MUESTRAS 6. 1.

Seleccin de la muestra Las consideraciones ms importantes que deben tenerse en cuenta son que la muestra debe ser representativa del proceso patolgico y que la cantidad recogida sea suficiente para asegurar un examen completo y adecuado. Por ejemplo, tina pequea cantidad de suero drenado de la lcera del pie de un diabtico con una osteomielitis subyacente no es probable que permita encontrar microorganismos del tipo presentes en el hueso infectado; en realidad, lo ms probable es que no permita detectar ningn microorganismo. En el ejemplo citado, la muestra ideal sera una biopsia de hueso (para ser estudiada histolgica y bacteriolgicamente). Aunque con frecuencia no es posible obtener tejido infectado, ste es sin duda la muestra ideal. En orden de conveniencia el siguiente es un exudado francamente purulento, que resulta por completo satisfactorio. En el caso de una lesin progresiva de la piel y tejido subcutneo (como gangrena bacteriana sinrgica progresiva), el material del margen activo de la lesin probablemente reflejar con mayor exactitud que el de la zona central la verdadera bacteriologa del proceso. El material obtenido con un hisopo del tracto abierto de un seno con frecuencia no proporciona el verdadero organismo infectante; una biopsia profunda ser mucho ms contable. El esputo expectorado, sobre todo si no es purulento y con mnima contaminacin salivar, presenta problemas graves en especial porque la neumona es con frecuencia una infeccin severa. Para soslayar el problema se puede recurrir a la obtencin de sangre para hemocultivo, al examen de lquido pleural cuando est presente, a la seleccin de las muestras de esputo bajo un aumento x 100 para determinar su calidad (cap. 4 y 7) y a la aspiracin transtraqueal. El material obtenido de localizaciones normalmente estriles del organismo proporciona un espcimen excelente si se tiene cuidado en evitar la contaminacin con la flora de la piel. Como las bacterias anaerobias pueden estar implicadas en todo tipo de infeccin en cualquier parte del organismo, siempre se debe cultivar en anaerobiosis todas las muestras libres de contaminacin con la flora normal. Ciertos tipos de muestras estn siempre contaminadas con la flora normal y por lo tanto no deben ser cultivadas en anaerobiosis en forma habitual: hisopos de garganta, nasofarngeos o gingivales, esputo expectorado u obtenido por succin nasotraqueal u orotraqueal, especmenes obtenidos mediante un broncoscopio, contenido gstrico, contenido del intestino delgado (el cultivo de estos dos ltimos tipos de muestras puede proporcionar informacin valiosa en el caso del sndrome del "asa ciega" o similares), contenido del intestino grueso o heces (excepto para Clostridium difficile, C. botulinum), ileostoma y efluentes de colostoma, orina emitida u obtenida por cateterizacin e hisopos vaginales o cervicales (excepto, como se ha discutido en la seccin de toma de muestras, en pacientes con endometritis). 6.2. Procedimientos para la toma de muestras Generalmente el informe del laboratorio bacteriolgico slo puede indicar los hallazgos obtenidos por examen microscpico y cultivo. De esta manera se confirma o no un diagnstico etiolgico. Sin embargo, el fracaso en el aislamiento del agente causal no se debe necesariamente a mtodos tcnicos inadecuados; a menudo, se debe a una mala toma de muestra o a deficiencias en el transporte. Con frecuencia, en los hospitales con muchos pacientes la recoleccin de las muestras se relega a personas que no comprenden los requisitos ni las consecuencias de tales procedimientos. En ocasiones tambin el microbilogo merece crtica por no proporcionar los materiales necesarios ni las instrucciones adecuadas, lo que conducir a una mala toma de muestras. A continuacin se presentan consideraciones generales acerca de la recoleccin de muestras para cultivo. En los captulos siguientes se tratarn las instrucciones especficas para el manejo de diversas muestras. Siempre que sea posible las muestras deben ser obtenidas antes de iniciar la administracin de agentes antimicrobianos. Con frecuencia un lquido cefalorraqudeo (LCR) purulento no revela patgenos bacterianos 1

