INMUNOHISTOQUIMICA RELACIONADO A LA CITOLOGIA

Corresponde a un grupo de tcnicas de inmunotincin que permiten demostrar una variedad de antgenos presentes en las clulas o tejidos utilizando anticuerpos marcados. Estas tcnicas se basan en la capacidad de los anticuerpos de unirse especficamente a los correspondientes antgenos. Esta reaccin es visible solo si el anticuerpo est marcado con una sustancia que absorbe o emite luz o produce coloracin. Los fijadores deben de preservarla morfologa celular y los antgenos. El alcohol de 96 es utilizado en extensiones citolgicas la cual es un buen fijador y conserva mejor que el formol los filamentos intermedios. Mas especficamente para la citologa se ha recomendado formol tamponado y acetona, formol calcio-acetona pura. En caso de necesitarse utilizar un mtodo de descalcificacin se elegirn los ms suaves, preferiblemente el EDTA. Si se han empleado cidos, es crtico realizar un lavado de duracin variable con agua corriente, de mayor duracin cuanto ms haya durado la descalcificacin. El mtodo de recuperacin antignica se realiza fundamentalmente mediante incubacin con calor, en torno a los 100 C, en bferes de citrato o EDTA. Menos frecuente es el uso de enzimas proteolticas, sin calentamiento, ya que dejan un fondo mayor y favorecen el desprendimiento del tejido. Los anticuerpos monoclonales son preferidos a los policlonales por tener especificidad y que pueden reaccionar con determinantes antignicos de estructura similar en clulas no relacionadas con la familia celular para que se preparo le anticuerpo monoclonal. En las tcnicas de inmunoperoxidasa se utilizan como marcadores enzimas capaces de hacer cambiar de color un sustrato incoloro. Por ejemplo, las enzimas ms frecuentemente utilizadas son peroxidasa y fosfatasa alcalina y los sustratos diaminobenzidina (color pardo), aminoetilcarbazol (color rojo), y nitroazul de tetrazolio (color azul). Estos marcadores pueden unirse (conjugarse) directamente al anticuerpo primario o bien indirectamente mediante otros anticuerpos (secundarios) o sustancias como biotina o protena A. La inmunohistoqumica tiene utilidad diagnstica en identificacin de diferenciacin y de marcadores pronstico de neoplasias (marcadores tumorales). Las tinciones nucleares realizadas conjuntamente con las reaccionesde antgeno anticuerpo son muy ventajosas, pues permiten visualizar la morfologa y diagnosticar la benignidad o malignidad de la clulas que se une al anticuerpo. Este proceder es el que caracteriza a l a ICQ. Esta tincin nuclear se puede hacer con la hematoxilina de MAYER Lilly o el mismo Papanicolaou.

El mtodo de ICQ puede ser aplicado al material de PAAF. de los derrames. Las improntas y los extendidos respiratorios.

Cuantificacin del resultado inmunohistoqumico Se seguir en general la siguiente pauta, aunque hay frecuentes casos especficos en los que los porcentajes y su significado pueden variar: Negativo (-): total negatividad o menos del 50% de las clulas diana con menor intensidad que el control. Positividad dbil (+/-): ms del 50% de las clulas diana con menor intensidad que el control. Positivo (+): ms del 50% de las clulas diana con igual o mayor intensidad que el control. Realizacin de inmunohistoqumica en preparaciones citolgicas

Lo mejor es prever siempre un bloque para procesar en parafina. Hay dos posibilidades, o bien realizar la inmunohistoqumica sobre la misma laminilla citolgica o tambin despegar las zonas deseadas y transferirlas a otros portas. Esta ltima es ms tediosa pero ofrece los mejores resultados y permite sacar varios portas de una sola extensin citolgica. El mtodo es muy reciente y se desarrolla de la siguiente manera: -

Es importante la utilizacin del medio Mount-Quick .

Echar el medio sobre la laminilla y endurecerlo en estufa a 50-60 C por varias horas. Marcar las zonas a estudiar con rotulador indeleble. Calentar en ell bao Mara (45 C) durante 15-20 minutos para ablandarlo. Levantar el medio del porta con un bistur y cortarlo en lonchas.

Transferir al porta adherente especial y mantener durante un minuto una presin con papel de filtro humedecido. Mantener a 60 C durante toda la noche. Retirar el Mont Quick mediante tres pasos por xilol. Rehidratar (No es necesario desteir si se va a utilizar HIER).

Evaluacin de nuevos anticuerpos Seleccin de un nuevo anticuerpo primario: Los motivos pueden ser por que existan nuevas demandas o para sustituir a otro existente. Deben predecirse el nmero de test que se realizarn anualmente y el coste de cada estudio. Optimizacin de la inmunorreactividad Los factores ms importantes son. Dilucin del anticuerpo primario. Duracin de la incubacin del primario. Tipo y concentracin del anticuerpo secundario. Tcnica de recuperacin antignica empleada. Temperatura de incubacin. Sistema de deteccin y amplificacin.

