Los vectores derivados de plsmidos

Introduccin a la Biologa plsmido

Los plsmidos son auto-replicantes, extrachroantibitico. El sitio de clonacin es una restriccin enmolculas de ADN cromosmicas que se encuentran en prcticamente todos los donuclease sitio de escisin en el que exterior especies bacterianas. En la naturaleza, los plsmidos se producen en ADN puede ser insertado sin interferir con profusin exuberante, variando en estructura, tamao el plsmido la capacidad de replicar o conferir a los modo de reproduccin, el nmero de copias por bacel fenotipo seleccionable en su husped. Durante el terial de clulas, la capacidad de Propag comi en diferentes bacaos, los vectores plasmdicos han aumentado en lo que se rios, la transferencia entre las especies b acterial, phistication; adems de estos tres bsico y quizs lo ms importante, en los rasgos que elemental vectores ts muchos ahora incluyen caractersticas llevar La mayora de los plsmidos procariotas son de doble que los hacen particularmente adecuados fo r especfica hundidos molculas de ADN circulares; sin embargo, tipos de experimentos. lin plsmidos odo han sido identificados en tanto de sc ribe proc edure s para hacer
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bacterias gram-positivas y gram-negativas. El ADN plsmido. El proceso por el cual los plsmidos tamao de los plsmidos vara ampliamente, desde varios se introducen en E. coli se llama transkilobases a cientos de kilobases. replicacin macin. . Protocolos de transformacin se dan en de plsmidos depende de las protenas celulares husped pero . Para obtener una lista de los vectores y sus ms destacados
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Tambin pueden requerir plsmido codificados funciones. caractersticas, consulte .

APPE NDI X 5

El plsmido de replicacin puede ser sincronizada sincronizar con

Replicantes
el ciclo celular bacteriana, resultando en una baja numnmero de molculas de plsmido por clula bacteriana, o Una de las maneras en que los replicadores son clasifiindependiente del ciclo de la clula husped, lo que permite cado se basa en el nmero de moles-plsmido la proliferacin de cientos de copias del plsmido culas mantenidas por clula bacteriana bajo alguna por clula. Algunos plsmidos transferir libremente su un conjunto de condiciones de crecimiento normales, los llamados ADN entre las especies b acterial, algunos slo transel nmero de copias de t que pl asm Identificacin. Libro de T hi fi nes de s fer su ADN en bacterias de la misma especie, alto nmero de copias de plsmidos como las que y algunos no transferir su ADN en absoluto. existen en 20 copias por clula bacteriana crecido en Los plsmidos portadores de genes que especifican una amplia variedad medio LB lquido, y bajo nmero de copias de funciones que incluyen: resistencia a los antibiticos, plsmidos como las que existen en <s 20 por copie resistencia a metales pesados, sensibilidad a la mucelular Alto co-PY-nmero de plsmidos tienden a ser tagens, la sensibilidad o resistencia a la bacterioms pequea que copia de baja-nu plsmidos mber. Ellos fagos, la produccin de enzimas de restriccin, proson ms comnmente utilizados en biologa molecular biolgiproduccin de aminocidos poco comunes, la produccin de toxtrumentales, ya que es ms fcil de preparar grandes ins, la determinacin de la virulencia, el catabolismo de cantidades de ADN plsmido puro a partir de clulas que complicadas molculas orgnicas, la capacidad para formar les doy. Bajo nmero de copias plsmidos son relaciones simbiticas, y la capacidad para transferir utilizada cuando es importante para controlar el gen ADN a travs de kingdo ms. dosificacin de una secuencia clonada, por ejemplo, cuando A partir de la dcada de 1970, los vectores de propagacinla secuencia de ADN o el p rotein que codifica i n, la manipulacin y la entrega de determinada hace que el organismo husped enfermo (ver Tabla 1.5.1). Secuencias de ADN fueron construidos con fragmentosAlto nmero de copias de plsmidos tienden a ser nogobiernos de los plsmidos de origen natural, prider control relajado de replicacin. Estas reprimordialmente Escherichia coli plsmidos. Todos plsmido plsmidos relajados iniciar la replicacin del ADN en un vectores contienen tres caractersticas comunes: un Rep proceso controlado por plsmidos codifican funciones licator A marcador seleccionable , Y un la clonacin del sitio . ciones (vase el mecanismo de replicacin y copia El replicador es un segmento de ADN que contiene Nmero de Contro l), y la rplica no se deel sitio en el que comienza la replicacin del ADN (e penden sobre el inicio de host de replicacin inestable origen de replicacin o Ori ), Y que tambin enprotenas sintetizadas en el inicio de la bacteriana incluye generacin de codificacin es lo plsmido-enciclo celular Debido a que su replicacin depende ARN y protenas codificadas son necesarias para slo en el host de replicacin enzimtica estable replicacin El marcador seleccionable, necesario maquinaria, el nmero de copias de estos plsmidos para el seguimiento y mantenimiento de la presencia de puede ser mucho mayor, o amplificada, por tratar-

el plsmido en las clulas, generalmente es dominante y es cin de las clulas que contienen el plsmido con progeneralmente un gen que codifica la resistencia a algunos Tein inhibidores de la sntesis, tales como cloranfenicol-

consumido A

Nmero de copias es para el prototipo de plsmido. Los vectores plasmdicos que contienen replicadores derivados de estos plsmidos pueden tener diferentes copiar los nmeros debido a la introduccin de mutaciones en el replicador. Por ejemplo, pUC serie (pMB1 derivado) tiene copia n umbers de 1000-3000.
b

Ensit Tem pe ratura s IVE.

consumido

no es conocida.