en un preparado en fresco o en el cultivo cuando se ha administrado un antibitico dentro de las 24 h previas. Un paciente con salmonelosis puede presentar un cultivo de heces negativo si la muestra ha sido tomada mientras reciba una terapia antibacteriana supresora, obtenindose un cultivo positivo slo varios das despus que ha finalizado la terapia. Si la muestra para el cultivo ha sido recogida despus de la iniciacin de la terapia antibacteriana, el laboratorio debe ser informado para que pueda tomar las medidas correspondientes, como agregar penicilinasa al medio o simplemente diluir la muestra. Es axiomtico que el material debe ser tomado de los lugares donde sea ms probable encontrar al microorganismo con la menor contaminacin externa posible. La piel y todas las superficies mucosas estn habitadas por una flora normal y con frecuencia tambin pueden adquirir una flora transitoria o incluso ser colonizadas por patgenos potenciales provenientes del ambiente hospitalario. Esto ltimo es particularmente cierto en enfermos graves en especial si reciben una terapia antimierobiana (a medida que la flora normal es eliminada se establecen los organismos resistentes). En consecuencia deben emplearse procedimientos especiales que permitan distinguir entre microorganismos implicados en un proceso infeccioso y aquellos provenientes de la flora normal o que son colonizadores "anormales" pero que no estn causando ninguna infeccin. Para resolver este problema se emplean cuatro metodologas principales: 1. Limpiar el rea con un germicida con la friccin suficiente como para realizar tambin una limpieza mecnica. Comenzar en el centro y extenderse en crculos crecientes. Repetir varias veces empleando un nuevo hisopo cada vez. El alcohol (70%) es satisfactorio para la piel pero se necesitan 2 min de contacto. El yodo (2%) y povidonayodo actan ms rpidamente (1 min) y son efectivos contra los microorganismos formadores de esporas. La obtencin de lquidos normalmente estriles (como lquido sinovial, pleural o LCR) por aspiracin con aguja percutnea debe ser precedida siempre por la cuidadosa descontaminacin de la piel como se ha descripto aqu. 2.Evitar totalmente las reas con flora normal (p. ej., aspiracin transtraqueal percutnea en lugar de esputo expectorado). 3. Cultivar slo para un patgeno especfico (p. ej., estreptococo grupo A en la garganta). 4. Los cultivos cuantitativos constituyen un medio para determinar la posibilidad de que los organismos aislados estn implicados en una infeccin (p. ej., urocultivos cuantitativos). Una cuantificacin menos rigurosa tambin puede ser til y debe ser empleada en la rutina diaria; esto puede realizarse sobre la base de una escala entre 4 + a 1 + o simplemente expresada como crecimiento abundante, moderado, escaso, cuatro colonias, etc. (cap. 8). Otro factor que contribuye al xito del aislamiento del agente causal es el estadio de la enfermedad en el que se recoge la muestra. Los patgenos intestinales estn presentes en un nmero mucho mayor durante el perodo agudo o diarreico de la infeccin intestinal y es ms probable aislarlos en ese momento. Los virus causantes de meningoencefalitis se aislan con mayor frecuencia del LCR cuando el lquido se extrae poco despus de la aparicin de los sntomas de la enfermedad que cuando los sntomas agudos han remitido. En algunas ocasiones, los pacientes deben participar activamente en la toma de la muestra, como en el caso de un esputo. Para ello se le proporcionar instrucciones completas (cap. 16) y se tratar de estimular su cooperacin. Con demasiada frecuencia se coloca un recipiente al lado de la cama del paciente y como nica instruccin se le dice "escupa en este envase". La muestra de orina por obtencin del chorro medio es otro ejemplo para el cual el procedimiento adecuado de recoleccin es esencial para obtener un cultivo confiable. Estos especmenes, con frecuencia recolectados por el paciente sin la asistencia de personal entrenado, constituyen una alta proporcin de las muestras 2

