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Studi di attivazione cerebrale con risonanza magnetica. Eraldo Paulesu, Paola Scifo, Ferruccio Fazio
Istituto Scientifico H San Raffaele, INB-CNR, Universita' degli Studi , Milano, Italia.

Introduzione Fino a solo dieci anni fa l'unica tecnica di risonanza magnetica (RM) che permetteva la misura di parametri funzionali era la spettroscopia. Nell'ultima decade abbiamo assistito ad un tumultuoso sviluppo di tecniche di neuroimaging basate sulla risonanza magnetica che permettono la misura qualitativa e/o quantitativa di parametri funzionali cerebrali. Oggetto di questo capitolo sara' la presentazione delle tecniche di attivazione basate sull'uso della RM [3, 41, 42, 65, 66]. Tali tecniche sono ormai di uso comune da parte di ricercatori nel campo delle neuroscienze [30, 45, 56, 64], e stanno progressivamente interessando il neuroradiologo clinico [5, 57]. Poiche' le tecniche in questione non sono ancora di uso routinario nella pratica diagnostica neuroradiologica, esse saranno presentate anche da un punto di vista metodologico onde illustrare le basi biologiche della tecnica, i principi fisico/ingegneristici dellacquisizione dei dati e i principi neuroanatomici e statistici della loro analisi. A queste sezioni seguira' una presentazione delle principali applicazioni di ricerca biomedica e degli iniziali usi clinici, tenendo anche presente il contesto piu' generale dell'imaging funzionale cerebrale, il quale comprende metodiche di medicina nucleare come la tomografia ad emissione di positroni (PET). Esistono altre tecniche di imaging funzionale con RM quali le tecniche di diffusione e di perfusione. Questi metodi sono molto interessanti ma non appaiono ancora sufficientemente maturi per un importante uso clinico. D'altra parte la ricerca di base nell'ambito delle tecniche di diffusione e perfusione non travalica l'ambito specialistico degli esperti in RM. Per una presentazione di questi metodi si veda Turner et al. (1991) e Pierpaoli et al. (1996) [51, 66]. A. Mappaggio delle funzioni cerebrali con RM funzionale (RMF): origini storiche di una moderna tecnica neurofisiologica. Per capire i fondamenti e gli scopi delle metodiche di attivazione basate su tecniche di imaging, ivi incluse quelle di RM, utile sapere in che contesto queste tecniche si sono sviluppate, quali sono stati i passaggi scientifici cruciali che ne hanno permesso l'avvento e quali esigenze esse tentino di soddisfare.

2 L'esigenza cui gli studi di attivazione vogliono rispondere quella di mappare le funzioni cerebrali normali e patologiche. Per arrivare allo stato attuale si dovuto assistere ad una serie di importanti progressi concettuali e tecnologici. Nonostante alcuni teorici abbiano sostenuto che la corteccia cerebrale sia priva di specializzazioni al di fuori delle aree sensitive e motorie primarie [31], la posizione attualmente dominante sull' organizzazione del cervello si fonda sull'assunto che le diverse aree corticali associative e primarie svolgano delle operazioni discrete che contribuiscono alla nostre capacit percettive, motorie e mentali [50]. E' chiaro che operazioni mentali complesse non possono dipendere da aree circoscritte del cervello ma piuttosto esse sono garantite da sistemi neurali distribuiti [37]. Tuttavia, la comprensione delle operazioni dei singoli nodi neurali di tali reti complesse rimane un presupposto necessario ed una priorita' nella ricerca neuroscientifica da ormai 150 anni. A tale comprensione sta contribuendo in maniera sostanziale l'imaging funzionale (PET e RMF). E' tradizionalmente riconosciuto che l'inizio della ricerca moderna sui correlati neurali delle funzioni mentali pu essere fatto risalire alla seconda meta' del 19' secolo e alle osservazioni di Paul Broca [7] il quale sugger, sulla base di osservazioni anatomopatologiche in un paziente gravemente afasico, l'importanza della terza circonvoluzione frontale sinistra nel linguaggio parlato. Il metodo di Broca, tuttavia, aveva il chiaro limite di una ridotta accuratezza anatomica e funzionale dato che si basava sull'osservazione di lesioni cerebrali vascolari, le quali di solito sono estese e danneggiano aree cerebrali sulla base della distribuzione del letto vascolare piuttosto che sulla base di un' organizzazione anatomo-funzionale. Il secondo limite del metodo anatomo-patologico consiste nel ritardo con cui l'anatomo-patologo pu osservare una lesione cerebrale circoscritta alla quale un paziente pu foryunatamente sopravvivere per anni. Tale limite stato aggirato dalle tecniche di imaging strutturale, tomografia assiale computerizzata e poi RM, divenute di uso comune all'inizio degli anni 70' e 80' rispettivamente. Le tecniche di neuroimaging strutturale hanno contribuito notevolmente al progresso delle nostre conoscenze neuroanatomiche basate sul modello di studio lesionale [12, 38, 52]. Le tecniche di neuroimaging morfologico, importantissime da un punto di vista clinico, hanno comunque un limite insormontabile per quanto riguarda la ricerca sulle funzioni cerebrali: esse dicono poco o nulla sul funzionamento del cervello intatto per non dire delle anomalie funzionali in patologie che non si associano ad alterazioni

