Qumica Biolgica

Ignacio Santos, Yair Litman, Vernica Zanel, Nicols Labonia 2012

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TRABAJO PRCTICO I ESPECTROFOTOMETRA Y CURVAS DE CALIBRACIN OBJETIVOS - Conocer y comparar distintos mtodos para el dosaje de protenas. - Aprender a disear curvas de calibracin y confeccionar los protocolos correspondientes. - Hallar la concentracin de una muestra incgnita a partir de los parmetros matemticos de la recta graficada. - Conocer la importancia de contar con una curva de calibracin cuando se necesite vincular una medicin experimental -tal como la absorbancia- con una determinada magnitud como, por ejemplo, la concentracin de un dado compuesto. METODOLOGA I) Mtodo de Bradford Materiales: * Solucin patrn: Seroalbmina bovina (BSA) en concentracin 0,5 mg/mL. * Reactivo de Bradford (modificado): 40 mg de Coomassie Brilliant Blue G 250 + 50 mL etanol + 100 mL cido fosfrico 85% y llevar a l litro con agua destilada. * H2O Destilada. Protocolo: TUBO BLANCO 1 2 3 4 PROTENAS (g) 5 10 15 20 Solucin Patrn (L) 10 20 30 40 Muestra Incgnita (L) H2O (L) 100 90 80 70 60 Reactivo Bradford (L) 2000 Mezclar y agitar bien y leer antes de 1 hora 0.098 0.203 0.285 0.359 0.438 Abs 595 0.100 0.211 0.288 0.354 0.438 0.105 0.187 0.261 0.340 Abs 595 - Blanco 0.111 0.188 0.254 0.338 PROMEDIO 0.099 0.108 0.187 0.257 0.339 II) Mtodo de Lowry Materiales * Reactivo de Folin-Ciocalteau: mezcla de fosfomolibdato y fosfotungstato disponible comercialmente que se diluye segn se especifique. * Solucin patrn: Seroalbmina bovina (BSA) o tripsina en concentracin de 0.5 mg/mL
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5 25 50 50 0.488 0.493 0.390 0.393 0.391

MUESTRA X 90 10 0.361 0.362 0.263 0.262 0.263

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* Solucin alcalina de cobre: Se prepara mezclando las soluciones A, B y C en relacin 0,1 A : 0,1 B : 10 C. La preparacin debe realizarse mezclando primero A + B y recin despus agregando C. Se prepara antes de usar y se descarta luego de un da. A) Solucin de tartrato de sodio y potasio al 2% B) Solucin de CuS04. 5H20 al 1% C) Solucin de Na2C03 al 2% en Na0H 0.1 N Protocolo: TUBO BLANCO 1 2 3 4 5 MUESTRA PROTENAS (g) 25 50 75 100 125 X Solucin Patrn (L) 50 100 150 200 250 Muestra Incgnita (L) 250 150 H2O (L) 400 350 300 250 200 150 150 250 Solucin Alcalina (L) 2000 Mezclar y dejar reposar 10 minutos a temperatura ambiente Reactivo Folin (L) 200 Mezclar inmediatamente y dejar reposar 30 minutos a temperatura ambiente -0.042 0.143 0.332 0.493 0.652 0.793 0.265 0.475 Abs 660 -0.037 0.180 0.347 0.479 0.634 0.813 0.275 0.463 0.185 0.374 0.535 0.694 0.835 0.307 0.517 Abs 660 - Blanco 0.217 0.384 0.516 0.671 0.850 0.312 0.500 PROMEDIO -0.039 0.201 0.379 0.525 0.683 0.843 0.309 0.509 Hay que tener en cuenta que en la preparacin de la solucin alcalina de cobre se mezcla primero una solucin de tartrato de sodio y potasio con la solucin de CuSo4.5H2O y posteriormente se agrega la solucin de Na2C03 al 2% en Na0H 0.1 N ya que el catin Cu2+, en medio bsico, interacta con los tomos de N de los enlaces peptdicos transfiriendo electrones entre el reactivo de Lowry y la protena, para formar productos de reduccin coloreados. Si primero se mezclara la solucin de sulfato de cobre directamente con el Na2C03 en NaOH el cobre podra precipitar como Cu(OH)2 , esto disminuira la concentracin de cobre libre en solucin y, por ende, el rendimiento de la reaccin sera menor, disminuyendo considerablemente la sensibilidad del mtodos. Esta reaccin se evita con el uso del in tartrato que forma un complejo con el Cu 2+ y lo mantiene en solucin, an en medio bsico. Otra cuestin a tener en cuenta es que el reactivo de Folin se degrada en medio bsico y puede reducirse en presencia del oxgeno ambiental a pH bsico, por lo cual hay que tener en cuenta el hecho de agitarlo inmediatamente para reducir esta probabilidad, otra tcnica es tambin agregar el reactivo de Folin en porciones ms pequeas o en menor concentracin, de esta manera logra unirse a la protena en solucin antes de que ocurra lo anterior. RESULTADOS Se graficaron las absorbancias promedio obtenidas para los mtodos de Bradford y Lowry en funcin de la masa de protena obteniendo los siguientes resultados:

