UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA/ SETOR FISIOLOGIA VEGETAL LABORATRIO DE BIOQUMICA E METABOLISMO DE PLANTAS

ANLISE DE MINERAIS EM TECIDOS VEGETAIS

Luiz Edson Mota de Oliveira

LAVRAS - MG 2003

SUMRIO 1. INTRODUO.........................................................................................................................1 2. PREPARAO DO MATERIAL VEGETAL.........................................................................1 3. OBTENO DOS EXTRATOS...............................................................................................2 3.1. Digesto sulfrica ..............................................................................................................2 3.2. Digesto Nitroperclrica....................................................................................................2 4. DETERMINAO DO TEOR DE NITROGNIO TOTAL (MTODO KJELDAHL) 3 4.1. Destilao ..........................................................................................................................3 4.2. Titulao ............................................................................................................................3 5. DETERMINAO DO TEOR DE ALUMNIO (MTODO DA ALUMINONA) ................4 5.1. Obteno da curva padro .................................................................................................4 5.2. Obteno do extrato para anlise.......................................................................................4 6. DETERMINAO DO TEOR DE FSFORO (P) EM TECIDOS VEGETAIS ....................5 6.1. Preparo da curva padro ....................................................................................................5 6.2. Obteno do extrato para anlise.......................................................................................5 7. DETERMINAO DO TEOR DE NITRATO (NO3-) ...........................................................6 7.1. Obteno da curva padro .................................................................................................6 7.2. Obteno do extrato para anlise.......................................................................................7 8. DETERMINAO DO TEOR DE BORO (B) EM TECIDOS VEGETAIS...........................7 8.1. Obteno da curva padro .................................................................................................7 8.2. Obteno do extrato para anlise.......................................................................................8

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INTRODUO Os elementos minerais podem ser classificados por: a. essenciais: so aqueles sem os quais a planta no sobrevive ou no completa seu ciclo. Fazem parte de algum composto da planta ou possuem funo osmtica; b. teis: no so essenciais, mas, a sua presena, contribui para o crescimento ou para a resistncia a condies desfavorveis do meio; c. txicos: quando so prejudiciais planta e no se enquadram nas classes anteriores. Os elementos minerais so divididos em dois grupos: macronutrientes (N, P, K, Ca,

Mg, S) e micronutrientes (B, Cu, Fe Mn, Mo e Zn) cujas concentraes so encontradas em uma escala de 1: 1000 vezes, respectivamente, podendo variar em funo do rgo analisado ou de parte dele, da poca da coleta onde inclui-se a condio climtica, estdio de desenvolvimento entre outros fatores. A anlise qumica de tecidos vegetais indica a presena de praticamente toda a tabela peridica, fato sabido desde o incio do sculo XX. Nos mtodos de anlise mineral as amostras, geralmente foliares, passam por um processo de preparao na qual so lavadas, secas e homogeneizadas. Em seguida so submetidas digesto cida (sulfrica ou nitroperclrica) pela qual a matria orgnica destruda para liberao dos minerais nela contida. Em qualquer desses casos, obtm-se extratos que sero utilizados nas anlises especficas para os nutrientes. No Brasil, os teores dos minerais, so expressos em porcentagem (%) ou g.Kg-1 para os macronutrientes e, em parte por milho (ppm) ou mg.Kg-1 para os micronutrientes.

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PREPARAO DO MATERIAL VEGETAL Procedimento: 1. Lavagem: selecionar o material necessrio e fazer uma lavagem criteriosa, agitando por alguns minutos em gua destilada, sendo colocadas em papel absorvente para secagem; 2. Secagem: utilizao de sacos de papel, em estufa de circulao a 65 a 70C at peso constante;
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3. Moagem: deve ser conduzida em material de ao inoxidvel para evitar contaminao da amostra, principalmente com ferro, zinco e cobre: 4. Armazenamento: em frascos de vidro, com tampa de plstico, devidamente identificados;

