DIVISIN CELULAR: MITOSIS Y CITOCINESIS

OBJETIVOS: 1.- Estudiar la divisin celular en clulas somticas. 2.- Aprender los mtodos para observar la mitosis al microscopio compuesto. 3.- Reconocer las cuatro fases principales de la mitosis. CONTENIDO: - El proceso de divisin celular: mitosis y citocinesis. - Fases de la mitosis: profase, metafase, anafase y telofase. - Los cromosomas como unidad fsica hereditaria. - Preparacin de lminas de tejido meristemtico subapical (raz). INTRODUCCIN: Los organismos eucariticos unicelulares se multiplican por divisin celular, mientras que los organismos pluricelulares crecen por divisin celular. Las clulas eucariticas de carcter vegetativo tienen dos conjuntos homlogos de cromosomas 2n (diploides), debido a que cada progenitor aporta un conjunto de cromosomas, que representa el nmero mnimo de cromosomas n (haploide), de la especie correspondiente. La divisin celular involucra dos procesos: el primero es la divisin del ncleo o mitosis, durante la cual el material gentico del ncleo, que ha sido previamente duplicado durante la interfase, se divide dando origen a dos nuevos ncleos idnticos; el segundo es la divisin del citoplasma o citocinesis, durante la cual se forma una nueva pared celular que separa en entidades celulares independientes los dos ncleos recin formados, originndose de esta manera dos nuevas clulas. La mitosis es un proceso continuo en el cual se distinguen convencionalmente cuatro etapas: profase, metafase, anafase y telofase, que se reconocen por el arreglo de los cromosomas en el citoplasma. El lapso entre una divisin y otra se denomina interfase (fig. 4a). Existen sustancias qumicas capaces de provocar alteraciones en la divisin celular, tanto de la mitosis como de la citocinesis. Una de estas sustancias es la cafena, un alcaloide que en altas dosis inhibe la formacin de la nueva pared celular durante la citocinesis, dando como resultado clulas binucleadas, dependiendo del tiempo de accin al que haya sido sometido el tejido meristemtico al alcaloide. Cuando la cafena acta por tiempos muy prolongados puede inhibir dos citocinesis seguidas y producir clulas tetranucleadas. Otra sustancia capaz de alterar la divisin celular es la colchicina, tambin un alcaloide que acta como inhibidor de la mitosis a nivel de la metafase, ya que impide la formacin del huso acromtico y, por lo tanto, evita la separacin de las cromtidas hermanas y su migracin a los polos de la clula. La

colchicina se utiliza para el estudio de la mitosis ya que acumula las clulas en metafase. Las clulas sometidas a la accin de la colchicina que se originan despus de un tratamiento prolongado por ms de un ciclo celular pueden ser tetraploides (4n), pues se duplica el material gentico (los cromosomas), pero al inhibirse la formacin de las fibras del huso acromtico no migran las cromtidas hermanas para formar dos ncleos independientes, de forma que se restituye una membrana nuclear alrededor de un ncleo con contenido multiplicado. El tejido ms comnmente utilizado para el estudio de la mitosis es el meristema de las races nuevas (fig. 4b). En esta prctica se utilizarn races de cebolla, (Allium cepa). Hay que tener en cuenta que la actividad mittica vara durante el da, por lo que lo ms correcto es verificar previamente la intensidad de la actividad mittica contra las horas del da. Esto permite determinar el momento en el que el meristema muestra el mayor nmero de divisiones. Se encontrarn ms figuras mitticas si la fijacin del material no se hace al azar sino a la hora del da en que el grfico muestra un pico de mitosis. Sin embargo, como siempre hay clulas en divisin, esto no es absolutamente indispensable. Por lo general, en el trpico, las horas ptimas de actividad mittica van desde el amanecer hasta las 10:30 a 11 am, con un ptimo alrededor de las 9 o 10 de la maana. Por lo tanto, es a esa hora en que se realizar la colecta de races en crecimiento, seguida de la fijacin en una mezcla de etanol absoluto-cido actico glacial en proporcin 3:1 y su posterior refrigeracin a 4 C por un mnimo de 24 horas.

4a (http:// www.bio.miami.edu/dana/250/mitosis.jpg)

4b (http://www.uc.cl/sw_educ/biologia/bio100/html/portadaMlval10.1.2.html) Figura 4. a.- Clulas mostrando interfase y las diferentes fases de la mitosis: profase, metafase, anafase y telofase. b.- Seccin longitudinal de raz mostrando las distintas zonas. MATERIALES: 1.- Races de cebolla, las cuales se inducen en bulbos colocados en contacto con agua y en oscuridad durante 5 das a temperatura ambiente. Para facilitar la aparicin de las races se raspa ligeramente con una hojilla la zona basal del bulbo para separar el tejido seco. Las races se cosechan a las 9 y 30 am, fijndose de inmediato en Carnoy 3:1 etanol: cido actico glacial) y se guardan en la nevera por lo menos por una noche a 4 C. 2.- Portaobjetos, cubreobjetos, vidrios de reloj o cpsulas de Petri, pinzas, agujas de diseccin, hojillas, pipetas Pasteur, papel de filtro y servilletas de papel absorbente, esmalte de uas transparente. .

