stio da patologia. Isoenzimas genticas e no genticas (isoformas modificao ps-transduo)

desnaturao (reversvel ou

ENZIMAS
ESPECIFICIDADE

ENZIMAS
CLASSIFICAO em RELAO s REAES QUMICAS CATALISADAS

A zona sombreada so os aminocidos desta enzima (protena) que configuram, neste caso, o centro ativo da enzima

ENZIMAS
CLASSIFICAO em RELAO AO SEU LOCAL

ENZIMAS PLASMTICAS
Fatores que afetam os nveis enzimticos no plasma ou no soro

1) Enzimas especficas do plasma

Trombina, plasmina, lipoprotena lipase.

Presente em concentrao mais elevada, especfica do plasma e tem papel funcional no plasma.

2) Enzimas secretadas* 3) Enzimas celulares*

LDH, FAL, AST, ALT.

Lipase, amilase, colinesterase.

* Normalmente esto em concentrao muito baixa e no tem papel funcional no plasma. Aparecem no sangue incidentalmente e tem valor diagnstico.

A leso dos tecidos de origem ou a proliferao aumentada das clulas de onde surgem estas enzimas levaro a um aumento da atividade dessas enzimas no plasma.

ENZIMAS de DIAGNSTICO
Para que o diagnstico do envolvimento de um rgo seja feito atravs de enzimas, deve-se: Conhecer a proporo entre as enzimas, que difere de tecido para tecido; Conhecer a cintica do aparecimento e desaparecimento da enzima no plasma. Enzimas que no so especficas do plasma so depuradas do plasma em velocidades variveis (estabilidade da enzima e captao pelo sistema retculo-endotelial).

ENZIMAS de DIAGNSTICO
Principais enzimas utilizadas no diagnstico de doenas so:
Fosfatase cida AST/TGO ALT/TGP GGT Amilase Lipase CK LDH Fosfatase Alcalina

Fosfatase cida
Maiores
concentraes: prstata, no fgado, na medula ssea, nos eritrcitos e plaquetas.

Fosfatase Alcalina
Maiores concentraes: presente em praticamente todos os tecidos do organismo, especialmente nas membranas das clulas dos tbulos renais, ossos (superfcie dos osteoblastos), placenta, trato intestinal e fgado. Funo: transporte de lipdios no intestino e nos processos de calcificao ssea.

frao no-prosttica: crianas em fase de crescimento e patologicamente aumentada em condies em que existe um hipermetabolismo sseo.

Utilidade diagnstica:

diagnstico e monitoramento da resposta ao tratamento e monitoramento de metstases, no CA de prstata.

Fosfatase Alcalina
Utilidade Diagnstica: doenas sseas que cursam : com aumento da atividade osteoblstica e na investigao de doenas hepatobiliares.
A resposta heptica a qualquer tipo de agresso da rvore biliar sintetizar fosfatase alcalina principalmente nos canalculos biliares.

TGO ou AST
Maiores

Transaminase Glutmico Oxalactica / Aspartato Amino Transferase

concentraes: encontrada em diversos rgos e tecidos, incluindo corao, fgado, msculo esqueltico e eritrcitos.

Citoplasma e mitocndrias Utilidade

Diagnstica: hepatites virais agudas, hepatites alcolicas, metstases hepticas e necrose medicamentosas e isqumicas, e infarto agudo do miocrdio.

Recm-nascidos,

crianas, e especialmente adolescentes, apresentam valores significativamente mais elevados do que os adultos, devido ao crescimento sseo.

TGP ou ALT
Maiores

Transaminase Glutmico Pirvica / Alanina Amino Transferase

CPK ou CK

Creatino fosfoquinase ou Creatino-quinase

concentraes: fgado, rim e em pequenas quantidades no corao e musculatura esqueltica.

Maiores concentraes: vasta distribuio tissular, est

principalmente na musculatura cardaco e no crebro. estriada, no tecido

fazendo com que se eleve rapidamente aps a leso heptica (marcador sensvel da funo heptica). do hepatcito (hepatites virais, mononucleose, citomegalovirus e hepatites medicamentosas).

Sua origem predominantemente citoplasmtica,

So encontradas no citosol ou associadas com estruturas miofibrilares, e so liberadas no sangue aps dano ao tecido. Utilidade Diagnstica: leses da esqueltica e infarto agudo do miocrdio.
musculatura

Utilidade Diagnstica: patologias que levam a necrose

3 isoformas = CK-1 (CK-BB) CK-2 (CK-MB) CK-3 (CK-MM)

CPK ou CK

Creatino fosfoquinase ou Creatino-quinase

CPK ou CK
Distrofia muscular de Duchenne, miosites, traumas musculares, injees intramusculares recentes CK-MB / CK-2 CKCK% 1 22 2a3 0 CK-MM CK-3 CKCK% 99 77 0 4

Creatino fosfoquinase ou Creatino-quinase

Seus

TECIDO Musculatura Esqueltica Esquel Miocrdio Mioc Crebro Estmago, leo e clon c

CK-BB / CK-1 CKCK% 0 1 97-98 9796 AVC, tumor no crebro

nveis sricos podem estar diminudos em situaes nas quais ocorra perda de massa muscular.