En la prctica se manejan nicamente tres variables: Dilucin del anticuerpo primario. Tiempo de incubacin del primario (si se aumenta el tiempo se pude diluir ms el anticuerpo primario). Tcnica de recuperacin antignica (el EDTA alcalino suele ser mejor que el citrato. Excepciones: LMP-1 y CD21, en los que se preferirn enzimas). Adems de la positividad de la diana debe valorarse el fondo. Dicha tincin de fondo tiene causas variadas. A veces es debido a que el anticuerpo no est totalmente purificado y tiene inmunoglobulinas inespecficas. Muchas veces es por una titulacin deficiente del anticuerpo primario y/o secundario (disminuid la concentracin y aumentad los tiempos para solucionarlo). En las tinciones citoplsmicas deben tenerse en cuenta los falsos positivos como los debidos a biotina endgena (neutralizada con avidina despus del anticuerpo primario) y con las peroxidasas (se neutraliza con agua oxigenada) y fosfatasa (se bloquea con levamisol) endgenas. Para detectar problemas de fijacin es til introducir un control de vimentina (Dako) pero sin realizar con ella recuperacin antignica alguna.

UTILIDAD DE LA APLICACIN INMUNOHISTOQUMICA A LA PAAF DE PULMN

La aplicacin de las tcnicas inmunohistoqumicas a los estudios citolgicos es una prctica cada vez ms frecuente entre los patlogos. El hecho de que el citopatlogo este presente durante la realizacin de la PAAF de pulmn, favorece la obtencin de material ptimo para estudios inmunohistoqumicos, siendo aconsejable realizarlas sobre bloque celular, pues permitir usar los mismos controles que se emplean en los cortes histolgicos de las biopsias. El citopatlogo debe tener en cuenta que la inmunohistoqumica es una tcnica complementaria de apoyo al diagnstico y la valoracin de la misma debe basarse en los hallazgos morfolgicos y en los datos clnicos. El inmunofenotipo de los carcinomas pulmonares primarios es el siguiente:

Adenocarcinomas Muestran inmunotincin positiva para CK 7 y negativa para CK 20, aunque los carcinomas bronquioloalveolares mucinosos y los carcinomas coloides pulmonares pueden ser positivos para esta ltima. El TTF-1 es el marcador ms especfico para los adenocarcinomas primarios, pero en una pequea proporcin de casos, es positivo en los carcinomas colorrectales. El hecho de la positividad de TTF-1 en los carcinomas de tiroides, hace imprescindible la realizacin de tiroglobulina si se sospecha una metstasis de dicho.

En cncer Bronquioloalveolar. Adenocarcinoma. TTF-1: POSITIVO

En cncer Bronquioloalveolar. Adenocarcinoma. CK-7: POSITIVO

En cncer Bronquioloalveolar. Adenocarcinoma. CK-5: NEGATIVO

Inmunomarcacin de biopsia pulmonar CK7: POSITIVO

Inmunomarcacin de biopsia pulmonar CK20: POSITIVO

Carcinomas Epidermoides Suelen ser negativos para CK 7, CK 20 y TTF-1, aunque un nmero escaso de casos pueden expresar positividad para CK 7 o TTF-1. La expresin positiva de CK 5/6 y P 63 permitir diferenciarlos de adenocarcinomas y carcinomas de clulas pequeas. La diferenciacin de los adenocarcinomas es de vital importancia para evitar el tratamiento con bevacizumad, que en los pacientes con carcinoma epidermoide puede ocasionar hemoptisis graves.

Carcinoma Epidermoide. TTF-1: NEGATIVO

Carcinoma Epidermoide. P63: POSITVO

Carcinoma Epidermoide. C-K-5: POSITVO

Tumores neuroendocrinos Los carcinomas neuroendocrinos y los tumores carcinoides se caracterizan por la expresin de marcadores neuroendocrinos, tales como sinaptofisina, cromogranina y CD 56, siendo tpicamente negativos para CK 7 y CK 20, aunque se han descrito casos con positividad para estos marcadores. La expresin de TTF-1 no es especfica de un origen pulmonar en los carcinomas de clulas pequeas, aunque si en los tumores carcinoides. El Ki-67 es de gran utilidad para diferenciar los tumores neuroendocrinos de alto grado de los tumores carcinoides, que presentan un ndice proliferativo bajo.

Cromogranina en Tumor neuroendocrino

Adenocarcinomas metastsicos La inmunohistoqumica es de gran utilidad para diferenciar los adenocarcinomas primarios de los metastsicos. Los anticuerpos ms comunmente empleados son: TTF-1, CK 7, CK 20, GCDFP-15, PSA, fosfatasa acida prostatica y tiroglobulina.

Mesotelioma epitelial vs carcinoma

CK7: se detecta en epitelios simples de pulmn. CEA: generalmente positivo en carcinomas de pulmn. Reactividad del EMA en carcinomas y tumores no epiteliales en pulmn:

Inmunomarcacin de biopsia pulmonar CDX2: POSITIVO

Carcinomas pulmonares: Epidermoide vs oat cell

OAT CELL ( Carcinoma indiferenciado de las clulas pequeas)

Es un tipo de cncer pulmonar de crecimiento rpido. Se disemina mucho ms rpidamente que el cncer pulmonar de clulas no pequeas. Existen dos tipos diferentes de este cncer:

Carcinoma de clulas pequeas (cncer de clulas en avena) Carcinoma combinado de clulas pequeas

La mayora de los cnceres pulmonares de clulas pequeas corresponden al primer tipo.

Se pueden usar los siguientes marcadores:

OAT CELL. CD56 : POSTIVO

OAT CELL. TTF-1 : POSTIVO

OAT CELL. CK-5 : NEGATIVO