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I tessuti connettivi costituiscono una famiglia di tessuti molto diversi fra loro, ma allo stesso tempo omogenei per

quanto riguarda: 1) TIPOLOGIA DI ORGANIZZAZIONE STRUTTURALE 2) DERIVAZIONE EMBRIOLOGICA 3) ASPETTI FUNZIONALI Ricordiamo per che ogni tipo di tessuto connettivo si presenta con determinate caratteristiche strutturali perch esse sono strettamente correlate a precise esigenze funzionali richieste dalla zona in cui quel tessuto viene ad inserirsi. In base alla diversa natura delle varie componenti fondamentali del tessuto e in base alla diversa funzione che tali tessuti sono pi spiccatamente diretti a svolgere, possiamo classificare i connettivi in: tessuto connettivo embrionale: Mesenchima tessuto connettivo propriamente detto T.c. lasso se le fibre sono meno abbondanti e lassamente intrecciate tra loro e prevale la sostanza amorfa T.c. denso o compatto se le fibre sono abbondanti e raccolte in grossi fasci stipati che conferiscono resistenza e notevole consistenza tessuto. Questo tessuto connettivo denso pu a sua volta essere tessuto connettivo denso irregolare se le fibre assumono una disposizione irregolare e disordinata (come nel derma), oppure tessuto connettivo denso regolare se le fibre sono raccolte in fasci paralleli come nei tendini o nei legamenti. T. c. adiposo bianco e bruno T.c. reticolare T.c. mucoso T.c. elastico T.c. pigmentato tessuti connettivi specializzati nel sostegno Tessuto cartilagineo (cartilagine ialina, elastica, fibrosa, condroide e cordoide) Tessuto osseo (lamellare, alamellare) Dentina Cemento tessuti connettivi con funzione trofica a sostanza fondamentale fluida (umori circolanti) Sangue Linfa tessuti emolinfopoietici Tessuto mieloide Tessuto linfoide

1) ORGANIZZAZIONE STRUTTURALE:
A differenza dei tessuti epiteliali in cui le cellule instaurano rapporti molto stretti interponendo fra di esse una scarsa matrice extracellulare, nei connettivi le cellule sono separate fra loro da una abbondante sostanza intercellulare o matrice extracellulare o ECM (attraverso la quale diffonde il liquido interstiziale o tissutale). 1

Le cellule specifiche dei connettivi, responsabili anche della sintesi della ECM, sono i fibroblasti nel tessuto connettivo propriamente detto, i condroblasti nel tessuto cartilagineo, gli osteoblasti nel tessuto osseo e infine odontoblasti e cementoblasti rispettivamente nella dentina e nel cemento. La matrice extracellulare poi a sua volta costituita da: - una sostanza amorfa o sostanza fondamentale - una componente fibrosa - da proteine strutturali con funzione adesiva La sostanza fondamentale costituita da macromolecole caratteristiche, quali i glicosamminogliacani (GAG) e i proteoglicani (macromolecole risultanti dal legame covalente di GAG con proteine), la cui elevata idratazione permette la diffusione di nutrienti, metaboliti e ormoni che vedremo essere componenti del liquido interstiziale; infatti nel tessuto connettivo propriamente detto, la sostanza fondamentale contiene il liquido tissutale o interstiziale. La consistenza della sostanza fondamentale variabile da connettivo a connettivo: gelatinosa nel connettivo propriamente detto, solida nella cartilagine e dura nel tessuto osseo, nella dentina e nel cemento. N.B. Un discorso a parte va fatto per i connettivi trofici, ossia sangue linfa, in cui della componente fibrillare assente, mentre la sostanza fondamentale fluida e prende il nome di plasma e in essa sono immerse in sospensione gli elementi cellulari. La componente fibrosa rappresentata dalle fibre collagene, fibre reticolari e fibre elastiche che sono immerse nella matrice e sono responsabili soprattutto delle caratteristiche meccaniche del tessuto. La loro quantit, qualit e disposizione un criterio importante per classificare in particolar modo il tessuto connettivo propriamente detto. Le proteine strutturali con funzione adesiva sono anche dette proteine fibrose di connessione (come la fibronectina) e collegano le cellule ai componenti della matrice. I rapporti tra le cellule del connettivo e la matrice extracellulare sono molto complessi: da un lato la matrice, sia la componente amorfa (sostanza fondamentale) sia la componente fibrosa, sono sintetizzate e secrete dalle cellule che ne regolano anche la disposizione tridimensionale nello spazio extracellulare. Dall'altro la matrice influenza e regola le funzioni delle cellule che vi sono immerse e svolge un ruolo determinante nel mantenimento del loro stato differenziativo.

2) DERIVAZIONE EMBRIOLOGICA:
Tutti tessuti connettivi, o per l'esattezza le cellule di tali tessuti, derivano dal tessuto connettivo embrionale che prende il nome di mesenchima e che si forma dal mesoderma (il foglietto embrionale intermedio). Alcune cellule mesodermiche migrano dai somiti e dalle lamine laterali del mesoderma e si insinuano negli spazi tra i foglietti embrionali primitivi e tra gli abbozzi degli organi, andando a costituire il mesenchima, appunto. Il mesenchima o tessuto mesenchimale, il precursore del tessuto connettivo adulto e si presenta come un tessuto estremamente lasso interposto negli spazi presenti tra gli organi embrionali in via di sviluppo. costituito da numerose cellule mesenchimali di forma irregolare, solitamente stellata o fusiforme, con nucleo in egual misura eu ed eterocromatinico e con nucleoli evidenti. Il citoplasma evidenzia numerosi ribosomi, pochi mitocondri, un piccolo Golgi. Queste cellule sono immerse in un abbondante sostanza fondamentale molto fluida inizialmente priva di fibre reticolari e di complessi proteoglicanici e glicoproteici. Successivamente si aggiunge una rete di fibrille di circa 40 nm di lunghezza e con 2

bandeggiatura di natura trasversale periodica di 25 nm, che nel connettivo adulto possono corrispondere alle fibrille reticolari. La cellula mesenchimale considerata una cellula staminale pluripotente perch pu differenziarsi in numerosi tipi di cellule connettivale (fibroblasti, cellule adipose, condroblasti, osteoblasti, mastociti) ma anche in cellule muscolari lisce, nelle cellule endoteliali, negli elementi del sangue e nei periciti.

3) ASPETTI FUNZIONALI:
La funzione comune a tutti tessuti connettivi quella di connettere strutturalmente e funzionalmente gli altri tessuti fra di loro nella formazione dei singoli organi e dell'organismo in genere. La loro funzione primaria una funzione meccanica di sostegno che a sua volta si estrinseca in varie forme a seconda della sede: ad esempio, un connettivo con un piccolo numero di fibre aggregate in una rete lassa pu dare un supporto limitato ma al tempo stesso, una grande flessibilit, mobilit ed elasticit (tessuto connettivo propriamente detto di tipo lasso tonaca propria mucosa intestinale); un connettivo con un maggior numero di fibre organizzate in fasci a formare una rete fissa garantisce grande resistenza a forze di tensione ma poca flessibilit e mobilit (tessuto connettivo propriamente detto di tipo denso tendini, legamenti, capsule); una maggiore capacit di sostegno fornita dal Tessuto cartilagineo (in cui la sostanza fondamentale incrementa il suo grado di polimerizzazione) e ancor pi dal tessuto osseo. In ogni caso basti pensare agli organi parenchimatosi e ai muscoli scheletrici, in cui il connettivo costituisce il tessuto interstiziale (o stroma) che si interpone tra gli elementi cellulari specifici proprio fungendo da sostegno. Poich lungo i setti connettivali decorrono i vasi sanguigni, il connettivo svolge anche una funzione trofica in quanto rappresenta la sede in cui avvengono gli scambi di gas e sostanze metaboliche tra il sangue e gli tessuti (in virt del liquido interstiziale) e regola quindi la diffusione di tali sostanze. Ecco perch i tessuti connettivi vengono anche definiti trofomeccanici. Il connettivo svolge anche una funzione di deposito, in particolar modo riserva di lipidi nelle cellule adipose, riserva di calcio nel tessuto osseo e di elettroliti ed acqua intrappolati nella matrice extracellulare. Infine nel tessuto connettivo hanno luogo anche funzioni di difesa in quanto, da un lato la matrice extracellulare funziona essa stessa da barriera fisica contro la diffusione di microrganismi penetrati attraverso le lamine epiteliali, dall'altro alcune cellule del connettivo svolgono funzione fagocitaria o producono anticorpi e altre molecole coinvolte nella difesa immunitaria.