Mecanismo de replicacin
Col o espectinomicina. Estas sntesis de protenas

Y COPIA DEL NMERO DE CONTROL

inhibidores de la sntesis de prevenir la replicacin protenas de iniciacin necesario para cromosmico Aunque hay muchos replicadores diferentes, replicacin, permitiendo que las enzimas de replicacin la mayora de plsmido RS vecto utiliza en la rutina a ser comandado para la replicacin del plsmido. trabajo ADN recombinante contener uno de los Alto nmero de copias de plsmidos por lo general no lo hacen replicadores funcionalmente similares derivados de cuenta con ningn mecanismo para asegurar la correcta segregacin plsmidos ColE1 o pMB1 (por ejemplo, el cin de los plsmidos de las clulas hijas, sino que serie pBluescript populares contienen un ori-ColE1 confiar en mezcla aleatoria de particin al menos ginebra, y los plsmidos pUC se derivan de una copia del plsmido para cada hija. pMB1). El replicador de ColE1 es un nucleo de 600Bajo nmero de copias de plsmidos son por lo general de la ONUtid e fragmento de ADN que contiene el origen de der un estricto control . La iniciacin de la replicacin replicacin Ori ), Codifica un cebador de ARN, y de estos plsmidos depende de las protenas inestables codifica dos reguladores negativos de la replicacin sintetizado en el inicio del ciclo celular bacteriana iniciacin. Todas las funciones enzimticas para rplicay por lo tanto est sincronizado con la replicacin del i n de la lasmid p son proporcionados por el bacteriana el cromosoma bacteriano. Como el nmero de copias husped disminuye, la segregacin aleatoria de plsmido la COPEl plsmido de replicacin comienza con transcripcin s no es suficiente para asegurar en cada hija cin de un cebador de ARN aguas arriba del Ori clula adquiere una copia del plsmido. Sin embargo, (RNAII; vase la Fig. 1.5.1.) Por el anfitrin RNA pola mayora de las bajas-el nmero de copias de plsmidos portadores de genes lymerase. RNAII es alargado a travs y terque garanticen su mantenimiento en la bacaguas abajo de la minated Ori . Interaccin de rial de la poblacin. La estabilizacin de los loci que codifican una una estructura especfica secundario en la naciente mecanismo para la matanza de postsegregational RNAII transcripcin con la plantilla de ADN de replsmido libre de clulas hijas y un sistema para resulta en la formacin de un hbrido persistente sereficiente para resolver los multmeros de plsmidos de modo que interpolacin RNAII y la plantilla de ADN tal que pueden ser adecuadamente reparti han sido RNAII queda emparejado con la plantilla de ADN identificadas. Adems, CIS y trans su actuacin, al Ori . La transcripcin RNAII se rompe por loci de particin ( par ) Que se cree que conRNaseH en el Ori secuencia Este procesado tituyen un mecanismo activo para la distribucin de Imprimacin RNAII se extiende por la DNA polimerasa copias del plsmido en las clulas hijas tambin han sido I de iniciar la replicacin del plsmido. Reglamento de la identificadas. la adecuada estructura de RNAII secundaria controla iniciacin de la replicacin del ADN y es responsable

para la determinacin del nmero de moles-plsmido Estructur El ARNi es complementaria exactamente com a culas por clula. el extremo 5 de la transcripcin RNAII. IRNA base de Ambos plsmidos ColE1 y pMB1 son de alta pares con el extremo 5 de RNAII, evitando que el nmero de copia plsmidos, mantenida entre formacin de la estructura secundaria especfica 15 y 25 copias por clula bacteriana, respectivamente. necesarios para el establecimiento de una persistente hiEl nmero de copias de estos plsmidos se regula Brid entre RNAII y la plantilla de ADN que por un ARN antisentido transcripcin, IRNA, y el es un requisito previo para la maduracin de la RNAII protena RP, el producto de la RP gen. R NA I principios ROP protena estabiliza la interaccin y el acto de protenas de ROP en el concierto para interceptar entre el IRNA antisentido y el cebador formacin de la adecuada secundaria RNAII RNAII. Las mutaciones que interrumpen o desestabilizar ningn hbrido persistente formado en ori sin la maduracin de imprimacin

iniciacin de ADN que lleva lnea de sntesis Figura 1.5.1 ColE1 la replicacin de iniciacin y el control de nmero de copias. ColE1 replicacin requiere el formacin de un cebador de ARN para iniciar ADN tesis SYN. El cebador de ARN se deriva de procesamiento Pro de una transcripcin, RNAII (en negrita), que se inicia aguas arriba de la Ori . Proc ess cin adecuada de la AII RN transcripcin depende de la formacin de un hbrido entre RNAII persistente y el Ori Un DN te mp La Te. Si las formas adecuadas RNAII estructura secundaria, a continuacin, el dplex de ARN / ADN se mantiene en el Ori y R Nase H puede escindir la transcripcin RNAII para generar el cebador para la sntesis de ADN.Procesamiento de RNAII para formar el cebador est regulada por una segunda transcripcin, IRNA. IRNA es complementaria a el extremo 5 de RNAII. Si la transcripcin IRNA forma un dplex con RNAII, RNAII no puede asumir el estructura secundaria necesaria para crear el hbrido persistente en el Ori una segunda m aturat de iones de la AII RN imprimacin se inhibe. La copia NUMBE r de plsmidos ColE1 est determinada por el equilibrio entre xito RNAII eventos de procesamiento y los inhibida por RNAi. Adaptado de Gerhart et al. 1994). con la misin por la Annual Review of Microbiology .

