PROCEDIMENTO DE OPERAO PADRO - POP

TTULO: ANLISE DE COLIFORMES TOTAIS TERMOTOLERANTES POR MEMBRANA FILTRANTE CONTROLE E MICROBIOLGICO P.O.P. N.: CMI 003 PG.: 1/7 DATA: 15/10/10

1. OBJETIVO Definir um procedimento para a anlise de coliformes totais e termotolerantes pela tcnica de membrana filtrante.

2. ALCANCE Este procedimento se aplica a anlise de coliformes pelo Laboratrio de Controle de Qualidade Microbiolgico.

3. POLTICA poltica da empresa cumprir com as Boas Prticas de Laboratrio.

4. RESPONSABILIDADES responsabilidade da Chefia de departamento e da Chefia de setor orientar seus funcionrios para a correta execuo deste procedimento. responsabilidade dos funcionrios do Controle de Qualidade Microbiolgica cumprirem com o estabelecido neste procedimento. responsabilidade de quem o elabora e de quem o revisa atualizar e manter vigente este procedimento.

5. DEFINIES Coliformes totais: bacilos Gram - negativos, oxidase negativos, capazes de crescer na presena de sais biliares ou agentes tensoativos (como lauril sulfato de sdio) e de fermentar a lactose a 35-37C, com produo de gs e aldedo, em 24 horas. A maior parte das bactrias do grupo coliforme pertencem aos gneros Escherichia, Klebsiela, Enterobacter e Citrobacter. Podem ocorrer no meio ambiente, fezes humanas, em guas com alta concentrao de matria orgnica, solo ou vegetao em decomposio. Coliformes termotolerantes( ou fecais): microorganismos capazes de fermentar a lactose a 44-45C sendo representados principalmente pela Escherichia coli (fecal), e algumas bactrias dos gneros Klebsiela, Enterobacter e Citrobacter. Somente Escherichia coli dentre estes microorganismos de origem exclusivamente fecal, estando presente em densidades elevadas nas fezes humanas,
ELABORADO:
Stelamaris B. Ribeiro

REVISADO:
Patricia C. Beneli

APROVADO CHEFIA:
Antonio C. A. Canabarro

SUBSTITUI A:

Controle Microbiolgico

Controle Microbiolgico

Reginaldo Schiavi

NOVO

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mamferos e pssaros, sendo raramente encontrada na gua ou no solo que no tenham recebido contaminao fecal. Os demais, podem estar presentes com alto teor de matria orgnica (efluentes industriais), ou em material vegetal ou solo em decomposio.

6. MATERIAL E EQUIPAMENTO - ala plstica estril (loop) - bandejas de plstico ou ao inox - bquer 50mL, 100mL - bico de Bunsen ou similar - bolsas plsticas para coleta das amostras 120 mL - bomba vcuo - caixa para esterilizao de ponteiras - cilindros inox para esterilizao de placas de Petri - equipamento ou sistema de filtrao - estantes de inox para tubos de ensaio - estantes revestidas de PCV para bolsa plstica de coleta - estojo inox para esterilizao de pipetas - frascos para gua de lavagem 100mL, 250mL, 300mL, 500mL, 1000mL - frascos para coleta das amostras de 250mL - hastes de madeira esterilizadas - incubadora bacteriolgica ( 35C 2C) - micropipetador 100 a 1000L - microscpio estereoscpico binocular, com iluminao fluorescente - papel alumnio - pinas de ao inox com extremidades arredondadas - pipetas graduadas de 1mL, 5mL - placas de Petri 60 x 15 mm - placas de Petri descartveis 60 x 15 mm - ponteiras universais 100 a 1000L - provetas graduadas de 100mL, 250mL - membranas filtrante estreis, brancas, quadriculadas, com 47 mm de dimetro e porosidade 0,45m (para a determinao de coliformes totais)

