PRCTICA # 9 VIABILIDAD CELULAR

OBJETIVO Determinar de acuerdo a la toxicologa gentica los efectos de agentes txicos como el mezcal sobre la salud de una persona y cuales son los daos celulares que estos causan. INTRODUCCIN La toxicologa es la ciencia que estudia el origen, naturaleza y propiedades de los txicos, su comportamiento cintico y sus efectos sobre los organismos vivos, las manifestaciones clnicas de la intoxicacin la deteccin y cuantificacin del agente txico, los procedimientos adecuados de prevencin y tratamiento y las implicaciones mdico-legal. Gentica: Ciencia que estudia los genes, la herencia, y la variacin de los organismos Toxicologa Gentica Es el estudio de la forma en que agentes qumicos o fsicos afectan al complejo proceso de la herencia. Las sustancias qumicas genotxicas son compuestos capaces de modificar el material hereditario de las clulas vivas Implementacin de mtodos para evaluar el riesgo de los agentes genotxicos presentes en el ambiente y cuya interaccin con el material gentico puede alterar la integridad del genoma humano. La aplicacin de estas metodologas para la deteccin y el conocimiento de los mecanismos de actuacin de los carcingenos. La probabilidad de que una determinada sustancia cause un dao gentico depende: Nivel de exposicin del organismo a la sustancia Distribucin y retencin en el organismo El metabolismo del organismo La detoxificacin en los tejidos Diana Reactividad de la sustancia o de sus metabolitos con macromolculas crticas de la clula. La probabilidad de que el dao gentico produzca enfermedad depende: La naturaleza del dao La capacidad que posee la clula de reparar o amplificar el dao gentico La oportunidad de expresar cualquier alteracin La capacidad del cuerpo de reconocer y suprimir la multiplicacin de clulas aberrantes. Mutaciones inducidas

Qumicos: (alquilantes, intercalantes, hidrocarburos Policclicos, aminas aromticas)

Sustancias txicas con habilidad de difundir su efecto sobre la salud

Efectos adversos Mutacin: Cuando se insertan nucletidos o se pierden nucletidos durante la sntesis del DNA. Cambio en la secuencia de nucletidos, que afecta al fenotipo

Carcinognesis: Es la formacin de cncer, para que una clula normal cambie su fenotipo y se convierta en una clula neoplsica, se requieren varias mutaciones en varios genes y eso ocurre a travs de mucho tiempo, a veces de aos, de estar expuesto a un agente carcinognico. Teratognesis:

Proviene del griego "Teratos", que significa monstruo. Desarrollo de malformaciones o defectos fsicos en el embrin. Pueden estar causados por agentes fsicos (radiaciones), qumicos (talidomida), y vricos (rubola). Mezcal El mezcal es una bebida alcohlica tradicional de Mxico, que se elabora de manera similar al tequila. El proceso comienza con la cosecha del agave despus de 8 aos de cultivo, en esta etapa las plantas son cortadas de su base y la mayor parte de sus hojas son retiradas, obtenindose las pias de agave, las cuales son cocidas en hornos o autoclaves. En esta etapa, los polisacridos, principalmente los de reserva (fructanos), son hidrolizados trmicamente para obtener un jarabe rico en fructosa que, posteriormente se somete a fermentacin alcohlica con levaduras nativas o cepas seleccionadas, finalmente el mosto con un contenido de etanol de 3-6 % v/v aproximadamente se destila para obtener el mezcal blanco o joven En la literatura existe escasa informacin referente a la composicin del mezcal, la mayora de los reportes estn relacionados con tequila y otras bebidas alcohlicas. Benn y Peppard (1996) analizaron mediante cromatografa de gases y expectrofotometra de masas (GC-MS) un extracto orgnico obtenido por extraccin lquido-lquido con diclorometano de un tequila comercial, en donde identificaron ms de 175 componentes que clasificaron por su naturaleza qumica en: acetales, cidos, alcoholes, aldehdos, steres, furanos, fenoles, pirazinas, compuestos sulfurados, terpenos, entre otros; siendo los ms abundantes los alcoholes, steres y cidos, en una variedad amplia de constituyentes en cada familia. Tambin determinaron los principales agentes odorantes del tequila analizado: isovalerialdehdo, alcohol isoamlico, b-damascenona y vainillina. Lpez y Dufour (1001) estudiaron la composicin de orgnicos voltiles en tequilas blancos, reposados y aejos as como la identi icacin de los principales descriptores de aromas. Lpez y col. (2003) hicieron un seguimiento de los compuestos voltiles generados durante el cocimiento de Agave tequilana, encontrando prcticamente los mismos grupos de compuestos