el ARNi / RNAII la interaccin como resultado una mayor marcador que se pueda o ccasionally utilizado es el nmero de copias del plsmido. Por ejemplo, el pUC inmunidad a la infeccin por fago lambda serie de plsmidos tienen pMB1 replicadores que hacer (Lambda represor). Adems, recesivo no contienen un intacta RP generacin e, lo que representa Los marcadores se utilizan a veces en el plsmido seleccin para un aumento de 2 veces en el nmero de copias en plastio ns, por ejemplo, leuB E. coli no puede crecer MID con intactas pMB1 replicones. Interesa que, en ausencia de leucina, y la seleccin para mutacin adicional (s) en el origen son la principal crecimiento de estas cepas en ausencia de leucina factor en el nmero u ARLT-copia de alta (1 000 a permite el aislamiento de lonies co transformada con un 3000) de esta serie plsmido (K. Struhl, sin publicar. plsmido que contiene un gen que complementa Observar leuB . Para los experimentos que implican la introduccin de

Incompatibilidad de plsmidos
vectores plasmdicos en otros sistemas de bacteriaPara los experimentos que requieren que ms de ra, tal como levadura o clulas de mamferos, es un vector de plsmido se mantenga en un bacteriana suele ser necesario seleccionar para la presencia de celular al mismo tiempo, otra caracterstica crtica de ADN plsmido en estos huspedes. Margen seleccionable replicadores de plsmidos es si dos plasres de la levadura y los sistemas de mamferos son genereplicadores son mediados compatible . Dos plsmidos erally distinto de los utilizados en E. coli (Ver se dice que son incompatible uno con el otro, Vectores plsmido de levadura y vectores plasmdicos y por lo tanto, pertenecen a la misma incompatibilidad para la expresin en clulas de mamfero cultivadas). Grupos , Si no de forma estable pueden coexistir. Los plsmidos En los casos donde se necesita un vector que sern son generalmente incompatibles si comparten cualquier utilizada en ambos E. coli y de acogida a otro, es funcin requerida para la regulacin del plsmido necesario para el vector de plsmido para llevar a seleccionarreplicacin Por ejemplo, ColE1 y pMB1marcadores capaces de ambas mquinas. plsmidos derivados son incompatibles con una

CLONACIN SITIO
otro pero son compatibles con p15A Plasfrecuencias medias. La incompatibilidad de ColE1 y pMB1 Toda y de pl como cont millas d vec tor s en un am ULT i pl e plsmidos es una consecuencia de dos hechos: primero, clonacin sitio (MCS) o polienlazador clonacin de reque la replicacin del ADN plsmido de estos plsmidos regin que puede incluir> 20 en tndem dispuestas Se negativamente controlada por IRNA que acta en sitios de endonucleasas de restriccin. Los sitios en el trans en otros plsmidos con el mismo cebador polienlazador son casi siempre diseados para ser ARN, y segundo, que estos plsmidos carecen de una nico dentro de la secuencia del vector para que corte mecanismo para garantizar que cada plsmido en una clula Ting el vector con una endonucleasa de restriccin replica una vez por ciclo celular. Por lo tanto, si un en el clonaje y cierre de ADN extrao en Ning celda que contiene un plsmido derivado de pMBI es este sitio no interferir con otras caractersticas crticas posteriormente transformada con un ColE1-detor del vector.La gran cantidad de sitios en la RIVED plsmido, las clulas seleccionadas para contener el polienlazador asegura que la enzima apropiada Plsmido ColE1 por lo general han perdido la pMBI sitios estar disponible para la clonacin de ADN ms plsmido. fragmentos, proporciona una referencia nica restriccin cin sitios para el mapeo de restriccin rpida del

Marcadores seleccionables
insertar, y generalmente permite una gran cantidad de

A fin de garantizar que un vector plasmdico flexibilidad en la manipulacin e clo ne ADN. es tomada por un d mantenido en clulas bacterianas, Las secuencias que flanquean el directamente debe haber una forma de seleccionar para el plsmido-CONsitio poliligador son a menudo tiles para la manipulacin Taining clulas. Los genes de codificacin Principal resistencia a unao el anlisis de ADN del inserto. Muchos polienlazador antibiticos tales como ampicilina, tetraciclina, sitios estn flanqueados por secuencias para los cuales existe kanamicina y cloranfenicol son los ms oli son complementarios disponibles comercialmente comunes indicadores bacterianos seleccionables para plasgonucleotides, por ejemplo a la inversa M13, vectores de medias. Tpicamente, las clulas se transforman 20, 40 y cebadores, que pueden ser utilizados para con el ADN del plsmido mediante la tcnica decebado reacciones en cadena de polimerasa (PCR) o se describe en y luego se sembraron en LB Secuenciacin de ADN reacciones. Tales cebadores son
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placas que contienen el antibitico apropiado (ver herramientas tiles para la amplificacin o secuenciacin de recetas en ). Slo las clulas bacterianas cualquier fragmento de ADN insertado en el Ker polylin.
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que contiene el plsmido se crecen en la seleccin Algunos polylinkers estn rodeados por 8-pb-cortador tiva medio; el fenotipo de resistencia a antibiticos sitios de restriccin, como No {0}1.{/0} {1} {/1} Estos sitios se producen Tipo conferido es dominante sobre el antibiticoinfrecuentemente en ADN y as permitir la fcil fenotipo sensible de clulas que no poseen la escisin de un fragmento intacto en SERT del el vector de plsmido. Otra dominante seleccionavector plasmdico.

