EXAMEN PARASITOLGICO EN DIFERENTES MUESTRAS

Autor Servicio Dr. Fidel Espinosa Rivero Microbiologa

CONTENIDO
En muestras de heces fecales En muestras de lquidos patolgicos Investigacin de Enterobius vermicularis (GRAHAM) Investigacin de Criptosporidium Investigacin de malaria (gota gruesa) Investigacin de Equistosomiasis mansoni, japonicum e intercalatum Investigacin de Esquistosomiosis hematobium Bsqueda de microfilarias en sangre venosa Investigacin de sangre oculta en heces fecales Investigacin de huevos de fasciola heptica (tcnica de copa cnica) Identificacin de larvas de Strongyloides stercoralis (mtodo Baerman)

EN MUESTRAS DE HECES FECALES

Objetivos Determinar la presencia de quistes y protozoarios, huevos y larvas de helmintos como agentes etiolgicos de enfermedades parasitarias del aparato digestivo, en las muestras estudiadas en nuestro laboratorio. Se le realizar a todas las muestras llegadas al departamento que cumplan con los requisitos correspondientes. Las muestras de heces fecales no deben ser trabajadas con mas de 8 horas de emitidas. Tcnico que trabaja en la seccin y profesional que atiende el cubculo. No procede nada especfico, las mismas generales del laboratorio.

Alcance

Responsabilidades Condiciones de bioseguridad Equipos y materiales

Microscopio ptico Centrfuga Colorantes eosina y lugol Depresores Aplicadores Lminas portaobjetos Cubre-objetos Para el examen directo no procede. Para el mtodo de concentracin por centrifugacin: Al frasco que contiene la muestra de heces fecales se le aade agua de la pila y se homogeniza la muestra con un depresor. Se pasa 10 mL de la mezcla a un tubo cnico de centrfuga a 2 000 rpm durante 15 minutos. Se formarn tres capas: lquida, una semislida y el sedimento que es una capa slida pequea. Decantamos la primera capa con viraje del tubo rpidamente. Decantamos la segunda capa despus de enjuagar las paredes del tubo con el chorro dbil de la pila y con la ayuda de un aplicador, cuidando no arrastrar el sedimento.

Operaciones preliminares

Procedimiento

Mtodos concentracin Su finalidad

es aumentar el nmero de parsitos en el volumen de materia fecal que se examina, mediante procedimientos de sedimentacin o flotacin. Dentro de las tcnicas de sedimentacin utilizamos la tcnica de Ritchie o centrifugacin formol-eter y de las tcnicas de flotacin aplicamos la tcnica de Willis con solucin saturada con cloruro de sodio. Al sedimento descrito se le aaden 2 o 3 gotas de una solucin eosina lugol en igual proporcin y se mezcla con un aplicador. Depositamos 1 gota aproximadamente en un porta objetos con ayuda del aplicador y colocamos encima un cubre-objeto. A la lmina colocada sobre el sobrenadante se le agrega 2 o 3 gotas de solucin eosina-lugol y se cubre con un portaobjetos. Para ambas tcnicas la observacin puede hacerse tambin utilizando soluciones separadas de eosina y lugol, lo que permitir definir mejor las estructuras parasitarias, su motilidad, etc.

Se observar toda la preparacin al microscopio con ocular 10 y objetivo de 10 y de 40.

Clculo e Interpretacin de los resultados

Se informarn la cantidad de huevos o protozoarios por preparacin. Otros mtodos por concentracin pueden ser utilizados como el mtodo de formol-salina de Ritchie, Kato Katz, etc.

Examen directo
Se coloca una gota del colorante (eosina 1 %, lugol) en un portaobjeto, se mezcla una partcula de heces con ayuda de un aplicador. Colocar el cubreobjeto y observar al microcopio Ocular 10 y objetivo 10 para conteo de larvas y huevos de parsitos. Ocular 10 y objetivo 40 para la observacin de protozoarios.

Clculo e Interpretacin de los resultados

Se informarn la cantidad de huevos o de protozoarios por campo especificando la especie.