6.1. Reagentes - gua destilada estril, confrome CMI-005 - gua fosfatada uso esterilizada, conforme CMI 005 - lcool etlico 95%
ELABORADO:
Stelamaris B. Ribeiro

REVISADO:
Patricia C. Beneli

APROVADO CHEFIA:
Antonio C. A. Canabarro

SUBSTITUI A:

Controle Microbiolgico

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- lcool etlico a 70% - caldo EC Medium preparado conforme CMI 001 - caldo lactose ou caldo lauril sulfato com prpura de bromocresol , concentrao simples, conforme CMI 001 - caldo verde brilhante com 2% de bile, confome CMI 001 - placas de Petri contendo o meio M-Endo Agar Les preparadas conforme CMI 001 - testes descartveis com o meio M-Endo (Nutrient pad sets) - tiossulfato de sdio 1,8%

7. DIAGRAMA DE FLUXO

ELABORADO:
Stelamaris B. Ribeiro

REVISADO:
Patricia C. Beneli

APROVADO CHEFIA:
Antonio C. A. Canabarro

SUBSTITUI A:

Controle Microbiolgico

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Amostra

Filtrao

M-Endo Agar Les 35C / 24 horas

Colonias tpicas (com brilho metlico)

Ausncia de colnia teste negativo p/ coliformes Lactose / Lauril Sulfato 24h-48h/ 35C

Colnias atpicas Ausncia de coliformes

Produo de gs

Ausncia de gs Teste negativo para coliformes

Caldo Verde Brilhante e Bile 35C / 24h -48h

Meio EC 44,5C / 24h

Produo de gs Teste positivo para Coliformes totais

Ausncia de gs Teste negativo para Coliformes totais

Produo de gs Teste positivo para Coliformes termotolerantes

APROVADO CHEFIA:
Antonio C. A. Canabarro

Ausncia de gs Teste negativo para Coliformes termotolerantes

SUBSTITUI A:

ELABORADO:
Stelamaris B. Ribeiro

REVISADO:
Patricia C. Beneli

Controle Microbiolgico

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8. PROCEDIMENTO 8.1. Preparao: 8.1.1 Antes de iniciar a anlise desinfete a bancada de trabalho com lcool a 70%. 8.1.2. Disponha na bancada de trabalho o equipamento de filtrao com porta filtro, placas de Petri de de 60 x 15 mm contendo meio M-Endo Agar Les (para determinao de coliformes totais), identifique-as com o nmero da amostra ou a identificao da amostra e a data, disponha tambm a gua de lavagem estril, contida em frascos, para enxge, pinas com as extremidades arredondadas, podendo flamb-las com lcool etlico contido em um bquer. Deixe prximo tambm as membranas filtrantes estreis, brancas, quadriculadas, com 47 mm de dimetro e porosidade de 0,45m. Os bicos de Bunsen, acesos prximos, permitem manter um ambiente assptico e efetuar a flambagem das pinas utilizadas. NOTA: Esta anlise pode ser realizada em cmara de segurana biolgica classe II sem o uso de bico de Bunsen, as pinas estreis, se disponveis em nmero suficiente, podem ser utilizadas individualmente por ponto de coleta. 8.1.3. Quando utilizadas as placas de testes descartveis com o meio M-Endo (Nutrient pad sets), disponha na bancada as placas, gua destilada estril, pipetas, pra ou ponteiras e micropipetador para hidrat-las. A hidratao deve seguir as orientaes do fornecedor. No inverta estas placas para a incubao. 8.2. Anlise: 8.2.1. Homogenize a amostra, no mnimo 25 vezes, inclinando o frasco at formar um ngulo de 45 entre o brao e o antebrao, e coloque 100 mL de gua a ser filtrada. NOTA: Caso o porta filtro no seja graduado, h necessidade de dosagem prvia do volume a ser filtrado, nesta situao utilize uma proveta graduada estril (100 mL), com a abertura recoberta pelo papel alumnio da esterilizao, e marque o filtro para as prximas amostras. 8.2.2. Retire a parte superior do porta-filtro e, com uma pina flambada e esfriada, coloque, na base do suporte do filtro, uma membrana estril, com a face quadriculada voltada para cima. 8.2.3. Recoloque a parte superior do porta filtro, tendo o cuidado para no danificar a membrana. Ajuste e rosqueie. 8.2.4. Verta cuidadosamente no porta-filtro o volume da amostra a ser examinado, evitando que a gua respingue nas paredes do filtro. NOTA: Se o volume da amostra a ser filtrado for inferior a 20 mL, necessrio adicionar ao porta-filtro 20 mL a 30 mL de gua de diluio estril, antes de adicionar o volume da amostra. 8.2.5. Proceda filtrao da amostra, ligando a bomba vcuo. 8.2.6. Enxge a membrana com pores de 20 a 30 mL de gua de diluio estril. 8.2.7. Desligue a bomba vcuo, ao finalizar a operao. Evite a secagem excessiva da membrana filtrante.

