Extraccin y anlisis de ADN

Objetivo general: mtodos de extraccin y anlisis de ADN. Objetivos especficos: 2.1. Extraer ADN genmico de la bacteria Escherichia coli.(dia 1) 2.2. Extraer ADN plasmdico de la bacteria E. coli.(dia 1) 2.3. Estimar por espectrofotometra la concentracin y pureza de las preparaciones de ADN (da2). 2.4. Analizar la calidad del ADN extrado mediante electroforesis en gel de agarosa (da 2) 2.5. Realizar una digestin del ADN con enzimas de restriccin (da1) y analizar el patrn de restriccin mediante electroforesis (da 2) EXTRACCIN DE ADN La extraccin de ADN se realiza en tres etapas: 1) ruptura de las clulas y homogeneizacin de la muestra; 2) aislamiento del ADN de las protenas y lpidos; 3) concentracin del ADN. Homogeneizacin de la muestra La forma de homogeneizacin depende de las caractersticas de la muestra. En general, se aplica una combinacin de agentes fsicos y qumicos que rompen tejidos. Para tejidos blandos se emplean generalmente homogeneizadores que rompen el tejido en forma mecnica. Para hacer ms eficiente la lisis celular, se pueden incluir ciclos de agitacin violenta (utilizando vortex) y/o combinar con ciclos de congelado-descongelado de la muestra. Para lisar clulas vegetales, hongos, bacterias, o cpsides virales, se suele congelar la muestra en nitrgeno lquido y pulverizarla mientras permanece congelada con un mortero, evitando as la degradacin de los AN por nucleasas celulares Dependiendo de la naturaleza de la muestra, en el buffer de lisis se pueden incluir enzimas que faciliten la degradacin de la pared celular (p.ej.lisozima, que hidroliza el peptidoglicano presente en la pared celular de las bacterias) La adicin de detergentes permite la desestabilizacin de la membrana celular alterando las interacciones lpido-lpido, lpido-protena y protena-protena Eliminacin de protenas Pueden ser degradadas mediante el tratamiento con proteasas, como la proteinasa K. (es activa en condiciones relativamente exigentes como lo son la presencia de SDS, urea, agentes quelantes (EDTA), Etc). Por otro lado, un incremento de temperatura desde 37 a 50 - 65 C aumenta su actividad, en condiciones en que las nucleasas que pueden afectar la integridad del ADN son inactivas. De este modo, la proteinasa K degrada las nucleasas y dems protenas, y permite la obtencin de ADN genmico de alto peso molecular. Otra forma de eliminar las protenas y lpidos es con solventes orgnicos que permite inactivar y remover compuestos solubles en la fase orgnica, y mediante una centrifugacin posterior, eliminar protenas desnaturalizadas que precipitan en la interfase (solv org.mezcla de fenol:cloroformo:alcohol isoamlico y cloroformo:isoamlico La mezcla de solventes en la primera extraccin hace que el procedimiento sea ms eficiente, y la segunda extraccin remueve restos de fenol. Su principal desventaja radica en la toxicidad de los reactivos y en el descarte de los desechos orgnicos) Tambin se utilizan con frecuencia kits comerciales que permiten obtener AN de alta pureza: la extraccin del ADN se basa en una cromatografa de intercambio inico, en la que el ADN se une a una resina y despus de realizar varios lavados, el ADN es eludo en un pequeo volumen de agua o de buffer. Concentracin del ADN por precipitacin La precipitacin de los AN permite eliminar contaminantes, cambiar el buffer en el cual se encuentra disuelto y concentrar el ADN. Requiere la presencia de dos elementos: (i) cationes, provenientes de sales, que neutralizan la carga negativa reduceniendo la repulsin de las hebras de ADN y (ii) alcohol, que reduce la constante dielctrica y deshidrata las molculas de ADN, haciendo que pierdan solubilidad y precipiten.

