Tema 13 Regulacin enzimtica Ya sabemos que todos los procesos celulares estn regulados, esta regulacin necesaria, se basa

en la posibilidad de aumentar o disminuir el flujo a travs de una va. El flujo se entiende como la velocidad de conversin del primer metabolito en el ltimo. La regulacin de una etapa no es ms que modificar la actividad de la enzima que la controla. Mecanismos de regulacin Generales: Se basan en la disponibilidad de sustrato o producto. Por ejemplo, la disponibilidad de glucosa aumenta el flujo de la glucolisis, de igual forma que si eliminamos el piruvato. Especficos: La regulacin de la actividad de una o varias de las enzimas de la va. Ya que lo que se modifica es la velocidad, veamos las ecuaciones que la rigen. V = K [S]; Vruta = [E] [metabolto]. A travs de ella podemos hacernos una idea de lo que se modifica. Enzimas reguladoras del flujo En una ruta hay dos tipos principales de enzimas, las que denominamos reguladoras del flujo, que son aquellas que al aumentar su cantidad de enzima activa aumentamos el flujo, y aquellas que no son reguladas de forma especfica. El grado de influencia sobre el flujo a travs de la va se denomina Coeficiente de control de flujo

Esto es as porque no podemos aumentar ms el flujo de la va que la actividad de la enzima que estamos regulando especficamente. Para poner un ejemplo: Una hormona puede aumentar la cantidad de enzima activa de 100 a 500 veces, de modo, que el denominador sera 400/100 = 4. Como mucho, entonces (recordemos que no puede ser mayor que 1), el numerador puede ser 4, pero pongamos que es 2. De esta forma tendramos un de 2/4 = 0,5. Cuanto mayor coeficiente presente, ms importante ser la enzima en el control del flujo a travs de la va metablica. Estas enzimas reguladoras catalizan etapas lentas ya que la cantidad de la cantidad de enzima activa que est presente es menor que el de la s dems de la ruta, por ello, las etapas lentas (limitantes) son irreversibles. Un ejemplo claro de esto es la etapa de la glucolisis catalizada por la PFK, que requiere ATP. La bajada de la concentracin del producto debido al drenaje del a va hara que faltara mucho para conseguir el equilibrio y, por tanto, la reaccin es espontanea. En cuanto a la ruta en general, el paso de Glu a Pyr produce ATP con una *Go' de "15,3 Kcal/mol, y el inverso, consumiendo ADP de .4,2 Kcal/mol. Ambas son espontaneas, por lo que se estaran dando a la vez, algo realmente estpido para la clula. En la realidad, algunas de las enzimas que catalizan etapas irreversibles estn reguladas, como por ejemplo la que veamos antes, la PFK, que requiere otra enzima para la reaccin inversa, la F1,6Bpasa, de esta forma, cuando se requiere glucosa aumenta la actividad de la fosfatasa y disminuye la de la kinasa, de forma inversa a lo que ocurre cuando hay demanda de 1

