Quim. Nova, Vol. 32, No.

8, 2142-2150, 2009 CIDO CLAVULNICO E CEFAMICINA C: UMA PERSPECTIVA DA BIOSSNTESE, PROCESSOS DE ISOLAMENTO E MECANISMO DE AO

Reviso

Jaine H. H. Luiz de Oliveira*, Ana Claudia Granato, Daniela B. Hirata, Carlos O. Hokka e Marlei Barboza Departamento de Engenharia Qumica, Universidade Federal de So Carlos, Rod. Washington Luiz, km 235, 13565-905 So Carlos - SP, Brasil Milan Trsic Instituto de Qumica de So Carlos, Universidade de So Paulo, CP 780, 13560-970 So Carlos - SP, Brasil Recebido em 27/10/08; aceito em 5/5/09; publicado na web em 20/10/09

CLAVULANIC ACID AND CEPHAMICIN C: A PERSPECTIVE OF THE BIOSYNTHESIS, ISOLATION AND ACTION MECHANISM. The present article reviews different aspects of the chemistry of two widely used b-lactam antibiotics Clavulanic Acid and Cephamycin C. The article discusses important details of the biosynthesis of these compounds, their action mechanism and, principally, the methods employed in their isolation and purification, in accordance with the available literature. Despite the large quantity of available articles and patents concerning b-lactam antibiotics, those which describe the isolation and purification of Clavulanic Acid and Cephamycin C are rare. Overall, the intention of this article is to discuss the up-to-date scientific research related to the compounds under review. Keywords: b-lactam antibiotics; clavulanic acid; cephamycin C.

INTRODUO Antibiticos so metablitos secundrios produzidos por microrganismos ou por organismos especficos, que em quantidades pequenas so capazes de inibir o desenvolvimento de patgenos e, portanto, so usados no combate s infeces em seres humanos e animais.1 Dos antibiticos produzidos por microrganismos 66% so de actinomicetos, 22% de fungos e 12% de outras bactrias. Dentre os actinomicetos, 80% so obtidos a partir do gnero Streptomyces.2 A histria das penicilinas se iniciou com Alexander Fleming em 1928, ao notar em um de seus experimentos com cultura de bactrias, que havia ficado exposta ao ar durante semanas, uma contaminao por fungos. Em seu experimento verificava-se que certa rea da colnia de bactrias ao redor da colnia de fungos estava morrendo. Fleming concluiu que a colnia de fungos estava produzindo algum agente antibacteriano que estava se espalhando ao redor da colnia com o objetivo de se proteger. Posteriormente, Fleming identificou a colnia como sendo uma espcie rara de Penicillium.3 Durante anos, Fleming dedicou-se ao trabalho de isolar e identificar o agente antibacteriano produzido pelo fungo em sua colnia de bactrias, entretanto a substncia mostrou-se muito instvel e seu propsito no foi alcanado, concluindo que o composto seria instvel demais para ser utilizado clinicamente.3 Mais tarde, em 1938, Florey e Chain chegaram ao extrato bruto contendo a penicilina, que aps 3 anos foi testada clinicamente obtendo-se grande sucesso.3 Por este trabalho, Fleming, Florey e Chain dividiram o Prmio Nobel de Medicina em 1945. A penicilina G (Figura 1), produzida por fungos do gnero Penicillium, foi o primeiro antibitico a se tornar disponvel para uso clnico em 1942, lembrando que sua descoberta remonta o final dos anos 20. Esse composto revolucionou o tratamento de uma grande variedade de infeces, dentre elas, a febre escarlate, a pneumonia, a gonorria e srias infeces causadas por bactrias do gnero Staphylococcus, as quais, at ento, no possuam tratamento. Aps muita investigao, observou-se que havia muitos derivados naturais
*e-mail: jainehh@gmail.com

da penicilina que eram letais a uma grande variedade de bactrias Gram-positivas, contudo, certas classes de bactrias Gram-positivas eram resistentes ao efeito das penicilinas e estas apresentavam baixa atividade contra bactrias Gram-negativas.3,4 Existem diversos anlogos da penicilina onde a diferena reside na cadeia lateral ligada ao anel b-lactmico.

Figura 1. Estrutura dos antibiticos b-lactmicos e dos inibidores de blactamase

O segundo grupo de antibiticos a ser isolado foi o das cefalosporinas. A primeira cefalosporina obtida foi a cefalosporina C (Figura 1) isolada por Brotzu em 1948, a partir do fungo Cephalosporium acremonium. Entretanto, apesar de sua forte atividade contra certas bactrias Gram-negativas ter sido descoberta no mesmo ano de seu isolamento, sua estrutura s foi determinada em 1961.4 Assim como para as penicilinas, existem vrios anlogos da cefalosporina C onde h variao na cadeia lateral 3-acetoximetil. A famlia dos antibiticos b-lactmicos constitui o grupo mais importante dentre esses frmacos, tanto em relao sua utilizao clnica quanto do ponto de vista econmico. Esses antibiticos podem ser subdivididos em 5 grupos, 5 como mostra a Tabela 1.

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cido clavulnico e cefamicina C

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Tabela 1. Diviso dos grupos de antibiticos b-lactmicos Estrutura qumica bsica Penam Antibiticos Penicilinas Microrganismos produtores Penicillium chrysogenum Aspergillus nidulans Cephalosporium acremonium Streptomyces clavuligerus Ceph-3-em Cefalosporinas Cefamicinas Cephalosporium acremonium Norcadia lactamdurans