EN MUESTRAS DE LQUIDOS PATOLGICOS

Objetivo Determinar la presencia Entamoeba histolytica y otras entidades parasitarias que puedan estar presentes en dichas muestras. Las muestras de lquidos patolgicos sern tomadas en las reas destinadas a este proceder y trados al laboratorio lo ms rpidamente posible para su observacin, de no ser posible debe ser refrigerada no ms de 8 horas para su observacin. Tcnico que trabaja en la seccin y profesional que atiende el cubculo. No procede nada especfico, las mismas generales del laboratorio. Centrfuga Lmina portaobjeto Cubreobjeto

Alcance

Responsabilidades Condiciones de bioseguridad Equipos y materiales

Operaciones preliminares

Si se trata de lquido, centrifugar y decantar. Observar el sedimento al microscopio con ocular 10 y objetivo de 10 y 40. Si se trata de pus ver directamente al microscopio, sin coloracin buscando formas negativas de Entamoeba o de los elementos parasitarios solicitados. Se informan los quistes observados y se sugiere diagnstico presuntivo de E. histolytica. No procede. Normas de parasitologa.

Procedimiento

Clculo e Interpretacin de los resultados

Controles Referencia

INVESTIGACIN DE ENTEROBIUS VERMICULARES (GRAHAM)

Objetivo Determinar la presencia de huevos de Enterobius vermicularis en la regin peri anal. La muestra se tomar por la maana antes que el paciente haga su deposicin habitual, no se realiza limpieza de la regin anal. Tcnico que trabaja en la seccin y profesional que atiende el cubculo. No procede Cinta transparente adhesiva Lmina portaobjeto Microscopio ptico Aplicar la cinta adhesiva en las mrgenes del ano o en la regin vulvar, retirar y llevar al microscopio. Puede repetirse 2 o 3 veces en un da. Observar al microscopio el sedimento con ocular 10 x con objetivo 10 x

Alcance

Responsabilidades Condiciones de bioseguridad Equipos y materiales

Operacin preliminar

Procedimiento

Clculo e interpretacin de los resultados Se informar la presencia de huevos caractersticos o parsito adulto en la preparacin.

INVESTIGACIN DE CRIPTOSPORIDIUM
Objetivos Determinar la presencia de quistes o protozoarios de Criptosporidium sp en las muestras de heces fecales estudiadas. Se le realizar este proceder a los casos que se les indique por orientacin clnica y que cumplan los requisitos de toma y conservacin de la muestra. Tcnico y profesional del cubculo. Las descritas para el laboratorio de Microbiologa. Microscpio ptico Lmina portaobjeto Aplicadores Metanol Fucsina bsica Etanol cido sulfrico Verde malaquita Fenol Homogeneizar las heces Hacer una extensin de forma rotatoria con aplicador en uno de los extremos de la lmina. Fijar con metanol y dejar secar totalmente. Poner fucsina solucin de trabajo (anexo 1) durante 1 hora. Lavar con agua corriente.

Alcance

Responsabilidades Condiciones de bioseguridad Equipos y materiales

Operaciones preliminares Procedimiento

Colocar en cido sulfrico 2 % durante 20 seg moviendo constantemente. Lavar con agua corriente y colocar en verde malaquita 3 % durante 5 min. Lavar con agua corriente, secar y mirar con lente de inmersin buscando criptosporidium, los cuales se observarn como estructuras circulares teidos de fresa (quistes). Se informaran los quistes observados como quistes de Criptosporidium sp. Se utilizaran como controles lminas de casos positivos archivadas en el departamento.

Clculo e interpretacin de los resultados

INVESTIGACIN DE MALARIA (GOTA GRUESA)

Objetivo Demostrar la presencia o no de especies de Plasmodium sp en pacientes sintomticos o asintomticos A todos los pacientes a los que se le realice la indicacin y que la muestra recogida cumpla con los requisitos orientados para la misma. Tcnico que trabaja en la seccin y profesional que atiende el cubculo. Las mismas generales del laboratorio. Microscopio ptico Colorantes segn la tcnica del Dr. Walker (OMS) (Anexo) Lminas portaobjetos Se utilizar una lmina limpia, en uno de los extremos de la misma se har una gota rectangular que debe medir aproximadamente 1,5 cm de ancho por 2 cm de largo y se deja secar (ver folleto de toma de muestra). La coloracin debe realizarse lo ms pronto posible, si permanece ms de 7 das sin ser coloreadas no estar apta para el examen. Se sumerge el portaobjetos por el extremo donde se encuentra la gota gruesa en una solucin de fosfato azul de metileno (anexo 2) durante 1 seg.