3 cerebrali macroscopiche (es. dislessia evolutiva, schizofrenia). D'altro canto le tecniche elettrofisiologiche, pur con l'eccezionale risoluzione temporale nel misurare eventi elettrici legati all'attivit cerebrale, mancano di accuratezza anatomica quando l'attivit elettrica sia registrata dallo scalpo (EEG) oppure coprono una finestra anatomica troppo limitata quando l'attivit cerebrale sia registrata con elettrodi profondi in corso di stereo-EEG o con elettro-corticografia di superficie in corso di esplorazione chirurgica. Una svolta cruciale sulla via dello sviluppo di tecniche non invasive per la localizzazione dell' attivit cerebrale stata l'osservazione che cambiamenti di attivit elettrica neurale regionale, la variabile che idealmente vorremmo misurare per mappare le funzioni corticali, si associano a cambiamenti di consumo metabolico di glucosio cerebrale e ad aumenti di flusso cerebrale. In particolare, il consumo di glucosio cerebrale strettamente legato all'attivit della ATPasi Na+/K+ dipendente a livello sinaptico [34] e quindi all'attivit sinaptica stessa [vedi Raichle (1987) per una revisione] [53]. Tali cambiamenti di metabolismo e flusso cerebrale non sono indiscriminati e globali, ma coinvolgono le aree strettamente implicate nella stimolazione usata [54]. Queste osservazioni, fatte inizialmente da Louis Sokoloff e colleghi [61, 62], hanno permesso l'esecuzione dei primi studi di "attivazione" nell'animale di laboratorio sottoposto a stimoli luminosi semplici (es. luce stroboscopica). Usando il metodo autoradiografico con 14C-desossiglucosio e' stato possibile dapprima evidenziare l'aumento del consumo di glucosio nella corteccia visiva in corso di stimolazione luminosa. Quindi si visto che il flusso cerebrale regionale accompagna fedelmente gli aumenti di consumo di glucosio e pertanto pu essere misurato come indice alternativo al consumo di glucosio stesso. Questa osservazione ha delle implicazioni importanti perch, per motivi pratici, il consumo regionale di glucosio non pu essere misurato pi di una volta per sessione sperimentale mentre il consumo di flusso cerebrale pu essere misurato pi e pi volte con metodica PET nella stessa sessione. Come vedremo, misure dirette o indirette del flusso cerebrale con RMF possono essere ripetute a piacimento. I primi studi di attivazione in vivo nell'uomo sono stati eseguiti con tecniche scintigrafiche planari capaci di rivelare cambiamenti di flusso cerebrale usando il tracciante Xenon 133 [27]. Con l'avvento di tecniche tomografiche PET, capaci di rivelare la distribuzione tridimensionale di radiocomposti emittenti positroni legati a molecole quali il 18fluoro-deossiglucosio (18F-FDG) o l'acqua (H215O), stato