Muchos vectores plasmdicos se han desarrollado a ser baja generacin o cuando de un gran nmero con bacterifago SP6, T7, o-T3-promo de clones es necesario. Sin embargo, para la rutina ERS que flanquean los sitios de clonacin polienlazador. Estos experimentos subclonacin el advenimiento de la PCR promotores puede ser utilizado in vitro o in vivo, si el ( ) Ha hecho posible para cribar rpidamente
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bacterifagos ARN polimerasa tambin est presente, a travs de un nmero de correo de los transformantes de larg para producir grandes cantidades de transcripciones de ARN identificar las posibles molculas recombinantes, oba partir de ADN insertado en el polienlazador. viating la necesidad de histoqumica y genticos Con el fin de hacer ms fcil para identificar Plasmtodos de deteccin. frecuencias medias que contienen ADN de insercin, los polylinkers El principal factor en la eleccin de un plsmido de algunos vectores han sido diseados de manera que vector es de comprender y anticiparse a la exintroduccin de ADN en los resultados poliengarzadores experimentos para que el clon recombinante en un fenotipo puntuable. El mo st comn ser utilizado. Las funciones especializadas de plsmido ejemplo de esto es la insercin del polienlazador de vectores son generalmente la clave para seleccionar el muchos vectores de clonacin bsicos, la serie pUC para vector correcto para un experimento. Por ejemplo, ejemplo, en el lacZ gen fragmento. En las tipos completamente diferentes de los vectores que est ld ser fondo gentico apropiado, la produccin de utilizado para la generacin de grandes cantidades de ADN, la ragment f lacZ permite fo r formacin de un expresar una protena de fusin en bacterias, o por -galactosidasa activa la enzima que da lugar a realizacin de una pantalla de dos hbridos en levadura. Una vez la formatio n de las colonias azules en Xgal / IPTG el tipo de vector requerida se determina entonces placas indicadoras. Clonacin en estos polylinkers decidir sobre un vector particular depende impide la produccin de un funcional lacZ tanto en los detalles del vector auxiliar FEAfragmento, lo que permite la rpida identificacin de ras, para los ex amplia el tipo de promotor utilizado para plsmidos que contienen insertos como colonias blancas expresar una protena recombinante, y la correctaen placas indicadoras Xgal / IPTG. Vectores tienen los lazos del replicador, polienlazador, y seleccionable Tambin se han desarrollado que permiten la seleccin directa Marcador i n de los plsmidos Con Taining inserta por ubicacin

Vectores plasmdicos PARA

del poliengarce en el ccdB (Control de la clula

produccin de las
muerte) gen que causa la muerte celular en E. coli.

ADN de cadena sencilla

La interrupcin de la ccdB gen por Intr oduccin de una insercin en el poliengarce permite que las clulas Los plsmidos se han desarrollado que contienen sobrevivir, y por lo tanto recombinantes slo crecer un origen de replicacin del fago filamentoso en bajo iciones cond donde el ccdB gen es el exAdems de un plsmido Ori . Estos "fagmido" A presi&#243;n vectores ( ) Pueden ser cultivadas y reproducidas
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como plsmidos. Sin embargo, al super-infeccin de

ELEGIR un plsmido vector

una clula que contiene el plsmido con un tipo salvaje Algunas de las caractersticas bsicas a considerar cuando se fago auxiliar, el fago Ori ser co m es un ct iv e, y seleccionar un vector plasmdico incluyen el tamao de ADN monocatenario (ADNmc) se produce y se el vector, su nmero de copias, el polienlazador, y secretada. Hay por lo general (+) y () versiones la capacidad de seleccionar y / o pantalla para las inserciones. de estos vectores, donde el fago Ori es en Plsmidos grandes, mayores de 15 kb, no se transforman as orientacin opuesta de modo que es posible y con frecuencia dan rendimientos ms bajos de ADN. DESVENTAJAS ssDNA producir a partir de cualquiera de cadena de ADN. Para Sider, el tamao final del vector, ms cuando se inserte Durante muchos aos, ssDNA era el sustrato de eleccin la planificacin de un experimento y siempre que sea posible para la secuenciacin del ADN ( ) Y oligonucletidos
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utilizar ms pequeos vectores. Cuanto mayor sea la copia numcleotide mutagnesis dirigida ( ). Devel
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bre el ADN del vector se produce ms, pero desarrollo de protocolos de secuenciacin y mutagnicos alto nmero de copias vectores puede no ser aplicaque el uso de doble cadena de plantillas ha hecho ble a todas las situaciones (ver Mecanismo de Replila produccin de ssDNA una menor frecuencia utilcin y control de nmero de copia). Cuando Ized caracterstica de vectores plasmdicos. El la eleccin de un vector plasmdico, considere bo lo pBluescriptI, pBluescriptII, y fagmido pBS sitios estn presentes en el poliengarce y el orden vectores derivados de lo general clonin g vector de los sitios. Si va a ser necesario manipular pUC19 (Fig. 1.5.2) son ejemplos de fagmidos la secuencia clonada posterior a la insercin que incorporan el fago filamentoso f1 Ori . en el poliengarce, ah plan de EAD para asegurarse de que

Vectores plasmdicos PARA

n los sitios ecessary seguirn estando disponibles en el

CLONACIN grandes insertos

polienlazador. Seleccin o pantallas para la identificacin i n de los clones recombinantes son tiles para la ex Vectores csmidos, plsmidos que llevan una lambda experimentos donde se espera que la eficiencia de la clonacin fago cos sitio (por ejemplo, pWE15, fig. 1.5.3), fueron

Mientras que las caractersticas de la expresin de la protena o la secuencia de fusin impide la funcin de la Los sistemas varan considerablemente, las propiedades bsicas protena en los ensayos pertinentes. esbozado para la expresin de protenas en E. coli son.