recibidas por el laboratorio de microbiologa clnica. Puede requerirse a los microbilogos cooperacin para preparar indicaciones para la obtencin correcta de las muestras. El uso de una tarjeta impresa (bilinge si es necesario) con la descripcin clara del proceso (vase p. 94 para un ejemplo de una tarjeta) puede ayudar al mejor cumplimiento por parte del paciente. Deben proporcionarse tarjetas distintas para hombres y mujeres. La cuidadosa instruccin del paciente mejorar la calidad de las muestras de orina recibidas por el laboratorio. Deben tomarse las muestras con tamao suficiente para permitir un anlisis completo y deben colocarse en recipientes estriles para evitar riesgos para el paciente, enfermeras o quienes deben transportarlo. Un peligro grave para el laboratorista, u otro personal, es la contaminacin de la superficie externa del envase de un esputo o prdidas en una muestra de heces o posibilidad de contacto con exudados que contienen sangre. Con frecuencia se pasa por alto el riesgo de diseminacin de enfermedades por empleados no profesionales mal entrenados. Su control requiere una educacin continua y vigilancia constante por parte de aquellos en posiciones de responsabilidad y supervisin. Para que los resultados del anlisis sean vlidos deben tomarse los recaudos para que las muestras sean remitidas rpidamente al laboratorio. Por ejemplo, es difcil aislar Shigella de una muestra de heces que ha permanecido demasiado tiempo en la sala del hospital permitiendo un sobredesarrollo de los microorganismos comensales y una creciente desaparicin de Shigellas. En algunos casos puede ser conveniente llevar los medios de cultivo y el equipo necesario hasta la cama del enfermo para asegurar la rpida inoculacin de la muestra. Esto constituye una circunstancia excepcional y requiere la coordinacin previa con el laboratorio. Aunque la mayora de los microorganismos patgenos no estn mayormente afectados por pequeos cambios de temperatura, en general son susceptibles a la desecacin, sobre todo cuando se encuentran en hisopos. Sin embargo, algunas bacterias, como el meningococo en LCR, son muy sensibles a las bajas temperaturas y requieren un cultivo inmediato. Las muestras para gonococo pueden ser inoculadas directamente en medios selectivos como el de ThayerMartin modificado con dixido de carbono provisto en un dispositivo (Trarsgrow) o colocando una tableta generadora en una cmara (fig. 61) (Jembec; caps. 8 y 19). Otros mtodos alternativos incluyen la colocacin inmediata de las placas de ThayerMartin sembradas dentro de un frasco con una vela (fig. 62). El material clnico que probablemente contiene una flora microbiana abundante, en la mayora de los casos, puede mantenerse en el refrigerador durante varias horas antes de su cultivo si no puede ser procesado inmediatamente. Esto es vlido sobre todo para especmenes como orina, heces y materiales tomados con hisopos a partir de diversas fuentes, con excepcin de materiales para cultivo provenientes de heridas que pueden contener anaerobios sensibles al oxgeno. stos deben ser inoculados rpidamente. La refrigeracin no slo conservar la viabilidad de la mayora de los patgenos sino que reducir al mnimo el sobrecrecimiento de los microorganismos comensales, que si estn presentes en nmero excesivo complicarn el aislamiento de un germen ms importante. De todos modos, cuanto ms rpido se transfiera un germen que acaba de abandonar el ambiente protector de su husped a un medio de cultivo apropiado, mayores sern las probabilidades de su supervivencia y posterior multiplicacin. Si bien la toma de muestra no es una funcin, un prerrequisito esencial es que el laboratorio reciba la suficiente informacin clnica para guiar al microbilogo en la seleccin de los medios y tcnicas adecuados. En forma anloga es importante que el clnico comprenda las limitaciones y potenciales del laboratorio de bacteriologa y tenga