4 possibile indagare pi accuratamente i pattern di attivazione cerebrale associati all'esecuzione di compiti motori, percettivi, cognitivi (es. linguaggio, memoria, attenzione). Dapprima gli studi di attivazione con PET sono stati eseguiti con tecnica 18F-FDG che permette la misurazione del consumo cerebrale di glucosio [49]. Questo genere di esperimenti, estremamente interessanti quando eseguiti nella condizione di riposo in popolazioni con disturbo cognitivo focale [17], non si presta agevolmente a studi di attivazione, a causa della cinetica del tracciante impiegato (il 18fluoro-deossiglucosio -FDG- raggiunge uno steady-state atto alla misura PET a 45' dall'iniezione endovenosa) e l' emivita del radioiosotopo ad esso legato (il 18F ha un'emivita di circa 2 ore). Viceversa, numerosissimi sono stati ad oggi gli studi di attivazione con tecnica PET e misurazione del flusso cerebrale tissutale con H215O, data la versatilit del metodo che permette fino a 16 misure di flusso cerebrale per soggetto in una sola sessione sperimentale [13, 19, 44, 48, 53, 73]. Per rendere possibile l' avvento delle metodiche di risonanza magnetica funzionale, cos come le conosciamo ora, sono state necessarie altre nuove osservazioni sperimentali e sviluppi tecnologici. Il primo fatto da ricordare lo studio di Fox e Raichle (1986) [18] i quali hanno eseguito un esperimento di attivazione tattile con la PET misurando sia il flusso che il consumo di ossigeno cerebrale. Fox e Raichle notarono che il metabolismo dell'ossigeno cresce in maniera proporzionalmente minore rispetto al flusso in corso di attivazione. Controversa alla sua pubblicazione, tale osservazione fornisce oggi il fondamento empirico al cosiddetto blood oxygenation level dependent contrast effect (BOLD effect) su cui si basa la stragrande maggioranza degli esperimenti di attivazione con risonanza magnetica. Tre altri fatti cruciali ci anno portato alla moderna RMF: la scoperta delle propriet paramagnetiche dell'emoglobina [46, 63]; lo sviluppo di tecniche di campionamento RM ultrarapide quali la tecnica echo-plananre (EPI); l'osservazione del BOLD effect in vivo con RM in corso di riperfusione cerebrale [67] e in associazione a stimolazione visiva [41] come metodo sostitutivo dei traccianti paramagnetici.

B. Studi RMF basati sulla de-ossiemoglobina come mezzo di contrasto endogeno. Vale a questo punto la pena stravolgere l'ordine storico di presentazione delle tecniche MRF per descrivere quella che rappresenta la metodica di elezione. Infatti,

5 nel solo volgere di un anno questa tecnica ha soppiantato gli altri metodi di RMF. Lo stesso gruppo di Boston che poco prima aveva proposto la tecnica basata sull'iniezione di mezzi di contrasto paramagnetici [3, 41] contemporaneamente al gruppo di Bethesda [67] scopre che era possibile osservare cambiamenti di segnale RM al variare dello stato di ossigenazione del sangue. La deossiemoglobina e l'ossiemoglobina hanno infatti caratteristiche magnetiche diverse: la prima e paramagnetica, mentre l'ossiemoglobina e diamagnetica [63]. Il sangue stesso puo quindi essere usato come un agente di contrasto naturale in quanto durante una stimolazione sensoriale, l'esecuzione di un atto motorio o di un atto mentale, varia il suo stato di ossigenazione nelle zone cerebrali attivate (figura 1).

Figura 1 Effetto BOLD: durante periodo di attivazione il contenuto relativo di deoxyHb nell'area attivata diminuisce. In particolare, nelle aree cerebrali attivate si osserva un aumento del consumo di ossigeno e del flusso ematico: il secondo, pero aumenta maggiormente [18] ed il risultato e un incremento regionale del grado di ossigenazione del sangue, una riduzione relativa della concentrazione di deossiemoglobina e, date le proprieta'

6 paramagnetiche di quest' ultima, si ha un aumento di T2 e T2* del sangue (vedi figura 2). Come detto, questo fenomeno da' le basi al cosiddetto effetto BOLD e su esso si fonda la grande maggioranza degli studi di attivazione con RM. L'implementazione del metodo per studi sull' uomo e' stata quasi immediata [42]. La sua totale non invasivita permette la ripetizione a piacimento degli esperimenti anche sugli stessi soggetti .

Figura 2 Effetto BOLD: schema del processo che genera il segnale RMF.

Quindi, misure del BOLD effect altro non sono che misure indirette dell'aumento del flusso cerebrale. In teoria il BOLD effect misurabile con strumenti RM 1.5T, dovrebbe essere 10 volte pi piccolo del cambiamento di flusso misurabile con PET [41]. In un nostro studio di confronto tra PET e RMF abbiamo per trovato che tale rapporto in alcune aree associative potrebbe non essere cos alto ma ridursi ad un fattore di 3 a favore del flusso cerebrale misurato con PET [43].

7 Ci sono delle differenze importanti rispetto alla perfusione cerebrale misurata con tecnica H215O PET: in tutti gli studi basati sul BOLD effect il segnale misurato intravasale, mentre la PET misura la concentrazione tissutale extracapillare dei traccianti di flusso quali la H215O. Nel caso dei dati basati sul BOLD effect raccolti con sequenza gradient echo con tecnica echo-planare, il segnale intravascolare origina dalla piccole vene drenanti. Nonostante le differenze tra tecnica RMF-BOLD e tecnica H215O PET la sovrapponibilit dei risultati con le due metodiche pu essere eccellente (figura 3) [43].