O valor de referncia para a CK total bastante ampla, variando com idade, estatura, atividade fsica e volume da massa muscular.

Infarto, miocardite

CPK ou CK

Creatino fosfoquinase ou Creatino-quinase

LDH ou DHL
Maiores

Lactato Desidrogenase ou Desidrogenase ltica

concentraes: vasta distribuio tissular, concentrando-se no miocrdio, rim, fgado, hemcias e msculo.

Utilidade Diagnstica: seus valores encontram-se elevados em todas as situaes em que ocorre grande destruio celular.
5 isoformas = HHHH (LDH1), HHHM (LDH2), HHMM (LDH3), HMMM (LDH4), MMMM (LDH5).
(Anemia hemoltica, infarto agudo do miocrdio, infarto pulmonar, doenas musculares, leses hepticas, neoplasias primrias ou secundrias (metastsicas), hepatites)

LDH ou DHL

Lactato Desidrogenase ou Desidrogenase ltica

BURTIS, Carl A e ASHWOOD, Edward R. Tietz Textbook of Clinical Chemistry. 3 ed. Saunders: Philadelphia, 1999, p.641.

Enzima

t (horas)
50 12 14 6 107 10

PM 110 000 ---120 000 100 000 135 000 135 000

ALT AST citoplasmtica

mitocondrial
Isoenzimas da lactato desidrogenase O contedo da isoenzima LDH varia por tecido. A figura mostra as formas especficas de LDH em tecidos adultos de rato.

mix aps IAM

2 cadeias polipeptdicas diferentes H: heart / M: muscle

LD

LD-1 (cardaca) LD-5 (heptica

RESUMO - DISTRIBUIO DAS ENZIMAS DE IMPORTNCIA DIAGNSTICA

ENZIMA ALT/TGP AST/TGO FONTES PRINCIPAIS Fgado, msculo esqueltico, corao Fgado, msculo esqueltico, corao, rim, hemcias Fgado, osso, mucosa intestinal, placenta, rim Fgado, rins Glndulas salivares, pncreas, ovrios Pncreas; mucosas gstrica, pulmonar e intestinal; glndulas da lngua Msculo esqueltico, crebro, corao, msculo liso Corao,fgado,msculo esqueltico, hemcias, plaquetas, linfonodos PRINCIPAIS APLICAES CLNICAS Doena heptica parenquimatosa Infarto do miocrdio, doena heptica parenquimatosa, doena muscular Doenas sseas, doenas hepatobiliares Doenas hepatobiliares; alcoolismo Doenas pancreticas Doenas Pancreticas

Enzima mix aps IAM CK CK-3 (MM) CK-2 (MB) CK-1 (BB)

t (horas)
12 20 10 3 <1 40 170 76

PM ---85 000 87 000 88 400 --------120 000 34 000

Fosfatase alcalina GGT Amilase Lipase

Fosf. ssea Alc. placentria

PSA

intestinal

CPK (Creatinofosfo quinase) LDH (Lactato desidrogenase)

Infarto do miocrdio, doenas musculares Infarto do miocrdio, hemlise, doenas do parnquima heptico

RESUMO - DISTRIBUIO DAS ENZIMAS DE IMPORTNCIA DIAGNSTICA

ENZIMA Glutamato desidrogenase 5-NT (5-Nucleotidase) PSA (Prostaticspecific antigen) Fosfatase cida Colinesterase

FONTES PRINCIPAIS Fgado Trato hepatobiliar Prstata Prstata, hemcias Fgado

PRINCIPAIS APLICAES CLNICAS Doenas do parnquima heptico Doenas hepatobiliares Carcinoma de Prstata Carcinoma da prstata Envenenamento por inseticida organofosforado, doenas hepticas parenquimatosa Doenas musculares Doenas do parnquima heptico

Aldolase SDH (Sorbitol Desidrogenase)

Msculo esqultico, corao Fgado

Medida da Atividade Enzimtica

Determinao da quantidade de enzima ou Determinao da atividade cataltica ?
A primeira uma forma de medida mais sensvel e especfica; A segunda mede a velocidade de reao catalisada: que proporcional quantidade de enzima.

Medida da Atividade Enzimtica

A medida da atividade enzimtica avaliada pela velocidade de reao que a enzima catalisa ( [S] ou [P])

Produto mol/mL

velocidade constante

Tempo (min.)

