NOTA CIENTFICA

Atividade de Protenas Hemaglutinantes em Sementes de Leguminosas Arbreas da Flora Amaznica

Larissa Ramos Chevreuil1, Silvana CristAina Pando2 , Adamir da Rocha Nina Junior3, Adriana Bariani4, Jos Francisco de Carvalho Gonalves5 e Andr Luiz Wendt dos Santos6

Introduo
A diversidade da flora Amaznica vem sendo cada vez mais valorizada como fonte potencial de informaes ecolgicas, fisiolgicas, bioqumicas e genticas, por conseguinte, tem despertado grande interesse da comunidade cientfica quanto possibilidade de novas descobertas sobre produtos biolgicos [1,2]. Essa diversidade vegetal, quando devida e sistematicamente associada a metodologias que viabilizem a obteno de biomolculas como protenas, em particular lectinas, podem exibir elevado potencial de aplicao industrial, fato que significa o verdadeiro equilbrio entre o uso e a preservao do ambiente florestal [3]. As lectinas so protenas ou glicoprotenas capazes de interagir especfica e reversivelmente com carboidratos, aglutinar clulas animais e/ou vegetais e precipitar polissacardeos, glicoprotenas ou glicolipdeos [4,5]. As lectinas de leguminosas esto entre as classes de protenas vegetais mais estudadas, pois correspondem de 2 a 10% das protenas solveis de sementes maduras e dentre as funes das lectinas destaca-se a toxicidade destas protenas contra vrias espcies de fungos fitopatognicos e insetos [6,7]. Portanto, o objetivo desse estudo foi caracterizar a atividade de protenas hemaglutinantes em extratos de sementes de duas leguminosas da flora amaznica.

as sementes de ambas as espcies foram conduzidas ao Laboratrio de Fisiologia e Bioqumica Vegetal do INPA V8 (Manaus AM). B. Isolamento de protenas (extrao salina) As sementes inteiras, aps assepsia foram trituradas at a obteno de um material pulverizado, o qual foi homogeneizado em soluo de cloreto de sdio (NaCl) 0,15 M (10% p/v). A suspenso foi mantida sob agitao por 2 horas temperatura ambiente para a extrao das protenas, e centrifugada a 5000 x g, por 20 minutos a 4C e filtrada em gaze. O sobrenadante, aps dilise durante 48 horas, foi utilizado para as etapas posteriores. C. Preparo dos eritrcitos As amostras de sangue foram obtidas de diferentes espcies de animais saudveis, e aps a coleta foram imediatamente misturadas com uma soluo anticoagulante, contendo 2,05% de glicose, 0,8% de citrato de sdio e 0,42% de NaCl, para evitar a coagulao. O pH desta soluo foi ajustado para 6,1 usando cido ctrico. Os eritrcitos foram lavados por quatro vezes com soluo salina (0,15M de NaCl, a 1000 x g durante 10 minutos a 4 C,). O precipitado foi ressuspendido na mesma soluo de modo a obter uma suspenso final de eritrcitos a 2% (v/v) D. Deteco da Atividade Hemaglutinante (AHE). A atividade hemaglutinante nos extratos totais foi identificada, utilizando eritrcitos de diferentes animais, previamente preparados como descrito acima. Para a deteco da AHE nos extratos totais de S. exasperata e T. plumbea, utilizou-se eritrcitos provenientes de camundongo, hamster e rato branco, com o propsito de selecionar aquele com maior susceptibilidade hemaglutinao. O ensaio foi realizado em placas de microtitulao com 8 fileiras de 12 poos cada, totalizando 96 poos. O volume final do ensaio foi de 150 l, contendo 50 l de soluo salina; 50 l da suspenso de eritrcitos a 2% e 50 l dos extratos proticos em estudo. Os resultados foram analisados visualmente, aps incubao overnight em geladeira (10C), comparando-se com os respectivos controles