La matrice extracellulare (detta anche metaplasma: ciascuna parte di un tessuto che non sia il componente di una cellula) una complessa architettura tridimensionale di macromolecole, localizzata nello spazio extracellulare e prodotta dalle stesse cellule connettivali, nella fattispecie dai fibroblasti nel connettivo propriamente detto, dai condroblasti, dagli osteoblasti e dagli odontoblasti. La formazione della matrice resa possibile dal fatto che i suoi componenti molecolari, una volta che sono stati prodotti e secreti dalle cellule, si associano mediante interazioni specifiche in complessi ordinati spazialmente, talvolta stabilizzati anche da legami covalenti. Alla formazione della matrice partecipano numerosi tipi di molecole diverse che possono variare anche a seconda del tipo di connettivo che prendiamo in considerazione. La matrice svolge molteplici funzioni: contribuisce alle propriet meccaniche dei diversi tessuti (abbiamo gi accennato che la sua consistenza cambia in base al fatto che il tessuto in cui si viene a localizzare necessiti di un maggiore sostegno oppure di una maggiore flessibilit oppure di una maggiore resistenza alla trazione e cos via) svolge una funzione adesiva che avviene per interazione con i recettori della superficie cellulare regola funzioni cellulari come la forma, le funzioni metaboliche, la proliferazione e la differenziazione lega molti fattori di crescita costituendo un sistema di conservazione e di organizzazione spaziale di queste molecole alcuni domini specifici di componenti della matrice possono svolgere una specifica attivit biologica una volta che sono stati liberati dalle molecole in seguito a proteolisi. La complessit strutturale della matrice dipende anche dal fatto che esistono delle varianti tessuto specifiche delle diverse molecole che la costituiscono, perch talvolta pur partendo da uno stesso gene si pu far ricorso a promotori alternativi, a splicing alternativo e ad altre modificazioni post traduzionali. La ECM costituita da 1) componente fibrillare (in realt le fibre vere e proprie le troviamo prevalentemente nel connettivo interstiziale (mentre possibile riscontrare come interfaccia tra il connettivo interstiziale e la superficie di diversi tipi cellulari, quali epiteliali, muscolari, adiposi, gliali, una sottile lamina flessibile resistente, detta membrana basale) 2) sostanza amorfa o sostanza fondamentale 3) proteine strutturali con funzione adesiva

1) FIBRE DEL TESSUTO CONNETTIVO


Le fibre svolgono solitamente un ruolo di organizzazione spaziale e di sostegno del tessuto stesso, poich racchiudono tra di loro le cellule e la sostanza fondamentale. Le fibre del tessuto connettivo vengono solitamente distinte in tre tipologie (ognuna di esse pu essere presente da sola o assieme alle altre, in differenti proporzioni a seconda della collocazione e della funzione richiesta): fibre collagene, fibre reticolari e fibre elastiche. Vedremo che le prime due tipologie in realt rappresentano modi di aggregazioni differenti di unit fibrose elementari che appartengono alla stessa famiglia: sono entrambi fibre costituite da molecole della proteina tropocollagene, sebbene tipi differenti. Invece le fibre elastiche hanno una costituzione chimica diversa dalle prime due.

Le fibre costituite da tropocollagene conferiscono al tessuto resistenza meccanica, le fibre elastiche la capacit di recuperare le dimensioni originali dopo essere stato disteso e sono due diverse propriet che per possono consistere all'interno lo stesso tessuto.

Le fibre collagene sono la categoria di fibre pi rappresentate nei tessuti connettivi e costituiscono il componente non minerale pi abbondante del nostro corpo, dopo l'acqua. Sono flessibili ma poco estensibili, ed offrono grande resistenza alla trazione. Sono rapidamente digerite dal succo gastrico, ma resistono alla digestione con tripsina in soluzione alcalina. Tendono a rigonfiarsi in acidi diluiti, mentre si dissolvono in acidi e alcali forti. Sono digerite specificatamente dall'enzima collagenasi. Prendono questo nome perch con la bollitura si trasformano in un materiale colloso, che poi raffreddandosi forma la gelatina. Esaminate a fresco hanno un colorito biancastro motivo per cui sono dette fibre bianche in contrapposizione alle fibre gialle (o fibre elastiche). All'osservazione al microscopio ottico si possono evidenziare con vari coloranti, soprattutto acidi, sebbene non presentino spiccate affinit tintoriali. Si colorano comunemente con esosina o di blu con la miscela Azan-Mallory o ancora con la fucsina acida. Sono debolmente PAS positive e non argirofile (caratteristica che permette di distinguerle dalle fibre reticolari). Appaiono come filamenti molto lunghi e con spessore variabile da 1-12 mm e decorrono in una o pi direzioni con un andamento che pu essere ondulato o rettilineo a seconda della loro collocazione. Ad esempio, la loro forma distesa nel tendine mentre ondulata nel connettivo lasso; oppure i fasci sono disposti parallelamente sempre nel tendine, mentre si incrociano l'uno con l'altro nel legamento. Sempre al M.O. ma a un ingrandimento molto maggiore, possibile notare che ogni fibra collagene costituita da fibrille pi sottili (0,2-0,3 mm di spessore) disposte parallelamente tra loro e riunite in fascetti, in cui le fibrille sono tenute insieme da un materiale amorfo che pu essere di solito dissolto da alcali diluiti e da tripsina. Esaminate al microscopio alle luce polarizzata, le fibrille presentano una birifrangenza di forma, che dimostra che a loro volta sono costituite da unit filamentose pi sottili, non visibili al M.O, ma orientate sempre longitudinalmente, ossia parallelamente all'asse maggiore della fibra. Nelle fibrille si possono poi notare delle striature trasversali dovute all'alternanza di bande scure larghe 35 nm e bande chiare larghe 32 nm, che nell'insieme costituiscono un periodo di ripetizione largo 67 nm. Queste fini fibrille di 0,2-0,3 mm, ancora osservabili al M.O. , se osservate invece al M.E. (con cui possono essere risolte a maggiore ingrandimento) appaiono a loro volta composte da un numero variabile di microfibrille o fibrille submicroscopiche o protofibrille dello spessore di 20-150 nm. Queste microfibrille sono associate parallelamente fra loro e orientate sempre lungo l'asse maggiore della fibra. Esse presentano l'analoga struttura periodica con periodo di 67 nm gi osservata nelle fibrille ed proprio la loro organizzazione ad essere responsabile della caratteristica birifrangenza delle fibre collagene. Nella terminologia istologica si dice che le fibre collagene mostrano una "periodicit assile", con un periodo di 64-70 nm. La tecnica della colorazione negativa permette poi di visualizzare le molecole di tropocollagene, che sono i costituenti elementari delle microfibrille. Infatti ogni microfibrille composta dal cinque protofilamenti paralleli; un singolo protofilamento costituito da una fila di molecole di tropocollagene le cui estremit testa-coda sono distanziate da un intervallo di circa 35 nm. Inoltre le molecole di tropocollagene dello stesso protofilamento sono sfalsate rispetto a quelle dei protofilamenti vicini di circa 67 nm, in modo da determinare l'aspetto periodico a bande chiare scure e da assicurare la stabilit del protofilamento. Fibre collagene Fibrille Microfibrille Protofilamenti Molecole di Tropocollagene 5

