Protocolos Nic

EXTRACCIN DNA PLASMIDIAL 1) Crecer 50 ml de la cepa crecida 12 h a 37C con agitacin. 2) Centrifugar a 7000 rpm por 20 min. 3) Resuspender el sedimento en 800 uL de Buffer de Lisis (Tris-HCl pH 8,0 25 mM; Glucosa 50 mM; EDTA 10 mM) suplementado con RNAsa 100 ug/mL. 4) Incubar 10 min a temperatura ambiente 5) Llevar a tubos de 1,5 mL (200 uL cada uno) 6) Agregar 400 uL de Solucin II preparada en el momento (para 1 ml: 100 uL SDS10% (SDS 1%); 20 uL NaOH 10N (NaOH 0,2 N); 880 uL de H2O dd) y agitar suavemente por inversin. 7) Incubar 15 min en hielo. 8) Agregar 300 uL de Acetato de amonio 7,5 N y agitas por inversin. 9) Incubar 15 min en hielo. 10)Centrifugar a 13000 rpm por 15 min. 11)Recuperar 800 uL de sobrenadante y llevar a tubo de 1,5 mL nuevo. 12)Agregar 500 uL de isopropanol y dejar precipitando por 20 min a temperatura ambiente (Tambin se pueden agragar 2 volmenes de Etanol absoluto fro y 0,1 volmen a Acetato de sodio 3M e incubar 30 min a 1 h a 20C, lo que es ms eficiente). 13)Centrifugar a 13000rpm por 30 min. 14)Eliminar el sobrenadante y lavar el sedimento con 500 uL de Etanol 70% fro. 15)Centrifugar a 13000 rpm por 15 min. 16)Descartar sobrenadante y dejar secar el sedimiento hasta que todo el Etanol se evapore. 17)Resuspender en 100-150 uL (para plasmidios de alto nmero de copias) 2050 uL de H2O dd (para plasmidios de bajo nmero de copias).

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CLULAS COMPETENTES Crecer un inculo de 2 ml de la bacteria por 12 h a 37C con agitacin. Sembrar 500 uL en 50 mL de caldo Luria en matrz con vstago hasta O.D 600 de 0,5. 3) Centrifugar a 7000 rpm por 20 min. 4) Descartar sobrenadante y resuspender en 25 mL de glicerol 10% estril fro. 5) Centrifugar a 7000 rpm por 20 min 6) Descartar sobrenadante y resuspender en 10 ml de glicerol 10% fro estril. 7) Centrifugar a 7000 rpm por 20 min 8) Descartar sobrenadante y resuspender en 5 mL de glicerol 10% fro y estril. 9) Centrifugar a 7000 rpm por 20 min. 10) Descartar sobrenadante y resuspender en 1 mL de glicerol 10% fro y estril. 11) Llevar a tubos de 1,5 mL estriles. 12) Centrifugar a 13000 rpm por 5 min. 13) Descartar sobrenadante y resuspender en 500 uL de glicerol 10% fro y estril. 14)Centrifugar a 13000 rpm por 5 min. 15) Descartar sobrenadante y resuspender en 50-100 uL. Utilizar de inmediato o almacenar a 20C.
1) 2)

50ml alcanza para obtener al menos 10 viales.

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EXTRACCIN DE BANDAS DE GELES DE AGROSA CON SOLUCIN DE ALTA SALINIDAD 1) Se escinde la banda de inters desde el gel de agarosa con un bistur y el trozo se deposita en un tubo de 1,5 mL. 2) Se agregan 200-400 uL de una solucin NaCl 2M en TE y la agarosa se fragmenta con una punta de pipeta. 3) Incubar por 12 h a 37C 4) Centrifugar a 7000-10000 rpm por 10 min. 5) Rescatar sobrenadante en un tubo de 1,5 ml limpio. 6) Agregar 0,5 volmenes de Fenol saturado bsico y 0,5 volmenes de cloroformo:isoamlico 24:1. 7) Precipitar con 2 volmenes de Etanol absoluto fro y 0,1 volmen de Acetato de Sodio 3M a 20C por 30 min. 8) Centrifugar a 14000 rpm por 15 min. 9) Descartar sobrenadante y lavar el sedimento con 500 uL de Etanol 70%. 10)Centrifugar a 14000 rpm por 15 min. 11)Descartar sobrenadante y dejar secar. 12)Resuspender en c.s.p con H2O dd.