Alcance

Responsabilidades Condiciones de bioseguridad Equipos y materiales

Operaciones preliminares

Procedimiento (coloracin segn tcnica de Walker)

Djese escurrir la lmina en una esponja o almohadilla hmeda, con el fin de eliminar el exceso de azul de metileno. Enjuagar con agua amortiguadora (anexo 4). Por lo general 2 inmersiones suaves en solucin amortiguadora son suficientes. Colocar la lmina con la gota hacia abajo en el fondo de la cubeta de coloraciones y se deja deslizar solucin acuosa de Giemsa recin preparada (3 gotas de Giemsa comercial por mL de agua amortiguadora) dejar actuar el colorante durante 7 min. Sumrjase brevemente, 2 veces, el portaobjetos en agua amortiguadora. Se deja escurrir y secar. Examinar al microscopio con ocular de 7 y objetivo de inmersin de 100 x. Como mnimo se observarn 100 campos de cada lmina ricos en leucocitos, buscando estructuras parasitarias de plasmodium.

Clculo e Interpretacin de los resultados Si no se observan parsitos se informar negativo; si se observan parsitos se informar segn la densidad parasitaria de la forma siguiente:
1 x campo X XX XXX XXXX

2-20 x campo 21-200 x campo Ms de 200 x campos

Si el nmero de parsitos contados en 100 campos flucta entre 40 y 60 se informar x/2 seguido de la letra inicial de la especie. Cualquier nmero inferior a 40 en 100 campos debe informarse completamente; por ejemplo, se observan 33 en 100 campos: se informa 33 parsitos en 100 campos. Las cruces se acompaan de la primera letra de la especie de Plasmodium; por ejemplo: si es un Vivas: XXX V; Falciparum XX F; Malariae X M.

En caso de P. Falciparum
F (formas anulares) -F + G (formas anulares y gametocitos) FG (gametocitos nicamente) Controles Lminas positivas archivadas en el Departamento.

EQUISTOSOMIASIS MANSONI, JAPONICUM E INTERCALATUM

Objetivos Demostrar la presencia de huevos de especies de S. mansoni, S. japonicum y S. intercalatum Se realizar el estudio a los pacientes a los que se les indic por sospecha clnica o por proceder de reas endmicas y que se cumplan los requisitos sealados para la toma de muestras. Tcnico que trabaja en la seccin y profesional que atiende el cubculo. Las mismas generales del laboratorio. Microscpio Tubos de centrfuga de 10 15 mL (preferiblemente plstico) Centrfuga Colorante lugol Depresores Aplicadores Lminas portaobjetos Cubre-objetos Las mismas que se realizan en el mtodo de concentracin por centrifugacin. En este caso se centrifuga 1500 rpm durante 15 min. El sedimento resultado de la centrifugacin le aadimos lugol dbil, utilizando una cantidad aproximada de uno a dos goteros de acuerdo al espesor del sedimento (mientras ms grueso ms lugol dbil se le aade). Se mezcla bien la suspensin con la ayuda de un aplicador. Se monta una gota de dicha suspensin entre cubreobjeto y portaobjeto. Se observan al microscopio con ocular y objetivo 10 (x 100) toda la lmina. Para la observacin de miracidium se utilizan dos tubos de centrfuga de 15 mL en los cuales se centrifuga 3 min. a 1500 rpm las heces homogenizadas.

Alcance

Responsabilidades Condiciones de Bioseguridad Equipos y materiales

Operaciones preliminares

Procedimientos

Se decanta y al sedimento se le agrega agua destilada hasta 10 mL. Se homogeniza y se coloca en la lmpara por espacio de 30 min. Se centrifuga nuevamente de la misma manera, se observa al microscopio el sedimento, agregndole una gota de lugol. Se cuentan los huevos de Equistosomas y se especifican si estn viables o no y si existen miracidium. Si no se observan en el da se conserva el sedimento con 2 3 gotas de lugol, aadindole Formol 5 %, en el fro o a temperatura ambiente. Despus de conservados, el tiempo de duracin es de una semana aproximadamente. Si se quiere dar el resultado por la cantidad de huevos por heces, la tcnica se realiza a partir de 1 g de heces fecales recipiente de vidrio con 10 mL de agua corriente a partir procedimiento ser el mismo hasta obtener el sedimento al agrega lugol dbil hasta completar 1 mL se mezcla. gramos de pesado en de ah el cual se le

Clculo e interpretacin de los resultados

Con una pipeta Ependorf tomamos 0,1 mL (10 L) observndolo al microscopio entre cubreobjeto y portaobjeto y damos el informe de cantidad de huevos por gramos. Si el resultado es negativo se puede remitir al IPK como centro de referencia. No procede.

Controles

ESQUISTOSOMIOSIS HEMATOBIUM
Objetivos Determinar la presencia de huevos de S. haematobium en muestra de orina en pacientes portadores o asintomticos. Se realizar el examen a los casos por orientacin clnica o por que procedan de reas endmicas y que cumplan con los requisitos para la toma, conservacin y transporte de la muestra. Tcnico que trabaja la seccin y profesional que atiende el cubculo. Las mismas generales del laboratorio.