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OBTENO DOS EXTRATOS

3.1. Digesto sulfrica Os extratos obtidos por meio desta metodologia so utilizados para a determinao do teor de nitrognio total. Metodologia Pesar 0,1 g da amostra e transferir para tubo de digesto; Adicionar 1,5 g de Sulfato de Potssio (K2SO4) e 0,3 g de Sulfato de Cobre (CuSO4); Adicionar 3,0 mL de cido sulfrico (H2SO4) concentrado; Colocar a mistura em bloco digestor a 50C, aumentando a temperatura lentamente at 370C; Deixar a misturar no bloco digestor at soluo apresentar cor verde-clara; Depois de resfriada, adicionar 30 mL de gua destilada, agitando at dissolver o resduo e proceder determinao do nitrognio total. 3.2. Digesto Nitroperclrica Os extratos obtidos por meio desta metodologia so utilizados para a determinao dos teores de Al, P, S, Mg, Ca, K, Cu, Zn, Fe e Mn. Metodologia Pesar 0,5 g da amostra previamente preparada e transferi-la para tubos de digesto. Acrescentar 10 mL de cido ntrico (HNO3) concentrado, misturar bem e deixar em repouso por duas horas; Colocar os tubos no bloco digestor e elevar a temperatura at 150C;
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Retirar os tubos do bloco aps a evaporao da maior parte do cido e do clareamento da soluo e, acrescentar 1 mL de cido perclrico (HClO4); Colocar novamente os tubos no bloco digestor e elevar temperatura at 210C. A digesto estar finalizada quando a soluo se tornar incolor, aparecendo uma fumaa branca e densa do cido perclrico. Ento, resfriar e adicionar amostra 10 mL de gua destilada, agitando o tubo para lavagem da parede interna. Proceder determinao dos minerais.

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DETERMINAO DO TEOR DE NITROGNIO TOTAL (MTODO KJELDAHL)

4.1. Destilao Em um erlenmeyer de 50 mL, adicionar 10 mL de soluo cido brico-indicador (verde de Bromocresol + vermelho de metila) e coloc-lo na sada do destilador; Soluo H3BO3-indicador : pesar 1 g de H3BO3, adicionar 0,5 mL de soluo indicadora (verde de Bromocresol + vermelho de metila) e completar o volume para 50 mL com gua destilada. Soluo indicadora (verde de bromocresol + vermelho de metila): adicionar 0,015 g de verde de Bromocresol e 0,006 g de vermelho de metila e completar o volume para 10 mL com gua destilada. Na entrada do destilador, encaixar o tubo de digesto, obtido da digesto sulfrica, e adicionar lentamente 10 mL de NaOH 13N; Elevar a temperatura do destilador ao mximo at iniciar ebulio, reduzindo posteriormente at que o volume do destilado alcance cerca de 25 mL. 4.2. Titulao Titular o destilado contra HCl 0,07143N at mudana de cor; Anotar o volume gasto de cido que ser igual porcentagem de N na amostra.

% protenas totais = % N x 6,25

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DETERMINAO DO TEOR DE ALUMNIO (MTODO DA ALUMINONA)

5.1. Obteno da curva padro Reagentes Tampo acetato de aluminona pH 4,6: adicionar 120 mL de cido actico glacial 37 g de NaOH e 0,35 g de aluminona. Completar o volume para 1 L com gua destilada e corrigir o pH para 4,6. Soluo padro contendo 250 ppm de Al3+; Soluo de HCl 0,3N

Metodologia Proceder conforme Tabela 1. Aps, agitar os tubos em vrtex e lev-los ao banhomaria a 80 C durante 30 minutos. Resfriar a temperatura ambiente e adicionar 1 mL do tampo acetato de aluminona. Deixar em repouso por 30 minutos e ler em espectrofotmetro em = 525 nm. Tabela 1. Alquotas de reagentes requeridos para o meio reacional.
Tubos 01 02 03 04 05 06 07 08
* Volume reacional = 4 mL.

Sol. Padro de Al3+ (mL) 0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,8 2,4 3,0

gua destilada (mL) 3 2,7 2,4 2,1 1,8 1,2 0,6 0

HCl 0,3 N (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1

ppm de Al3+ 0 3 6 9 12 18 24 30

5.2. Obteno do extrato para anlise A determinao do alumnio feita utilizando-se o extrato obtido da digesto nitroperclrica.
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DETERMINAO DO TEOR DE FSFORO (P) EM TECIDOS VEGETAIS

6.1. Preparo da curva padro Reagentes Soluo aquosa de Molibdato de Amnio 5% (p/v) (Reagente A); Soluo de Vanadato de Amnio 0,25% (p/v): dissolver 2,5 g do sal em 500 mL de gua fervente, esperar esfriar e adicionar 350 mL HNO3. Esfriar e diluir para 1000 mL (Reagente B). Reagente Misto: misturar iguais volumes dos reagentes A e B. Essa mistura deve ser preparada diariamente. Soluo estoque primria de P (80 ppm): 0,3509g de KH2PO4 em 300 mL gua. Adicionar 10 mL de cido sulfrico 10 N. Esfriar e diluir para 1000 mL. Soluo estoque secundria de P:
Soluo Primria de P (mL) 0 3 6 9 15 21 27 30 H2SO4 conc (mL) 1 1 1 1 1 1 1 1 Soluo secundria de P (ppm) 0 2,4 4,8 7,2 12,0 16,8 21,6 24,0