energa. La regulacin de la enzima se puede conseguir a dos niveles: Regulacin de la cantidad de protena enzimtica: mediante la sntesis y degradacin de la enzima. Este control como es lgico, es a largo"medio plazo. Regulacin de la actividad cataltica: Se trata de un control muy fino y a muy corto plazo. Esta a su ves se subdivide en: Cambios en la estructura covalente de la enzima de forma reversible, como por ejemplo la fosforilacin, metilacin o farnesilacin. Cambios conformacionales de la enzima por la unin de molculas reguladoras. Se trata del modelo tpico de regulacin alostrica, tambin es reversible. De este modo, recordamos los distintos tipos de regulacin: General Especfica Cantidad de protena activa Regulacin de la actividad Modificacin covalente de la enzima Unin de ligandos Tipos de enzimas y su importancia en regulacin Podramos preguntarnos si una enzima michaeliana puede llevar a cabo el control a travs de una va metablica. Para intentar dilucidarlo, no hay ms que escoger un valor para [S] pequeo y un grande en relacin con Km (de forma equivalente a como lo hacamos para determinar [S] para Vmax, en funcin de Km). La diferencia de coger [S] como Km/9 o 9Km es de 0,1Vmax a 0,9 Vmax. Esto que significa, pues que un aumento de aproximadamente 9 veces requiere aadir sustrato en 81 veces, algo que fisiolgicamente no pasa, ya que las concentraciones de los metabolitos son pequeas y no pueden variar tanto ya que romperan el equilibrio osmtico. De hecho lo que se observa es que pequeas variaciones en [S] promueven variaciones de hasta 200 veces en la actividad de una enzima. De este modo parece quedar claro que la regulacin por [S] pertenece casi exclusivamente a los enzimas alostricos que, adems, tambin se regulan por efectores. Una de las caractersticas ms importantes de estos enzimas es la cooperatividad, de la que hablaremos ms adelante. Estudio de primeras enzimas de una ruta Monod, Changeux y Jacob estudiaron las caractersticas comunes de enzimas que catalizaban la primera reaccin de una va o ruta metablica inhibida por el producto final de la misma: El ligando regulador (efector activador o inhibidor) es distinto estructuralmente al sustrato o al producto de la reaccin. Muchas de ellas presentaban cintica sigmoide (algunas enzimas son reguladoras pero con cintica michaeliana), pero hay que tener en cuenta que hay enzimas con cintica sigmoide per no son reguladoras. Varios tratamientos fisico"qumicos (T, reduccin de puentes disulfuro) desestabiliza la enzima frente al efector, sin prdida de la actividad cataltica. Esto es debido a la menos posibilidad de transmitir cambios conformacionales en estructuras ms flexibles, (similar a la mejor transmisin de los sonidos por slidos o lquidos que por el aire). Suelen ser hetero u oligomricas.

La conclusin a sacar es que el efector se une a un sitio distinto del C.A. generando cambios conformacionales en la enzima que causa un cambio en la estructura del C.A., lo que provoca cambios en las propiedades cinticas de la enzima. De este trabajo surgi en trmino alostersmo, no como respuesta a una cintica sigmoide, sino a una regulacin por ligando. Cooperatividad Se trata de la propiedad que permite responder con gran sensibilidad a cambios relativamente pequeos en la [S], O2 para nuestro ejemplo, la Hg y Mg. Como hacemos siempre al describir una propiedad cintica, hay que caracterizarla matemticamente, por ello definimos Y como el grado de saturacin, definido por el n de sitios ocupados por el ligando dividido entre el n total de sitios de unin. Mioglobina Se trata de una nica cadena polipeptdica con cintica hiperblica y un nico sitio de unin por cadena. Mediante el desarrollo de las constantes de la reaccin (constante de disociacin, de equilibrio, Y) llamando P a la protena y A al O2 se llega a la conclusin de que Y no puede ser mayor que 1, acercndose slo en el caso de [A] , cuando todos los sitios estn ocupados por el ligando. Hemoglobina Se trata de un tetrmeno (2, 2) con un sitio de unin por subunidad, lo que hace un total de 4. Para esta protena

, que se denomina curva de saturacin sigmoide. El exponente h para la hemoglobina es de 2,6. Cooperatividad infinita Imaginamos que inmediatamente y simultaneamente, las subunidades unen ligandos (algo que no ocurre en la Hg). La 1 molcula que se une aumenta la afinidad de unin del resto por parte de la protena. El desarrollo de K, nos lleva a una ecuacin, similar a la de Hill, pero que ahora presenta n en lugar de h, definiendo n como el n e sitios de unin dividido entre la molcula (P). es el caso de la Hg, n = 4, que obviamente es distinto de 2,6. Esto es debido a que no hay un equilibrio todo o nada en la unin de ligando. Hay estados intermedios (Hg con 1, 2, 3, 4 sitios ocupados). Afirmamos que en la Hg hay cooperatividad positiva, teniendo en cuenta, adems, que h<n, nunca igual. Definimos h como una medida de lo fuerte que es la cooperatividad, en mis palabras, la fuerza que hay que ejercer para provovar un estado ms receptivo en las subunidad de al lado. Cuando h sea prximo a n, indicar una cooperatividad infinita, que indicar que inmediatamente de la unin del ligando se induce la unin del resto. Para h>1 es positiva, para h=1 no hay cooperatividad (recordad las prcticas) y para h<1 es negativa, lo que significa que la unin de un ligando disminuye la afinidad del resto de las subunidades por el ligando. Determinacin del valor de h Al igual que suceda con la cintica michaeliana, la linearizacin de la curva de velocidad permite obtener unos valores mucho ms reales. Por ello, comenzamos describiendo 1"Y como la fraccin de sitios de unin libres, al ser 1 el mximo grado de saturacin. A partir de ah y mediante una serie de desarrollos matemticos llegamos a una ecuacin logartmica: 3