Vectores plasmdicos PARA

comn a todos ellos. Los vectores de expresin son

FUSIONES gen reportero

generalmente diseados de tal manera que la produccin del p rotein extranjera est fuertemente regula aislados. Esto es necesario Los vectores plasmdicos se han diseado para simsario, porque de acogida e celu lar maquinaria hacer ms fcil la construccin y ulation manip de la recooptado para producir grandes cantidades de la paraportero de genes fusiones, donde un promotor de la interextranjera protena, la cantidad de cizallamiento de que puede EST se utiliza para accionar un gen marcador fcilmente anot ser txico para la clula, y / o la protena extraa ( ). Fusiones de genes proporcionar una rpida y
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puede codificar una funcin que va a inhibir la clula mtodo simple fo r despus de la expresin crecimiento o matar la clula husped. Por lo general, exprepatrn conferida por un promotor en particular. sin vectores estn configurados de modo que el polienlazador En general, existen dos tipos de reportero de fusitio de clonacin est aguas abajo de un pro-inducible nes, fusiones de transcripcin y traduccin. promotor. Uno de los promotores comnmente utilizados en Por fusiones transcripcionales, el codn de iniciacin ATG E. coli vectores de expresin es el hbrido trp / lac es proporcionada por el gen marcador. En la traduccin promotor (CVR), que contiene el operador laco fusiones, el 5 untra NSLA te d la regin y ATG e ar Lugar Este promotor se apaga en presencia proporcionada por el gen de inters, de hecho estos del lacI represor; el gen represor es construcciones pueden fusionar una gran parte, o incluso
q

ya sea llevado por el husped bacteriano o codificado se toda la co repique regin, al extremo amino de en el vector de expresin en s. Expresin de un marcador. En el vector reportero, el polienlazador la protena extraa a partir del promotor trc es sitio de clonacin est localizado directamente aguas arriba del inducida por la adicin de IPTG. gen reportero para la insercin del promotor La cantidad de protena producida exterior fragmento || fragmentar En los vectores que estn diseados para ex ser determinado por tanto la tasa de transcripcin depresin en clulas eucariotas, una poliadenilacin cin del gen y la eficacia de la traduccin seal est situado aguas abajo del reportero del ARNm. Por consiguiente, adems de regular gen. Hay una variedad de genes indicadores usados lated altamente promotores inducibles, muchos E. coli incluyendo cloranfenicol acetiltransferasa,

vectores de expresin de protenas estn diseados para opluciferasa,-galactosidasa, alcalina secretada timize traduccin de la protena extraa en bacfosfatasa, la hormona del crecimiento humano,-Gluteriales clulas. Estos vectores de expresin incluyen un protena fluorescente curonidase, y verde (tambin eficiente del sitio de unin al ribosoma y el inicio ATG ver ). Un ejemplo de un reportero
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codn uptsream del sitio de clonacin polienlazador. vector pEGFP, se muestra en la Figura 1.5.5. El Por lo general, los sitios de clonacin en el polienlazador son eleccin del gen reportero depender de la clula diseado de modo que es posible hacer una entipo o nismo org, si el ensayo ser marco de la fusin a la protena en favor de los intereses en los tres realizado in vivo o in vitro, y si-cuantitativa marcos de lectura. datos administrativos o cualitativa que se desea. El replicador, Para muchos experimentos, los altos niveles de pureza marcador seleccionable, y otros elementos del la protena recombinante se requieren, y algunos vector reportero tambin tendr que ser compatible vectores de expresin estn diseadas para crear con el sistema. etiquetado o protenas de fusin que facilitan purifi-

Vectores plasmdicos para la levadura

catin de la protena recombinante. Etiqueta SEcuencias puede estar situado 5 o 3 para el poliYe como t pl como midv ec t o s co nt a en el ba sa m enlazador, ya sea la creacin de amino-o carboxi-terminal caractersticas SIC E. coli vectores-replicante, senal-etiquetados protenas de fusin. Seis polihistidina marcador seleccionable, y la clonacin sitio ( ).
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los residuos ( ), El eptopo FLAG, y Hay dos tipos principales de replicadores usados
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glutatin(s) -Transferasa protena ( son. en vectores de levadura plsmido, de manera autnoma RepliONU TI 16. 7

algunas de las secuencias que se aade a cando las secuencias (ARS) derivados de la levadura protenas para ayudar en la purificacin. Tagged o los cromosomas y la levadura natural 2 () m plasprotenas de fusin puede ser rpida y eficazmente replicador de media. ARS que contienen plsmidos frepurificado utilizando una columna de afinidad adecuada cuentemente contienen secuencias de levadura centromricas a diseado para unirse firmemente la etiqueta o la regin de fusin. garantizar su mantenimiento estable en la poblacin Muchos vectores de expresin de protenas se crean i n de las clulas. Tanto el ARS y 2 () m vectores promediocon sitios especficos de la protena de escisin adyacentes a edad 10 a 30 copias por clula. Muchos vectores de levadura las secuencias de etiquetas o fusin para permitir la eliminacin "lanzadera" son vectores que pueden ser mantenidos en de estas secuencias de la protena purificada. Escuelas S. cerevisa e y E. coli (Por ejemplo, pRS303; s e Esta caracterstica puede llegar a ser esencial si la etiqueta Fig. 1.5.6). Estos vectores tienen una E. coli Plas-