Clavam

cido clavulnico

Streptomyces clavuligerus

Carbapenem

Tienamicinas Streptomyces cattleya cidos olivnicos Streptomyces olivaceus

Monolactam

Monolactmicos

Glunobacter sp. Pseudomonas acidophila Acetobacter sp. Norcadia uniformis

Norcadicinas

do carbono C2 no tazobactamo. Ambos os compostos podem ser encontrados em formulaes disponveis comercialmente com os nomes de Unasyn (ampicilina/sulbactamo) e Zosyn (piperacilina/ tazobactamo). Nos Estados Unidos, as formulaes comerciais contendo estes compostos so: Superazone (cefoperazona/sulbactamo), Sultamicilina (ampicilina/sulbactamo) e Tazocin (piperacilina/ tazobactamo), sendo este ltimo comercializado pela Wyeth e responsvel por uma venda anual de 1 bilho de dlares.10 O mecanismo de inibio tanto para o sulbactamo quanto para o tazobactamo parecido com o do AC.11 Entretanto, segundo Payne et al.,12 o cido clavulnico apresenta atividade inibidora de enzimas b-lactamase quase 5 vezes maior que o tazobactamo e quase 600 vezes maior que o sulbactamo (cido clavulnico= 0,03 mM; tazobactamo= 0,14 mM; sulbactamo= 17 mM). At o momento tudo o que foi descrito tem uma abrangncia mundial, porm o mesmo no se aplica ao Brasil. Isso porque, dentre as estratgias para diminuir os preos dos medicamentos, a substituio da importao pela produo local , sem dvida, uma das mais importantes. Mas se verdade que a indstria nacional farmacutica cresceu significativamente na dcada de 90, respondendo hoje por aproximadamente 90% do que consumido no pas (dados da Associao Brasileira da Indstria Farmoqumica Abiquif), o contrrio se deu para a indstria farmoqumica, responsvel pela fabricao dos princpios ativos e intermedirios, cujo desenvolvimento foi praticamente nulo. Atualmente, 82% dos farmoqumicos utilizados na fabricao de medicamentos so ainda importados, segundo os dados da Abiquif.13 Hoje, a atividade do setor farmacutico no Brasil consiste em misturar os componentes para dar a forma final de apresentao aos medicamentos. Resolver a disparidade entre as indstrias farmacutica e farmoqumica est no centro das discusses sobre o crescimento do setor de frmacos no Brasil. A necessidade de atuao do governo, atravs de uma poltica de incentivo pesquisa e desenvolvimento e de incentivo indstria nacional, apontada como requisito para solucionar o problema.13 A integrao entre todos os setores vista como fundamental, uma vez que o nmero de importaes de princpios ativos e medicamentos muito maior do que a quantidade de exportaes pelo Brasil. CIDO CLAVULNICO (AC) O AC constitudo por um anel b-lactmico condensado a um anel oxazolidina, apresenta baixa atividade antibitica, mas um poderoso e irreversvel inibidor de enzimas b-lactamases produzidas por bactrias resistentes s penicilinas e cefalosporinas. Possui uma estrutura bsica clavam e uma estereoqumica caracterstica 2R, 5R, essencial para atuar como uma molcula inibidora de b-lactamases.14 O AC o primeiro exemplo de composto natural onde o anel b-lactmico no est ligado a um anel contendo enxofre, capaz de inibir a maioria das b-lactamases classe A, pouco ativo contra as cefalosporinases da classe C e inativo contra metaloenzimas Zn2+ da classe B.14 Na presena de baixas concentraes de AC, muitas bactrias produtoras de b-lactamases tornam-se sensveis s penicilinas e cefalosporinas comercialmente disponveis.9 Quando o AC utilizado juntamente com estes antibiticos, ocorre uma ligao irreversvel entre o grupo hidroxila da serina da b-lactamase e o AC, produzindo um intermedirio estvel, inativando a enzima e permitindo, assim, que o outro antibitico atue no combate infeco.15 A combinao do AC com a amoxicilina o exemplo de maior sucesso do uso de um antibitico b-lactmico sensvel b-lactamase, juntamente com um inibidor desta enzima.16 Esta combinao a mais comercializada e gerou 1,3 bilhes de dlares em vendas em 1995, porm, de acordo com Saudagar e colaboradores houve um decrscimo nas vendas desta formulao de 1,6 bilhes em 2001

A produo industrial de antibiticos b-lactmicos por fermentao nos ltimos 50 anos um grande exemplo de utilizao de biotecnologia; as penicilinas e cefalosporinas representam um mercado de 15 bilhes de USD, correspondendo a 65% do mercado global de antibiticos, sendo que 9,9 bilhes so devidos a cefalosporinas e cefamicinas.6 Desde a introduo destes antibiticos, muitos outros derivados b-lactmicos com atividade antibitica superior foram colocados no mercado, porm a eficincia destes frmacos tem sido ameaada pelo crescente nmero de bactrias capazes de inativ-los.7 Estes microrganismos, atravs de suas enzimas b-lactamases, catalisam a hidrlise do anel b-lactmico do antibitico, originando um produto inativo, isto , sem ao antibitica. Em 1967, no Beecham Research Laboratories iniciou-se um programa de triagem de microrganismos, com a finalidade de isolar inibidores de b-lactamases de ocorrncia natural, que permitiu o isolamento do cido clavulnico (AC-Figura 1) a partir de Streptomyces clavuligerus,8 o qual foi descrito pela primeira vez em 1976 por Brown e seu grupo de pesquisa.9 Tambm so conhecidos outros dois compostos inibidores de b-lactamases, o sulbactamo e o tazobactamo (Figura 1), porm de origem sinttica. Estes so estruturalmente parecidos, diferenciando-se apenas na adio de um grupo triazol no grupo b-metil