Alcance

Responsabilidades Condiciones de bioseguridad Equipos y materiales

Microscpio Tubos de centrfuga Centrfuga Lminas portaobjetos Lminas cubreobjetos Las muestras de orina de 24 horas o una muestra dentro del horario 10:00 AM y las 3:00 PM, despus de esfuerzo fsico del paciente. Se dejan reposar en el frasco durante 1 hora. Se decanta y se recoge el sedimento en tubo de centrfuga de 10 mL. Se centrifuga el sedimento a 1 500 rpm durante 3 min y se decanta el sobre nadante. Se agita el sedimento y se procede a colocar 1 gota del mismo en un portaobjetos. Se observa al microscopio entre cubre y portaobjetos con ocular 7 y objetivo de 10 (x70). Se observa toda la lmina y se informa la cantidad de huevos por lmina y si son viables o no y si existe miracidium. Si se observan hemates y no huevos, se realizar la lectura de 3 lminas ms de la misma muestra; informndose entonces el resultado de lo que se encuentre. No procede.

Operaciones preliminares

Procedimiento

Clculo e interpretacin de los resultados

Controles

BSQUEDA DE MICROFILARIAS EN SANGRE VENOSA

Objetivos Determinar la presencia de microfilarias en sangre perifrica. La muestra de sangre ser extrada por medio de puncin venosa, en horario que se corresponda con la sospecha clnica del tipo de filaremia que se sospeche. Tcnico que trabaja la seccin y profesional que atiende el cubculo. Alcance

Responsabilidades

Condiciones de bioseguridad Las mismas generales del laboratorio. Microscopio - centrfuga Tubos de ensayo con tapa preferiblemente de goma Citrato de sodio 3,8 % o heparina Lminas portaobjetos Lminas cubreobjetos Metanol Giemsa comercial Solucin amortiguadora (anexo 4) Se le administra al paciente previamente a la extraccin dietilcarbamacina (dosis 100 mg) oralmente; la extraccin se har pasado una hora de haber administrado el medicamento (despus de 2 h no tiene valor la extraccin). Se recolecta 3 mL de sangre en un tubo de ensayo o frasco con tapa, preferiblemente de goma, que contenga 2 3 gotas de solucin de Citrato de sodio 3,8 %, puede utilizarse tambin heparina, mezclar por inmersin suave. Aadir 10 mL de agua destilada a 2 mL de sangre no coagulada. Centrifugar 5 min a 1500 rpm. Decantar. Se repite el paso anterior dos veces hasta observar que el sobrenadante quede rosado. No deben realizarse lavados en exceso buscando transparencia del sobrenadante ya que corremos el peligro de que se arrastren en ellos los microfilarios. Colocar una gota del sedimento entre cubre y portaobjetos y observar al microscopio con ocular y objetivo 10 para la localizacin de microfilarios (x100) y despus observar con objetivo de inmersin (100) a fin de analizar la presencia o no de vainas. Si los microfilarios son envainados se debe proceder a la identificacin de especie, para lo cual se realizar una coloracin de Giemsa. Se hace un frotis de sangre fresca o del sedimento, al paciente que se le detect microfilarios envainados. Equipos y materiales

Operaciones preliminares

Procedimiento

Se deja secar a temperatura ambiente. Se fija con metanol durante 2 min. Se le aade Giemsa preparada a razn de dos gotas por mL de H2O amortiguadora (anexo 4). Se esperan 10 min. Se lava con solucin amortiguadora (anexo 4) o agua de la pila. Se informa la presencia de microfilarias, con la existencia o no de formas envainadas. El cuadro clnico, el rea endmica y la periodicidad y toma de muestra permitirn realizar el diagnstico.

Clculo e interpretacin de los resultados

INVESTIGACIN DE SANGRE OCULTA EN HECES FECALES

Objetivos Demostrar la presencia o no de sangre oculta en heces fecales, que puede ser un indicador indirecto o no de una enfermedad parasitaria. Se realizar el examen a todos los pacientes a los que se les realiz la indicacin y que cumplan con los requisitos para el procesamiento de esta muestra. La misma no debe exceder las 8 horas de emitida.

Alcance

Los pacientes no deben ingerir carne durante las 24 h previas al examen.