La representacin del primer trmino Vs log [A] nos da una pendiente igual a n y un corte en ordenadas que nos da el "log de K. A este representacin se la denomina representacin de Hill. Como ya vimos en prcticas, los datos que obtenemos experimentalmente no es Y, sino la curva de velocidad, por ello, cogiendo los puntos del tramo central, ms lineal, representamos la siguiente ecuacin:

El cambio de n por h se debe a la partida de un supuesto falso, una cooperatividad infinita, al coger el tramo lineal. Definimos ahora K = K0,5 como anloga a Km, es decir, la concentracin de sustrato para alcanzar la mitad de la velocidad mxima. Modelo concertado o de simetra Monod, Wyman y Changeux dilucidan este modelo para explicar el alostersmo. En el propio ttulo se explican varias cosas, concertado implica que las dos subunidades cambian de conformacin a la vez y la simetra nos indica que las dos subunidades tienen la misma conformacin y la misma constante de disociacin. Para enunciarlo partieron de las siguientes premisas: La protena es un oligmero. Existe en dos posibles estados conformacionales T de tenso y R de relajado. La primera predomina cuando el ligando no est unido. La conformacin R tiene ms afinidad por el ligando, lo que significa que la constante de disociacin de T es mayor que la de R y, por lo tanto, el ligando se une preferentemente a R. Todos los sitios de unin en cada estado son equivalentes (ya lo habamos dicho, es la condicin de concertado) y tienen idnticas constantes de disociacin por los ligandos (resultado de la simetra). En definitiva, todas las subunidades cambian de conformacin a la vez Parmetros . En ausencia de ligando L>1. : El grado de saturacin. : Fraccin de protena en estado R

. De modo que, en concordancia con lo que dijimos antes C<1. Origen de la cooperatividad

La base es que la protena predomina en ausencia de ligando en estado T, pero el ligando se une preferentemente a R. Por esto, nos preguntamos: Cmo puede aumentar ? Aumentando la concentracin de ligando Aumentando el estado R Las dos Al aumentar el ligando, se satura el estado R, ms receptivo, lo que lleva al equilibrio entre las dos formas a desplazarse, aumentando a su vez el n de sitios activos. De este modo a mayor L (ms T y menos R en situacin inicial, necesaria para que se produzca un desplazamiento, ya que si toda la protena se encuentra en un solo estado no hay posibilidad de cooperatividad) y menor C (KT > KR), mayor ser el efecto cooperativo (mayor h) Regulacin por interacciones alostricas El efecto alostrico bien sea positivo o negativo, modifica la razn del equilibrio R"T estabilizando uno u otro. Activador: se une preferentemente a R aumentando su concentracin, lo que provoca los efectos mencionados en el apartado anterior. Inhibidor: se une preferentemente al estado T disminuyendo R y, por tanto, el n de sitios activos, lo que conlleva la disminucin de . El efecto que tienen estos dos tipos de efectores sobre las curvas de saturacin alostricas ya los conocemos por prcticas. Si el efector alostrico se une slo (no preferentemente) a uno de los dos estados se pierde la cooperatividad, obteniendo una curva de saturacin hiperblica. Efectos alostricos Homotrpicos: Son los producidos por interacciones entre molculas idnticas del sustrato. Se trata de cooperatividad. Heterotrpicos: Son los producidos por interacciones entre los efectores alostricos (molculas distintas ala sustrato) y el sustrato. Se trata de la regulacin alostrica en sentido estricto. Enzimas alostricas Hay dos sistemas, el K y el V, que detallaremos a continuacin: Sistemas K Se caracteriza por tener afinidades diferentes tanto por sustrato como por ligando. Su actividad se regula (positiva o negativamente) por cambios en la afinidad por el sustrato. Kcat no cambia, siendo Vmax constante, slo cambia K0,5, como se observa en la grficas de las hojas. Sistemas V Se caracteriza porque tanto R como T presentan la misma afinidad por el sustrato, con lo que se da en enzimas alostricas sin cooperatividad (recordemos las premisas). LA diferencia, por tanto, entre las dos conformaciones es di distinta Kcat. Es esto lo que permite que estos sistemas tenga representacin 5