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para 107 milhes em 2004, o que representa uma perda de 93% nas vendas em apenas 3 anos.10 Antecipando o final da patente do Augmentin, a GSK lanou os produtos Augmentin ES-600 e Augmentin XR. Porm, apesar destes dois produtos ajudarem parcialmente na diminuio da perda em vendas (de 93 para 68%), a GSK continuou registrando uma queda nas vendas.10 A formulao que contm o AC e a amoxicilina comercializado, no Reino Unido, com o nome Augmentin (DSM Anti Infectives Delft - Holanda) e no Brasil, com o nome Clavulin (Smith Kline Beecham Laboratory Rio de Janeiro). O processo de obteno industrial do AC pouco documentado na literatura, sendo importante o conhecimento e o melhoramento do seu processo de produo.6 Mesmo aps 20 anos de uso clnico, a combinao amoxicilina/ AC continua apresentando excelente atividade contra a maioria das espcies de bactrias patognicas Gram-positivas (Staphylococcus aureus (MSSA), S. epidermidis, Enterococcus faecalis, Streptococcus pyogenes, S. pneumoniae, entre outras) e tambm contra muitas bactrias Gram-negativas (Haemophilus influenzae, H. parainfluenzae, M. catarrhalis, Neisseria gonorrhoeae, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, P. vulgaris, entre outras).17 Esta combinao utilizada no combate a diferentes enfermidades com grande eficcia se comparada a outros medicamentos como, por exemplo, no tratamento de infeces do trato respiratrio com resposta positiva superior se comparado azitromicina, cefixima ou ciprofloxacina nos casos de bronquite crnica.18 Um estudo realizado com crianas africanas que apresentavam infeces no trato urinrio mostrou que a eficcia do antibitico amoxicilina/AC era de 77,8% dos casos, enquanto que para a nitrofurantoina era de 67%.19 Estudou-se tambm a ao do medicamento em ostete alveolar,20 em abscessos endodnticos,21 em casos de diarria,22 entre outras doenas, sendo excelentes os resultados para os tratamentos destas infeces quando se utiliza a combinao amoxicilina/AC. O aumento de bactrias S. pneumoniae resistentes aos antibiticos tem causado grande preocupao nos ltimos anos. Em vrios estudos realizados notou-se que, embora as CIMs (concentraes inibitrias mnimas) de amoxicilina/AC sejam essencialmente similares quelas apenas com amoxicilina, existe uma tendncia para as CIMs serem menores para a combinao dos antibiticos. Estas diferenas so pequenas, mas testes de CIM in vitro podem no ser suficientemente sensveis para demonstrar qualquer efeito do clavulanato na atividade da amoxicilina contra S. pneumoniae. Estudos in vitro sugerem que o clavulanato pode interferir na atividade b-lactmica contra S. pneumoniae atravs de uma ligao complementar s PBPs (protenas de ligao penicilina).23,24 Atualmente, as companhias que produzem o AC so: Glaxo SmithKline, nos EUA; Sandoz Lek D.D., em Lendava (Eslovnia) e CIPAN, em Portugal.10 Biossntese do cido clavulnico A biossntese do AC no foi totalmente elucidada, apesar de muitos intermedirios e enzimas j terem sido isolados. Os estudos com istopos, a purificao e caracterizao das enzimas que participam do processo juntamente com os estudos genticos tm contribudo para esclarecer sua rota biossinttica. Na biossntese do AC (Figura 2), a arginina e a ornitina exercem uma estimulao dependente da concentrao25 e ambos os aminocidos so efetivamente incorporados na molcula de cido clavulnico.25-27 A incorporao destes dois aminocidos acontece nos carbonos C-2, C-3, C-8 e C-10. A incorporao da arginina na molcula de AC no estabelece a ornitina como precursor direto, pois a enzima ornitinacarbamil transferase de S. clavuligerus possui atividade arginase, que converte a arginina em ornitina.28 No entanto,

Valentine et al.29 utilizaram mutantes bloqueadores nos genes argF e argG, os quais foram incapazes de converter a ornitina em arginina e mesmo assim encontraram uma boa incorporao da arginina marcada isotopicamente na molcula de AC e uma pobre incorporao de ornitina. Isto demonstra que a arginina o precursor direto do AC e indica que a atividade arginase no produz suficiente ornitina para incorporar no AC. Townsend et al.26 sugeriram como precursores do AC a arginina e o piruvato para a formao do AC.

Figura 2. Biossntese do cido clavulnico

Os cidos clavamnico e proclavamnico foram os primeiros intermedirios isolados de S. clavuligerus30 e, mais tarde, dois compostos guanidnicos N2-(2-carboxietil)-arginina (CEA) e o cido desoxiguanidino (DGPC) foram identificados.31 Usando o cido proclavamnico como substrato, a clavaminato sintase (CAS) foi descrita por converter o cido proclavamnico em cido clavamnico.14,30 A purificao da enzima CAS foi realizada por Salowe e colaboradores, em 1990, e revelou que haviam duas formas da mesma enzima, cujas diferenas estavam nas propriedades cinticas e na massa melecular. Embora a enzima seja capaz de catalisar 3 passos distintos na rota biossinttica, no h evidncias que suas duas formas diferem na capacidade de catalisar qualquer uma das 3 etapas.32 Acredita-se que uma das formas da CAS faa parte da biossntese do AC, enquanto a outra esteja associada produo de outros clavams. O cido clavamnico difere do AC na estereoqumica do sistema de aneis e esta transformao requer a inverso na estereoqumica do anel, bem como a converso do substituinte da cadeia lateral de um grupo amino para um grupo hidroxila, porm esta reao ainda no foi esclarecida. A presena de um aldedo intermedirio com a mesma estereoqumica do AC demonstra a presena de NADPH, que reduz o clavaldedo atravs da enzima CAD a cido clavulnico.33 Pouco se conhece sobre a regulao da produo de AC, existindo controvrsias a respeito dos substratos que favorecem ou no a produo do mesmo. Processos de isolamento e purificao do cido clavulnico O processo de separao e purificao do AC a partir do meio de fermentao envolve uma srie de etapas, como filtrao e centrifuga-

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cido clavulnico e cefamicina C