Figura 3. Cross-validazione PET/RMF: mappe di attivazione RMF (sopra) e PET (sotto) relative ad un unico soggetto che esegue un compito di working memory verbale (tenere a mente una serie di lettere). Le aree attivate in entrambe la metodica si localizzavano nella regione di Broca (giro frontale inferiore sinistro) e alle giunzioni temporo-parietali di entrambi i lati [43]. Se le basi del BOLD effect per aumenti di flusso cerebrale sembrano sufficientemente chiare almeno da un punto di vista empirico [18], non ancora altrettanto chiaro se sia possibile registrare delle vere diminuzioni del segnale basate sul BOLD effect. Per registrare un simile calo di segnale si dovrebbe osservare una

8 diminuzione di flusso cerebrale che eccede il calo di metabolismo dell'ossigeno cerebrale, con aumento quindi dell'estrazione di ossigeno a livello tissutale. Finora un simile meccanismo, per le grandezze di variazione del flusso cerebrale osservate in fisiologia, non mai stato dimostrato empiricamente. Lo stesso meccanismo invece alle basi del compenso metabolico cerebrale in corso di riduzione della riserva emodinamica durante ischemia cerebrale quando i cali di perfusione cerebrale siano veramente importanti [71].

D. Altre tecniche RMF RMF con mezzi di contrasto esogeni. Questa, nella pur breve storia dalla RMF, ha avuto gli onori di essere stata la prima tecnica utilizzata ma e' anche stata rapidamente abbandonata in favore del metodo basato sul BOLD effect. Il primo esperimento su esseri umani in grado di valutare l'attivita cerebrale con risonanza magnetica in un paradigma di attivazione fu infatti eseguito al Massachusetts General Hospital di Boston e pubblicato nel 1991 [3]. Il metodo consisteva nell'iniettare un tracciante intravascolare paramagnetico (gadolinium-DTPA) durante due separati periodi di osservazione: uno di riposo ad occhi chiusi ed uno durante il quale il soggetto veniva stimolato con della luce stroboscopica. Il transito del bolo di contrasto nel letto vascolare generava una riduzione del segnale acquisito con tecniche gradient echo e, poiche nelle aree cerebrali attivate dal compito il volume ematico aumentava insieme alla concentrazione di tracciante paramagnetico, il confronto fra le immagini acquisite durante i diversi periodi permetteva di individuare le zone attivate. L'esperimento fu eseguito con l'allora innovativa sequenza ecoplanare che permetteva il monitoraggio accurato del passaggio del bolo di contrasto acquisendo le immagini ad intervalli di 0.75 sec sulla singola sezione cerebrale. Questo esperimento ebbe una grandissima eco a livello mondiale anche se erano chiare una serie di limitazioni: il segnale misurato il cambiamento di volume sanguigno a livello venoso e il letto venoso pu essere distante dal tessuto attivato o il segnale in un certo distretto venoso pu essere influenzato dall'attivazione di tessuto ad esso distante. Inoltre, l'iniezione di mezzo di contrasto paramagnetico nello stesso soggetto non pu essere ripetuta a piacere. Va notato tuttavia che il rapporto segnale rumore della singola misurazione RMF con mezzi di contrasto paramagnetici e' migliore che nel caso di dati basati sul BOLD effect [35].