Medida da Atividade Enzimtica

A medida da atividade enzimtica avaliada pela velocidade de reao que a enzima catalisa ( [S] ou [P])

Medida da Atividade Enzimtica

Mtodos para a determinao da atividade enzimtica
1. Mtodos que analisam o consumo de substrato

Produto mol/mL

2. Mtodos que analisam o produto formado

velocidade decresce
[ ] de substrato: -inativao parcial da enzima,
Tempo (min.)

3. Mtodos que analisam a variao de absoro da coenzima que participa da reao (NAD+)

-inibio por produto e deslocamento do equilbrio (reversvel)

Espectrofotometria; titulometria; medidas de viscosidade; quimioluminescncia; ELISA; RIA; eletroforese; etc.

Medida da Atividade Enzimtica

Mtodos que analisam o consumo de substrato
Determinam a quantidade de substrato no consumido atravs de uma reao especfica. Exemplo: Dosagem da Amilase pelo mtodo de Caraway
Amilase
Hidrlise

Medida da Atividade Enzimtica

Mtodos que analisam o produto formado
Determinam a quantidade de produto formado atravs de uma reao especfica:
1. Produto formado na reao j um composto corado (Ex: Fosfatase alcalina pelo mtodo do paranitrofenol) p-nitrofenilfosfato
FAL
Hidrlise

p-nitrofenol + fosfato

AMIDO

Glicose + maltose + dextrinas + Amido*

no hidrolisado

2. Produto formado tem que ser transformado em um composto corado (Ex: Fosfatase alcalina pelo mtodo de Roy) Timolfatelenamonofosfato
FAL
Hidrlise

Amido * + iodo

Complexo azul (dosado fotometricamente)

Timolfatelena + fosfato Coloro azul

Timolfatelena + Tampo alcalino

Medida da Atividade Enzimtica

Mtodos que analisam a variao de absoro da coenzima que participa da reao (NAD+)
Baseiam-se no princpio que as formas reduzidas das coenzimas NADH e NADPH absorvem energia em U.V, enquanto que as formas oxidadas NAD+ e NADP+ no. Exemplo: Dosagem da LDH pelo Mtodo do U.V
cido ltico + NAD+
LDH

Medida da Atividade Enzimtica

A velocidade de reao medida e expressa em Unidades Internacionais (UI)

cido pirvico + NADH + H+

da absoro no UV qdo NAD+ reduzido a NADH

ou
cido pirvico + NADH + H+
LDH

1 UI a quantidade de enzima capaz de formar 1mol de produto por minuto em condies timas UI/L

cido ltico + NAD+

da absoro no UV qdo NADH oxidado a NAD+

Medida da Atividade Enzimtica

Fatores que influenciam as reaes enzimticas
- Temperatura - pH - [S] - Inibidores competitivos

Medida da Atividade Enzimtica

Temperatura
Medio

37o C
Variaes de 1C podem resultar em alterao de at 10% no resultado de medio de enzimas por atividade

Medida da Atividade Enzimtica

pH
A conformao das enzimas depende, em parte, de suas cargas eltricas. Haver um pH no qual a conformao ser a mais adequada para a sua atividade cataltica = pH timo

Medida da Atividade Enzimtica

Concentrao do Substrato
V max 50 Saturao da Enzima pelo [S]

40
velocidade inicial -1 [ mol.min ]

30 20 10 0 Km = Vmax

10

12

14

Substrato [mmol/L]

Medida da Atividade Enzimtica

Concentrao do Substrato
Substrato Enzima

Medida da Atividade Enzimtica

Concentrao do Substrato
1.0 0.8 0.6 0.4 0. 2 0 Lag fase 0
tempo (minutos) Diluir amostra

Velocidade de reao Cintica de 1 ordem Conc. [S] Conc. Enzima

Exausto do substrato

Perda da linearidade Substrato deixou de ser saturante ( perda da cintica de ordem zero)

Absorbncia

Pouco S

linearidade

Medida de Atividade

[S] saturante

Cintica de ordem zero Saturao do substrato

A velocidade da reao depende apenas da quantidade da enzima

10

15

Medida da Atividade Enzimtica

Clculo da Atividade - Mtodos
Mtodo do Ponto Final Mtodo Monitoramento Contnuo ou Cintico - Todos os mtodos em U.V (340nm)
Absorbncia (405 nm)

Medida da Atividade Enzimtica

0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 0 2 4 6 8 10
Tempo (minutos)

Apenas 1 leitura A t = 0.8 - 0 10 - 0

Medida da Atividade Enzimtica

0.8 0.7
Absorbncia (340 nm)

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0 2 4 6 8 10

tempo (minutos)

Velocidade
A = 0.4 - 0.2 = 0.2 t = 5 - 3 = 2