Reaces mono-substrato

Entre as enzimas com mecanismos mono-substrato incluem-se as isomerases como a triose-fosfato isomerase ou bisfosfoglicerato mutase, liases intramoleculares como a adenilato ciclase e a ribozima, uma liase de RNA.[6] Porm, algumas enzimas que apenas tm um substrato no se agrupam nesta categoria de mecanismos. A catalase um exemplo, pois reage com uma molcula de substrato de perxido de hidrognio, oxida-se e ento reduzida por uma segunda molcula de substrato. Embora um nico substrato esteja envolvido, a existncia de um intermedirio que uma enzima modificada significa que o mecanismo de catlise um mecanismo ping-pong (tipo de mecanismo discutido mais abaixo).

[editar] Cintica de MichaelisMenten

Curva de saturao para uma enzima mostrando a relao entre a concentrao do substrato (abcissas) e a velocidade de reaco (ordenadas). As reaces catalisadas por enzimas so saturveis, e a sua velocidade de catlise no indica uma resposta linear face ao aumento de substrato. Se a velocidade inicial da reaco medida sobre uma escala de concentraes de substrato (denotada como [S]), a velocidade de reaco (v) aumenta com o acrscimo de [S]. Todavia, medida que [S] aumenta, a enzima satura-se e a velocidade atinge o valor mximo Vmax. No modelo da cintica de Michaelis-Menten de uma reaco mono-substrato existe uma reaco bimolecular inicial entre a enzima E e o substrato S para formar o complexo ES. Embora o mecanismo enzimtico para a reaco unimolecular possa ser bastante complexo, h tipicamente um passo na determinao da velocidade que permite que se modele o mecanismo como um passo cataltico simples de velocidade constante k2. (Eq. 1). k2 tambm designado como kcat ou turnover, o valor mximo de reaces enzimticas catalisadas por segundo. Com baixas concentraes de substrato [S], a enzima permanece em equilbrio entre a forma livre E e o complexo enzima-substrato ES; aumentando [S] aumenta [ES] custa de [E], mudando o equilbrio para o lado direito. Uma vez que a velocidade de reaco

depende da concentrao [ES], a velocidade sensvel a pequenas alteraes de [S]. Todavia, com altos valores de [S], a enzima fica totalmente saturada com substrato, e existe apenas na forma ES. Nestas condies, a velocidade (vk2[E]tot=Vmax) insensvel a pequenas alteraes de [S]; assim, [E]tot a concentrao total enzimtica

que aproximadamente igual concentrao [ES] em condies de saturao. A equao de MichaelisMenten[7] descreve como a velocidade de reaco v depende da posio do equilbrio ligado ao substrato e da constante de velocidade k2. Michaelis e Menten mostraram que se k2 for bem menor que k-1 (chamada a aproximao de equilbrio), pode obter-se a seguinte equao:

(Eq. 2) Esta equao de Michaelis-Menten a base da maior parte da cintica enzimtica monosubstrato. A constante de Michaelis Km definida como a concentrao para a qual a velocidade da reaco enzimtica metade de Vmax. Isto pode verificar-se ao substituir Km = [S] na equao de Michaelis-Menten. Se o passo de determinao da velocidade for lento, quando comparado com a dissociao do substrato (k2 << k-1), ento a constante de Michaelis Km aproximadamente constante de dissociao do complexo ES, embora tal situao seja relativamente rara. A situao mais normal d-se quando k2 > k-1 na por vezes chamada cintica de BriggsHaldane.[8] A equao ainda se verifica em condies mais gerais, como provm da aproximao ao estado estacionrio. Durante o perodo inicial, a velocidade de reaco v relativamente constante, indicando que [ES] tambm aproximadamente constante (cf. equao 1):

Assim, a concentrao [ES] dada pela frmula

em que a constante de Michaelis Km definida por

([E] a concentrao de enzima livre). Em conjunto, a frmula geral para a velocidade de reaco v vem pela equao de Michaelis-Menten:

A constante de especificidade kcat / Km uma medida da eficincia de converso pela enzima do substrato em produto. Usando a definio da constante de Michaelis Km, a equao escreve-se na forma

sendo [E] a concentrao de enzima livre. Assim, a constante de especificidade um modo eficaz de obter a constante de segunda ordem da velocidade para enzimas livres na reaco com substrato livre para formao de produto. A constante de especificidade limitada pela frequncia com que o substrato e a enzima se encontram na soluo, podendo atingir 1010 M1 s1.[9] Esta taxa mxima amplamente no dependente da dimenso do substrato ou da enzima.[10] A razo entre constantes de especificidade para dois substratos uma comparao quantitativa da eficincia da enzima na converso dos substratos. O declive do grfico de Michaelis-Menten com baixa concentrao de substrato [S] (i.e. [S] << Km) tambm resulta na constante de especificidade.