FIBRE COLLAGENE

Nella fattispecie le microfibrille si formano per polimerizzazione di molecole di tropocollagene di tipo I e la caratteristica bandeggiatura si ripete con un periodo che corrisponde a circa un quarto della lunghezza totale della molecola di tropocollagene, che di 280 nm e infatti il periodo di 67 nm. Abbiamo anche detto che questa bandeggiatura dovuta a due fatti: -- ogni estremit di un'unit di tropocollagene non tocca mai l'estremit della molecola seguente ma viene interposto uno spazio vuoto di 35 nm. - ogni unit di tropocollagene di una fila, partendo sfalsata rispetto a quella della fila parallela di una lunghezza pari al periodo (67 nm), presenta una zona di sovrapposizione di circa 32 nm e quindi andando ad usare una colorazione negativa per l'osservazione al microscopio elettronico, il colorante di contrasto penetrer negli spazi vuoti che si riempiono e diventano opachi agli elettroni formando la banda scura, mentre dove le unit di tropocollagene parallele si sovrappongono il colorante non riuscir ad entrare e si avr la banda chiara. Il tropocollagene una glicoproteina filamentosa lunga 280 nm e spessa 1,4 nm costituita dall'associazione di tre subunit polipeptidiche elicoidali (catene a) avvolte a formare una tripla elica. Ciascuna elica consta di circa 1000 residui a.a. di cui il 34% costituito da glicina e il 20% da prolina. Sono anche presenti idrossiprolina e idrossilisina e sono unite catene disaccaridiche in numero variabile a seconda del tipo di collagene. I COLLAGENI Sono una superfamiglia di proteine della ECM che comprende 27 tipi diversi di collagene. Si tratta di glicoproteine filamentose lunghe 280-300 nm e spesse 1,4 nm. La molecola di tropocollagene tipica (circa 300 kDa) costituita da una tripla elica determinata dall'avvolgimento di tre catene polipeptidiche a di circa 100 kDa ciascuna, tipicamente ricche di glicina, prolina, idrossiprolina. Inoltre presente idrossilisina (risultante da una modifica post traduzionale della catena a) solo alle estremit C e N terminali delle catene. Ovviamente la concentrazione dei diversi amminoacidi varia a seconda del tipo di collagene. Tutte le catene a presentano almeno un segmento caratteristico costituito da triplette iterative di a.a. che iniziano sempre con un residuo di glicina. Poi gli altri due amminoacidi della tripletta sono solitamente proprio la prolina e idrossiprolina sopra citate. Nelle regioni contenenti queste triplette ripetute, ognuna delle tre catene a si dispone in un'elica sinistrogira che, ripiegandosi a sua volta attorno un'asse comune, forma una tripla elica con leggero ripiegamento verso destra. Si forma una struttura bastoncellare piuttosto rigida. La tripla elica stabilizzata da legami idrogeno tra le catene a ma sono anche presenti legami crociati covalenti intermolecolari che servono a stabilizzare le catene del tropocollagene e la loro associazione nei protofilamenti delle microfibrille; inoltre questi legami crociati contribuiscono grandemente alla resistenza alla trazione tipica delle fibre collagene (la frequenza dei legami covalenti varia con la sede e tende ad aumentare con l'et). La presenza della glicina ogni tre amminoacidi fondamentale per la formazione di questa struttura e anche l'idrossiprolina contribuisce alla sua stabilit. Le molecole di tropocollagene si associano prima longitudinalmente (testa-coda) dando il protofilamento, poi parallelamente tra loro, dando la microfibrilla (costituita da 5 protofilamenti) e poi pi microfibrille danno la fibrilla e quindi la fibra vera e propria. Poich il tropocollagene una glicoproteina, sono presenti brevi catene laterali di carboidrati legate in particolare ai residui di idrossilisina. Il numero totale di unit gli glicidiche varia da 0,4-5,8 unit per 1000 residui di amminoacidi. Il basso livello di glicosilazione rende ragione della PAS negativit del collagene. 6

Biosintesi dei collageni o Fibrillogenesi La biosintesi delle fibrille collagene un processo complesso che avviene in varie tappe sia endo che extracellulari, a opera di diversi tipi cellulari nei diversi tipi di tessuto connettivo: fibroblasti, condroblasti, osteoblasti, ecc... 1) il processo inizia nel nucleo con la trascrizione dei geni o del gene, seguito dalla maturazione dei relativi mRNA 2) la traduzione avviene a livello dei ribosomi del RER, dove vengono sintetizzate catene polipeptidiche di procollagene o catene pro a che sono di dimensioni maggiori rispetto alle catene a definitive perch presentano alle estremit dei peptidi globulari che poi verranno rimossi: un pro-peptide N-terminale e un pro-peptide C-terminale 3) sempre all'interno delle cisterne del RER nel corso dell'assemblaggio delle catene di procollagene , alcune molecole di prolina e lisina vengono idrossilate e poi al termine della traduzione, avviene la glicosilazione delle idrossilisine con aggiunta sopratutto di galattosio. 4) da questi processi risultano le catene a di procollagene. Tre di queste catene si allineano previa formazione di ponti disolfuro tra le estremit C-terminali delle catene e quindi si avvolgono a formare la tripla elica di procollagene, senza che l'avvolgimento per coinvolga l'estremit della molecola 5) la molecola di procollagene (costituita da una parte centrale bastoncellare ad elica e dalla due estremit globulari) passa nel Golgi dove si completa la glicosilazione e da qui passa alle vescicole di secrezione. 6) le triple eliche di procollagene secrete all'esterno della cellula subiscono l'azione di alcune procollagene-peptidasi, enzimi capaci di tagliare selettivamente i telomeri delle molecole di procollagene trasformandole in tropocollagene 7) una volta eliminati i peptidi terminali, le molecole possono disporsi spontaneamente in file parallele formando fibrille con diametro di 20-150 nm e le lunghe alcuni mm, nelle quali visibile fin dagli stadi relativamente iniziali di assemblaggio, la tipica periodicit assile. Le fibrille collagene neoformate hanno i caratteri di fibre reticolari, cio sono isolate, non raccolte in fasci e presentano la caratteristica argirofilia. Successivamente le fibrille si raccolgono in fasci tra loro paralleli assumendo l'aspetto di tipiche fibre collagene, perdono la capacit di impregnarsi con i sali di argento ed assumono i coloranti del collagene (Mallory e Van Gieson). Perch il collagene prodotto prima come procollagene e solo successivamente viene trasformato in tropocollagene? Questa modalit di sintesi porta almeno due vantaggi: il primo che affinch si formi la tripla elica le tre catene a devono prima allinearsi correttamente e tale allineamento dipende dalla formazione di ponti disolfuro tra i telomeri C-terminali delle tre catene a. Il secondo motivo che le molecole di tropocollagene si aggregano spontaneamente in fibrille ma non quelle di procollagene proprio perch la presenza dei peptidi terminali globosi impedisce l'associazione delle molecole, perch se ci avvenisse entro la cellula prima della sua secrezione potrebbe avere conseguenze disastrose. La fibrillogenesi l'evento iniziale nella formazione delle fibre collagene a cui segue la fase di crescita delle fibrille e la loro associazione di strutture di ordine superiore quali le fibre e i fasci di fibre. Il tipo, la grandezza e l'organizzazione delle fibre che risultano da questo processo dipende da molti fattori sia stadi che tessuto specifici. Lo specifico assortimento di tipi molecolari di collagene (fibrillari e non fibrillari) e cos anche l'associazione con altri tipi di macromolecole, sono importanti fattori per determinare la qualit delle fibre mature. 7