mencionados antes, pero con un menor nmero de constituyentes, tambin reportan componentes con poder odorfico como b-damascenona, vainillina y linalool; en sus resultados se destaca la presencia elevada de 5-hidroximetil furfural, que es un compuesto originado a partir dela degradacin de fructosa. Pea-Alvarez y col. (2004) estudiaron la presencia de cidos grasos y terpenos en tres variedades de agave: A. angustifolia, A. salmiana y A. tequilana, encontrando 32 terpenos en A. tequilana y solamente 11 de stos en las otras dos especies utilizadas para la elaboracin de mezcal: en cambio en cidos grasos A. salmiana es ms rico. En general, el tequila y A. tequilana han sido objeto de muchos estudios en diversos aspectos: autenticidad, gentica, composicin y cultivo, debido a su importancia econmica y comercial

INTOXICACION POR ALCOHOL METILICO El alcohol metlico (CH3OH), o alcohol de madera se encuentra en el alcohol slido y es usado como anticongelante para remover pinturas y como solvente de lacas y barnices, se obtiene por destilacin de madera o por hidrogenacin de monxido de carbono. La intoxicacin aguda se presenta principalmente por adulteracin de licores. En muchos pases el metanol se comercia libremente. FISIOPATOGENIA La dosis letal de metanol por va oral vara entre los 60 y 200 ml. La toxicidad obedece al metabolismo del alcohol metlico que se convierte en cido frmico y formaldehido, con la propiedad de precipitar las protenas de las vas nerviosas causando dao irreparable. Es conocido el efecto lesivo especfico que tiene esta sustancia sobre las clulas ganglionares de la retina y el nervio ptico, generando ceguera total, muchas veces de carcter irreversible. El cido frmico produce acidosis metablica severa. Su biotransformacin se realiza principalmente en el hgado y su eliminacin como cido frmico por va urinaria. En menor porcentaje se elimina por utiliza la va entero-heptica. La administracin de alcohol etlico disminuye la toxicidad del metanol, al bloquear el metabolismo de ste en formaldehido y cido frmico, permitiendo a los riones excretar el metanol inalterado. CUADRO CLINICO

Las principales manifestaciones son los transtornos visuales y la acidosis. El cuadro se inicia con alteraciones neurolgicas de gravedad variable, como agitacin, ebriedad, y coma, cefalea global de predominio frontal, nuseas, vmito y visin borrosa. Los sntomas progresan rpidamente, con respiracin rpida y superficial como consecuencia de la acidosis. Tambin aparecen cianosis, coma, hipotensin y dilatacin pupilar. Aproximadamente 25% de las personas con intoxicacin grave fallecen por insuficiencia respiratoria. DIAGNSTICO Los criterios para el diagnstico son: a. Antecedente de ingesta de alcohol b. Visin borrosa c. Respiracin rpida y superficial (acidosis) d. Nivel de metanol en sangre. Cifras superiores a 20 mg/100 ml son indicativos de intoxicacin severa y requieren tratamiento con etanol. Niveles superiores a 50 mg/100 ml son indicacin para la hemodilisis. e. Gases arteriales; el pH y la concentracin sangunea de bicarbonato delimitan la gravedad del cuadro. f. Presencia de formaldehido o cido frmico en la orina TRATAMIENTO 1. Lavado gstrico con carbn activado en las primeras 4 horas despus de la ingestin 2. Lquidos parenterales 3. Vendaje ocular precoz 4. Manejo de la acidosis mediante la administracin de bicarbonato de acuerdo con los gases arteriales 5. Administracin parenteral de etanol (1 mg/kg). Se utiliza la infusin endovenosa de etanol absoluto diludo en dextrosa al 5% en AD, para pasar en 15 minutos, continuando con una dosis de 125 mg/kg/hora para mantener concentraciones sanguneas de etanol de 100-200 mg/dl, las cuales causan ebriedad; este tratamiento se debe mantener por 72 horas. El etanol se presenta en ampollas de 2 ml y 5 ml al 97%; 1 ml de etanol contiene 790 mg de alcohol. Cuando no se cuente con el etanol para va parenteral, el tratamiento se hace por va oral, con: 1. Aguardiente (100 ml tienen 30-35 ml de etanol puro), ron o 2. Wisky 40-45% de etanol en volumen, o 3. Vodka 40-45% de etanol en volumen La hemodilisis se utiliza cuando los sntomas progresan a pesar del alcohol etlico, o bien si la concentracin de metanol en la sangre es igual o superior a 50 mg/100 ml MATERIAL sistema vacutainer torundas torniquete multiplaca de cultivo 6 tubos eppendorf gradilla EQUIPO centrifuga microscopio ptico cmara de Neubauer