Representao da equao de Michaelis-Menten

Ver artigo principal: Diagrama de Lineweaver-Burke Ver artigo principal: Diagrama de Eadie-Hofstee

O grfico de Lineweaver-Burke ou do duplo recproco mostra o significado dos pontos de intercepo entre a recta e os eixos de coordenadas, e do gradiente da velocidade. O grfico de velocidade face a [S] mostrado anteriormente no linear. Embora a baixas concentraes de substrato se mantenha linear, vai curvando medida que aumenta a concentrao de substrato. Antes da chegada dos computadores, que permitem ajustar regresses no lineares de forma simples, podia chegar a ser realmente difcil estimar os valores de Km e Vmax nos grficos no lineares. Isto deu lugar a que vrios investigadores

concentrassem os seus esforos em desenvolver mtodos de linearizao da equao de Michaelis-Menten, dando como resultado o grfico de Lineweaver-Burke, o diagrama de Eadie-Hofstee e o grfico de Hanes-Woolf. Com o seguinte tutorial da cintica de Michaelis-Menten realizado na Universidade de Virgnia a, pode-se simular o comportamento de uma enzima variando as constantes cinticas. O grfico de Lineweaver-Burk ou representao de duplo recproco a forma mais comum, e simples,de mostrar os dados cinticos, apesar de no ser a mais fivel. Para tal, tomam-se os valores inversos de ambos os lados da equao de Michaelis-Menten. Como se pode apreciar na figura da direita, o resultado deste tipo de representao uma linha recta cuja equao e = mx + c, sendo o ponto de intercepo entre a recta e o eixo das ordenadas equivalente a 1/Vmax, e o ponto de intercepo entre a recta e o eixo de abcissas equivalente a -1/Km.

Evidentemente no se podem tomar valores negativos para 1/[S]; o mnimo valor possvel 1/[S] = 0, que corresponderia a uma concentrao infinita de substrato, e da 1/v = 1/Vmax. O valor do ponto de intercepo entre a recta e o eixo x uma extrapolao de dados experimentais obtidos em laboratrio. Geralmente, os grficos de LineweaverBurke distorcem as medidas realizadas a baixas concentraes de substrato e isto pode dar lugar a estimativas no muito exactas de Vmax e de Km.[11] Um modelo linear muito mais exacto o diagrama de Eadie-Hofstee, mas nas investigaes cientficas actuais, todo este tipo de linearizaes tornou-se obsoleto e foi substitudo por mtodos mais fiveis baseados na anlise de regresso no linear. Para analisar os dados conveniente a normalizao dos mesmos, j que isto pode ajudar diminuio da quantidade de trabalho experimental a realizar e incremento da fiabilidade da anlise.[12]

[editar] Importncia prtica das constantes cinticas

O estudo da cintica enzimtica importante por duas razes principais. Em primeiro lugar, ajuda a explicar como as enzimas trabalham, e, em complemento, permite prever o comportamento das enzimas em organismos vivos. As constantes cinticas acima definidas, Km e Vmax, so crticas na compreenso do modo de funcionamento conjunto das enzimas para controlar o metabolismo. Fazer estas previses no trivial, mesmo para sistemas simples. Por exemplo, o oxaloacetato formado pela malato desidrogenase no interior da mitocndria e pode ser consumido pela citrato sintase, a fosfoenolpiruvato carboxiquinase ou a transaminase glutmico-oxalactica, entrando no ciclo do cido ctrico, gluconeognese ou biossntese do cido asprtico, respectivamente. A capacidade de previso de quanto oxaloacetato segue cada via exige conhecimento da sua concentrao e da concentrao e cintica de cada uma das enzimas. Esta capacidade preditiva do comportamento metablico atinge a sua expresso mais complexa na sntese de grandes quantidades de dados cinticos e genticos em modelos matemticos de organismos inteiros. Embora este objectivo seja longnquo para qualquer eucariota,

fazem-se tentativas para atingi-lo nas bactrias, com modelos do metabolismo da Escherichia coli.[13][14]

Reaces multi-substrato
As reaes multi-substrato seguem uma srie de complexas equaes que descrevem como se unem os substratos e em que ordem o fazem. A anlises destas reaes muito mais simples se a concentrao do substrato A se mantiver constante e a do substrato B variar. Nestas condies, a enzima se comporta igual a uma enzima de nico substrato, pelo que num grfico de velocidade a concentrao do substrato dar um dos valores aparentes das constantes cinticas, Km e Vmax, para o substrato B. Se se realizarem uma srie de medidas a diferentes concentraes fixas de substrato A, os dados obtidos permitiro saber a que tipo de mecanismo pertence a reao enzimtica. Para uma enzima que una dois substratos A e B, e os transforme em dois produtos P e Q, existem dois tipos de mecanismos descritos.