Ad esempio il collagene di tipo I embrionale molto pi sensibile alla proteolisi del collagene di tipo I dell'adulto e questa una caratteristica vantaggiosa perch durante la vita embrionale avvengono estesi fenomeni di rimaneggiamento tissutale. Torniamo indietro a parlare delle catene a che costituiscono la singola molecola di tropocollagene: in alcuni collageni tutte e tre le catene sono identiche mentre in altri le catene possono essere due o tre diverse fra loro. Poich ad oggi sono state individuate circa 42 diverse catene esisteranno anche diversi tipi di collagene che differiscono tra loro per composizione aminoacidica e per diverso numero di catene glicidiche. I tipi di collagene pi rappresentati e pi importanti sono i collageni fibrillari (costituiscono la maggior parte della matrice extracellulare di tessuti connettivi come il derma, i tendini, i legamenti, le cartilagini) che hanno la propriet di formare fibre caratterizzate da quella tipica striatura trasversale con periodicit di 67 nm. Tra tutti i collageni fibrillari il pi diffuso il collagene di tipo I che costituisce circa il 90% del collagene del corpo. il solo collagene presente nelle ossa e nei tendini, predominante nel derma e in molti altri tessuti connettivi. Il collagene di tipo II anch'esso fibrillare si trova nelle fibre collagene della cartilagine ialina e nell'occhio e nel corpo vtreo dell'adulto. Il collagene di tipo III lo troviamo nelle fibre reticolari. Poi esistono anche i collageni associati a fibrille che sono costituiti da molecole in cui la tipica tripla elica interrotta dalla presenza di alcuni domini non elicoidali e quindi queste molecole non formano fibrille da sole, ma si associano ai collageni fibrillari, stabilendo legami all'interno delle fibrille e tra le fibrille e altre macromolecole della matrice. (Questo gruppo di collageni pu essere identificato col nome di FACIT, cio Fibril Associated Collagen with Interrupted Triple Helix: associandosi ai collageni fibrillari contribuiscono a determinarne le caratteristiche, come dimensioni, interazioni con altre macromolecole dell' ECM e l'organizzazione stessa nella matrice; ne fanno parte il collagene IX e XII). Infine esistono i collageni laminari che sono localizzati nelle zone pericellulari e si organizzano in strutture sottili. Appartengono a questa classe i collageni della membrana basale degli epiteli che non formano strutture fibrillari bens maglie reticolate e presentano un elevato contenuto aminoacidico di idrossilina glicosilata e le subunit molecolari comprendono le regioni terminali globulari non avvolte in tripla elica. Esempio: collagene IV, VIII e X.

Le fibre reticolari furono considerate in passato una particolare categoria di fibre del connettivo. In realt oggi si sa che anche esse sono composte da tropocollagene e quindi possono essere considerate una variet di fibre collagene appartenenti alla stessa famiglia di cui abbiamo parlato precedente. Nella fattispecie sono costituite da collagene di tipo III che, da un punto di vista molecolare, caratterizzato da un pi alto contenuto di idrossilisina e quindi anche da una maggior grado di glicosilazione rispetto alle fibre collagene di tipo I. Le fibre reticolari hanno un diametro di 0,5-2 mm quindi sono pi sottili delle fibre collagene (che sono 1-12 mm). Osservate al M.E. si risolvono in un'aggregazione di fibrille dello spessore di 20-40 nm ma che comunque in generale non superano mai 50 nm, e anche in questo caso risultano pi sottili delle fibrille del collagene di tipo I (che sono 0,2-0,3 mm). Anche le fibrille di collagene tipo III presentano la caratteristica striatura periodica di 67 nm e derivano dalla polimerizzazione di un'unit di tropocollagene III secondo modalit simili a quelle riscontrate nelle fibre collagene. Ma a differenza delle fibrille di collagene che si riuniscono in fascetti, queste si anastomizzano tra loro formando un intreccio ramificato, motivo per cui complessivamente le fibre reticolari risultano pi sottili 8

FIBRE RETICOLARI

delle fibre collagene. Quindi le fibre reticolari decorrono isolate scambiandosi reciprocamente fibrille e costituendo complicati reticoli che fungono da impalcatura per le cellule circostanti. Il tessuto caratterizzato dalla presenza di fibre reticolari appare come formato da una rete a maglie larghe in cui gli ampi spazi sono occupati dalla matrice amorfa. Da un punto di vista istologico le differenze pi importanti tra le fibre collagene tipiche (cio quelle formate da tropocollagene di tipo I) e queste fibre collagene formate da tropocollagene di tipo III (fibre reticolari) riguardano soprattutto il loro grado di aggregazione e le propriet tintoriali. Poich le fibre sono meno aggregate fra loro, non visibile la striatura longitudinale che evidente nelle fibre collagene tipiche. Inoltre il ridotto spessore delle fibre reticolari le rende difficilmente visibili con i comuni preparati istologici; le fibre reticolari sono ben colorarli con i metodi di impregnazione argentica, motivo per cui sono dette fibre argirofile. Inoltre, per il loro maggior grado di glicosilazione, si colorano intensamente di rosso con il metodo di Schiff: sono PAS positive. Le fibre reticolari sono particolarmente rappresentate nel connettivo lasso delle tonache sierose, nella parete dei vasi sanguigni, nel connettivo che circonda le singole fibre muscolari, sono componenti permanenti del impalcatura fibrosa che sostiene i tessuti linfoide e mieloide. Formano una fine trama che costituisce la lamina reticolare delle membrane basali degli epiteli di rivestimento e degli endoteli dei capillari. Circondano la cellula adipose e formano lo stroma di organi parenchimatosi (fegato, pancreas, ecc...)

Le fibre elastiche sono in genere pi sottili delle fibre collagene e sono particolarmente presenti in tutti quegli organi che per le loro funzioni, necessitano di particolare elasticit come i vasi, la cute, i legamenti, i polmoni ecc... Sono scarsamente presenti nel tessuto connettivo lasso (in cui sono pi numerose le fibre collagene) ma si accumulano in grande numero nel tessuto elastico, una variet di tessuto connettivo propriamente detto caratterizzato dalla capacit di distendersi sotto l'azione di una forza e di acquisire le dimensioni originali quando questa forza viene meno. Sono molto abbondanti nella tonaca elastica delle arterie, nei legamenti elastici e nei tendini, della cartilagine elastica insieme alle fibre collagene. Le fibre elastiche possono decorrere isolate o in fascetti sottili oppure possono ramificarsi costituendo fitti intrecci a rete e in alcuni casi possono anche riunirsi in lamine o membrane. Osservate a fresco, nei casi delle fibre elastiche pi spesse, appaiono di colore giallastro motivo per cui vengono denominate fibre gialle in contrapposizione alle fibre bianche di collagene. A differenza sia delle fibre collagene sia delle fibre reticolari, le fibre elastiche sono pi difficilmente distinguibili al M.O. con metodi convenzionali e richiedono colorazioni specifiche come il metodo Gomori dell'aldeide fuxina o quello di Weigter della resorcina fuxina. Inoltre non presentano la striatura longitudinale. Sono termostabili, resistenti a molti agenti chimici e al succo gastrico ma sono digerite da un enzima specifico estratto dal pancreas, l'elastasi. Sono meno resistenti alla trazione delle fibre collagene ma possono facilmente distendersi e poi ritornare alla lunghezza originaria. Dicevamo che le fibre elastiche sono in genere pi sottili delle fibre collagene e misurano da 0,2-1 mm di spessore. La microscopia elettronica dimostra che le fibre e le lamine elastiche sono entrambi costituiti da due componenti:

FIBRE ELASTICHE

una componente amorfa di densit elettronica variabile ma che in realt costituito da un microreticolo di elastina una componente microfibrillare costituita da fibrillina. La componente amorfa delle fibre e delle lamine elastiche l'elastina, una proteina globulare idrofobica che si forma per aggregazione mediante legami covalenti crociati, di molecole di tropoelastina, il precursore solubile della elastina. Le tropoelastine sono proteine di circa 70 kDa non glicosilate caratterizzate da un'elevata presenza di glicina (oltre il 30%) e inoltre dal fatto che oltre il 75% degli aminoacidi che contiene sono oltre la glicina,valina, alanina e prolina, i quali costituiscono ampi domini idrofobici intervallati da pi piccole regioni ricche di alanina. Vediamo il processo dell'elastinogenesi (che consta di fasi intra ed extra cellulari): all'interno della cellula, l'associazione tra monomeri di tropoelastina impedita perch sono legati con un'altra proteina che li accompagna fino all'esterno della cellula. Gi all'interno della cellula la tropoelastina subisce varie modificazioni post traduzionali tra cui l'idrossilazione di residui di prolina. Dopo la secrezione al di fuori della cellula la molecola di tropoelastina si separa dalla proteina a cui era legata e pu quindi cominciare la sua polimerizzazione. La formazione di legami crociati tra molecole di tropoelastina richiede che queste prima si allineino correttamente fra di loro e questo processo favorito dal fatto che le microfibrille di fibrillina sono gi presenti nello spazio extra cellulare disposte ordinatamente. Infatti l'elastina si accumula tra le microfibrille un po' alla volta sino a formare la parte preponderante della fibra. Un enzima extracellulare, la lisil-ossidasi, catalizza l'ossidazione e deaminazione della maggior parte dei residui di lisina nella tropoelastina. Queste reazioni precedono la formazione di legami crociati che coinvolgono gli a.a. modificati e ne risultano a.a. insoliti, derivati dalla condensazione di 2-4 residui, che formano composti ciclici chiamati desmosine che formano un ponte covalente tra due catene polipeptidiche della tropoelastina. Il risultato di questi processi la formazione dell'elastina, un polimero amorfo, insolubile ma al tempo stesso altamente idratato che formano un reticolo tridimensionale che avvolge le microfibrille di fibrillina. Le molecole di elastina sono aggregate tra loro in maniera da formare una sorta di rete attorcigliata in condizioni di riposo e dispersa se sottoposta trazione. Infatti la catena polipeptidiche dell'elastina ha una conformazione disordinata ma se sottoposta a una forza di trazione le catene vengono stirate e si ordinano allineate. Quando la forza applicata cessa le molecole si riportano allo stato iniziale di disordine. Tant' che questo tipo di elasticit viene definito di tipo entropico proprio perch basato sullo stato di maggior o minor ordine delle catene polipeptidiche. Inoltre la resistenza alla trazione delle fibre elastiche direttamente proporzionale al numero di legami presenti tra le molecole di elastina. Le microfibrille invece sono prevalenti nelle fibre elastiche in via di sviluppo e meno numerosa con l'aumentare dell'et. Poich compaiono prima della componente amorfa di elastina probabilmente hanno il ruolo di determinare la forma delle fibre elastiche nei vari tessuti e sono localizzate solitamente alla periferia della fibra proprio per impedire l'iperestensione delle fibre: come se la polimerizzazione dipendesse dallo stampo costituito da microfibrille. Le microfibrille sono costituite soprattutto da una glicoproteina filamentosa detta fibrillina. Queste molecole di fibrillina si dispongono longitudinalmente testa-coda e per file parallele venendo a costituire queste microfibrille spesse circa 10-13 nm. Altre macromolecole sono associate alla fibrillina nella costituzione delle microfibrille: tra queste proteoglicani (condroitin solfato e dermatan solfato) e la glicoproteina associata alle microfibrille. Le fibre elastiche possono essere stirate sino una volta mezzo rispetto alla loro lunghezza di partenza, poi sono in grado di ritornare alla normalit. L'eventuale incapacit a riprendere o mantenere la normale

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struttura dipende dall'invecchiamento o da processi patologici. Fibre elastiche sono sintetizzate da fibroblasti, condroblasti, cellule muscolari lisce della parete dei vasi sanguigni.

IL SISTEMA DELLE FIBRE ELASTICHE Cos come precedentemente abbiamo parlato di fibre collagene facendo riferimento sia alle fibre collagene tipiche sia alle fibre reticolari, adesso vedremo che parlando di fibre elastiche ci riferiamo a un sistema di fibre (una famiglia) che comprende tre tipi di strutture: 1) fibre elastiche 2) elauiniche 3) ossitalaniche 1) Le fibre elastiche (vedi sopra) appaiono formate da una parte centrale omogenea e amorfa detta elastina contornata in periferia da strutture microfibrillare di 10-13 nm di diametro. 2) Nelle elauiniche i depositi di elastina amorfa sono meno abbondanti e sparsi tra fasci di microfibrille. 3) Le fibre ossitalaniche sono costituite soltanto da fasci di microfibrille e manca l'elastina amorfa. Poich abbiamo visto che il processo di formazione delle fibre elastiche prevede che prima si depositino le microfibrille e poi un po' alla volta, si vada accumulando l'elastina, potremmo dire che queste tre tipologie di fibre possono rappresentare momenti diversi del processo di formazione e maturazione delle fibre elastiche. Si parte dalle fibre ossitalaniche quando ancora non c' elastina, poi diventano elauiniche e infine si formano le fibre elastiche vere e proprie. In realt le fibre ossitalaniche ed elauiniche si trovano anche come strutture stabili nei tessuti adulti di alcuni distretti anatomici. Ad es, le fibre ossitalaniche possiamo trovarla nella pelle, nei filamenti ancoranti dei vasi linfatici e nella zonula ciliare e nell'endonevrio. Le fibre elauiniche si trovano all'interfaccia tra derma papillare e reticolare, nell'epinevrio e a ridosso degli adenomeri delle ghiandole sudoripare. Le fibre elastiche abbondano nel derma reticolare, nei vasi, nel polmone, nei legamenti gialli della colonna vertebrale. Spesso per i tre tipi di fibre possono formare una rete continua in cui le fibre ossitalaniche rappresentano un sistema di ancoraggio alle membrane basali. Infine ricordiamo che la caratteristica elasticit delle fibre elastiche dipende proprio dall'elastina, dalla sua composizione ma soprattutto dalla sua conformazione disordinata capace di distendersi e di ritornare nuovamente allo stato iniziale. Le microfibrille invece sono strutture piuttosto rigide con limitate propriet elastiche.

2) SOSTANZA AMORFA O SOSTANZA FONDAMENTALE La sostanza amorfa, cos chiamata perch inizialmente era considerata non strutturata, la componente in cui sono immerse le fibre e le cellule di ogni tessuto connettivo. Possiede le propriet di una soluzione colloidale molto viscosa o di un gel fluido capace di legare quantit variabili di acqua (acqua che, con le sostanze e i gas in essa disciolti, diffonde dai capillari sanguigni e costituisce il liquido interstiziale o tissutale; vedi dopo). Nell'ambito delle funzioni del tessuto connettivo propriamente detto, la sostanza amorfa svolge un ruolo 11

di regolazione selettiva del flusso di liquido interstiziale che la traversa. Il suo ruolo anche quello di dare turgidit al tessuto, proprio legando l'acqua alle sue macromolecole e garantendo cos una risposta, seppur limitata, alle forze di compressione. Inoltre la sostanza amorfa influenza l'orientamento delle microfibrille nascenti di collagene e di fibrillina e contribuisce alle reazioni di difesa dell'organismo ostacolando la diffusione dei microrganismi. La sostanza fondamentale costituita, oltre da quella quantit variabile di acqua che rappresenta il liquido interstiziale, soprattutto da alcune macromolecole quali i glicosaminoglicani (GAG) e i proteoglicani, nonch glicoproteine tra cui spiccano le proteine adesive (come la fibronectina) che collegano macromolecole della superficie cellulare a macromolecole della matrice (vedi dopo). Solitamente la sostanza amorfa caratterizzata da una scarsa densit delle macromolecole che la costituiscono (oltre che da un contenuto pi o meno elevato di acqua) motivo per cui ha un indice di rifrazione molto vicino a quello dell'acqua, e ci la rende invisibile nei preparati a fresco. Anche nei comuni preparati istologici di difficile evidenziazione perch solubile nei comuni fissativi. conservata meglio utilizzando il metodo del congelamento-essiccamento seguito da fissazione mediante esposizione a vapori di etere-formaildeide. Nei preparati cos allestiti si colora debolmente con la reazione di Schiff (debolmente PAS positiva) e si colora metacromaticamente con alcuni coloranti basici come il blu di toluidina. In alcuni tessuti connettivi, come la cartilagine e l'osso, il contenuto di glicosaminoglicani e glicoproteine della sostanza amorfa tanto elevato da renderla fissabile e colorabile con i coloranti basici e con il metodo di PAS in preparati istologici allestiti con tecniche comuni. La metacromasia della sostanza amorfa dei connettivi una propriet istochimica conferita dai glicosaminoglicani acidi in essa contenuti: acido ialuronico, condroitin solfato, cheratan solfato, ecc... I glicosaminoglicani solforati sono in genere pi metacromatici di quelli non solforati. Quando i gruppi solforici sono molto numerosi, come nella cartilagine, la sostanza amorfa si colora anche con ematossilina. La colorabilit dei tessuti connettivi con la reazione PAS non dipende tanto dai GAG, ma deve essere attribuita alle glicoproteine, scarsamente concentrate nel tessuto connettivo lasso ma presenti in elevate concentrazioni nelle membrane basali e nella sostanza amorfa della cartilagine e dell'osso. La sostanza amorfa dei tessuti connettivi, in particolar modo quella della cartilagine, si colora inoltre con il metodo del ferro colloidale di Hale e col metodo Alcian blu. Queste reazioni sono dovute alla propriet dei glicosaminoglicani di legare cationi bivalenti e sono di solito impiegate per mettere in evidenza i glicosaminoglicani acidi della cartilagine.