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o para a separao de clulas e tcnicas de extrao e/ou adsoro para posterior purificao do antibitico. Porm, o AC apresenta velocidades de degradao elevadas em temperaturas acima de 30 C, em regies bsicas pH > 7,5 e em regies cidas pH< 4,5.34,35 Isso leva a baixos rendimentos durante os processos de purificao, quando comparados a outros compostos b-lactmicos.36 Muitos autores investigaram a estabilidade do AC em solues tampo em diferentes valores de pH. Estes autores observaram que a degradao do AC segue uma cintica de pseudoprimeira ordem e que esta degradao muito influenciada pela catlise causada pelos sais do tampo utilizados para manter constante o pH.35 Haginaka e colaboradores concluram, em seu estudo de degradao utilizando temperaturas de 35, 60 e 100 C, que a mxima estabilidade para o AC ocorre a 35 C, com uma fora inica igual a =0,5 e em pH= 6,39. Alm disso, concluram que a constante de velocidade de degradao aumenta com o aumento da concentrao do tampo.37 Os autores tambm constataram que a degradao do AC em meio neutro e cido diferente da degradao que ocorre em meio bsico. Os mesmos autores estudaram a degradao do AC em soluo aquosa levemente alcalina a vrias temperaturas e identificaram quatro produtos de degradao (Figura 3) que so a 2,5-bis-(2-hidroxietil)pirazina (I), 3-metil-2,5-bis-(2-hidroxietil) pirazina (II), 3-(2-carboxietil)-2,5-bis-(2-hidroxietil)pirazina (III) e a 3-etil-2,5-bis-(2-hidroxietil)pirazina (IV). temperatura de 35 C no observada a formao do produto II, mas a 60 C todos os produtos foram observados e a 100 C o produto III no formado.38

Figura 3. Produtos de degradao do cido clavulnico

O trabalho realizado por Finn e colaboradores39 identificou e caracterizou o produto majoritrio resultante da hidrlise do AC em meio cido como sendo uma amino cetona. Em condies cidas, a amino cetona pode ser estvel, entretanto em solues neutras ou bsicas pode-se esperar que este composto sofra uma reao de condensao intermolecular, formando uma pirazina. Bersanetti e colaboradores concluram que a estabilidade do AC a 20 C e = 0,5 maior em pH = 6,0 e que a degradao ocorre mais rapidamente em solues bsicas do que em solues cidas.34 Verificaram tambm que as constantes de degradao do AC em solues aquosas so menores em relao s solues obtidas do meio de fermentao, isto devido presena de outros componentes do meio, tal como compostos que contm amnio.35 Muitas patentes40-42 descrevem que o AC pode ser extrado do caldo de fermentao por diferentes mtodos. O primeiro passo remover as clulas do meio, o que realizado atravs de filtrao ou centrifugao. Em seguida, feita uma extrao com solvente orgnico aps abaixar o pH da soluo aquosa entre 2-3 atravs da adio de cido, sob agitao. Estas patentes sugerem vrios solventes orgnicos como acetato de etila, n-butanol, metilisobutilcetona, acetato de n-butila, entre outros. Depois da separao das fases, o AC, presente na fase orgnica, re-extrado com uma nova fase aquosa onde podem ser utilizados tampo fosfato, soluo de bicarbonato de sdio, carbonato de clcio ou apenas gua, mantendo o pH prximo de 7. O extrato aquoso pode ser concentrado presso reduzida e liofilizado. O sal obtido estvel quando armazenado como um slido seco a 20 C. Para sua purificao pode-se utilizar resina de troca inica do tipo Amberlite IR4B ou Zerolite FFIF, at a

saturao da resina, a qual deve ser lavada com gua e com soluo de NaCl para eluir o AC. Essas patentes sugerem tambm que o AC ou o seu sal clavulanato pode ser convertido em um ster, atravs de uma reao de esterificao, podendo ser purificado em seguida por cromatografia de permeao em gel Sephadex LH20, utilizando-se como eluentes uma mistura de cicloexano e clorofrmio (1:1) e por cromatografia em Si gel utilizando como eluente cicloexano e acetato de etila (1:1). O ster obtido pode ser convertido em clavulanato de sdio ou potssio, atravs de uma reao de hidrogenlise utilizando como catalisador 10% Pd/C em soluo de NaHCO3 e etanol. A recuperao do sal feita por cristalizao. As patentes Fleming et al.43,44 sugerem que a purificao do AC deve ser feita pela sua converso em clavulanato de ltio com subsequente precipitao, a qual geralmente ocorre na forma cristalina. Esta precipitao possvel devido a grande afinidade dos ons clavulanato pelos ctions ltio, juntamente com insignificante coprecipitao de impurezas. Diminuindo-se a temperatura para cerca de 0-5 C, diminui-se tambm a solubilidade do clavulanato, o qual alcanar uma mxima precipitao em baixas temperaturas. A adio de solventes orgnicos, como acetona, metanol, etanol etc, contribui para a precipitao. A purificao do AC complexa devido presena de compostos com propriedades e comportamento similares ao AC. As patentes Cook,45 Kim et al.46 e Cardoso47 descreveram a precipitao do AC com o sal 2-etilexanoato de potssio ou sdio, como uma das etapas no processo de purificao do AC presente no meio de fermentao. Uma etapa de extrao com solvente orgnico realizada e a fase orgnica submetida a uma reao de precipitao, na qual ocorre a precipitao do AC com o 2-etilexanoato de potssio (sdio) com formao do sal clavulanato de potssio (sdio). Contudo, a reao direta do AC com o sal 2-etilexanoato de potssio muitas vezes no favorecida, ocasionando formao de leo e no do produto desejado, na forma de cristal. Outras patentes, como Capuder,48-50 Simon,51 e Callewaert52 sugerem uma etapa intermediria, visando diminuir a instabilidade da reao citada atravs da formao de um sal de amina do AC como intermedirio, o isolamento deste intermedirio e sua converso em AC geram um composto com alto teor de pureza. Entretanto, Kim et al.46 descreveram que, em geral, a maioria das aminas inadequada para a manufatura do sal de clavulanato, ou usadas como intermedirias, pois estes sais de amina so txicos e higroscpicos, e que tambm necessitam de grandes quantidades de solventes para que ocorra sua solubilizao para a reao posterior, dando origem ao clavulanato de potssio. Butterworth53 descreveu dois mtodos de purificao do AC a partir de caldos de fermentao. No primeiro, o caldo tem seu pH reduzido e a extrao do AC feita com solvente orgnico. A fase orgnica re-extrada com soluo de NaOH em pH 7. O extrato obtido aplicado em uma resina Amberlite XAD-4 para desmineralizar o meio, sendo ento obtido o clavulanato de sdio. No segundo mtodo, o caldo aplicado em uma resina de troca aninica e eludo com soluo salina, seguindo-se as etapas de adsoro em resina XAD-4 e Zerolite SRA 62. Segundo o autor, o meio desmineralizado em resina XAD-4. O produto final apresenta alto teor de pureza e obtido por liofilizao ou por cristalizao na soluo aquosa. Mayer et al.16 estudaram o uso de resina Amberlite XAD para a purificao do AC a partir do caldo fermentado. Foi observada uma fraca interao entre o cido clavulnico e a superfcie apolar das resinas. Estas resinas foram testadas em combinao com sais de amnio quaternrio com diferentes polaridades e formando pares inicos com o grupo cido da molcula de AC. Os autores concluram que a cromatografia com formao de par inico uma alternativa eficiente na purificao do AC e que a resina Amberlite XAD-4 com