A mediados de rplica, con frecuencia pMB1 derivados, y nes en una va biosinttica. Por ejemplo, un replicador de levadura. Por el contrario, la levadura inteEl URA3 marcador transportado en un plsmido se utiliza rejilla plsmido vectores, que se utilizan para la introduccin para restaurar la capacidad de crecer en ausencia de de genes en el cromosoma de la levadura, tienen una uracilo a una ura3 levadura. Por lo tanto, la levadura seleccionarreplicador de bacterias, pero no replicador de levadura. marcadores capaces, a diferencia de la mayora de seleccionar las bacterias Los marcadores seleccionables en levadura son para el marcadores, se dependiente de la cepa. la mayora de los marcadores recesivos parte, generalmente clonado Hay una amplia variedad de vectores de levadura los genes de levadura que se utilizan para complementar mutacin disponibles que tienen una amplia gama de funciones especializadas

Figura 1.5.6 Mapa de pRS303 (adaptado de Sikorski y Heiter de 1989, con por misin). ciones-por ejemplo, la expresin de protenas recombinantes prose lleva a cabo. No es necesario para el plsmido protenas en la levadura, la integracin de las secuencias en el vectores utilizados en estos ensayos para llevar a un mamfero de genoma de la levadura, y la clonacin de fragmentos muy grandeIan marcador seleccionable o para replicar en mammentos (cientos de kilobases) de la genmica las clulas de Mal, por lo tanto fcilmente manipulable adn plsmidos bacterianos, como pUC, son generalmente el vectores de la eleccin.

Vectores plasmdicos PARA

Los vectores plasmdicos que llevan un seleccionable

EXPRESIN EN CULTIVADAS
marcador que funciona en clulas de mamfero son

Clulas de mamfero
necesaria para la generacin de estable transEl tipo de vector que se utiliza en mamferos lneas gnicas ( ; Por ejemplo, pcDNA3.1, fig.
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clulas depende de si el experimento en1.5.7). Con el fin de generar un mamfero estable involucra transfeccin transitoria en mamferos lnea celular, el ADN del plsmido se tran en sfected clulas o la generacin de clulas de mamferos estable las clulas de mamferos, y durante un perodo de Lin es llevar a la construccin de inters ( varias semanas el ADN de inters se selecciona
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). Prcticamente cualquier vector plsmido que conpara basado en la expresin de la transmisin vectorial
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distribucin contiene un constructo adecuado para la expresin en Marcador Muchos vectores de mamferos no pueden repreclulas de mamferos se pueden utilizar en transitoria comolicate en clulas de mamfero, y la nica manera de dice. En los ensayos de transitorios, el vector de plsmido mantener el ADN de inters y el seleccionable llevando el ADN de inters se transfecta en marcador es para el vector de integrar al azar clulas de mamferos, las clulas se recogen algunos en el genoma de los mamferos. Sin embargo, no sera tiempo ms tarde (24 a 96 h), y el ensayo pertinente son algunos vectores plasmdicos que llevan el simio

Figura 1.5.8 Mapa de pRR54 (un dapted de Rober ts et al., 1990, con por misin). y puede ser fcilmente introducido en las clulas husped. El El mtodo preferido para la introduccin de plsLo primero a considerar al seleccionar un plsmido ADN mediados en clulas husped bacterianas vara ampliamente vector para el uso en un noE. coli de acogida es la de si con la cepa acterial b. A diferencia de E. coli muchos o no se puede replicar y mantenerse de forma estable las bacterias no pueden ser eficientemente transformado por en la cepa particular. Representante plsmido diferente procedimientos qumicos o electroporacin. EN EL licators tienen diferentes rangos de acogida, algunos tienen estos casos apareamiento bacteriano se utiliza para introducir una gama de huspedes estrecho y slo puede replicarse en una ADN plsmido en el husped deseado bacteriana. cepa especfica, mientras que otros son profesionales miscuous El apareamiento para transferir un vector plasmdico a partir de un E. y puede replicarse en una amplia variedad de husped (por ejemplo, E. alojar donde el vector se mantiene y se pRR54, fig. 1.5.8). Desafortunadamente, la ColE1 manipulado a una bacteria receptora requiere replicadores tipo tienen un rango de hospedadores, por lo tanto Escuelas CIS un d trans -Actuando funciones. El tra (O estndar de muchas E. coli vectores no puede ser principalturba ) Genes codifican el trans Protenas de accin contenidas en otras bacterias. Sin embargo, un nmero de necesaria para transferir el ADN plasmdico a partir amplio rango de hospedantes, como replicadores y RK2 una bacteria a otra, y son generalmente RSF1010, han sido bien caracterizadas y localizado en un plsmido auxiliar que es distinta de utilizado para construir vectores que pueden replicarse en el vector de plsmido. Cualquier vector plasmdico que es muchas bacterias gram-negativas (especies bacterianas y en que se moviliza debe contener el CIS De accin sitio el caso de RSF1010, algunos SPE-gram-positivos Llamaron? " oriT donde el ADN se escinde y CIES tambin). transferencia est en itiated. Los genes de resistencia a antibiticos se utilizan como SE-

MAPAS de los plsmidos

marcadores en lectable no E. coli huspedes bacterianos; Sin embargo, la cantidad de un antibitico usado para Figuras 1.5.2-1.5.11 mapas actuales de Plasseleccionar contra no plsmido que contienen clulas es frecuencias medias que estn en uso generalizado o son ejemplos suele ser mayor que la cantidad utilizada para E. coli de los plsmidos cuyas funciones especiales que sean seleccin. Adems, algunas cepas bacterianas til para tcnicas particulares descritas en el son inherentemente resistentes a los antibiticos particulares, este manual. Tenga en cuenta que la tendencia en el desarrollo por lo tanto es importante para determinar si el de vectores es para incluir funciones mltiples en una marcador seleccionable transportado en un vector plasmdico nico vector, y muchos de estos ejemplos abarcan es funcional en una cepa particular. las categoras vector descrito.