LIQUIDO INTERSTIZIALE
La sostanza intercellulare amorfa ha le propriet di una soluzione colloidale molto viscosa ed capace di legare quantit variabili di acqua. Quest'acqua che ritroviamo nella sostanza amorfa costituisce il liquido tissutale o interstiziale. In essa sono disciolte le sostanze metaboliche e i gas e diffonde dai capillari sanguigni al connettivo e viceversa. La matrice amorfa ed i liquidi tissutali sono intimamente associati e le caratteristiche molecolari e biofisiche di queste due componenti stanno alla base della funzione trofica del tessuto connettivo lasso (che svolge anche un ruolo di regolazione selettiva del flusso di liquido interstiziale). La maggior parte del fluido extracellulare legata ai componenti macromolecolari della matrice amorfa e in condizioni normali non si riscontra in quantit apprezzabili come fluido libero nel connettivo; si accumula invece in grandi quantit come liquido libero nell'edema o in caso di infiammazioni.

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GLICOSAMINOGLICANI (GAG)
I costituenti chimici pi importanti della sostanza amorfa dei tessuti connettivi appartengono a una classe di polisaccaridi denominati glicosaminoglicani o GAG, che poi legandosi covalentemente a proteine, formano complessi proteico-polisaccaridici giganti detti proteoglicani. I GAG sono lunghi polisaccaridi lineari costituiti da unit ripetute moltissime volte di disaccaridi, concatenati mediante legame O-glicosidico. Ogni disaccaride costituito da un acido uronico (glucuronico o idruronico) e da un amminozucchero (N-acetil glucosamina o N-acetil galattosamina). Gli aminozucchero possono essere spesso solfatati. I GAG sono molecole grandi (da alcune migliaia ad alcuni milioni di dalton). L'elevato contenuto di gruppi anionici (gruppi solforici o carbossilici, ecc...) conferisce ai GAG un'elevata carica negativa e ci spiega la loro intensa basofilia, la loro metacromasia ma anche la loro capacit di legare molte molecole di acqua. Proprio legando acqua e cationi, i GAG sono i principali responsabili del turgore e della resistenza alle forze di compressione della ECM; inoltre tendono ad occupare un volume molto elevato rispetto alla loro massa e sono proprio queste loro caratteristiche a rendere gelatinosa e viscosa alla sostanza intercellulare amorfa. Il pi semplice e comune dei GAG lo ialuronato o acido ialuronico: una singola catena non ramificata costituita da un caratteristico disaccaride non solforato (acido glucuronico- N acetil glucosamina) che pu essere ripetuto fino al 25.000 volte. abbondante in numerosi tessuti sia dell'embrione che dell'adulto. digerito specificatamente dall'enzima ialuronidasi. Ha una consistenza viscosa e per questo rappresenta un ottimo lubrificante: infatti il componente principale del liquido sinoviale. La viscosit dell'acido ialuronico dipende dal suo grado di polimerizzazione, dalla sua conformazione tridimensionale e dalla sua capacit di legare acqua; queste propriet possono modificarsi rapidamente a seconda delle condizioni funzionali determinando variazioni nella consistenza della matrice amorfa e variazioni nella diffusione delle sostanze dai capillari dei tessuti e viceversa (liquido tissutale). L'acido ialuronico svolge quindi un ruolo importante nel controllare la diffusione attraverso il tessuto connettivo di quelle sostanze disciolte nel liquido interstiziale e allo stesso tempo previene la diffusione di agenti tossici e batteri nelle infezioni localizzate (tant' che alcuni batteri secernono proprio l'enzima ialuronidasi). adatto a resistere alla compressione e inoltre durante lo sviluppo o durante la cicatrizzazione viene utilizzato, proprio in virt del suo elevato volume specifico, come sostanza capace di creare uno spazio che sar poi riempito da altre macromolecole o cellule. Mentre gli altri GAG sono solitamente sintetizzati dentro la cellula e poi secreti all'esterno per esocitosi, l'acido ialuronico sintetizzato da un enzima inserito nel doppio strato lipidico della membrana plasmatica: le singole sub unit saccaridiche sono aggiunte sul versante citoplasmatico delle membrana e il polimero che si va formando viene via via emesso attraverso la membrana nello spazio extracellulare. Un'attiva sintesi di acido ialuronico e un suo accumulo nella matrice, determina un allontanamento delle cellule e la formazione di gel idratati in cui le cellule si muovono facilmente. Se invece si ha una degradazione dell'acido ialuronico, le cellule si avvicinano e questo un processo che sta alla base, ad esempio, della formazione degli abbozzi scheletrici. Altri GAG (che sono sempre legati covalentemente a proteine) sono il condroitin solfato, il dermatan solfato, il cheratan solfato, l'eparan solfato e l'eparina. (L'eparina ha una localizzazione intracellulare nei mastociti e granulociti neutrofili e pu essere rilasciata in risposta a certi stimoli per espletare funzioni fisiologiche. L'eparan solfato, sotto forma di proteoglicano, un componente ubiquitario della superficie cellulare).

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PROTEOGLICANI
In natura, i GAG, eccezione fatta per l'acido ialuronico, non esistono come molecole libere ma sono sempre legati covalentemente a proteine diverse dal collagene, formando degli enormi complessi macromolecolari detti proteoglicani. Ogni proteoglicano costituito da un lungo polipeptidiche che forma l'asse centrale (detto asse proteico) al quale sono connessi con legami covalenti numerosi GAG (che in particolare sono legati ai residui di serina dell'asse proteico tramite un tetrasaccaride di connessione). La Biosintesi dei proteoglicani segue la via secretoria: sono cio sintetizzati all'interno della cellula e poi secreti mediante esocitosi. La parte proteica viene sintetizzata sui ribosomi legati alle membrane del REG e viene poi traslocata nel lume del reticolo dove pu essere glicosilata in modo simile alle glicoproteine. Dopo di che, la proteina viene trasportata tramite vescicole all'apparato di Golgi e qui in corrispondenza di numerosi residui di serina, vi si lega, mediante il caratteristico legame O-glicosidico, uno specifico tetrasaccaride (detto tetrasaccaride di connessione o di legame). La catena dei glicosaminoglicani inizia ad essere sintetizzata e ad accrescersi, un monosaccaride alla volta, a partire dall'estremit libera del tetrasaccaride. I proteoglicani meglio caratterizzati sono quelli della matrice cartilaginea. Un proteoglicano tipico della cartilagine ialina l'aggrecano (che contribuisce alla grande resistenza di questo tessuto alla compressione), costituito da un asse proteico al quale sono legati covalentemente in punti diversi oltre 100 catene laterali costituite da GAG solforati, appartenenti a tre categorie: condroitin 4 solfato, condroitin 6 solfato e cheratan solfato. L'asse proteico invece costituito da circa 3000 a.a. ed ha una lunghezza di circa 100-150 nm e pu essere suddivisa in tre regioni: una regione che lega prevalentemente le molecole di condroitin solfato, una regione intermedia che lega prevalentemente le molecole di cheratan solfato e un segmento situato a un'estremit privo di catene laterali polisaccaridiche, con cui si attacca all'acido ialuronico. Infatti molte molecole di aggrecano si legano a una singola catena di acido ialuronico tramite proteine di connessione, dando origine ad aggregati che pensano molti milioni di dalton e possono raggiungere alcuni micrometri di dimensione e che sono capaci di legare grandi quantit d'acqua per il loro carattere idrofilo. Ricordiamo per che solitamente nei proteoglicani i diversi tipi di GAG non sono legati ciascuno ha una specifica regione dell'asse proteico cos come in questo caso, ma sono pi mescolati tra loro. Le funzioni dei proteoglicani sono principalmente di due tipi: 1) - contribuiscono ad organizzare in modo ordinato l'ECM mediante interazioni specifiche con altri componenti; a causa della loro viscosit e permeabilit costituiscono dei "filtri" molecolari a porosit variabile: regolano la diffusione di molecole da e verso i capillari; per la loro forte carica negativa proteggono gli endoteli e impediscono l'attacco di cellule circolanti nel sangue alla parete del vaso. Il caso pi evidente di proteoglicano che contribuisce a organizzare la matrice proprio quello dell'aggrecano, che si trova a nella cartilagine e contribuisce a dare resistenza al tessuto nei confronti di forze di compressione. Inoltre per le sue grandi dimensioni e per il suo carattere idrofilo capace di trattenere grandi quantit di acqua. 2) hanno la capacit di regolare le funzioni cellulari intervenendo in vario modo sull'attivit dei recettori cellulari e i meccanismi con cui agiscono sono molteplici. Infatti possono intrappolare nello spazio intercellulare molecole, come fattori di crescita o enzimi; il legame con il proteoglicano pu stimolare oppure inibire la funzione del fattore di crescita; il proteoglicano pu limitare la diffusione del fattore intrappolandolo in una regione limitata, mediante legami covalenti, e da cui pu essere rilasciato all'occorrenza. Infine il legame con il proteoglicano pu 14