Tcnico que trabaja la seccin y profesional que atiende el cubculo. Las mismas generales del laboratorio. Microscopio Lminas portaobjetos Aplicadores Pipeta de 1 mL Bencidina Agua oxigenada

Responsabilidades Condiciones de bioseguridad Equipos y materiales

Operaciones preliminares: No procede Procedimiento Se coloca 1 dcima de bencidina encima de una lmina portaobjeto. Se le aade una pequea porcin de heces fecales y se realiza un frotis.

Aadir al frotis 2 3 gotas de agua oxigenada y observar a trasluz. Es positivo cuando toma una coloracin azul. Se informa por cruces. En caso de que contemos con kit diagnsticos (Haemaccuet-Test, Smith K, u otros) proceder segn instrucciones y recomendaciones del fabricante. Controlar los reactivos bencidina, agua oxigenada en caso de los kit, verificar controles positivos y negativos.

Clculo e interpretacin de los resultados

Controles

HUEVOS DE FASCIOLA HEPTICA (TCNICA DE COPA CNICA

Objetivos Demostrar la presencia de huevos de Fasciola heptica mediante la aplicacin de esta tcnica. Se procesaran todas las muestras solicitadas por los especialistas que as lo indiquen, sean de heces fecales o de contenido duodenal y que cumplan con las condiciones de recogida, transporte y conservacin de las mismas. Tcnico que trabaja la seccin y profesional que atiende el cubculo. Las mismas generales del laboratorio. Microscopio Depresores Copa de cristal cnica Gasa Lmina portaobjeto Lmina cubreobjeto Diluir aproximadamente 50 g de heces fecales en agua de la pila y filtros en copa cnica y pasar a travs de una gasa las heces diluidas. Estirar la gasa y llenar la copa con agua corriente. Dejar sedimentar.

Alcance

Responsabilidades Condiciones de bioseguridad Equipos y materiales

Operaciones preliminares

Decantar el sobre nadante cada dos horas o ms llenando de nuevo la copa y agitndolo el sedimento hasta que el lquido sobre nadante sea claro y transparente. Cuando el lquido est transparente se desecha el sobrenadante y se observa el sedimento al microscopio con objetivo y ocular 10. En ocasiones se hace necesario repetir el procesamiento de varias muestras, por la intermitencia en la expulsin de huevos por los parsitos adultos. Se informara la presencia y cantidad de huevos de Fasciola heptica.

Procedimiento

Clculo e interpretacin de los resultados

LARVAS STRONGYLOIDES STERCORALIS (MTODO BAERMAN)

Objetivos Aislar e identificar larvas de Strongyloides stercoralis a partir de muestras de heces fecales o aspirado duodenal. Se realizar el examen a todos los pacientes a los que se le indique y que se cumpla con los requisitos para la toma, conservacin y transporte de la muestra.

Alcance

Definiciones: no procede. Responsabilidades: tcnico y profesional que atienden el cubculo. Condiciones de seguridad y bioseguridad: las generales del laboratorio. Operaciones preliminares Debe recogerse una abundante cantidad de materia fecal. Mezclar uno 50 g de materia fecal con carbn estril y poner esto en agua tibia en un embudo. El material obtenido se mira directamente al microscopio entre cubre y porta, aplicando una gota de lugol. Se informa la presencia y cantidad del nmero de larvas observadas. Procedimiento

Informe

ANEXOS
ANEXO 1 Fucsina bsica de Ziehl (solucin madre) Fucsina bsica ............... Etanol............................... Solucin madre................. Agua fenicada 5 %............ ANEXO 2 Solucin de fosfato Azul de metileno Azul de metileno medicinal.............. Ortofosfato disdico anhidro............ Ortofosfato monopotasico................. 1 g 3 g (Na2HPO4) 1 g (KH2PO4) 15 g 1 000 mL 10 mL 90 mL

Fucsina bsica de Ziehl (solucin de trabajo)

Se mezclan en un mortero; se disuelve 1 g de la mezcla en 400 mL de agua destilada y se filtra. ANEXO 3 Colorante de Giemsa (solucin alcohlica) Colorante de Giemsa en polvo........... Alcohol metlico puro........................ Glicerina pura.................................... ANEXO 4 Agua amortiguadora Ortofosfato disdico anhidro............ Ortofosfato monopotasico................. 6 g (Na2HPO4) 5 g (KH2PO4) 0,75 g 65 mL 35 mL

Si existe colorante de Giemsa comercial no es necesario prepararla.

pH......................................................7,5 Se mezcla en un mortero, se disuelve un gramo de la mezcla en 1 000 mL de agua destilada o toda la mezcla para 2 litros de agua destilada. Se conserva en botellones de cristal.