micropipeta 100 l

REACTIVOS Azul de Teypan Mezcal MATERIAL BIOLOGICO Sangre perifrica

PROCEDIMIENTO Estrategia Metodolgica 1. 2. Seleccionar un compuesto con potencial genotxico Hacer un cultivo de linfocitos humanos de sangre perifrica Administrar las dosis del compuesto elegido (mezcal) o Volumen total en cada pozo es de 3 ml o El 1 pozo contiene solo la muestra sin tratamiento o 2 pozo con 100 ml de dosis y cada pozo fue aumenta la dosis de 100 en 100 ml Homogenizar cada pozo del cultivo celular (con micropipeta) 0.04% Hacer una dilucin 1:1 de suspensin celular / azul de Teypan (50l / 50ml) Llenar por capilaridad la cmara de Neubauer con la solucin (25 l de cada lado)

3.

4. 5. 6. 7.

Realizar el conteo en 4 cuadros de los 4 cuadrantes (16 cuadros). Diferenciando clulas redondas brillantes (vivas) de las teidas (muertas) 8. Graficar resultados (Dosis / # de clulas vivas) 9. Obtener el porcentaje de viabilidad celular con y sin tratamiento 10. Obtener el ndice mittico 11. Observar cambios en la morfologa celular RESULTADOS

S/T (1)

100 ml (2)

200 ml (3)

300 ml (4)

400 ml (5)

500 ml (6)

Concentraciones del toxico (mezcal)

Preparacin de la muestra

Tubos preparados

Deposito de la muestra en la Cmara de Neubauer

Observaciones al miscroscopio de la Cmara de Neubauer, en la cual se pueden diferenciar cada una de las clulas Diferenciacin de clulas vivas y muertas (las clulas totales se multiplican por el factor: # de clulas * 2 * 10000 = # de clulas / ml) Muestra 1 Cuadrante Clulas vivas Azul Teypan Clulas muertas Azul Teypan + Muestra 3 Cuadrante Clulas vivas Azul Teypan Clulas muertas Azul Teypan + Muestra 5 Cuadrante Clulas vivas Azul Teypan Clulas muertas Azul Teypan + 1 39 0 2 41 0 3 31 0 4 50 0 Total (clulas / ml) 3 220 000 0

1 5 1

2 10 1

3 8 0

4 6 10

Total (clulas / ml) 580 000 240 000

Muestra 2 Cuadrante Clulas vivas Azul Teypan Clulas muertas Azul Teypan + Muestra 4 Cuadrante Clulas vivas Azul Teypan Clulas muertas Azul Teypan +

1 39 0

2 12 0

3 24 0

4 33 2

Total (clulas / ml) 2 160 000 40 000

1 2 0

2 4 0

3 4 4

4 9 0

Total (clulas / ml) 380 000 80 000

1 4 0

2 2 0

3 8 0

4 1 0

Total (clulas / ml) 300 000 0

Dosis / # clulas Muestra Dosis (ml) 1 0

# clulas vivas 3 220 000

Muestra 6 Cuadrante Clulas vivas Azul Teypan Clulas muertas Azul Teypan +

1 9 0

2 5 1

3 5 0

4 1 0

Total (clulas / ml) 400 000 20 000

2 3 4 5 6

100 200 300 400 500

2 160 000 580 000 380 000 300 000 400 000

Dosis / # clulas vivas

4000000 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0 100 200 Dosis 300 400 500