Figura 1.5.9 Mapa de pBR322 (Bolivar et al 1977;. Secuencia en Sutcliffe, 1978). pBR322 es uno de los vectores de clonacin clsicos

insertado en la regin alfa del lacZ ge ne una segunda partir de la cual muchos otros vectores se derivan. Esto T3 y T7 secuencias promotoras que flanquean el contiene un replicador amplificable y pMB1 sitios de clonacin. La F1 (+) fagos filamentosos los genes que codifica la resistencia a la ampicilina y origen de replicacin en pBluescript SK permite
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Tetraciclina La insercin de ADN en una restriccin para la recuperacin de la hebra sentido del lacZ sitio en cualquiera de los genes de resistencia a medicamentos por lo general INACgen como ADN de cadena simple, el pBluescript SK () vector tivates y permite que las colonias teniendo plsmidos (Fig. 1.5.10) con el origen f1 en la direccin opuesta con tales inserciones a ser identificados por su orientacin, f1 (), facilita la recuperacin del incapacidad para crecer en medio con ese antibitico otra cadena. La posicin del poliengarce en (Vase la figura 1.5.9;. Bolvar et al, 1977;. Secuencia la regin alfa del lacZ gen permite en Sutcliffe, 1978). identificacin de insertos basado en un azul / blanco pUC19 pertenece a una familia de plsmido vectorcolor de la pantalla bajo la s condiciones adecuadas. res que contiene un poliengarce insertado dentro Los promotores de T3 y T7 son reconocidos por la regin alfa del lacZ gen. La pol il i nkbacterifagos ARN polimerasas. Transcripcin ERS son los mismos que los utilizados en el M13mp cin de estos promotores se lee en el serie (fig. 1.14.2). pUC19 y pUC18 tienen polienlazador desde ambos lados. Transcripciones de ARN el poliengarce mismo pero en orientacin opuesta cualquier DNA clonado en el polienlazador as puede cione Bajo condiciones approp riate (ver ser producidas por escorrenta transcripcin in vitro.
ONU TI un 0,4

para obtener una descripcin), las colonias que llevan plsmidos pWE15 es un ejemplo de un vector csmido que contiene un fragmento insertado en el utilizado para la clonacin de fragmentos de ADN de 35 a 45 kb colonias poliengarzadores forma blanca en lugar de azul (Vase la figura 1.5.3;. Wahl et al, 1987.). El cos sitios seres. Estos plsmidos pMB1 derivados (vase la fig. permitir que el ADN para ser cortado y envasado en 1.5.2) mantener un muy alto nmero de copias cabezas de fagos por el apropiado lambda pro(1000 a 3000 por genoma). De tipo salvaje y protenas. Hay una sola nica Bam HI clonacin plsmidos recombinantes confieren resistencia a la ampicilinasitio flanqueado por secuencias del promotor de T3 y T7. importancia y puede ser amplificado con cloranfenicolEstos promotores son particularmente tiles para procol (Norrander et al., 1983). Adems salvaje produccin de sondas de ARN correspondiente plsmidos de tipo confieren un LacZ fenotipo de a los extremos del ADN inserto, y stas pueden ser
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clulas apropiadas (por ejemplo, clulas JM101, ). utiliza para identificar csmidos solapantes para croONU TI 1. 4

pBluescript es un fagmido comnmente utilizado caminar mosome y la construccin de csmido vector de clonacin que contiene un poliengarce encontigs. No 1 sitios que flanquean el sitio de clonacin puede

Figura 1.5.11 Mapa de pTrc99A, B, C. potencialmente ser utilizada para extirpar una insercin intacta genes esenciales que componen el factor F reprefragmento del vector. El derivado de ColE1 licator. oris y repe los genes son necesarios para Ori y el amplificador gen de resistencia a icillin permiten replicacin unidireccional del plsmido, y replicacin y seleccin en bacterias. El SV40 parABC mente loci apualar a mantener el nmero de copias promotor (incluido en el SV40 Ori ) Que acciona en uno a dos por E. coli ge nome. Ther e ar e dos el gen de la neomicina fosfotransferasa permite sitios nicos de clonacin ( Hin dIII y Bam HI) enseleccin en clulas eucariotas. insertado en el lacZ alfa regin. {0}Otros usos:{/0} pBeloBAC11 es un ejemplo de la familia de caractersticas de la regin de clonacin son (1) y T7 bacteriana-artificial-el cromosoma vectores basados SP6 secuencias promotoras que flanquean la clonacin

en el replicador de F bajo nmero de copias factor de sitios, (2) No Me sitios de restriccin que flanquean el clon (Ver fig. 1.5.4; Shizuya et. al., 1992). BAC Ing sitios de escisin potencial de la insercin y vectores se usan para la clonacin de ADN a gran fragmento (3) y la presencia del loxP una segunda CoSN los sitios que tos (100 a 500 kb) en E. coli y se utilizan puede ser escindida por enzimas especficas. Los extremos comnmente en las estrategias de mapeo del genoma. generado por escisin a loxP o CoSN puede ser oris , repe , para || Tras el trmino se indica el nmero de partos, es decir, para 0, para I, para II, etc. , parB ,Y parC gen s son e utilizarse como puntos de referencia fijos en la construccin de un