3.- Agua destilada, cido clorhdrico 50% en agua destilada, carbolfucsina modificada u orcena actica al 1% (en cido actico de 45%), glicerina 50% en agua destilda fenolada. MTODOS: La preparacin de las lminas se realizar de acuerdo al siguiente protocolo: 1.- Lavar las races para eliminar el fijador. Para ello coloque las races en un vidrio de reloj o en una cpsula de Petri con agua destilada por 5 minutos. Realice tres cambios de agua destilada, para un total de 15 min de proceso de lavado. 2.- Maceracin: para ello elimine el agua destilada y aada HCl al 50%, y deje actuar por durante 15 minutos, o por el tiempo mnimo suficiente para que el tejido radical se ablande. La maceracin provoca la disgregacin celular del tejido meristemtico, por degradacin de la lamela media de la pared celular, permitiendo una buena separacin de las clulas. Este paso es muy sensible al tiempo transcurrido: si se deja actuar demasiado al cido, ste digiere completamente la lamela media y penetra en el interior celular comenzando la degradacin del protoplasto y su contenido; por el contrario, si el tiempo de accin del cido no es suficiente, no se lograr la degradacin de la lamela media y la consecuente disgregacin del tejido meristemtico y las clulas no podrn por tanto disponerse en una monocapa luego de su separacin, por lo que los resultados sern lminas con clulas superpuestas, donde es imposible distinguir las diferentes fases mitticas. 3.- Lavar las races para eliminar el HCl, utilizando 3 cambios de agua destilada de 5 minutos cada uno, para un total de 15 min de proceso de lavado. Es importante el lavado del HCl pues ste interfiere con la coloracin de los cromosomas. 4.- Disgregacin: aadir una gota de cido actico al 45% en una lmina portaobjetos, luego colocar la raz, cortar con una hojilla y conservar los 2 mm terminales del lado del meristema (del lado de la caliptra o cofia) y eliminar el resto de la raz. El meristema se distingue por ser ms blanco. Con un par de agujas finas se disgrega el meristema en tiras finas como mechas y se elimina en lo posible la caliptra terminal, dejando lo ms limpio y disgregado posible el tejido meristemtico. ES MUY IMPORTANTE NO DEJAR NUNCA QUE EL MATERIAL SE SEQUE EN LA LMINA PORTAOBJETOS. 5.- Ponga una gota de colorante (carbolfucsina u orcena) sobre el material disgregado. Espere 1 a 3 minutos, cuidando en todo momento que el material no se seque y monitoreando bajo la lupa el avance del proceso de coloracin. 6.- Cuando las tiras de tejido hayan adquirido coloracin uniforme tape el preparado con un cubreobjetos teniendo cuidado que no entre aire. Espere un minuto.

7.- Coloque la lmina entre hojas de papel de filtro o una servilleta absorbente y presione con la yema del dedo pulgar firmemente contra la superficie plana y uniforme de una mesa, pero con cuidado de no romper la lmina, y sobre todo, de no mover lateralmente el cubreobjetos mientras se ejerce la presin; el movimiento lateral del cubreobjetos genera el enrollamiento de las clulas meristemticas disgregadas sobre el portaobjeto, generando la prdida de la preparacin. 8.- Realice las observaciones bajo el microscopio, comenzando por ubicar las agrupaciones de clulas meristemticas sobre el portaobjetos para luego cambiar a un aumento de observacin mayor e identificar las distintas fases que caracterizan la divisin celular (interfase y mitosis) y de la mitosis (profase, metafase, anafase y telofase).

BIBLIOGRAFA: JIMNEZ MARTN, G.; GONZALEZ, A. y J. A. LOPEZ. 1965. New method of labeling cells. J. Cell Biol. 26: 305-309. LINDORF, H.; L. Parisca y P. Rodrguez. 1985. Botnica. Clasificacin, Estructura, Reproduccin. EBUC. Caracas. Cap. V. RAVEN, P.H.; R.F. Evert y S.E. Eichhorn. 1999. 6a. Ed. W.H. Freeman and Co. Worth Publishers. New York. Cap. 8. SHARMA, A.K. y A. Sharma. 1972. Chromosome Techniques, Theory and Practice. 2a Ed. Butterworths-University Park Press. London-Baltimore. STRASBURGER, E.; F. Noll; H. Schenck & A.F.W. Schimper. 1986. Tratado de Botnica. 7 Ed. Marn. Barcelona. Cap. 1. Pg.49.

Gua-Informe Prctica de Divisin Celular

NOMBRE: Fecha:

CDULA:

OBSERVACIONES: 1.- En las lminas preparadas a partir de meristema de races de cebolla (Allium cepa), localice las cuatro fases principales de la mitosis y clulas en interfase. Dibuje cada fase y describa brevemente qu caracteriza a cada fase.

INTERFASE: Aumento:

PROFASE: Aumento:

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METAFASE: Aumento:

ANAFASE: Aumento:

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TELOFASE: Aumento:

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2.-Utilizando aumento mediano y para tres campos diferentes cuente las clulas que se encuentran en cada una de las fases de la mitosis: Profase, metafase, anafase, telofase y tambin las que aparecen en interfase. Campo 1 Interfase Profase Metafase Anafase Telofase Campo 2 Campo 3

3.-Calcule el ndice mittico (IM) utilizando los datos anteriores, de acuerdo a la siguiente frmula: IM= Nmero total de clulas en mitosis x 100 Nmero total de clulas

El ndice mittico da una idea de la velocidad de divisin de un tejido.