Arterial spin-tagging. Quasi contemporaneamente ai primi studi RMF basati sul BOLD effect e' stata proposta un'altra tecnica RMF per studiare attivazioni cerebrali mediante misure piu' dirette del flusso ematico cerebrale. Il suo nome e' arterial spin-tagging (AST) [70]. L'interesse della tecnica sta nel fatto che essa misura piu' direttamente l' attivita' cerebrale in quanto la variabile misurata e' il flusso capillare, piu' prossimo alla sorgente dellattivazione neuronale. Inoltre la AST permette in linea di principio una misura quantitativa del flusso cerebrale. Le informazioni relative al flusso sono ottenute dalla differenza fra il segnale proveniente da spin appartenenti alla sezione di cervello che si vuole acquisire e il segnale proveniente dagli spin che entrano nel piano della sezione. Recentemente la tecnica AST e stata combinata con la sequenza EPI. In questa nuova sequenza, chiamata EPISTAR la magnetizzazione degli spin viene invertita tramite un impulso a radiofrequenza adiacente al piano della sezione di interesse [15]. Un limite delle tecniche AST sta nel fatto che il campo di vista utile per la misura di attivazioni cerebrali si riduce a singole sezioni; con sequenze EPI-BOLD possono essere invece facilmente studiati interi volumi cerebrali. D. Sequenze di impulsi per studi di attivazione con fRM.9 Data la natura dinamica degli studi di attivazione, le sequenze utilizzate devono essere molto veloci per permettere di monitorare accuratamente levoluzione dei parametri misurati. Come e stato detto nel paragrafo precedente, la tecnica BOLD si basa sulla differenza di suscettivita magnetica fra ossi-emoglobina e deossi-emoglobina. Le sequenze da utilizzare dovranno quindi essere sensibili alle differenze locali di suscettivita' magnetica e pertanto dovranno generare immagini pesate T2 e T2*. Fra quelle piu comunemente utilizzate ricordiamo le sequenze eco-planari (sia gradientecho - sia spin-echo), le sequenze spirali [32, 39], le sequenze fast-SPGR (o FLASH) [10], la sequenza PRESTO [68] e le loro varianti (per una revisione si veda Moseley e Glover, 1995 [40]). Una prima distinzione fra le sequenze utilizzate per studi RMF puo essere fatta sulla base del numero di impulsi a radiofrequenza usati per campionare il k spazio per ogni sezione: con questo criterio possiamo distinguere fra sequenze single-shot e multi-shot. Le prime campionano il k-spazio con un solo impulso mentre le seconde con un numero di impulsi che puo variare da 2 a quante sono le righe della matrice utilizzata nellacquisizione. Chiaramente le sequenze single shot sono molto piu veloci rispetto alle altre: riescono a raggiungere risoluzioni temporali impossibili con altre tecniche (fino a 100msec) e acquisire ogni 3-7 sec un volume di immagini che

10 copre l'intero cervello e cervelletto. Inoltre, poiche gli spin sono eccitati dall'impulso a radiofrequenza una sola volta per ogni sezione, il rischio di effetti in-flow , l'artefatto legato al flusso di sangue refluo proveniente da sezioni adiacenti, e limitato. Le sequenze echo-planari (sia gradient, sia spin echo) single-shot sono fra le piu diffuse nellambito della RMF. In questo caso, k spazio e campionato con traiettorie a zig-zag. Il maggior svantaggio della sequenza eco-planare e la sua sensibilita (soprattutto nella forma gradient-echo) a distorsioni e perdite di segnale in zone disomogenee del cervello. Tale caratteristica non puo essere corretta in quanto legata alla naturale differenza di suscettivita magnetica fra diverse zone dello spazio campionato (es. interfaccia fra aria e tessuto in prossimit dei seni paranasali quale quello frontale). La differenza fra spin-echo e gradient-echo eco-planari sta sostanzialmente nel fatto che la spin-echo e meno sensibile al segnale proveniente da grossi vasi ma ha complessivamente un peggiore rapporto segnale/rumore [2]. Di conseguenza, se da una parte la sequenza spin-echo risulta piu specifica per il segnale di origini microvasale e meno affetta da distorsioni rispetto alla sequenza gradient-echo, dallaltra, essendo meno sensibile, puo essere utilizzata solo se il paradigma di attivazione e' tale da generare un segnale molto forte (es. compiti motorii) e/o se la potenza del magnete e' elevata. Un altro modo per campionare il k-spazio e chiamato a spirale, dalla traiettoria lungo la quale viene campionato il k-spazio. Vantaggi e svantaggi di questa sequenza sono analoghi a quelli della EPI. Fra le sequenze multi shot, oltre alle versioni a piu impulsi delle sequenze viste sopra, ricordiamo le sequenze FLASH e le PRESTO. Esse, sono piu facilmente implementabili su uno scanner convenzionale in quanto, come vedremo, richiedono un hardware meno potente. Nelle sequenze FLASH il tempo di acquisizione e ridotto grazie allutilizzo di angoli bassi (inferiori a 60 gradi) e questo permette di ridurre il tempo fra un impulso rf e quello successivo. Per cio che riguarda invece le sequenze PRESTO (nellultima` versione 3d) la riduzione dei tempi di acquisizione e ottenuta con la tecnica a shift di eco (e quindi TR<TE) [68, 69]. Tra gli svantaggi di queste tecniche, ricordiamo che la sequenza FLASH tende ad essere sensibile agli effetti di flusso mentre, la PRESTO, meno sensibile ad effetti inflow grazie alla sia natura 3D, risente pero maggiormente degli artefatti da movimento che possono risultare critici per i tempi di acquisizione piuttosto lunghi. Inoltre, in entrambi i casi, l' uso di un basso valore di flip angle ha come conseguenza un minor rapporto segnale/rumore.