Material e mtodos
A. Material vegetal Neste estudo foram selecionadas duas espcies de leguminosas florestais da Amaznia: Tachigali plumbea Ducke e Sesbania exasperata H. B. K., pertencentes famlia Leguminosae Caesalpinioideae e Papilionoideae, respectivamente. As sementes de T. plumbea (tachi da terra firme) foram coletadas na Estao Experimental de Silvicultura Tropical (EEST / INPA), localizada no Km 45 da Br-174, 23545 S e 601240 W, (Manaus Boa Vista) e as sementes de S. exasperata (cssia do brejo) foram coletadas na vrzea da Ilha da Marchantaria, localizada no rio Solimes, prximo a Manaus (314S e 5957W). Aps as coletas,

________________ 1. Bolsista IC/CNPq. Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia (INPA), Laboratrio de Fisiologia e Bioqumica Vegetal - Campus V8, Av. Efignio Salles, s/n, V8, Manaus, AM, CEP 69060-020. E-mail: larissachevreuil@gmail.com 2. Professora do Departamento de Cincias Fisiolgicas, Universidade Federal do Amazonas (UFAM), Av. Gen. Rodrigo Octvio Jordo Ramos, 3000, Campus Universitrio, Reitoria. Bairro Coroado I. CEP 69077-000. Manaus/AM.. E-mail: silvana.pando@uol.com.br 3. Bolsista IC/CNPq. Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia (INPA), Laboratrio de Fisiologia e Bioqumica Vegetal - Campus V8, Av. Efignio Salles, s/n, V8, Manaus, AM, CEP 69060-020. E-mail: adamirjr@gmail.com 4. Estudante de mestrado em Cincias de Florestas Tropicais, Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia (INPA), Laboratrio de Fisiologia e Bioqumica Vegetal - Campus V8, Av. Efignio Salles, s/n, V8, Manaus, AM, CEP 69060-020. E-mail: bariani@inpa.gov.br 5. Pesquisador Adjunto, Departamento de Silvicultura Tropical, Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia (INPA), Laboratrio de Fisiologia e Bioqumica Vegetal - Campus V8, Av. Efignio Salles, s/n, V8, Manaus, AM, CEP 69060-020. E-mail: jfc@inpa.gov.br 6. Bolsista ProDoc/CAPES., Programa de Cincias de Florestas Tropicais, Instituto Nacional de Pesquisas da Amaznia (INPA), Laboratrio de Fisiologia e Bioqumica Vegetal/Campus V8, Av. Efignio Salles, s/n, V8, Manaus, AM, CEP 69060-020. E-mail: alwsantos@yahoo.com.br

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negativos, contendo somente a suspenso de eritrcitos a 2%, preparados em soluo salina. As hemcias susceptveis hemaglutinao pelos extratos, foram utilizadas para os ensaios de inibio por acares. E. Inibio da Atividade Hemaglutinante Uma soluo de 50 l de extrato protico das espcies estudadas foram pr-incubadas durante 1 (uma) hora com igual volume de solues 0,1M de diferentes acares (glicose, lactose, sacarose e galactose), seguida da adio de 50 l de soluo salina. Aps este perodo, 50 l de uma suspenso de eritrcitos de animais (2%) foram adicionadas em cada poo da placa de microtitulao. As placas foram incubadas overnight em geladeira (10C) antes da anlise dos resultados. F. Dosagem de protenas: As concentraes relativas de protenas dos extratos foram estimadas pelo mtodo descrito por Bradford [8]. G. Eletroforese em SDS-PAGE: A anlise eletrofortica foi realizada segundo Laemmli [9].

Quanto ao perfil protico dos extratos totais de S. exasperata e T. plumbea, foi possvel detectar maior ocorrncia de protenas com massa molecular aparente entre 30 kDa e 10 kDa (Fig. 8). Adicionalmente, na presena do DTT (ditiotreitol), no houve a separao de subunidades proticas, indicando a no ocorrncia de protenas oligomricas nos extratos. Considerando que a massa molecular das subunidades da lectina de legume est em torno de 30 kDa, sugere-se que as espcies em estudo apresentem lectinas. No entanto, ensaios de caracterizao das fraes proticas sero realizados para confirmar estes resultados.