Metodologia Aps proceder conforme Tabela 2, deixar em repouso durante 5 minutos e fazer a leitura no espectrofotmetro em = 420 nm. 6.2. Obteno do extrato para anlise A determinao do fsforo feita utilizando-se o extrato obtido da digesto nitroperclrica.

Tabela 2: Alquotas de reagentes requeridos para o meio reacional.

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 * Volume reacional: 14 mL Sol. Secundria de P (mL) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Reagente Misto (mL) 4 4 4 4 4 4 4 4 gua (mL) 10 9,9 9,9 9,9 9,9 9,9 9,9 9,9 ppm de P 0 0,017 0,034 0,051 0,086 0,119 0,154 0,171

A determinao do fsforo feita utilizando-se 1 mL do extrato obtido da digesto nitroperclrica. DETERMINAO DO TEOR DE NITRATO (NO3-)

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7.1. Obteno da curva padro Reagentes cido saliclico (5% em H2SO4 conc.); NaOH 2N; Solues diludas de KNO3

Metodologia Conforme Tabela 3, pipetar 0,1 mL das solues diludas de KNO3. Adicionar 0,4 mL de cido saliclico (5% em H2SO4 conc.) e deixar em repouso por 20 minutos a temperatura ambiente. Aps, adicionar vagarosamente 9,5 mL de NaOH 2 N, elevando o pH acima de 12. Resfriar as amostras temperatura ambiente, e fazer leitura em espectrofotmetro em = 450 nm.

Tabela 3: Alquotas de reagentes requeridos para o meio reacional.

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 N-NO3 (ppm) 0 5 50 100 150 200 250 300 N-NO3 (mL) 0,0 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Ac. Saliclico (5% em H2SO4) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 NaOH 2N (mL) 9,5 9,5 9,5 9,5 9,5 9,5 9,5 9,5 g NO3-/0,2 mL 0 1 10 20 30 40 50 60

* Volume reacional: 9,9 mL

7.2. Obteno do extrato para anlise Incubar a 45C por 1 hora, 100 mg do tecido vegetal, previamente seco, e 10 mL de gua. Aps, centrifugar a 5.000 rpm por 15 minutos e coletar o sobrenadante para anlise. 8. 8.1. DETERMINAO DO TEOR DE BORO (B) EM TECIDOS VEGETAIS Obteno da curva padro Reagentes gua destilada isenta de boro; lcool etlico 95% (mnimo); Soluo oxlico-curcumina: dissolver 40 mg de curcumina e 5 g de cido oxlico em 100 mL de lcool etlico. Filtrar se turvar e manter em geladeira at uso; Soluo padro de boro (5 ppm): dissolver 0,572 g de cido brico (H3BO3) em gua e completar para 1000 mL. Dessa soluo, pipetar 25 mL e completar para 500 mL com gua. Metodologia Proceder conforme Tabela 4 e fazer a leitura no espectrofotmetro em = 540 nm.

Tabela 4: Alquotas de reagentes requeridos para o meio reacional.

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 Sol. Padro de B (mL) 0,0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 gua (mL) 1,0 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Sol. ac. oxlico-curcumina (mL) 4 4 4 4 4 4 4 ppm de Boro 0 0,5 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0

* Volume reacional = 4,1 mL.

8.2. Obteno do extrato para anlise Os extratos so obtidos por incinerao da amostra. Pesar 0,25 g da amostra e transferir para cadinhos de porcelana de 30 mL; Incinerar em mufla a 550C at obter cinza branca; Dissolver a cinza em 10 mL de HCl 0,1N e homogeneizar; Pipetar 1 mL dessa soluo para um tubo de ensaio e adicionar 4 mL da soluo de cido oxlico- curcumina; Evaporar em banho-maria at secagem completa a 55C; Deixar esfriar e adicionar 25 mL de lcool etlico, agitando at ressuspender todo material; Se necessrio, filtrar ou centrifugar para obter soluo lmpida.

Para quantificao, tomar uma alquota de, no mximo, 1 mL e proceder como na curva padro.