[editar] Mecanismos de complexo ternrio

Mecanismo de complexo ternrio para uma reaco enzimtica. A enzima E une os substratos A e B e liberta os produtos P e Q em ordem no definida. As enzimas (E) que apresentam este mecanismo de reaco unem ao mesmo tempo os dois substratos (A e B), dando lugar a um complexo ternrio EAB. A ordem sequencial da unio dos substratos pode ser ao acaso (mecanismo aleatrio) ou seguir uma ordem em particular (mecanismo ordenado). Se se fixar a concentrao do substrato A e variar a de B, ao representar-se graficamente o comportamento da enzima mediante um diagrama de Lineweaver-Burke, obter-se- uma srie de rectas com um ponto de interseco comum a todas elas. Entre as enzimas que apresentam este mecanismo podemos encontrar a glutatio Stransferase,[15] a di-hidrofolato redutase[16] e a DNA polimerase.[17] As seguintes ligaes mostram animaes do mecanismo de complexo ternrio da di-hidrofolato redutase e da DNA polimerase .

[editar] Mecanismos pingpong

Como se pode ver na figura da direita, as enzimas com um mecanismo de ping-pong podem apresentar dois estados: a conformao normal (E) e a conformao modificada quimicamente (E*) ou conformao intermdia. Nesse tipo de mecanismo, o substrato A une-se enzima E, que passa a um estado intermedirio E*, por exemplo, por transferncia de um grupo qumico ao centro activo da enzima, podendo j ser libertado

na forma de produto P. Apenas quando o substrato A foi j libertado do centro activo da enzima se pode unir ao substrato B, que devolve a enzima modificada E* ao seu estado original E, e libert-lo em forma de produto Q. Se se fixar a concentrao de A e variar a de B, e se se representar graficamente uma enzima com mecanismo de ping-pong num diagrama de Lineweaver-Burke, obter-se- uma srie de rectas paralelas entre si.

Mecanismo de ping-pong para uma reao enzimtica. A unio dos substratos A e B tem lugar numa ordem definida e sequencial, por meio de um intermedirio enzimtico modificado, E*. Entre as enzimas com este tipo de mecanismo encontram-se algumas oxirredutases, como a tiorredoxima peroxidase,[18] transferases, como a acilneuraminato citidilo transferase,[19] e proteases de serina, como a tripsina e a quimiotripsina.[20] As proteases de serina formam uma famlia diversa de enzimas muito comuns, que incluem enzimas digestivas (tripsina, quimiotripsina e elastase), vrias enzimas do processo de coagulao e muitas outras. Nas proteases de serina, o estado intermedirio E* uma espcie acilada numa serina do centro cataltico da enzima. Mostra-se uma animao do mecanismo cataltico da quimiotripsina na ligao seguinte:.

[editar] Cintica no-michaeliana

Ver artigo principal: Regulao alostrica Algumas reaces enzimticas do lugar a curvas do tipo sigmide, ao ser representadas numa curva de saturao, o que pode indicar uma ligao cooperativa do substrato ao centro cataltico da enzima. Isto significa que a unio de uma molcula de substrato influencia a unio das molculas de substrato posteriores. Este comportamento o mais comum nas enzimas multimricas, que apresentam diversas zonas de interaco com o substrato.[21] O mecanismo de cooperao semelhante ao observado na hemoglobina. A unio de una molcula de substrato a uma das zonas de interaco altera significativamente a afinidade pelo substrato das restantes zonas de interaco. As enzimas com este tipo de comportamento so denominadas alostricas. A cooperatividade positiva tem lugar quando a primeira molcula de substrato unida incrementa a afinidade do resto de zonas de interaco. Pelo contrrio, a cooperatividade negativa tem lugar quando a primeira molcula de substrato unida reduz a afinidade da enzima por novas molculas de substrato. Exemplos de enzimas com cooperatividade positiva incluem a aspartato transcarbamilase bacteriana [22] e a fosfofructoquinase,[23] e com cooperatividade negativa, a tirosilo-RNAt transferase de mamferos.[24] A cooperatividade um fenmeno bastante comum e pode chegar a ser crucial na regulao da resposta enzimtica a mudanas na concentrao de substrato. A cooperatividade positiva faz que a enzima seja muito mais sensvel concentrao de substrato. Com isto, a actividade pode chegar a variar fortemente, mesmo em intervalos