Referncias
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Resultados e Discusso
A hemaglutinao dos diferentes eritrcitos ocorreu na presena de 5,3 g e 1,6 g de protenas totais provenientes de S. exasperata e T. plumbea, respectivamente. Aps diluio serial desses extratos foi possvel observar que a concentrao mnima para promover a hemaglutinao dos eritrcitos testados foi de 0,33 g e 0,8 g de protena, respectivamente, sugerindo que protenas da classe das lectinas podem estar presentes nos extratos totais destas espcies (Fig. 1, 2 e 3). Considerando os resultados de inibio da atividade hemaglutinante com eritcitos de camundongo e os quatro tipos de acares, foi possvel observar para a espcie T. plumbea, que a glicose no foi capaz de inibir a atividade hemaglutinante da lectina (Fig. 4, linhas c e d). Resultados similares foram obtidos na presena de lactose, sacarose e galactose, indicando que esses acares no inibem a AHE das lectinas de T. plumbea (Fig. 5, 6 e 7, linhas c e d). Por outro lado, os resultados acima mencionados, de certa forma, so semelhantes a aqueles encontrados para a lectina de Caesalpinia tinctoria, uma espcie leguminosa [10].

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1022 1 a b c Figura 1. Ensaio de deteco da atividade hemaglutinante nos extratos totais com eritrcitos de camundongo. Legenda: a controle (sem extrato protico), b S. exasperata e c T. plumbea; 1 6: sem diluio serial e 7 12: com diluio serial. 1 a b c Figura 3. Ensaio de deteco da atividade hemaglutinante nos extratos totais com eritrcitos de rato branco. Legenda: a controle (sem extrato protico), b S. exasperata e c T. plumbea; 1 6: sem diluio serial e 7 12: com diluio serial. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 a b c Figura 2. Ensaio de deteco da atividade hemaglutinante nos extratos totais com eritrcitos de hamster. Legenda: a controle (sem extrato protico), b S. exasperata e c T. plumbea; 1 6: sem diluio serial e 7 12: com diluio serial. 1 a b c d Figura 4. Ensaio de inibio da atividade hemaglutinante nos extratos totais, utilizando eritrcitos de camundongo na presena de glicose. Legenda: a controle negativo: salina + eritrcito; b controle positivo: salina + eritrcito + extrato; c e d ensaio: salina + eritrcito + extrato de T. plumbea + glicose. 1 a b c d Figura 6. Ensaio de inibio da atividade hemaglutinante nos extratos totais, utilizando eritrcitos de camundongo na presena de sacarose. Legenda: a controle negativo: salina + eritrcito; b controle positivo: salina + eritrcito + extrato; c e d ensaio: salina + eritrcito + extrato de T. plumbea + sacarose. Figura 5. Ensaio de inibio da atividade hemaglutinante nos extratos totais, utilizando eritrcitos de camundongo na presena de lactose. Legenda: a controle negativo: salina + eritrcito; b controle positivo: salina + eritrcito + extrato; c e d ensaio: salina + eritrcito + extrato de T. plumbea + lactose. 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 a b c d

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1 a b c d

10

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Figura 7. Ensaio de inibio da atividade hemaglutinante nos extratos totais, utilizando eritrcitos de camundongo na presena de galactose. Legenda: a controle negativo: salina + eritrcito; b controle positivo: salina + eritrcito + extrato; c e d ensaio: salina + eritrcito + extrato de T. plumbea + galactose.

A B Figura 8: Perfil eletrofortico em SDS PAGE 12,5%. A: 20g de extrato protico de S. exasperata e B: 36 g de extrato protico de T. plumbea, em condies no redutoras (-) e redutoras - DTT (+). Marcador de massa molecular: Bench Mark Protein Ladder (160 kDa 10 kDa). kDa: kilo Dalton. As bandas de protenas foram coradas com nitrato de prata. Revista Brasileira de Biocincias, Porto Alegre, v. 5, supl. 2, p. 1020-1022, jul. 2007