la restriccin ordenada por el mapa de fin de etiquetado y otros vectores plasmdicos, incluyendo un ColE1 repdigestin de restriccin parcial. licator para la propagacin en E. coli , La ampicilina pEGFP-1 es un vector seleccionable para el monitoreo de gen de resistencia para la seleccin en E. coli , La F1 Ing. actividad promotora en clulas de mamferos a travs Ori para la produccin de DNA de cadena simple, y la pro-T7 fluorescencia de la protena verde fluorescente promotor de secuencia para la transcripcin in vitro de (GFP) derivado (Clontech, ver fig. 1.5.5; ADN insertado en el polienlazador. Ya ng et un l. , 1 9 9 6). L a V del Tratado CE o en contra ta ins un neo pRR54 es un ejemplo de una amplia gama de hospedadoresmicina aguas abajo de genes de resistencia del SV40 vector plsmido movilizable. Este vector conpromotor temprano para la seleccin de forma estable transdistribucin contiene replicador y stablilization secuencias deformado clulas de mamfero. Tiene un polienlazador estn derivadas del RK2 naturales de amplio rango de hospedantes situado aguas arriba del gen EGFP, de modo que el plsmido (vase la Fig. 1.5.8;. Roberts et al, 1990.). funcin de secuencias promotoras introducidos en oriV es el origen he getative cin de la rplica, trfA la olylinker p puede ser evaluada sobre la base de EGFP codifica trans -Actuando funciones necesarias para actividad. El gen EGFP es una modificacin del medio silvestre replicacin y par codifica un lugar que estipo de buenas prcticas agrarias para garantizar la expresin en mamferos hances estabilidad del plsmido. Este plsmido las clulas, tiene mutaciones silenciosas base que correspuede ser acoplado en diversas bacterias gram-negativas SPEponder a humanos de uso de codn de preferencias, y CIES, siempre y cuando la movilizacin adecuada secuencias que flanquean la regin de codificacin han sido maquinaria se proporciona en tra ns porque conconvierte en una traduccin consenso Kozak mantiene la origen de la transferencia conyugal, oriT . El iniciacin de la seal. El vector columna vertebral contiene plsmido lleva el gen de lactamasa, permitiendo un F1 Ori para la produccin de ssDNA, un pUC-dea ampicilina / carbenecillin seleccin de plasRIVED Ori para la propagacin en E. coli y un mediados contiene bacterias. gen de resistencia a la kanamicina para la seleccin de bacLa serie pTrc del plsmido de expresin vectorrios. res facilita la expresin regulada de los genes en Una serie de vectores lanzadera levadura (pRS304, E. coli . Estos vectores de llevar el hbrido fuerte 305, y 306) se ha creado para facilitar trp / lac promotor, el lacZ de unin a ribosoma manipulatio n de ADN en Saccharomyces ceresitio (RBS), el MCS de pUC18 que permite visiae (Vase la Fig. 1.5.6,. Sikorski y Hieter, insercin en tres marcos de lectura, y el rrnB 1989). Estos vectores tienen una columna vertebral derivado terminadores de la transcripcin (vase polienlazador SEdesde pBLUESCRIPT en que las caractersticas cuencias a continuacin el diagrama vectorial de la figura.

necesario fo r replicacin y mantenimiento en 1.5.11). Estos vectores son igualmente tiles para levadura se han introducido. Los miembros de la expresin de protenas sed unfu (resultante de esta serie de plsmidos difieren slo en la levadura insercin en el Suboficial I sitio) o para la expresin de marcador seleccionable incorporado; pRS303 coche protenas de fusin (usando uno de los sitios de clonacin rios de la HIS3 marcador que complementa un noen el marco de traduccin correcto). La presencia volver his3 mutacin cromosmica, en espede los lacI alelo en el plsmido asegura comq

cepas especficas de levaduras. Estos plsmidos contienen un la represin completa del hbrido trp / lac promotor secuencia de replicacin autnoma, as como durante la clonacin y el crecimiento en cualquier cepa husped una secuencia de centrmero, CEN6 , Que asegura (Ver Amann et al., 1988, para ms detalles). mantenimiento estable en clulas de levadura.

LITERATURA CITADA
pcDNA3.1 es una clonacin seleccionable y exAmann, E., Oc hs, B., y Abel, KJ 1988.Estrechamente depresin vector para el uso en clulas de mamfero. El Regulada tac promotoras tiles para los vectores caractersticas de este vector incluyen un neomicina de rela expresin de protenas no fusionadas y fundida en ES resistencia gentica impulsada por la temprana SV40 proEscherichia coli . Gene 69:301-315. promotor (contenido dentro del SV40 Ori )Y Bolvar, F., Rodrguez, RL, Greene, PJ, Betlach, terminado por una seal de poliadenilacin de SV40 MC, Heynecker, NS, y Boyer, HW 1977. para la seleccin en clulas de mamfero (vase la fig. Construccin de vectores de clonacin tiles. Gene 1.5.7). Adems, debido a la inclusin del 2:95-113. SV40 Ori , El vector puede replicarse como un episoma Chang, ACY y Cohen, SN 1978. .construcci en las clulas que expresan el antgeno T de SV40 grande. y caracterizacin de amplificable mulitcopy Vehculos de clonacin de ADN derivados de la P15A El sitio de clonacin poliengarce se encuentra abajo miniplasmid crptica. {0}J.{/0}{1} {/1} Bacteriol. 134:1141 corriente de citomegalovirus fuerte potenciador de 1156. secuencias del promotor y aguas arriba de las especies bovina Gerhart, E., Wagner, H., y Simmons, OR 1994. la hormona del crecimiento seales de terminacin de genes para El ARN antisentido de control en las bacterias, fagos, y alto nivel de expresin de la protena-codificacin SEplsmidos. Annu. Rev. Microbiol. 48:713-742. cuencias clonado en este vector. Este vector tambin contiene algunas de las caractersticas ms estndar de