presente que un informe negativo no invalida necesariamente un diagnstico. Es esencial que la estrecha colaboracin entre el clnico, la enfermera y el microbilogo sea la regla y no la excepcin. El personal de laboratorio debe rechazar las muestras que no fueron obtenidas en la forma adecuada y deben ser apoyados en esta posicin por los clnicos especialistas en infecciosas y por los pat6logos. Por supuesto, al rechazar las muestras deben explicarse claramente las razones al mdico que solcita el anlisis. Por otra parte, estos especmenes no deben descartarse antes de discutir el problema con el clnico, dado que algunas 3

muestras como las obtenidas durante una ciruga son difciles o imposibles de obtener nuevamente. Estos especmenes que no pueden ser reemplazados se teirn con una coloracin de Gram y se interpretarn con el mayor cuidado posible. En el captulo 3 se discuten criterios para el rechazo de muestras. 6.2.a. Procedimientos para muestras en anaerobiosis. Debe insistirse en la adecuada recoleccin de la muestra (es decir, tener especial cuidado para evitar la inclusin de la flora normal) dado que con frecuencia los anaerobios de, la flora normal son muy numerosos y la mnima contaminacin de la muestra puede llevar a resultados errneos y a la prdida de muchos esfuerzos. El esputo expectorado es inadecuado porque se contamina con los anaerobios de la flora normal en su pasaje a travs de la boca y faringe. Por la misma razn tampoco deben ser cultivados en anaerobiosis los especmenes obtenidos por broncoscopa o por succin con tubo nasotraqueal. El tubo siempre se contamina con la flora normal en su camino descendente. Algunos cuestionan la efectividad de un catter taponado, con doble lumen, para prevenir esta contaminacin, pero es posible obtener resultados confiables si se pone atencin a los detalles de la tcnica y se realizan cultivos cuantitativos. Pueden obtenerse muestras pleuropulrnonares para cultivos en anaerobiosis mediante aspiracin transtraqueal (ATT), toracocentesis o puncn percutnea con aguja y aspiracin del pulmn. Las muestras obtenidas de tubos de traqueostoma pueden ser adecuadas cuando el tubo recin ha sido colocado; al cabo de un tiempo la contaminacin con secreciones orofarngeas es inevitable, existan o no manguitos inflables. Las muestras de orina emitida no son adecuadas para el cultivo en anaerobiosis porque la porcin distal de la uretra y del meato est colonizada con una flota normal que contiene anaerobios que contaminarn la orina en su pasaje estas zonas. Si el paciente tiene colocado un catter vesical suprapbico o un tubo de cistostosma o nefrostoma pueden obtenerse a partir de ellos muestras adecuadas de orina. La endometritis presenta un problema muy difcil ya que los anaerobios son claramente muy importantes en esta inaccin Sin embargo, la mayora de las endometritis son posteriores a un parto y se ha demostrado que en el perodo posparto, Exista o no una infecci6n endometrial, se encuentran en la cavidad uterina grandes nmeros de anaerobios y otros microorganismos provenientes de la flora vaginal y cervical. Tampoco se observan diferencias cuantitativas entre pacientes infectadas y no infectadas. Esta situacin tambin se aplica a una endometritis posaborto. En consecuencia se debe realizar un hemocultivo y traes de cultivar cualquier otro material disponible que se considere adecuado. Puede ser til el cultivo para grmenes del grupo de Bacteroides fragilis, ya que la presencia de estas bacterias en la muestra indica un mal pronstico y por otra parte son ms resistentes a los antimicrobianos que otros anaerobios. Las infecciones de lceras por decbito comnmente implican a organismos anaerobios, en especial cuando se encuentra en las proximidades del ano (decbito sacral y decbito de la cadera y glteos). Dado que estas reas pueden tener contaminacin fecal (es as como se infectan) deben limpiarse con cuidado con un agente antisptico antes de tomar la muestra. Cuando sea posible, se debe aspirar el pus presente debajo de un colgajo de