DISCUSIN DE RESULTADOS En la realizacin de esta practica se comprueba el dao celular por algn toxico comn o comercial en nuestro caso se manejo el Mezcal este es un producto de la fermentacin del corazn del agave o maguey, como se le llama a esta planta en Mxico. El mezcal es un destilado de la planta agave, perteneciente a la familia amaryllis, de la cual slo se utilizan unas cuantas variedades de las 136 que existen en Mxico. El consumidor debe tener mucha precaucin, porque el mezcal con proceso de destilacin inadecuado puede originar grandes riesgos en la salud del consumidor y llevarlo hasta la muerte, por su alto grado de Metanol. Y este es el toxico principal que daa a las clulas, ya que como sabemos el parmetro ms importante es el metanol, porque los niveles altos de metanol son demasiado txicos. El alcohol en s es txico, pero el mezcal como es una bebida espirituosa debe tener 300 miligramos por decilitro de alcohol anidro s es daino para la salud; el hgado no lo puede asimilar y se intoxica, y cuando hay una concentracin alta de metanol no lo puede eliminar quien lo ingiere y los daos pueden ir desde una ceguera hasta la muerte en altas dosis. Ya que a mayor concentracin de este toxico hay una mayor destruccin de clulas debido a la saturacin del sistema ADH-NADH. La muerte celular llevada a cabo por este toxico es por la deshidratacin en la membrana celular que este produce en ellas llegando as a su destruccin (muerte). Esto se comprob al observar la grafica realizada comparando la dosis con el nmero de clulas vivas observadas en la cmara de Neubauer. Para la realizacin de esta prctica no se pudo realizar la extraccin del DNA y realizar ensayo cometa, amplificar el gen P53 por PCR ni la realizacin del cariotipo ya que no se cont con el tiempo suficiente para llevarla a cabo. CONCLUSIONES Se llega a la conclusin de que a mayor dosis (concentracin) del toxico mayor es el dao celular que se produce, es por esto que todos los txicos son dainos sin embargo nosotros podemos disminuir este dao consumiendo dosis bajas en este caso de Mezcal. Y se debe tomar en cuenta que una vez llevada a cabo una intoxicacin de este tipo se debe de esperar a que el alcohol se elimine completamente del organismo por degradacin en el hgado. Si es un caso muy grave se debe de realizar dilisis. En esta practica los diferentes equipos utilizaron diferentes txicos pero en todos se aplica la misma conclusin de que entre mas alta sea la dosis mas muerte celular se observa.

# Clulas

En nuestro caso no hubo mucha muerte celular como en otros casos (por ejemplo: marihuana), en los que la muerte celular fue muy elevada. REFERENCIAS 1.

2. 3. 4. 5. 6. 7.

http://www.alfa-ditores.com/web/index.php?option=com_content&task=view&id=1290&Itemid=66 (Aguilar-Cisneros, B.O., Lpez, M.G., Richling, E., Heckel, F., y Schreier, P. (2002). Tequila authenticity assessment by headspace SPME-HRGC-IRMS analysis of 13C/12C and 18 O /16 O ratios of ethanol. Journal of Agric. and Food Chemistry 50, 7520-7523. Cedeo, M.C. (1995). Tequila production. Critical Reviews in Biotechnology 15, 1-11. Gil-Vega, K., Daz., C., Nava-Cedillo, A. y Simpson, j. (2006). AFLP analysis of Agave tequilana varieties. Plant Science 170, 4, 904-909. Gobeille, A., Yavitt, J., Stalcup, P. y Valenzuela, A. (2006). Effects of soil management practices on soil fertility measurements on Agave tequilana plantations in Western Central Mexico. Soil and Tillage Research 87, 1, 80-88. http://www.drogas.bioetica.org/drohol.htm http://books.google.com.mx/books?id=k1YTQn23InYC&pg=PA62&lpg=PA62&dq=da %C3%B1o+celular+por+metanol&source=web&ots=nl7fH4VcU&sig=uJeNOkD1EdT1jzt9dG3DgJrXGNE&hl= es&sa=X&oi=book_result&resnum=1&ct=result