proteggere oppure accelerare la degradazione del fattore. I proteoglicani non solo li troviamo nello spazio intercellulare all'interno della matrice: alcuni diventano componenti integrali delle membrane plasmatiche, essendo ancorati al doppio strato o tramite l'inserimento della proteina centrale oppure attraverso il legame covalente con il GPI (glicosil fosfatidil inositolo) e svolgono in questa sede molte funzioni: co-recettoriali, di collegamento con macromolecole della matrice, ecc...). Ad es, il proteoglicano decorina pu legarsi al fattore di crescita trasformante b e ci impedisce al fattore di interagire con le cellule bersaglio; oppure ancora questo fattore pu legarsi a un altro proteoglicano, il betaglicano, che lo presenta allo specifico recettore di membrana. Opuure ancora, il sindecano pu legarsi al fattore di crescita dei fibroblasti tramite le catene di eparansolfato e in alcuni casi questo legame sembra essenziale per l'interazione del fattore con le cellule bersaglio. Inoltre l'asse proteico del sindecano una proteina transmembrana che possiede un dominio intercellulare che si lega ai filamenti di actina subplasmalemmali (contribuendo a determinare lo stato organizzativo del citoscheletro), un dominio transmembrana e un dominio extracellulare a cui sono legati i GAG, attraverso i quali il sindecano stabilisce rapporti con macromolecole della matrice, fungendo quindi da integrina. Abbiamo gi parlato dell'aggrecano, ora vediamo in generale di parlare di aggregati proteoglicanici. Un aggregato proteoglicanico un complesso macromolecolare formato da molte molecole di proteoglicano che si legano lungo una molecola di acido ialuronico. Il complesso che ne risulta di grossissime dimensioni. Ad es, l'aggregato presente nella matrice cartilaginea costituito da un asse di acido ialuronico cui sono legate circa 100 molecole di aggrecano (ciascuna mediante una molecola di una proteine di collegamento) e ha un peso molecolare dell'ordine di 100 milioni di dalton. La stessa proteine di collegamento capace di mediare l'interazione di altri proteoglicani (versicano, neurocano) con l'acido ialuronico e aggregati come quelli sopra descritti sono reperibili in molti tessuti e sedi, come il corpo vitreo dell'occhio, la polpa dentaria o il cumulo ooforo. I proteoglicani possono legarsi anche ad altre macromolecole, tra cui il tropocollagene o la fibronectina, formando reti tridimensionali estremamente complesse. possibile che l'organizzazione in fasci orientati delle strutture fibrillari dei tessuti connettivi sia dovuta all'interazione tra tropocollagene e proteoglicani. 3) PROTEINE STRUTTURALI CON FUNZIONE ADESIVA Le glicoproteine costituiscono una componente importante della sostanza fondamentale dei tessuti connettivi, anche se quantitativamente inferiore rispetto al glicosaminoglicani. Sono formate da catene polipeptidiche su cui sono uniti con legame covalente alcuni oligosaccaridi, costituiti da una corta catena di glicidi: in particolare, glucosio, mannosio, acido sialico, fucosio, esosamine, xilolo, ecc... Queste catene di glicidi possono essere lineari o ramificate e terminano molto spesso con un residuo di acido sialico o di L-fucosio. I carboidrati rappresentano circa il 10-40% della molecola e infatti, sebbene siano molto simili strutturalmente ai proteoglicani, le glicoproteine contengono una maggiore percentuale della componente proteica, ossia il 60-90%. La componente glucidica costituita da brevi catene oligosaccaridiche (anzich polisaccaridiche come nei proteoglicani) legate con legame O-glicosidico ad un'unica catena polipeptidica, di solito in corrispondenza di residui di serina o treonina, o con legame N-glicosidico all'asparagina. Le glicoproteine della sostanza amorfa sono responsabili della colorabilit di tale sostanza con il reattivo di Schiff. Glicoproteine simili a quelle della sostanza amorfa dei tessuti connettivi sono presenti sulla superficie di tutti i tipi cellulari come componenti intrinseci della membrana in quanto formano il cosiddetto glicocalice o matrice pericellulare. 15

Queste glicoproteine hanno la comune caratteristica di essere composta da vari domini strutturali ognuno con propriet particolari soprattutto per quanto riguarda le interazioni con altri componenti della matrice extracellulare o con altre cellule. Queste glicoproteine hanno funzioni molto varie, anche se la maggior parte di queste molecole media l'adesione cellulare. Ogni specie molecolare viene espressa in modo caratteristico nei diversi tessuti e poich differenti glicoproteine riconoscono diversi recettori di adesione,il risultato un sistema di adesione cellulare molto variabile e complesso. Adesso vedremo le principali glicoproteine capaci di ancorare le cellule alle fibre collagene oppure ad altri substrati attraverso interazioni (contatti focali) con i MF di actina del citoscheletro, mediante dei recettori di membrana del gruppo delle integrine. Fibronectina: una glicoproteina presente nei connettivi interstiziali ma anche nel glicocalice. lunga circa 60 nm ed formata da due subunit polipeptidiche simili, unite da ponti disolfuro. Regioni diverse della fibronectina possono legare vari tipi di molecole, come il collagene, l'eparina o altre molecole di fibronectina e inoltre la proteina ha anche una regione di legame per le cellule. Il sito di legame per le cellule costituito da due domini detti di tipo III in cui una particolare sequenza di a.a. (arginina-glicina-acido aspartico) localizzata in una ansa esposta della catena polipeptidica ed riconosciuta dal recettore integrinico. La fibronectina quindi una glicoproteina multifunzionale, il cui ruolo si pensa sia proprio quello di fattore di adesione, specifica per gli attacchi delle cellule e matrice extracellulare quale il collagene e glicosaminoglicani dei diversi proteoglicani. Il legame della fibronectina al collagene pu essere modulato dagli glicosaminoglicani. Sebbene il meccanismo di questa interazione non sia del tutto chiaro, possibile che la fibronectina formi complessi macromolecolari differenti in base al tipo di proteoglicano con cui per prima si lega. Nella matrice fibrosa, la fibronectina legata al collagene potrebbe subire un cambiamento conformazionale che le fa acquisire maggiore affinit per il glicosaminoglicani solfati. Questi ultimi a loro volta regolano il legame della fibronectina con il collagene stabilizzando il complesso fibronectina-collagene e inducono la precipitazione della fibronectina e del collagene determinando la loro organizzazione strutturale per formare un reticolo fibrillare. In generale la fibronectina una volta che stata secreta dalla cellula pu organizzarsi in filamenti con un assemblaggio controllato dalla cellula stessa: da un lato la fibronectina agisce sull'organizzazione del citoscheletro e della cellula, dall'altro il citoscheletro agisce sull'organizzazione delle fibrille di fibronectina. Infatti nel momento in cui la fibronectina si lega ai suoi recettori integrinici, si ha un reclutamento di molecole citoscheletriche e di segnale. Ne consegue l'organizzazione del citoscheletro di actina e un ulteriore aggregazione di proteine del citoscheletro e segnalatrici, con formazione di grossi complessi molecolari al di sotto della membrana, detti adesioni focali. vero che la maggior parte delle glicoproteine della ECM ha funzioni adesive, per alcune hanno anche funzioni anti-adesive. Tenascina: una glicoproteina composta da sei catene polipeptidiche tenute assieme da ponti disolfuro; particolarmente abbondante nei tessuti embrionali, e pu promuovere oppure inibire l'adesione a seconda del tipo di cellula. In particolare il suo effetto antiadesivo sembra attribuito al fatto che la tenascina inibisce il legame sindecano-fibronectina, un'interazione che complementa quella della fibronectina con il suo recettore integrinico. SPARC: contenuta nelle membrane basali, ha soltanto una fusione antiadesiva. A quanto pare attiverebbe una via di segnalazione che destabilizza le adesioni focali. La distribuzione di queste proteine adesive ed antiadesive ha un ruolo importante nel guidare la migrazione delle cellule all'interno della matrice, un fenomeno particolarmente importante durante lo 16

