1 INTRODUO O Mtodo de colorimtrico denominado tcnica de bradford, largamente empregado para dosagem de protenas totais, apresentando sensibilidade na deteco

o das protenas. A tcnica envolve a utilizao de um corante coomassie brilliant blue (BG-250), esse mtodo baseia-se na interao entre o corante BG-250 e macromolculas de protenas que contem aminocidos de cadeias laterais bsicas ou aromticas. No pH de reao, a interao entre a protena de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilbrio do corante para a forma aninica, que absorve fortemente em 595 nm (ZAIA; LICHTIG, 1998). Alguns autores recomendam o mtodo de Bradford para a determinao de protenas totais em leite humano, lqor e urina. No entanto, com relao urina, diversos autores destacam dois fatores contra a utilizao desta metodologia, sendo um deles a dependncia entre o nmero de diluies da amostra e o resultado da concentrao de protena obtido e, o outro, a presena de protenas de baixo peso molecular, subestimando a concentrao de protenas totais na urina, principalmente, de pacientes com proteinria (ZAIA; LICHTIG, 1998).

2 OBJETIVO Determinar, de modo qualitativo, as concentraes variadas de protenas totais de duas amostras, pelo mtodo de colorimtrica bradford.

3. MATERIAIS E MTODOS Para realizao do teste foram utilizados reagentes de bradford pronto para o uso temperatura ambiente. Em uma placa foi realizado uma curva de concentraes da seguinte maneira:

2
16L H20 + 4L de BSA

3
10L H20 + 10L de BSA

1 0

1 1

1 2

20L de H2O (Branco)

4L H20 + 16L de BSA

20L de BSA

20L de H2O (Branco)

14L H20 + 6L de BSA

10L H20 + 10L de BSA

4L H20 + 16L de BSA

20L de H2O (Branco) 18L H20 + 2L de BSA 18L H20 + 2L de BSA 18L H20 + 2L de BSA 16L H20 + 4L de BSA 16L H20 + 4L de BSA

14L H20 + 6L de BSA

8L H20 + 12L de BSA

4L H20 + 16L de BSA

Amostra 1 Macrfago

14L H20 + 6L de BSA 12L H20 + 8L de BSA 12L H20 + 8L de BSA 12L H20 + 8L de BSA 10L H20 + 10L de BSA

8L H20 + 12L de BSA

2L H20 + 18L de BSA

Amostra 2 Clula B

8L H20 + 12L de BSA

2L H20 + 18L de BSA

6L H20 + 14L de BSA

2L H20 + 18L de BSA

6L H20 + 14L de BSA

20L de BSA

6L H20 + 14L de BSA

20L de BSA

Tabela 1: representao da placa utilizada com as diluies de concentraes diferentes de BSA (100ug/ml), a curva foi feita em triplicata, as amostra 1 macrfago, amostra 2 clula B. Para realizao da tcnica necessrio fazer uma curva de concentrao, com uma protena cuja concentrao conhecida, utilizamos o BSA 100ug/ml (soro albumina bovino). Foram colocados em diferentes poos concentraes variadas de BSA, as concentraes comearam com 0,2ug/ml at 2,0ug/ml (0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 ug/ml) (como mostra a tabela 1). O calculo utilizado para determinar a diluio (gua destilada) e a concentrao de BSA adicionada a cada poo foi: 100ug/ml de BSA _____ 1000ul (1ml) 0,2ug/ml de BSA ______ X X= 2ul. Adicionar 18ul de gua + 2ul/ml de BSA. O calculo foi repetidos para todas as outras concentraes. Aps adicionar o BSA e a gua, colocou-se 200ul de CBB (comassie Brilhant Blue) em todos os poos. O CBB liga-se a regio N-terminal da protena, formando um precipitado de cor azul. Quanto mais intenso o azul, maior a concentrao da protena. Alm desses foram utilizados luvas para evitar contaminao, gua destilada para realizar as diluies, papel absorvente, micropipeta, placa, as amostra foram denominadas 1 macrfago e 2 clula B,

4.RESULTADOS Aps realizar o procedimento descrito em materiais e mtodos obtivemos o resultado demonstrado na figura 1. A microcavidade que continha s amostras apresentou colorao azul comparada a do controles. A amostra 1 se apresentou parecida com a microcavidade C2 (0,6ug/ml), e a amostra 2 apresentou-se parecida com a microcavidade B2 (0,6ug/ml).

Controle B2 negativo
C2 1 2

Amostrast estadas

Figura 1.1 Placa com a curva de concentrao de BSA e as duas amostras testadas, em branco legenda dos poos B2 e C2 cujas concentraes so de 0,6ug/ml foram qualitativamente parecidas com as amostras 1 e 2.

5.DISCUSSO A colorimetria visa determinar a concentrao de uma substncia, em condies bem definidas, pela medida da absoro de luz, tomando como referncia a absoro da substncia numa concentrao conhecida. A principal vantagem desse mtodo de proporcionar um meio simples para determinar pequenas quantidades de substncias.* Entre os mtodos colorimtricos destaca-se a espectrofotometria, um processo analtico sensvel, rpido, e cujos resultados so mais precisos, comumente utilizado na determinao da concentrao de constituintes biolgicos. * A partir da leitura dos valores de absorbncia, de solues padres de concentraes conhecidas, obtm-se a curva padro ou curva de calibrao. Com esta curva, pode-se determinar a concentrao de uma determinada substncia presente em uma dada amostra.* A limitao da tcnica ocorreu devido no possuirmos um leitor de ELISA para uma analise quantitativa (dados numricos) para construir a curva padro, nossa analise foi qualitativa.

6. CONCLUSO O mtodo baseia-se na ligao do corante Azul Brilhante de Comassie G250 com a protena. So utilizados etanol, acido fosfrico e corante que reage com os grupos funcionais bsicos e aromticos das protenas. Para que ocorra esta ligao as protenas devem ter estruturas macromoleculares, com no mnimo 89 ligaes peptdicas (RAUNKJAER et al., 1994). O mtodo sensvel presena de protenas na amostra, se fazendo necessria uma curva padro com uma protena de concentrao conhecida para validao do mtodo. A anlise dessa curva feita quantitativamente por espectrofotmetro (570nm), a curva deve apresentar-se retilnea com concentraes crescentes. A anlise feita foi qualitativa, apenas com a comparao da intensidade da colorao das amostras com a da curva padro, o que limitou a preciso dos resultados obtidos.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ZAIA, Dimas A. M. et al. DETERMINAO DE PROTENAS TOTAIS VIA ESPECTROFOMETRIA: VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MTODOS EXISTENTES. Disponvel em: <www.scielo.br/pdf/qn/v21n6/2914.pdf>. Acesso em: 09 maio 2012.

RAUNKJAER, K; HVITVED-JACOBSEN, T.; NIELSEN, P. H. (1994). Measurement of pools of protein, carbohydrate and lipid in domestic wastewater. Wat. Res. V. 28, n. 2, pp. 251-262.