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de Oliveira et al. Mecanismo de ao do cido clavulnico

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sais de amnio quaternrio mais eficiente em relao IRA 400. Um sistema de duas fases aquosas, constitudo de polietileno glicol (PEG) e tampo fosfato, foi desenvolvido por Videira et al.54 para extrao e purificao do AC. Observou-se que o clavulanato de potssio apresenta grande afinidade pela fase rica em PEG com elevados coeficientes de partio. O estudo foi realizado com PEG de diferentes massas moleculares e em diferentes valores de pH. Foi observado que o coeficiente de partio do AC maior em pH 8, porm sua degradao neste pH maior. At o momento no se conhece uma maneira de re-extrair o AC do PEG. Brites et al.55 compararam dois diferentes mtodos de extrao do AC do caldo de fermentao, a extrao por solvente orgnico e por sistema de duas fases aquosas (SDFA). Na extrao por solvente orgnico, vrios solventes foram estudados, como acetato de etila, acetato de butila, metilisobutilcetona, n-butanol e 2-butanol em diferentes pHs (de 2 a 5). Os sistemas de duas fases aquosas eram compostos por PEGs de massas moleculares diferentes (6000, 4000, 1000, 400 e 600), solues fosfato em dois valores de pH (6,0 e 7,0). Os dois mtodos foram comparados, utilizando-se o coeficiente de partio, os fatores de concentrao e de purificao e o rendimento. Os melhores resultados para o solvente orgnico foram a pH 2, pois a constante de ionizao do AC de 2,25. O melhor solvente em termos de coeficiente de partio foi o n-butanol (1,37), seguido do 2-butanol (0,91) e acetato de etila (0,58). Para os sistemas de duas fases aquosas o melhor coeficiente de partio ficou com o PEG 600 e PEG 6000 (15,5); em relao aos fatores de purificao e concentrao, os melhores resultados foram para o n-butanol. Silva et al.56 fizeram um estudo envolvendo a otimizao da extrao de AC usando SDFA. Os autores utilizaram um modelo experimental que permitiu avaliar o efeito de cada parmetro no coeficiente de distribuio, fator de purificao e rendimento, para que fosse possvel otimizar os parmetros de processo, determinando assim as melhores condies de purificao. Para a extrao do AC do caldo de fermentao por SDFA, o melhor rendimento ficou entre 90-100% e o fator de purificao entre 1,5-2,0. Os quatro parmetros que alcanaram um nvel timo de rendimento e fator de purificao foram PEG 400, pH 6,4, TLL (tie line length) 42 e rTTL (tie-line ratio) 1,3 correspondente a um SDFA com rendimento de cerca de 100% e fator de purificao de 1,5 para o AC. Estes resultados indicaram que o SFDA uma alternativa vivel para a purificao do AC, podendo ser integrada a outras operaes de purificao como ultrafiltrao, troca inica ou mesmo reaes de precipitao. Hirata et al.57 descreveram detalhadamente a reao citada em patentes sobre a precipitao do cido clavulnico proveniente do caldo de fermentao utilizando o sal 2-etilexanoato de potssio. Examinaram a influncia de diferentes concentraes de AC em diferentes concentraes de sal 2-etilexanoato de potssio durante as reaes de precipitao e verificaram que a concentrao combinada de 15 mg/mL de AC (solvente orgnico AcOEt) e 0,3 M de 2-etilexanoato de potssio favoreceu a precipitao de clavulanato de potssio com elevado grau de pureza e bom rendimento. Este estudo indicou que as concentraes dos reagentes interferem no rendimento, na estabilidade e na purificao dos cristais obtidos. Este trabalho foi o primeiro a fornecer detalhes sobre os mtodos de isolamento, as melhores condies para se efetuar a reao de precipitao do clavulanato de potssio, bem como as anlises por RMN realizadas para identificar o clavulanato de potssio obtido.57 Vale ressaltar que o AC uma molcula muito instvel com elevadas velocidades de degradao, o que dificulta seu processo de isolamento e purificao. Sua baixa estabilidade em solues aquosas faz diminuir o rendimento durante as etapas de purificao, como citam Barboza et al..58,59

Muitos antibiticos tm ligaes qumicas hidrolisveis cuja integridade fundamental para exercerem atividade biolgica. Existem muitos exemplos de enzimas que envolvem a quebra destas ligaes vulnerveis, destruindo a atividade do antibitico. Como as enzimas necessitam apenas de gua como cossubstrato, estas podem frequentemente ser excretadas pela bactria, interceptando os antibiticos, antes que eles entrem em contato com a mesma. O AC um potente inibidor das Ser-b-lactamases da classe A. Quando ele utilizado juntamente com antibiticos blactmicos, ocorre uma ligao irreversvel entre o grupo hidroxila da serina da b-lactamase e o cido clavulnico, produzindo um composto estvel, inativando a enzima e permitindo assim que o outro antibitico atue no combate a infeco, 11,15,60,61 como mostra a Figura 4.