piel o en cavidades profundas, mediante una jeringa y aguja. Las mismas consideraciones se aplican a otras lesiones presentes en esta rea (abscesos perirrectales). Las muestras de materiales normalmente estriles (corno LCR y lquido sinovial o sangre) pueden recolectarse en la forma usual luego de una prolija descontaminacin de la piel. En general, el material para cultivos en anaerobiosis se obtiene mejor con la ayuda de una jeringa y aguja. Debe expulsarse todo el aire de la jeringa y de la aguja (lmina 6 l). El empleo de hisopos es una mala alternativa a causa de la excesiva exposicin de la muestra al efecto deletreo del oxgeno y la desecacin. 6.3. Transporte de las muestras

En el examen microbiolgico de las muestras clnicas es esencial que el envase que las contiene no contribuya con su propia flora microbiana. Adems, la flora original no debe multiplicarse ni disminuir debido a una permanencia prolongada del paciente en la sala o a una refrigeracin prolongada en el laboratorio. En otras palabras debe usarse un recipiente estril y la muestra debe inocularse tan pronto como sea posible. Aunque estas reglas no son rgidas cualquier desviacin de ellas es responsabilidad del microbilogo. Se han diseado una variedad de recipientes para la recoleccin de muestras para su estudio bacteriolgico. Muchas de ellas pueden ser usadas repetidamente luego de su limpieza y esterilizacin, mientras que otras deben ser incineradas luego de su empleo. Adems de la placa de Petri de Pyrex y su versin moderna, las placas de plstico descartabas y preesterilizadas, el equipo de recoleccin ms usado (pero no necesariamente el ms aconsejable) es el hisopo de madera con punta de algodn, alginato de calcio o dacrn (polister). Estos hisopos se preparan mejor por esterilizacin en autoclave de la varilla de manera sumergida en solucin reguladora de Sorensen pH 7,2 durante 5 min, secndolos y acondicionando el extremo con lana de polister (polister Dacron, para relleno, bolsas de 250 g, Sears, Roebuck y Co), alginato de calcio (Colab Laboratories) o algodn medicinal de fibra larga. Una tcnica emplea una unidad para cultivo estril (Culturette, Marion Scientific Corp) (fig. 63) que consiste en un tubo de plstico con un hisopo estril, extremo de polister y una pequea ampolla de vidrio que contiene medio de Stuart modificado. La unidad se retira de su sobre estril y el hisopo se emplea para recoger la muestra. ste se coloca nuevamente en el tubo, se rompe la ampolla y el hisopo se introduce en el medio de transporte. Esto proporcionar suficiente humedad durante 72 h a temperatura ambiente. Ciertos algodones que se emplean en los hisopos pueden contener cidos grasos que son nocivos para el desarrollo bacteriano. Un excelente sustituto es la lana de alginato de calcio, derivada del cido algnico, un producto vegetal natural. Este material que semeja fibras de seda se disuelve en ciertas soluciones compatibles con el mantenimiento de la viabilidad bacteriana (como solucin de Ringer diluida con hexametafosfato de sodio) y forma un alginato de sodio soluble. Los hisopos de mandera con extremo de alginato de calcio o los hisopos nasofarngeos de alambre de aluminio flexible (fig. 64) as como los diluyentes con citrato o hexametafosfato pueden encontrarse en el comercio. Cuando se sospecha la presencia de virus herpes no deben emplearse hisopos con alginato de calcio porque puede inhibir su replicacin. Una modificacin de estos hisopos emplea alambre de Nicromo con calibre 28 o un alambre delgado de aluminio en lugar de la varilla de madera. A causa de su flexibilidad se recomienda el hisopo con alambre para la toma de muestras de la nasofaringe. Para asegurar que la pequea cantidad de algodn del hisopo no se desaprenda durante su pasaje a travs del tracto nasal, debe doblarse el extremo del alambre y colocarse una gota de colodin antes de envolverlo con el algodn; el resto de la unidad es igual a lo descripto anteriormente. En el comercio se encuentran hisopos con alambre, estriles, ya preparados.