11 E. Acquisizione di dati RMF. I requisiti tecnologici necessari per eseguire uno studio di risonanza magnetica funzionale riguardano sia la fase di acquisizione sia la successiva fase di elaborazione dei dati. Per cio che concerne l'hardware dello scanner, fondamentale e l'intensita del campo magnetico: la variazione del segnale e infatti proporzionale ad esso e tipicamente non supera il 10% per campi da 1.5T e il 25% per campi da 4T in aree sensori/motorie primarie. I gradienti di campo devono essere tali da permettere l'utilizzo di sequenze ultraveloci come quella eco-planare single-shot (intensita' >20 mT/m e slew-rate > 70 T/m/s) o le sequenze FLASH (multi-shot) (intensita' >10mT/m e slew-rate >30T/m/s 1msec to get 10 mT) adatte, rispettivamente ad acquisizioni multi-slice o single-slice. L'omogeneita del campo magnetico deve essere ottima proprio per la sensibilita intrinseca di tali sequenze. F. Disegno sperimentale di esperimenti RMF. Il disegno sperimentale tipico degli esperimenti di attivazione di natura sottrattiva: il segnale RMF in un compito sperimentale di interesse (esempio: muovere un dito) viene confrontato al segnale misurato durante una condizione di riposo che non contenga la componente sperimentale di interesse (il movimento del dito). Questo genere di disegno sperimentale ha dominato la scena nella ricerca con metodi di attivazione PET [48] e gran parte del lavoro fatto con la RMF finora [11]. Il grado di sofisticatezza del disegno sottrattivo pu variare grandemente. Per una revisione dei disegni sperimentali adottabili con PET e RMF nei paradigmi di attivazione si veda Frackowiak e Friston (1994) [20] e Friston et al. (1997) [22]. Nella figura 4 mostrato il pattern di attivazione nella regione di Broca durante un semplice compito di fluenza verbale silente confrontato con un compito di riposo [45] in un disegno sottrattivo. La stessa figura mostra una curva attivit/tempo in cui sono chiaramente evidenziati i periodi di riposo (baseline) da quelli di attivazione. Tali cicli si alternavano ogni 10 misure RMF per 12 cicli complessivi (sei di riposo, sei di fluenza verbale).

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Figura 4. Aree di attivazione RMF associate a produzione interna di parole. Le aree attivate (in giallo) sono state sovrapposte ad una immagine media T2 in sagittale (emisfero di sinistra, a sinistra) e coronale. La parte inferiore della figura mostra il decorso temporale del segnale RMF nell'area di Broca nei 4 soggetti studiati. Il paradigma prevedeva l'alternanza di cicli di 10 misure a riposo e 10 misure durante il compito di fleunza verbale, per un totale di 120 misure per soggetto. Valide alternative ai disegni sottrattivi sono i disegni correlativi in cui una variabile lineare (es. stimolazione acustica con parole a diverse frequenze, 10/min; 20/min, ecc.) viene correlata con l'attivit cerebrale regionale misurata con RMF e BOLD. Da ultimo, pi recentemente si sta affermando un nuovo tipo di disegno sperimentale pi simile a quelli impiegati negli esperimenti con potenziali evocati: la event-related RMF permette di disambiguare l'attivit cerebrale legata a singoli trials ripetuti nel tempo [36, 65]. Questo approccio permette maggiore flessibilit consentendo, per esempio, di isolare trials in cui la prestazione del soggetto in un compito sia corretta da trials in cui il soggetto commette errori. G. Analisi di dati RMF Dal 1991 ad oggi numerosi metodi sono stati proposti per analizzare dati RMF. Per semplicit si dar per scontato che i dati in oggetto siano dati BOLD volumetrici con volumi cerebrali senza gaps tra le varie sezioni. Questo in definitiva il solo