Figura 4. Mecanismo de ao do cido clavulnico

CEFAMICINA C As cefamicinas pertencem a uma importante classe de compostos com atividade antibitica, isolada no incio da dcada de 70 pela Merck & Co Inc. e pela Eli Lilly & Co. O primeiro membro isolado desta famlia foi a cefamicina C (CefC), produzida por Nocardia lactamdurans62 e S. clavuligerus,63 bem como por vrios outros actinomicetos. As cefamicinas64 diferem das cefalosporinas pela substituio de um hidrognio, na posio 7a do anel bicclico, por um grupo metoxila e a cefamicina C foi o primeiro composto b-lactmico a ser isolado a partir de bactria. A atividade antibitica das cefamicinas est relacionada sua habilidade de se ligar a uma protena receptora no organismo susceptvel e, ento, inibir a sntese de sua parede celular. A estrutura b-lactmica inibe especificamente a atividade das enzimas transpeptidases.65 A CefC foi identificada, primeiramente, como inibidor de sntese de parede celular bacteriana.66 Posteriormente descobriu-se que este composto, alm de possuir esta atividade inibitria, resistente ao das b-lactamases e que o grupo 7a metoxila o responsvel por esta atividade. Este grupo atua como estabilizador da estrutura do anel b-lactmico, reduzindo a sensibilidade lactamase.65

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Enquanto a CefC ativa contra organismos Gram-negativos, no ativa contra os Gram-positivos, assim, esta molcula precisou ser quimicamente modificada para aumentar seu espectro de atividade antibitica. A troca da cadeia lateral aminoadipil na posio 7b da CefC por um grupo tienilacetil proporcionou o efeito desejado, o que resultou no composto semi-sinttico b-lactmico, cefoxitin. O cefoxitin, produzido pela Merck & Co Inc., amplamente usado no tratamento de infeces e na preveno de infeces ps-operatrias por bactrias resistentes penicilina. interessante o fato de que a introduo de um grupo metoxila na posio 6 resulta na perda da atividade biolgica.3 Alm do cefoxitin, outros antibiticos semi-sintticos so obtidos a partir da cefamicina C, como o cefometazol e o cefotetan, todos com excelente atividade contra bactrias Gram-negativas resistentes aos antibiticos b-lactmicos conhecidos.67 O cefminox, um antibitico de terceira gerao, foi obtido por uma modificao na posio 7b e uma metoxilao da posio 7a, por Iwamatsu et al.68 no Japo. O cefminox mais ativo que outras cefamicinas contra enterobactria e Bacterides fragilis, exibindo propriedades farmacocinticas favorveis. Contudo, muitas dificuldades so encontradas no processo qumico da 7a-metoxilao.69 A descoberta da CefC representa um marco no desenvolvimento dos antibiticos, pois pela primeira vez, uma molcula com atividade antibacteriana mostrou-se resistente a b-lactamases de bactrias Gram-negativas. A CefC no utilizada clinicamente, porm o precursor de vrios antibiticos de importncia teraputica, chamados cefmicos. S. clavuligerus, amplamente estudado por Liras,14 dos mais utilizados industrialmente tendo a capacidade de sintetizar tambm o AC. Porm diferentemente do AC, sua biossntese j conhecida, tendo vrias etapas em comum com aquelas da biossntese das cefalosporinas, incluindo a formao do tripeptdeo ACV como intermedirio.14 A CefC produzida por grandes empresas farmacuticas, como Eli Lilly & Co., Takeda Industries e Otsuka Pharmaceuticals.70,71 Para a produo da CefC so utilizados actinomicetos, sendo que apenas a Merck & Co. Inc. emprega Nocardia lactamdurans,4 este antibitico produzido por fermentao para depois ser transformado quimicamente, e no se encontra disponvel comercialmente nem mesmo sob a forma de reagente. Biossntese da cefamicina C A biossntese de antibiticos em culturas de actinomicetos em meios ricos em nutrientes segue um modelo de duas fases, caracterizado por uma fase de rpido crescimento onde se acumula biomassa, seguida da fase de produo dos antibiticos, na qual as enzimas utilizadas na sntese dos mesmos so formadas rapidamente e permanecem ativas por um certo perodo, at que decaem irreversivelmente. A demanda de oxignio dissolvido uma varivel crtica nos tanques de fermentao para que se obtenha boa produo de antibitico. Nas fermentaes onde so produzidas a CefC e a cefalosporina C, a reduo de oxignio leva ao acumulo de um dos intermedirios, a penicilina N, o que indica a baixa eficincia da converso deste intermedirio no produto final, que requer a introduo de oxignio molecular.72 Na biossntese das cefamicinas (Figura 5) so utilizados trs aminocidos como precursores, o cido L-a-aminoadpico, a L-cistena e a L-valina (tripeptdeo ACV), que se unem formando a estrutura b-lactama. A famlia das cefamicinas apresenta substituies no C-3 e no C-7. Uma substituio metoxi est sempre presente no C-7a de todas as cefamicinas e esta substituio confere a elas a capacidade de resistncia enzima b-lactamase. O grupo metila desta substituio vem do grupo metila da metionina.73 A segunda substituio no C-7 vem do cido a-aminoadpico. Existe tambm a substituio carbamoila, que deriva do fosfato de carbamoila.74

Figura 5. Biossntese da cefamicina C

Kern et al.75 propuseram que o tripeptdeo sintetizado a partir dos aminocidos individuais, sofrendo posterior ciclizao para formar a isopenicilina N, que convertida em penicilina N para depois formar o anel de seis membros, a desacetoxicefalosporina. Estes autores sugeriram que a expanso do anel a etapa limitante na sntese da CefC. A substituio metoxi no C-7 parece acontecer depois da expanso do anel.76 No se sabe quando ocorre a substituio no C-3, mas sabe-se que esta ocorre primeiro e que justamente ela que distingue as cefamicinas naturais das sintticas. Processos de isolamento e purificao da cefamicina C Alguns processos de purificao da CefC foram publicados.77,78 Schubert78 patenteou um processo de reciclagem eficiente que gera a CefC pura e com alto grau de rendimento. Neste processo, o caldo fermentativo tem seu pH ajustado a um valor entre 1,8-2,5 e em seguida submetido a uma filtrao. O filtrado obtido aplicado em uma coluna de resina de troca catinica e a coluna lavada com gua. A fase estacionria ento eluda com soluo de NaCl 10%. O material coletado tem seu pH ajustado para 7, o qual ento repassado pela coluna. Para que diminua a degradao qumica em pH = 7 abaixa-se a temperatura no processo de purificao. Este procedimento deve ser repetido de 10-15 vezes. A eficincia deste processo maior em relao ao processo de adsoro em carvo ativo79 e ao processo de troca inica sequencial.77 J a patente80 GB2052502A descreve que aps a centrifugao ou filtrao do caldo, o filtrado tem seu pH ajustado para 7-8 e ento submetido a uma cromatografia de troca catinica em resina Diaion PA 406; o material adsorvido eludo com NaCl 0,5 M. Segundo Miller et al.,81 aps a filtrao do caldo faz-se uma cromatografia de troca catinica Dowex 1x2 utilizando como eluente