El Acetato de sodio es la sal ms frecuentemente empleada para precipitar ADN y ARN, mientras que el isopropanol y el etanol son los alcoholes ms utilizados. El ADN (o ARN) se recupera en el precipitado luego de centrifugar. Se remueve el sobrenadante y el precipitado se lava con EtOH (elimina de sales que pueda inhibir pasos posteriores, por ej reacciones enzimticas). Finalmente, el precipitado de AN es solubilizado en un cierto volumen de buffer o agua. La solucin de ADN se mantiene en hielo mientras se trabaja con ella y se la conserva en alcuotas congeladas a -20 C. ANLISIS DE ADN Cuantificacin de AN: Espectrofotometra Las bases nitrogenadas absorben UV. Mtodo til, siempre y cuando el ADN est puro y no haya degradacin de la muestra, que no contenga protenas ni solventes orgnicos que absorben a cercanas a la de los AN. Algunas reglas empricas permiten estimar la concentracin a partir del valor de absorbancia a 260 nm.
1 UA a 260nm = 50 g/mL ADN doble cadena 1 UA a 260nm = 33 g/mL ADN cadena simple 1 UA a 260nm = 40 g/mL de ARN

Nanodrop, equipo que permite determinar la concentracin en un volumen de muestra de 1 L, en un rango aproximado de 5 ng/ L a 3.000 ng/ L, y no requiere el uso de celdas (capacidad de 0.5 1 mL) Evaluacin de la pureza del ADN por espectrofotometra A pesar de ser estimativo, es posible considerar que una preparacin es de buena calidad en relacin al grado de pureza si cumple con las siguientes relaciones: A - contaminacin con protenas:
ADN A260 /A280 1,8 ARN A260 /A280 2,0

B - contaminacin con compuestos orgnicos como el fenol:

ADN A260 /A230 1,5 ARN A260 /A230 2,0

Electroforesis y visualizacin de ADN Forma sencilla de resolver y visualizar los AN. Se basa en la diferente velocidad de migracin a travs de un soporte poroso que tienen molculas cargadas sometidas a un campo elctrico. Dicha velocidad de migracin de las molculas es proporcional a la intensidad del campo elctrico. La visualizacin de los AN resuelto se basa en el teido fluorescente del ADN utilizando un agente intercalante (Bromuro de Etidio: bajo luz UV produce una seal fluorescente, como es cancergeno pueden usarse SyberSafe, GoodView (estos compuestos no atraviesan las membranas celulares) Las molculas de ADN estn cargadas negativamente, presentando una densidad de carga constante, por lo que la diferencia de velocidad de migracin se basa en la diferencia de: tamao (largo en pares de bases, pb), de conformacin (lineal, circular cerrado o superenrollado), en la formacin de estructuras secundarias o por la unin de protenas o ligandos especficos. Separacin de fragmentos de ADN de diferente tamao: la velocidad de migracin a travs del gel disminuye con el mayor tamao del ADN. En el rango de pH en que se trabaja normalmente, la carga neta del ADN es negativa debido a la carga de los grupos fosfato. Dado que por cada par de bases hay dos grupos fosfato, la densidad de carga (relacin carga/masa) es constante para molculas de ADN de diferente tamao, en su forma lineal. Las molculas de mayor tamao tendrn menor movilidad que las pequeas por diferencia de friccin a travs del gel. Para el ADN de doble hebra, la migracin es inversamente proporcional al log10 del nmero de pb en un intervalo determinado. La conformacin del ADN afecta la migracin: Fragmentos de ADN de igual tamao en pares de bases, de idntica secuencia nucleotdica, migran con diferente velocidad, en funcin de la conformacin. Una molcula de ADN de determinada longitud (nmero de pb) puede presentarse en diferentes conformaciones: 1. superenrollada (ADN doble hebra circular cerrado superenrollado), (migra ms) 2. forma lineal. 3. circular relajada (sin superenrollamiento) = migra menos Matrices ms utilizadas son la agarosa y la poliacrilamida (fragmentos ADN cortos (de 5 a 500 pb), son ms trabajosos de preparar, sin polimerizar es txica)