13 formato di dati grezzi che permetta una analisi corretta. Si d anche per scontato che l'analisi avvenga con tecnica pixel x pixel, ovvero che i confronti statistici avvengano direttamente sulle immagini RMF di modo che il valore di contrasto BOLD in un determinato pixel a certe coordinate nella condizione "a" sia confrontato con il contrasto BOLD dello stesso pixel nella misura relativa la condizione "b". I primi approcci impiegati per analizzare i dati RMF possono essere considerati obsoleti in quanto non suffiecientemente conservativi [1, 59]. Essi generalmente consistevano nel confrontare i valor medi dei pixels nelle condizioni sperimentali e di riposo o nel cercare una correlazione lineare tra intensit dei pixels e disegno sperimentale (alternaza di condizioni di riposo e di attivazione), senza che vi fosse una stringente correzione per confronti multipli. Purtroppo tali metodi sono spesso gli unici resi disponibili commercialmente dai produttori di strumentazione RM. E' improbabile che dati analizzati in tal modo superino il vaglio della revisione nelle riviste scientifiche specializzate. In breve un'analisi corretta dei dati RMF deve tener conto dei seguenti fattori. Una prima analisi deve escludere dati grezzi corrotti da artefatti grossolani. Questo un punto tutt'altro che banale con dati RMF. I volumi cerebrali acquisiti anche nel volgere di pochi minuti devono poi essere riallineati l'uno all'altro onde garantire la massima congruenza anatomica tra una misura e l'altra per evitare di registrare false attivazioni legate al movimento del soggetto [23]. Esistono algoritmi automatizzati che permettono di fare questo con accuratezza inferiore al millimetro [24, 72]. Dati grezzi per i quali si abbia evidenza di movimenti cospicui dovrebbero essere non considerati per le analisi statistiche. Il confronto del segnale BOLD nelle condizioni sperimentali e di controllo puo' essere fatto mediante t test per confronti appaiati. Non ci riferiamo qui pero' al t test nella versione consueta, usato nei primi esperimenti RMF comparsi in letteratura. Viceversa, per dati RMF il calcolo della significativita' del confronto statistico deve tener conto del fatto che, se il tempo di acquisizione di un volume cerebrale molto veloce (es. TR = 3sec), le misure ripetute contigue non sono genuinamente indipendenti, tenuto anche conto della latenza della risposta emodinamica cerebrale (di solito intorno ai 3-4 secondi). Accettare come repliche indipendenti tutte le osservazioni raccolte in sei minuti (tanto occorre per raccogliere 120 volumi cerebrali per un TR=3") porterebbe ad una stima per eccesso dei gradi di libert effettivamente presenti nei dati e ad una sovrastima della significativit delle "attivazioni" cosi' osservate. Esistono equazioni che permetto la corretta stima dei gradi di libert presenti nei dati, saputo il TR impiegato e il disegno sperimentale adottato [21]. La significativit di un'area attivata pu e deve essere sottoposta al vaglio di una correzione per confronti multipli che tenga conto del numero di pixels su cui si sono

14 eseguiti confronti statistici. Esistono metodi per operare tali correzioni pur rimanendo a livelli di significativit osservabili nella pratica sperimentale [25]. Va inoltre detto che possibile aumentare il rapporto segnale/rumore con l'analisi statistica se, con opportune equazioni, si compensa per quelle componenti del segnale RMF dovute al ciclo cardiaco e respiratorio [21] e se si eliminano quelle fluttuazioni nei conteggi legate a fluttuazioni globali del segnale. Un particolare problema quello delle analisi di gruppo che combinino i dati di pi soggetti studiati durante le stesse condizioni sperimentali. Presupposto per una efficiente analisi di gruppo la trasformazione dei dati di ogni individuo ad uno spazio anatomico comune in modo tale che un pixel con certe coordinate cada nella stessa regione anatomica in tutti i soggetti. Lo spazio anatomico convenzionale impiegato invariabilmente quello stereotassico di Talairach e Tournoux (1988) cui si possono trasformare i dati RMF con l'uso di appositi algoritmi [24]. Per un esempio di analisi di gruppo di dati RMF, si veda Paulesu et al. (1997) [45].

15 H. Applicazioni di ricerca e cliniche. Dal 1991 ad oggi l'avvento delle tecniche di RMF ha generato una vera esplosione nella ricerca sulle funzioni cerebrali con metodi di imaging. I primi esperimenti sono stati principalmente rivolti a dimostrare l'affidabilit della metodica, a studiarne i meccanismi di base e a valutare come il segnale BOLD si correli con il flusso cerebrale misurato con PET [43, 55]. Sempre nei primi anni '90 si assistito alla esecuzione di esperimenti RMF che erano sostanzialmente repliche di precedenti esperimenti PET. L'immaturit dei primi mezzi di analisi ha anche contribuito a pubblicazioni su riviste di massimo prestigio che non hanno retto al confronto con immediati tentativi di replica [8, 16, 26, 58, 60]. Pi recentemente per stiamo assistendo alla pubblicazione di esperimenti RMF veramente originali. Tra essi vanno ricordati gli esperimenti del gruppo di Roger Tootell sul sistema visivo [4, 33, 64] o gli esperimenti sequenziali sulla plasticit delle aree motorie legate all' apprendimento di abilit procedurali [29]. Interessanti pure gli studi delle rappresentazioni del linguaggio in soggetti bilingui [14, 30]. L' approccio event related RMF sembra estremamente originale in quanto consente di descrivere l'attivit cerebrale associata ad una collezione di eventi singoli anche dispersi nel tempo [36].