muito estreitos de concentrao de substrato. Pelo contrrio, a cooperatividade negativa faz com que a enzima seja insensvel a pequenas mudanas na concentrao de substrato. A equao de Hill [25] pode ser utilizada para descrever quantitativamente o grau de cooperatividade em cinticas no michaelianas. O coeficiente de Hill (n) indica quantas das zonas de unio de substrato de uma enzima afectam a afinidade da unio do substrato no resto das zonas de unio. O coeficiente de Hill pode tomar valores maiores ou menores que 1:

n < 1: indica cooperatividade negativa. n > 1: indica cooperatividade positiva.

[editar] Cintica do estado pr-estacionrio

Curva do progresso pr-estacionrio, mostrando a fase inicial de uma reaco enzimtica. Ao realizar um ensaio enzimtico e misturar a enzima com o substrato, existe um breve perodo inicial em que no se produz nem sntese de produto, nem estado intermdio da enzima. O estudo dos milissegundos seguintes mistura denominado cintica do estado pr-estacionrio e est relacionado com a formao e consumo dos intermedirios enzima-substrato (ES ou E*) at ao momento em que se alcanam certas concentraes e comea o estado estacionrio. A primeira enzima em que se estudou este processo, durante a reaco de hidrlise, foi a quimiotripsina.[26] A deteco de intermedirios costuma ser a principal prova necessria para saber sob que mecanismo actua a enzima. Por exemplo, ao realizar um ensaio de cintica rpida de uma reaco enzimtica governada por um mecanismo de ping-pong, pode seguir-se a libertao de produto P e medir a formao de intermedirios enzimticos modificados E*.[27] No caso da quimiotripsina, o intermedirio enzimtico produzido por um ataque nucleoflico do substrato a uma serina do centro cataltico, o que gera uma forma intermediria acilada da quimiotripsina. Na figura da direita, pode-se observar como a enzima passa rapidamente a um estado intermdio E* durante os primeiros segundos da reaco. Posteriormente, quando alcanado o estado estacionrio, a velocidade diminui. Esta primeira fase da reaco proporciona a taxa de converso da enzima. Portanto, a quantidade de produto liberado durante esta fase (que pode obter-se prolongando a recta correspondente ao estado

estacionrio at cortar o eixo y) tambm d a quantidade de enzima funcional presente no ensaio.[28]

[editar] Mecanismo qumico

Um dos objectivos mais importantes no estudo da cintica enzimtica determinar o mecanismo qumico que subjaza na reaco enzimtica, por exemplo, determinar a sequncia ordenada de eventos que ocorrem na transformao de substrato em produto. As aproximaes cinticas discutidas anteriormente podem proporcionar informao relacionada com a velocidade de reaco dos intermedirios enzimticos formados, mas no iro permitir identificar que intermedirios so formados. Com o intuito de determinar a etapa limitante da reaco ou os intermedirios que se formam durante a mesma, podem fazer-se ensaios enzimticos em diversas condies com enzimas ou substratos ligeiramente modificados, que tragam dados relacionados. Um exemplo caracterstico de etapa limitante de uma reaco aquela na qual se rompe uma ligao covalente dando lugar a um tomo de hidrognio. Se se trocar cada tomo de hidrognio pelo seu istopo estvel, o deutrio, poderemos saber qual dos possveis hidrognios transferidos o que determina a etapa limitante. A velocidade sofrer uma variao quando o hidrognio crtico seja substitudo, devido ao efeito isotpico cintico primrio, cuja origem se encontra na maior estabilidade das pontes de deutrio, mais difceis de romper que as de hidrognio.[29] Tambm possvel medir efeitos similares por meio de outras substituies isotpicas, tais como 13C/12C ou 18O/16O, mas os efeitos produzidos nestes casos so mais difceis de detectar. Os istopos tambm podem ser utilizados para obter informao sobre o destino de diversas partes da molcula de substrato quando este transformado em produto. Por exemplo, por vezes difcil determinar a origem de um tomo de oxignio no produto final, j que pode vir da gua ou da molcula de substrato. Isto pode resolver-se mediante a substituio sistemtica dos tomos de oxignio das molculas que participem na reaco, pelo seu istopo estvel 18O, fazendo depois uma procura do istopo no produto obtido. O mecanismo qumico tambm pode ser elucidado estudando os efeitos cinticos e isotpicos sob diferentes condies de pH,[30] alterando os nveis de ies metlicos ou outros cofactores,[31] por mutagnese dirigida de aminocidos conservados, ou pelo estudo do comportamento da enzima na presena de anlogos do substrato.