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NaCl 5%. As fraes que apresentam atividade so reunidas e seu pH ajustado para 2 com HCl. Nova cromatografia realizada em resina Dowex 50x2 e como eluente usa-se piridina 2%. A amostra coletada concentrada e novamente cromatografada em resina Dowex 1x2, porm desta vez eluda com tampo piridina/HCl (0,1M, pH=5). A frao que apresenta atividade dessalinizada por cromatografia em Bio gel P-2 e ajusta-se o pH para 7. O rendimento de 66% e a CefC apresenta 40% de pureza. De acordo com Charcosset,82 so relatados vrios trabalhos utilizando membranas de microfiltrao de 0,45 a 0,22 m de dimetro de poro. Uma das vantagens da utilizao dessa tcnica de separao a obteno de altos valores de recuperao com altos rendimentos, devido possibilidade da realizao de dilise. O processo de ultrafiltrao muito utilizado para a retirada de macromolculas que interferem nos processos subsequentes. O autor sugere tambm que a ultrafiltrao pode ser utilizada para a remoo de emulsificao de caldos de antibiticos. Aps a etapa de filtrao podem ser utilizadas as tcnicas de extrao lquido-lquido e/ou cromatogrficas, tal como a permeao em gel. De acordo com Barboza et al.,58 para as cefalosporinas, antibiticos hidroflicos, a extrao lquido-lquido no muito eficiente devido sua alta solubilidade em gua. Neste caso utiliza-se a adsoro em resinas no funcionais do tipo Amberlite XAD-2 para a extrao do antibitico do meio de cultura. Poucos artigos so encontrados sobre a CefC, e muito pouco se sabe sobre seu isolamento e purificao. Algumas patentes referemse a seu isolamento, mas os procedimentos so descritos superficialmente; alm disso, a CefC no est disponvel comercialmente, dificultando sua anlise quanto degradao, solubilidade e outras caractersticas fsico-qumicas, as quais poderiam ser teis durante seu isolamento. Mecanismo de ao da cefamicina C Sabe-se que para a bactria sobreviver precisa se adaptar a vrias condies ambientais, tais como, pH, temperatura e presso osmtica, para isso necessrio que se tenha uma parede celular robusta. Como a parede celular no encontrada em clulas animais, essa um importante alvo para agentes antimicrobianos, como as penicilinas e cefalosporinas.3 Entretanto, muito difcil atravessar a parede das bactrias, devido sua formao, que pode agir como uma barreira protetora, por exemplo, a camada exterior pode ter carga positiva ou negativa, dependendo dos triglicerdeos constituintes, um excesso de fosfatidilglicerol pode resultar em uma carga aninica e, tambm, um excesso de lisilfosfatidilglicerol pode resultar em uma carga catinica. Como tanto as penicilinas quanto as cefalosporinas e as cefamicinas apresentam um grupo cido carboxlico livre, se esse grupo estiver ionizado, o composto ser repelido pela membrana celular, como mostra o Esquema 1. Os antibiticos podem conseguir penetrar na parede celular pelos canais de protena situados na membrana externa, porm muitos desses encontram-se sempre fechados.3 A parede celular das bactrias composta de peptidoglicanos, ou seja, feita de peptdeos e unidades de acar. A estrutura da parede celular consiste de um esqueleto de acares, contendo dois tipos de acares, o cido N-acetilmurmico (NAM) e a N-acetilglucosamina (NAG). As cadeias de peptdeo so ligadas ao NAM e, no passo final da biossntese da parede celular, essas cadeias de peptdeos se ligam pela substituio da D-alanina de uma cadeia pela glicina de outra cadeia. A enzima responsvel pela reao de ligao cruzada conhecida como transpeptidase (Esquema 2).3 Esse o passo final da reao cruzada que inibido pelas penicilinas e cefalosporinas, de forma que a estrutura da parede celular no fique unida. Como resultado a parede celular torna-se fraca, uma vez

Esquema 1. Esquema da parede celular de uma bactria. Adaptado da ref. 3

que a concentrao salina dentro da clula maior do que fora, com isso a gua penetra na clula, essa fica inchada e acaba se rompendo.3 Esse processo pode ser observado no Esquema 2.

Esquema 2. Esquema de formao da ligao cruzada para construo da parede celular de bactrias. Adaptado da ref. 3

Existe uma proposta em que a penicilina apresenta a mesma conformao da poro da cadeia de aminocido D-Ala-D-Ala envolvido na reao cruzada. Como este o centro de reao responsvel pela transpeptidase, essa uma teoria bastante interessante, uma vez que se acredita que por um erro da enzima a unidade D-Ala-D-Ala substituda por molculas de penicilina. Uma vez que o antibitico se encontra no stio ativo, a reao enzimtica ocorre com a penicilina.3 No mecanismo normal, a ligao amida entre as duas unidades alanina dividida. A unidade alanina terminal sai do stio ativo, deixando a cadeia peptdica ligada ao mesmo. A glicina terminal da cadeia pentaglicil entra no stio ativo e forma uma ligao peptdica com o grupo alanina, removendo o outro grupo alanina do stio.3 A enzima pode atacar o anel b-lactmico da penicilina e abrir o anel da mesma forma que feito com a ligao amida. Entretanto, como a penicilina cclica, essa no dividida e nada deixa o stio ativo. Subsequentemente, a hidrlise do grupo acil no ocorre, provavelmente porque a glicina no capaz de chegar at o stio de reao, pois a molcula de penicilina impede seu acesso, como pode ser visto no Esquema 3.3 Entretanto, ainda existem dvidas quanto a essa teoria uma vez que, por exemplo, a 6-metilpenicilina um anlogo bastante prximo D-Ala-D-Ala (Figura 6) e por isso deveria se encaixar melhor no stio ativo e ser mais ativa, mas, pelo contrrio, menos ativa.3