******************* inserire figura 4 approssimativamente qui *******************

Dobbiamo quindi ragionevolmente aspettarci un sempre maggiore uso della RMF a scopi di ricerca neurofisiologica in protocolli di attivazione. Una questione diversa e se la RMF possa soppiantare la PET a tale scopo. E' probabile che ci non sia possibile per una serie di motivi, legati ad alcuni limiti della RMF. La metodica, pur ricchisima di possibilit, non permette una completa interazione con il soggetto sperimentale, il quale deve ben badare a non muoversi neanche di pochi millimetri (durante un esperimento PET un soggetto pu essere riposizionato nell'intervallo tra una misura di flusso e l'altra). Durante RMF non possibile eseguire studi che implichino il linguaggio parlato perche movimenti della lingua e della mandibola possono indurre notevoli artefatti nei dati. Da ultimo, la RMF sostanzialmente incapace di campionare l'attivit cerebrale di alcune

16 importanti regioni quali il polo frontale ventrale e il giro temporale inferiore per via degli artefatti da inomogeneit. La PET ha i noti limiti legati ad una certa invasivit da radioesposizione che limita il numero di esami eseguibili nello stesso soggetto normale, alla limitata risoluzione temporale e spaziale. Viceversa con la PET possibile visualizzare ogni area cerebrale senza artefatti ed avere protocolli sperimentali che implichino complesse interazioni del soggetto sperimentale con l'ambiente e l'esaminatore [6]. D' altro canto la maggiore semplicit logistica legata alla tecnica RMF fa s che questa possa contribuire a rendere le tecniche di attivazione di una qualche utilit clinica. La pi ovvia delle applicazioni cliniche cui la RMF potrebbe venire incontro la valutazione prechirurgica della localizzazione delle aree del linguaggio in pazienti con epilessia parziale farmaco-resistente. Sono stati ad oggi pubblicati alcuni lavori finalizzati a dimostrare la potenziale utilit della RMF in tal senso. I dati di questi esperimenti sembrano incoraggianti [5]. La figura 4 riporta proprio un esperimento da noi sviluppato con tale finalit. Nella figura e' riportato il pattern di attivazione associato ad un compito di fluenza verbale silente. La cospicua lateralizzazione del segnale a sinistra nel lobo frontale di questo gruppo di 4 soggetti destimane evidente. Un'altra applicazione clinica "futuribile" della RMF potrebbe essere nello studio dellle crisi epilettiche parziali [9, 28]. E' noto dai tempi di Penfield [47] che una crisi epilettica si accompagna a fenomeni tissutali, in forma estrema, simili a quelli della attivazione fisiologica con ridotta utilizzazione dell'ossigeno regionale e con evidente BOLD effect regionale. E' concepibile quindi che la RMF possa essere usata per identificare la distribuzione delle aree coinvolte da crisi epilettica parziale, a condizione che le crisi non si associno a movimento del soggetto.

17 Legende per le figure. Figura 1 Effetto BOLD: durante periodo di attivazione il contenuto relativo di deoxyHb nell'area attivata diminuisce. Figura 2 Effetto BOLD: schema del processo che genera il segnale RMF. Figura 3. Cross-validazione PET/RMF: mappe di attivazione RMF (sopra) e PET (sotto) relative ad un unico soggetto che esegue un compito di working memory verbale (tenere a mente una serie di lettere). Le aree attivate in entrambe la metodica si localizzavano nella regione di Broca (giro frontale inferiore sinistro) e alle giunzioni temporo-parietali di entrambi i lati [43]. Figura 4. Aree di attivazione RMF associate a produzione interna di parole. Le aree attivate (in giallo) sono state sovrapposte ad una immagine media T2 in sagittale (emisfero di sinistra, a sinistra) e coronale. La parte inferiore della figura mostra il decorso temporale del segnale RMF nell'area di Broca nei 4 soggetti studiati. Il paradigma prevedeva l'alternanza di cicli di 10 misure a riposo e 10 misure durante il compito di fleunza verbale, per un totale di 120 misure per soggetto.

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