[editar] Inibio enzimtica

Ver artigo principal: Inibio enzimtica

Esquema cintico para inibidores enzimticos reversveis. E=Enzima; S=Substrato; ES=Complexo; P=Produto; I=Inibidor Os inibidores enzimticos so molculas que reduzem ou eliminam a actividade das enzimas. Podem encontrar-se dois tipos, os reversveis (quando a remoo do inibidor restaura a actividade enzimtica) e os irreversveis (quando o inibitor inactiva de modo permanente a enzima).

[editar] Inibidores reversveis

Os inibidores enzimticos reversveis podem ser classificados como competitivos, acompetitivos, no-competitivos e mistos, segundo o efeito que produzam nas constantes cinticas Km e Vmax. Este efeito depender da unio do inibidor enzima E, ao complexo enzima-substrato ES ou a ambos, como se pode observar na figura e na tabela abaixo. Para classificar correctamente um inibidor pode-se estudar a sua cintica enzimtica em funo da concentrao de inibidor. Os quatro tipos de inibio do lugar a diagramas de Lineweaver-Burke e de Eadie-Hofstee [11] que variam de diferente forma com a concentrao de inibidor. Para abreviar, usam-se dois smbolos:

y onde Ki e K'i so as constantes de dissociao para se unir enzima e ao complexo enzima-substrato, respectivamente. Na presena de um inibidor reversvel, os valores aparentes de Km e Vmax passam a ser (/')Km e (1/')Vmax, respectivamente, como se pode ler na tabela abaixo para os casos mais comuns. Tipo de inibio apenas ( Ki apenas ( Ki' Ki = Ki' ) competitiva ) acompetitiva ( ) ( mista ) Os ajustes por regresso no linear dos dados de cintica enzimtica [32] podem proporcionar estimativas muito precisas das constantes de disociao Ki e Ki'. no competitiva Km aparente Vmax aparente

Ki Ki'

[editar] Inibidores irreversveis

Os inibidores enzimticos tambm se podem unir e inactivar uma enzima de forma irreversvel, geralmente por meio de modificaes covalentes de resduos do centro cataltico da enzima. Estas reaces decaem de forma exponencial e so habitualmente

saturveis. Abaixo dos nveis de saturao, mantm uma cintica de primeira ordem em relao ao inibidor.

[editar] Mecanismos de catlise

Ver artigo principal: Catlise enzimtica

A variao de energia como funo de uma coordenada de reaco mostra a estabilizao do estado de transio quando essa reaco efectuada por uma enzima. O modelo de ajuste induzido o mais utilizado em estudos de interaco enzimasubstrato.[33] Este modelo prope que as interaces iniciais entre a enzima e o substrato so relativamente dbeis, embora suficientes para produzir certas mudanas estruturais na enzima, que estabilizam e incrementam a fora da interaco. Estas mudanas de forma implicam uma srie de aminocidos catalticos do centro activo, nos quais se produzem as ligaes qumicas correspondentes entre a enzima e o substrato. Depois da unio, um ou mais mecanismos de catlise diminuem a energia do estado de transio da reaco, por meio de uma via alternativa reaco. Os mecanismos de catlise classificam-se com base em diferentes critrios: catlise covalente, catlise por proximidade e alinhamento de orbitais, catlise cido-base geral, catlise por ies metlicos e catlise electrosttica. Os estudos de cintica enzimtica no permitem obter o tipo de catlise utilizada por uma enzima. Alguns dados cinticos podem proporcionar uma srie de indcios que levem a realizar outro tipo de estudos dirigidos a determinar certo tipo de catlise. Por exemplo, um mecanismo de ping-pong na cintica do estado pr-estacionrio poder estar a sugerir uma catlise de tipo covalente. Por outro lado, variaes no pH podem produzir efeitos drsticos em Vmax mas no em Km, o que poderia indicar que um resduo do centro activo precisa um estado concreto de ionizao para que se possa efectuar a catlise enzimtica.