sigmoide. El trabajo del efector consiste en desplazar el equilibrio R"T, de modo que si predomina la forma de menor Kcat, disminuye la velocidad, siendo entonces un inhibidor y viceversa. Modelo secuencial Este modelo ms complicado enunciado por Koshland, Nmethy y Filmer parte de dos premisas: En ausencia de ligando, la protena existe en una nica conformacin (al contrario que ocurra con el modelo de simetra). En presencia de ligando, el cambio de conformacin es secuencial, subunidad por subunidad. Origen de la cooperatividad En este modelo, son las interacciones entre las subunidades, bien positivas o negativas, las que favorecen o impiden la unin de ligando a la adyacente. De este modo llamamos cooperatividad positiva a la interacciones favorecedoras de la unin de ligando y negativa a las desfavorecedoras. Cooperatividad negativa o anticooperatividad Este comportamiento slo se puede explicar con el modelo secuencial. No se ajusta la modelo concertado porque A estabiliza el estado de alta afinidad, por lo que no puede aumentar el estado de baja afinidad. Se caracteriza por una curva Vs [A] sin tendencia a la saturacin, con lo que no tiene nada que ver ni con la cintica hiperblica ni con una sigmoide, ya que a medida que se aade ms sustrato hay que ir aadiendo ms y ms para conseguir una subida que antes o en otros modelos se consigue con poca variacin de concentracin. Se obtienen resultados equivalentes a diferentes sitios de unin de ligando con distintas afinidades y no interactivos. No es lo mismo cooperatividad negativa que regulador alostrico negativo, ya que el primero se produce por la unin de sustrato y la segunda por la de in inhibidor distinto al sustrato. Adems, un efector alostrico negativo no produce cooperatividad negativa. Representacin de Scatchard Una forma de dilucidar si nos enfrentamos a una cooperatividad es esta representacin. Se basa en estudios de unin de ligando a receptor, y suele utilizarse para ver si un mismo ligando se une a dos o ms tipos de receptores. Si partimos de una protena con un solo tipo de unin, podemos hallar la cantidad de ligando unido, a travs de filtrado y posterior contabilizacin (como el centelleo). El ligando unido depende de la cantidad total de protena y de la fraccin de saturacin. De ah se obtiene la ecuacin de una hiprbola. Ya que [E] << [A] podemos considerar, de forma equivalente a como lo hacamos en temas anteriores que la concentracin de A libre es la total. Si consideramos ahora una protena oligomrica con n sitios de unin por molcula, se nos transforma la ecuacin anterior incorporando el trmino n multiplicando el segundo trmino. A partir de esta ecuacin y mediante un procesamiento se consigue linearizarla, representando la fraccin de ligando unido frente al total Vs lo unido. De esta forma, podemos calcular (como se ve en la grfica de las hojas) n y K, la constante de disociacin.

Una vez conocida esta linearidad, podemos comparar lo que sucede si cogemos una poblacin de dos protenas con distintas n y K (siendo K1 < K2). En este caso, la ecuacin que nos define el ligando unido ser la suma de las dos hiprbolas. Si esto lo representamos podremos obtener dos tipos de curvas, una descendente desde el primer momento, que nos indicar que hay dos poblaciones y que tambin se corresponder con una nica poblacin de una enzima alostrica con cooperatividad negativa, ya que al cambiar K con la aadidura de ligando, la representacin parece indicar que se trata de dos poblaciones. Si se obtiene una curva ascendente en primer lugar, indicar una verdadera suma de afinidad conforme se aumenta el ligando unido, o lo que es lo mismo, una poblacin con una cooperatividad positiva. Si se pudiera observar las dos poblaciones de forma independiente, stas se corresponderan con las dos rectas discontinuas. Evidentemente aqu pasa algo, ya que si recordamos el las prcticas ese trmino era S0,5 y, adems, de la propia representacin, es imposible que K tenga unidades de concentracin ya que se trata de un trmino adimensional. Por ello, y porque as lo demostr en el examen, designamos a partir de ahora S0,5 como la concentracin de sustrato para conseguir de Vmax. K es la constante de disociacin No entra la ecuacin de Adair. ENZIMOLOGA 98 Regulacin enzimtica