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8.2.8. Com o auxlio da pina flambada e fria, retire a membrana do filtro, tomando o cuidado para que a pina toque apenas a parte perifrica da membrana. 8.2.9. Obedecendo aos cuidados de assepsia, coloque a membrana sobre o meio de cultura MEndo Agar Les, evite a formao de bolhas de ar entre a membrana e o meio de cultura, pois pode prejudicar o crescimento das colnias de bactrias. 8.2.10. Lave o filtro com 20 a 30 mL de gua de diluio, antes de colocar a prxima membrana para filtrar outra amostra. NOTA: Cada unidade de filtrao deve ser usada at no mximo para 30 amostras de gua, sucessivamente. Quando o intervalo, entre uma amostra e outra, ultrapassar 30 minutos, usar nova unidade de filtrao. 8.2.11. Aps a filtrao das amostras, coloque as placas em posio invertida, em bandejas forradas com papel toalha umedecido. 8.2.12. Incube as placas, em estufa de incubao, a 35 2C por 24 + 2 horas. 8.2.13. Aps a incubao, faa a leitura das amostras.

8.3. Resultados: 8.3.1. Uma placa que no apresente formao de colnias na membrana significa ausncia para coliformes totais. 8.3.2. Uma placa que apresente formao de colnias atpicas (incolores at vermelho escuras, sem brilho metlico em sua superfcie), ausncia de coliformes totais. 8.3.3. Uma placa que apresente formao de colnias tpicas (de colorao rosa a vermelho escuro, com brilho verde metlico superficial recobrindo toda colnia ou parte dela), presena de coliformes totais. 8.3.4. Para confirmar se dentre estes coliformes totais existem coliformes termotolerantes proceda confirmao das colnias.

8.4. Confirmao da presena de termotolerantes: 8.4.1. Passe o inculo da placa com colnias tpicas para o caldo lactosado, incube por 24 a 48 horas a 35 + 2C. 8.4.2. Na ausncia de formao de gs o teste negativo para coliformes. 8.4.3. Se houve produo de gs passe o inculo do caldo lactosado para o meio EC e incube a 44,5 C por 24 horas, passe o inoculo do caldo lactosado para o meio Verde Brilhante e Bile e incube por 24 a 48 horas a 35 C. 8.4.4. No caldo verde brilhante e bile: se houve produo de gs o teste positivo para coliformes totais, na ausncia de gs o teste negativo para coliformes totais.

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8.4.5. No caldo EC: se houve produo de gs o teste positivo para coliformes termotolerantes, na ausncia de gs o teste negativo para coliformes termotolerantes.

9. ANEXOS No se aplica.

10. BIBLIOGRAFIA Procedimento elaborado pelo Controle de Qualidade Microbiolgico da ETA Cerrado do SAAE Sorocaba de acordo com o manual: ___ CETESB ___ Tcnicas de Anlises Microbiolgicas da gua Membrana Filtrante. So Paulo, 2001.

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