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AGRADECIMENTOS FAPESP (processos 04/15540-1, 05/55079-4 e 06/59474-8), ao CNPq e CAPES pelo apoio financeiro. REFERNCIAS
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Esquema 3. Mecanismo de ao normal e mecanismo inibido pela molcula de penicilina. Adaptado da ref. 3

Figura 6. Estruturas da penicilina, da 6-metilpenicilina e da Acil-D-Ala-D-Ala

Existe ainda uma proposta alternativa onde, na verdade, a penicilina no se liga ao stio ativo, mas se liga a um stio vizinho e isso impediria o acesso dos reagentes normais ao stio ativo isso conhecido como efeito guarda-chuva e pode ser visto no Esquema 4. Mesmo que um grupo nucleoflico ataque o anel b-lactmico, a penicilina permanece ligada irreversivelmente, bloqueando o acesso ao stio ativo permanentemente.3

Esquema 4. Mecanismo de ao alternativo da penicilina (efeito guardachuva). Adaptado da ref. 3

CONCLUSES Os antibiticos, de maneira geral, esto, estiveram ou, provavelmente, estaro presentes na vida de todos ns. A descoberta da penicilina, durante a 2 Guerra Mundial foi o que proporcionou a cura para muitos soldados que, sem ela, teriam pouca chance de sobreviver. Existem vrios grupos de pesquisa em todo o mundo estudando os antibiticos b-lactmicos, quer seja para compreender as etapas ainda desconhecidas da biossntese desses compostos, quer seja para tentar isolar novos compostos bioativos a partir de linhagens produtoras de antibiticos b-lactmicos ou, ainda, tentando melhorar a produo e/ou os processos de produo destes compostos. Qualquer que seja a linha de pesquisa, todas trazem informaes valiosas e que, sem dvida, enriquecem o conhecimento a respeito destes compostos.

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33. Nicholson, N. H.; Baggaley, K. H.; Cassels, R.; Davison, M.; Elson, S. W.; Fulston, M.; Tyler, J. W.; Woroniecki, S. R.; J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1994, 1281. 34. Bersanetti, P. A.; Barboza, M.; Hokka, C. O.; Araujo, M. L. G. C.; Resumos do XIII SINAFERM (Simpsio Nacional de Fermentaes), Terespolis, Brasil, 2000. 35. Bersanetti, P. A.; Almeida, R. M. R. G.; Barboza, M.; Araujo, M. L. G. C.; Hokka, C. O.; Biochem. Eng. J. 2005, 23, 31. 36. Mayer, A. F.; Hartmann, R.; Deckwer, W. D.; Chem. Eng. Sci. 1997, 52, 4561. 37. Haginaka, J.; Nakagawa, T.; Uno, T.; Chem. Pharm. Bull. 1981, 29, 3334. 38. Haginaka, J.; Yasuda, H.; Uno, T.; Nakagawa, T.; Chem. Pharm. Bull. 1985, 33, 218. 39. Finn, M. J.; Harris, M. A.; Hunt, E.; Zomaya, I. I.; J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 1984, 1345. 40. Cole, M.; Howarth, T. T.; Reading, C.; PS 1,508,977 1978. 41. Box, S. J.; US pat. 4,072,569 1978. 42. Box, S. J.; PS 1,563,103 1980. 43. Fleming, I. D.; Noble, D.; Wall, W. F.; PS 1,543,563 1979. 44. Fleming, I. D.; Noble, D.; Wall, W. F.; US pat. 4,367,175 1983. 45. Cook, M. A.; WO 05142 1997. 46. Kim, J. K.; Choi, N. H.; Choi, G. S.; Lee, D. W.; WO 34194 1995. 47. Cardoso, J. P.; WO 98/42858 1998. 48. Capuder, E.; US pat. 6,180,782B1 2001. 49. Capuder, E.; US pat. 2001/0007761A1 2001. 50. Capuder, E.; US pat. 5,780,274 1998. 51. Simon, R.; US pat. 6,172,221 2001. 52. Callewaert, G. L.; US pat. 5,786,351 1998. 53. Butterworth, D.; Biotech. Ind. Antibiot. 1984, 22, 225. 54. Videira, M.; Aires-Barros, M. R.; J.Chromatogr., A 1994, 668, 237. 55. Brites, L. M.; Hirata, D. B.; Pasotto, M. B.; Hokka, C. O.; Resumos do XX Congresso Mercosul de Engenharia Qumica (EMPROMER), Costa Verde, Brasil, 2005. 56. Silva, C. S.; Bovarotti, E.; Rodrigues, M. I.; Hokka, C. O.; Barboza, M.; Bioprocess Biosyst. Eng. (2008), doi:10.1007/s00449-008-0285-6. 57. Hirata, D. B.; Oliveira, J. H. H. L.; Leo, K. V.; Rodrigues, M. I.; Ferreira, A. G.; Giulietti, M.; Barboza, M.; Hokka, C. O.; Sep. Purif. Technol. 2009, 66, 598. 58. Barboza, M.; Almeida, R. M. R. G.; Hokka, C. O.; Ind. Eng. Chem. Res. 2002, 41, 5789; Barboza, M.; Almeida, R. M. R. G.; Hokka, C. O.; Bioseparation 2002, 10, 221; Barboza, M.; Maugeri Filho, F.; Hokka, C. O.; Bioprocess. Biosyst. Eng. 2002, 25, 193.

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