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EXTRACCIN DE DNA GENMICO CON FENOL 1) Centrifugar 2-5 mL de un cultivo bacteriano en tubos 1,5 mL a 13000 rpm por 15 min. 2) Descartar sobrenadante y resuspender el sedimento en 560 uL de Buffer TE estril. 3) Agregar 30 uL de SDS 10% y 10 uL de proteinasa K (100 ug/mL). 4) Incubar a 37C por 60 min. 5) Agregar 0,5 volmenes de Fenol saturado bsico y 0,5 volmenes de cloroformo:alcohol isoamlico 24:1. 6) Agitar varias veces por inversin y centrifugar 15 min a 14000 rpm. 7) *Rescatar fase acuosa sin arrastrar interfase. 8) Agregar 0,6 volmenes de isopropanol y 0,1 volmenes de acetato de sodio 3M ( 2 volmenes de Etanol fro y 0,1 volmenes de acetato de sodio 3M) 9) Agitar varias veces por inversin. 10)Centrifugar a 14000 rpm por 30 min. 11) Descartar sobrenadante y lavar con 500 uL de Etanol 70% fro. 12)Centrifugar 15 min a 14000 rpm, descartar sobrenadante y dejar secar. 13)Resuspender en 40 uL de H2O dd.

*Nota: Si se llega a sacar interfase, el fenoleo debe repetirse. Si llega a quedar fenol en la fase acuosa, agregar 1 vol de cloroformo:alcohol isoamlico 24:1, centrifugar y recuperar fase acuosa de nuevo. Si llega a quedar con cloroformo:alcohol isoamlico dejar evaporar a temperatura ambiente.

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TOOTHPICK PLASMID SCREEN 1) Centrifugar 1 mL de inculo bacteriano. 2) Descartar sobrenadante y resuspender con 75 uL de solucin de lisis. 3) Dejar 5 min a temperatura ambiente. 4) Agregar 0,5 volmen de Fenol saturado bsico y 0,5 volmenes de cloroformo: alcohol isoamilico 24:1. 5) Agitar por inversin y centrifugar 15 min a 14000 rpm. 6) Cargar 5 uL de la fase acuosa en gel de agarosa. Solucin de Lisis: 6 mL H2O dd 3 mL SDS 10% 1 mL Tris HCl 1M pH 8,0 120 uL 10 N NaOH

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EXTRACCIN DE DNA GENMICO CON CTAB Crecer 2-5 mL de un inculo bacteriano por 12 h. Centrifugar 1,5 mL del cultivo por 15 min a 14000 rpm. 3) Descartar sobrenadante y resuspender el sedimento en 567 uL de Buffer TE. 4) Agregar 30 uL de SDS 10% y 3 uL de proteinasa K (20 mg/mL). 5) Agitar por inversin e incubar a 37C por 1 h. 6) Agregar 100 uL de NaCl 5M y mezclar. 7) Agregar 80 uL de una solucin de CTAB en NaCl 0,7M. 8) Mezclar e incubar 10 min a 65 C. 9) Agregar 0,5 volmenes de Fenol saturado bsico y 0,5 volmenes de cloroformo: alcohol isoamlico 24:1. 10) Agitar por inversin y centrifugar por 15 min a 14000 rpm. 11) Transferir el sobrenadante a un tubo de 1,5 mL nuevo. 12) Agregar 0,6 volmenes de isopropanol fro y mezclar suavemente por inversin. Dejar 30 min a temperatura ambiente. 13)Centrifugar 15 min a 14000 rpm. 14) Descartar sobrenadante y lavar el sedimento con 500 uL de Etanol 70% fro. 15)Centrifugar 15 min a 14000 rpm, descartar sobrenadante y dejar secar. 16)Resuspender en 50 uL de H2O dd.
1) 2)

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TRANSFORMACIN CON CLORURO DE CALCIO.

a)

Preparacin de clulas competentes.

Inocular 20 mL de caldo Luria con 100 uL de bacterias. Crecer a 37C con agitacin hasta O.D 600 de 0,6. Colocar en hielo por 10 min. Centrifugar por 5 min a 4C en tubos estriles a 7000 rpm. Descartar sobrenadante y resuspender el sedimento en 0,1 volmenes de CaCl2