sviluppo embrionale. Laminina: glicoproteina solforilata che permette l'adesione delle cellule epiteliali ed endoteliali al collagene di tipo IV e ai proteoglicani delle lamine basali. N.B. Ricapitolando i componenti pi importanti della sostanza amorfa sono: GAG: acido ialuronico Proteoglicani: versicano, decorina, sindecano, betaglicano e aggrecano Glicoproteine: fibronectina, laminina, fibrillina, tenascina, SPARC La composizione e la struttura della matrice extracellulare non dipende soltanto dal tipo di molecole prodotte, ma anche dai processi di degradazione con cui queste molecole possono essere distrutte una volta secrete. Tale degradazione avviene ad opera di enzimi extracellulari, tra cui i pi importanti sono: - metallo proteasi della matrice o MMP o matricine, che necessitano di ioni zinco legati alla proteina - serina-proteasi che possiedono una serina particolarmente reattiva nel sito catalitico. Questi enzimi sono necessari in condizioni fisiologiche per rimaneggiare rapidamente la matrice extracellulare, ad esempio durante l'involuzione dell'utero dopo la gravidanza e nell'ossificazione endocondrale. Proprio nei processi di ossificazione, il ruolo delle matricine particolarmente importante perch contribuiscono a rimuovere parzialmente la matrice cartilaginea per sostituirla con tessuto osseo. Inoltre sempre le matricine, nel momento in cui distruggono la matrice cartilaginea, permettono di liberare fattori di crescita che erano resi inattivi proprio dal legame con la matrice extracellulare. Invece in condizioni patologiche, come i tumori, questi enzimi favoriscono l'invasione dei tessuti circostanti e la disseminazione metastatica.

MEMBRANA BASALE
E' una struttura submicroscopica specializzata dell'ECM. Ha aspetto laminare con spessore di circa 50100 nm. Si trova all'interfaccia tra il tessuto connettivo propriamente detto e diversi tipi di cellule: epiteliali, muscolari, gliali, adipose. Pu formare uno strato basale, un rivestimento, che costituisce il substrato a cui aderiscono le cellule epiteliali, oppure pu avvolgere completamente altri tipi cellulari quali appunto cellule muscolari o adipociti o cellule di Schawann. Particolarmente spessa la membrana basale del glomerulo renale, membrana che si interpone tra le cellule endoteliali del glomerulo renale e i podociti (cellule epiteliali della capsula di Bowman). La membrana basale si presenta come una zona priva di cellule ma ricca di macromolec le della matrice, PAS positiva e metacromatica (propriet conferitagli da glicoproteine e GAG). Si presenta apparentemente omogenea se osservata al M.O. , mentre osservata al M.E, si rivela costituita da pi strati. In particolar modo se parliamo della membrana basale che separa l'epitelio dal connettivo si distinguono 17

sul versante epiteliale la lamina basale, sul versante connettivale la lamina reticolare. La lamina basale si suddivide a sua volta in: - lamina lucida detta anche lamina rara: uno strato di 10-50 nm di spessore, addossato alla membrana plasmatica delle cellule epiteliali, relativamente omogeneo e ricco di integrine e glicoproteine come lamina ed entactina - lamina densa: uno strato elettron-denso di 20-300 nm di spessore, ricco di filamenti di collagene di tipo IV e di perlencano, un proteoglicano ricco di eparan solfato. Nella lamina basale sono presenti componenti elaborati soprattutto dalle cellule epiteliali e inoltre anche microfibrille di collagene di tipo VII e di fibrillina e molecole di fibronectina prodotte dai fibroblasti. La lamina reticolare invece ricca di macromolecole elaborate dai fibroblasti, come collagene di tipo I e III, ed ha spessore variabile. L'insieme dei componenti dei diversi strati forma, attraverso una serie di interazioni, un intreccio complesso, un feltro, elaborato da entrambi tessuti confinanti: le molecole di collagene IV si aggregano, attraverso interazioni specifiche tra le estremit amminiche e carbossiliche, a formare una rete estesa. Questa rete si lega alla nidogenina e attraverso questa, con la laminina. La laminina a sua volta si lega a recettori di superficie delle cellule epiteliali, muscolari, ecc... Si forma cos una fitta impalcatura tridimensionale stabilizzata da numerosi legami covalenti. Le funzioni della membrana basale dipendono proprio dal complesso intreccio di macromolecole: la rete di collagene assicura coesione meccanica tra connettivo e tessuto confinante, la presenza dei GAG svolge funzioni di filtrazione molecolare, e cos via. Complessivamente quindi la membrana basale in primis fornisce un ancoraggio flessibile, deformabile, ma resistente alla tensione per il tessuto confinante col connettivo: questo ancoraggio permette di determinare la forma della cellula, la sua popolarit e durante lo sviluppo costituisce un percorso lungo il quale avvengono migrazioni cellulari. Un'altra funzione che riguarda soprattutto il glomerulo renale proprio quella di filtro molecolare sopra accennato. La membrana basale del glomerulo impedisce infatti il passaggio delle macromolecole del sangue nell'urina e questo dovuto soprattutto alla presenza del perlecano (un proteoglicano ricco di eparan solfato). La membrana basale poi determinante per la differenziazione delle cellule, per la loro sopravvivenza e per regolarne la proliferazione. anche fondamentale nei processi di rigenerazione tessutale: infatti se la membrana basale non rimane conservata nella sua struttura, la riparazione del tessuto avviene pi lentamente e in modo disordinato. Infine alcuni componenti della membrana basale contengono dei domini con funzione criptica, una funzione cio che non si esplica fino a quando la molecola integra. Quando la molecola per viene degradata da enzimi proteolitici, magari in seguito a processi patologici, questi domini vengono liberati sotto forma di frammenti singoli e possono svolgere la loro funzione. Ad esempio, l'endostatina inibisce la neoformazione di vasi sanguigni. Le fibre dell'ECM e le membrane basali sono connesse da vari sistemi strutturali: - fibrille ancoranti: un complesso di ancoraggio che si trova al di sotto di molti epiteli ed costituito da fasci di procollagene VII, le cui estremit si inseriscono nella membrana basale oppure nelle placche ancoranti (corpuscoli immessi nella matrice interstiziale, con un'ultrastruttura simile alla lamina densa della membrana basale e costituiti in prevalenza da collagene IV). La rete di fibrille ancoranti ingloba nelle sue maglie fasci di fibre collagene, stabilendo cos un'effettiva integrazione tra membrana basale e stroma interstiziale. - filamenti di collagene VI: questo collagene forma dei filamenti perlati diffusi in tutto il connettivo interstiziale ma soprattutto al di sotto delle membrane basali. La sottile rete a maglie larghe che ne deriva, 18

prende contatto con la membrana basale, legandosi col il collagene IV. Questa rete di filamenti particolarmente importante come componente dell'endomisio, perch necessaria per stabilizzare le fibre muscolari durante il processo di contrazione. - fibre ossitalaniche: servono ad integrare le membrane basali e l'elastina fibrosa. Queste fibre decorrono spesso perpendicolarmente alla membrana basale degli epiteli, vi si inseriscono direttamente mentre negli interstizi si continuano prima con le fibre elauiniche e poi con la rete di fibre ricche di elastina. In questo modo gli stress meccanici applicati all'epitelio vengono trasmessi attraverso fibre ossitalaniche rigide e poi smorzati su fibre che hanno via via quantit pi abbondante di elastina.

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