La agarosa es un polmero lineal formado por residuos alternados de D- y L-galactosa. Se prepara fundiendo agarosa con un tampn, y dejando enfriar para que gelifique. El tamao de l os poros de la matriz depende de la concentracin de la agarosa. La resolucin de fragmentos de ADN en la electroforesis depende de esta concentracin. La velocidad relativa de migracin se ve afectada de diferente forma principalmente por la concentracin y el tipo de soporte de electroforesis (por ejemplo agarosa), pero tambin por la intensidad del campo elctrico y la fuerza inica del buffer o la presencia de agentes intercalantes. Si se quiere determinar el tamao de un fragmento de ADN por electroforesis, por comparacin de la migracin respecto a un marcador de PM, nicamente puede compararse fragmentos que estn en conformacin lineal. Para un determinado ADN y una determinada concentracin de gel en una electroforesis hay una relacin aproximadamente lineal entre el logaritmo del PM y su Rf (movilidad electrofortica relativa). - Otros factores que afectan la movilidad electrofortica El intercalado del EtBr en las molculas de AN afecta el superenrollamiendo, la carga neta, y la rigidez dependiendo de la concentracin. La presencia de EtBr en la electroforesis modifica la migracin de una molcula de ADN hasta un 15%. Otros factores que pueden afectar la separacin de los AN son el campo elctrico, la composicin y secuencia de bases de los fragmentos de ADN, la temperatura y la composicin del buffer de electroforesis. PLSMIDOS Los plsmidos son molculas de ADN extracromosmico que se encuentran naturalmente en las bacterias. Su tamao vara entre 1 y 250 kb Tienen una estructura circular, covalentemente cerrada y contienen un origen de replicacin. proveen de alguna caracterstica que confiere una ventaja selectiva a la bacteria que lo posee Por ejemplo, resistencia a algn antibitico. Tecnologia ADN recombinante: es necesario insertar la secuencia de ADN que codifica para la protena de inters en un plsmido adecuado, el cual ser incorporado en el sistema de expresin elegido para su produccin. El proceso de aislar un fragmento de ADN (inserto), de introducirlo en un plsmido, de amplificar y aislar la molcula recombinante, se denomina clonado o clonacin. Una estrategia muy utilizada es la que se basa en el uso de enzimas de restriccin. Enzimas de restriccin Las endonucleasas de restriccin son enzimas que forman parte del sistema de restriccin-modificacin de bacterias. El sistema de restriccin-modificacin tiene un rol de defensa en la bacteria para diferenciar el ADN propio del exgeno, y degradar el ADN exgeno preservando la integridad del propio. Las enzimas de restriccin reconocen secuencias especficas en el ADN de doble cadena, palindrmicas, de 4 o 8 pares de bases y cortan las dos hebras en un sitio especfico. Segn la enzima, se pueden generar dos tipos de extremos en el ADN, cohesivos o romos. Estos extremos pueden aparearse con cualquier otro extremo complementario. Fragmentos de cualquier ADN que hayan sido digeridos con la misma enzima de restriccin podrn unirse por los extremos, por apareamiento de bases complementarias. De esta manera, si se digiere el inserto y el plsmido con la misma enzima se obtienen extremos cohesivos, complementarios, lo que facilita el clonado del inserto en el plsmido. Finalmente, para unir dos fragmentos de ADN y formar el enlace fosfodister se utiliza una enzima llamada ADN ligasa. Mapas de restriccin Representacin del ADN donde se muestran los sitios de corte de distintas enzimas de restriccin sobre una secuencia de ADN particular. Estos sitios constituyen puntos de referencia sobre la secuencia Para construir un mapa de restriccin el ADN se digiere con varias enzimas de restriccin, cada una por separado y en todas sus combinaciones. Los fragmentos resultantes de la digestin se analizan mediante electroforesis. Se determina el tamao de los fragmentos obtenidos por comparacin con un estndar de peso molecular. Con el conjunto de los datos se construye el mapa cual un rompecabezas determinndose el orden y la ubicacin precisa de los sitios de corte de las enzimas en la representacin del ADN total. Los mapas de restriccin son caractersticos de la secuencia nucleotdica del ADN y permiten elegir las enzimas adecuadas para clonar un inserto en el mismo.