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Grfico 1: Curva de absorbancia vs masa de protena (BSA) para los mtodos de Bradford y Lowry Como puede observarse en el Grfico 1, para ambos mtodos la relacin entre la absorbancia y la masa de protena en cada patrn es lineal, es decir que en los intervalos de masas respectivos se cumple la Ley de Lambert-Beer, razn por la cual no se descartaron puntos para hacer la regresin lineal. Segn la Ley de Lambert-Beer la relacin entre la concentracin de un analito en solucin y su absorbancia est dada por la ecuacin: A 0.l.C, donde A es la absorbancia medida en el espectrofotmetro, 0 es el llamado coeficiente de extincin, l es la longitud del camino ptico y C la concentracin de la protena. En el caso estudiado, 0.l es constante a lo largo del experimento, con lo cual la pendiente de la recta obtenida es igual a A/C, e y es la absorbancia de la muestra incgnita. Para calcular la masa de la muestra incgnita, en cada recta respectiva se interpola la masa de protena en la muestra utilizando la absorbancia promedio medida para la misma en la ecuacin obtenida en la curva de calibracin. En ambos mtodos se logr despejar la masa de protena contenida en la muestra; en 400 L para el caso de Lowry y en 100 L para el caso de Bradford. A partir de esto se obtuvieron los siguientes datos: Mtodo Bradford Lowry Lowry Regresin lineal y=0.015x+0.129 R2=0.991 y=0.006x-0.015 R2 =0.995 y=0.006x-0.015 R2 =0.995 Muestra A A B Absorbancia promedio 0.3605 0.270 0.468 Masa de la muestra 15.4g 47,5g 80,5g Concentracin de la muestra 0.171g/L 0.19 g/L 0.54 g/L

El valor de masa de protena en la muestra incgnita cae dentro del valor de los patrones utilizados, mbito en el cual se verifica la Ley de Lambert-Beer. Por el Grfico 1, observando las pendientes de las rectas para el mtodo de Lowry y el de Bradford sabemos que este ltimo mtodo es ms sensible que el de Lowry, ya que posee una pendiente mayor, (es decir que la variacin de la respuesta frente a la variacin en la concentracin o cantidad de protena a determinar es mayor) siempre que la medicin se encuentre en el mismo rango de concentraciones. CONCLUSIONES

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A partir de las experiencias realizadas en el laboratorio se pudo cuantificar la concentracin de una protena (la seroalbmina bovina) en una muestra incgnita a travs de dos mtodos diferentes. Si bien la metodologa para la preparacin de los patrones en cada mtodo era distinta, la medicin de la concentracin se haca indirectamente a travs del uso de un espectrofotmetro. Si bien las sensibilidades de ambos mtodos son distintas no podemos decir nada al respecto de los lmites de deteccin pues en los ensayos se utilizaron rango de concentraciones distintas y ambos mtodos mostraron linealidad. Si se quisiera comparar los lmites de deteccin habra que ampliar los intervalos de concentraciones utilizados y observar donde se pierde la linealidad entre la absorbancia y la concentracin. Es importante destacar que en el mtodo de Bradford, se producen interacciones inicas entre el colorante Coomassie Blue G 250 y los aminocidos bsicos de la cadena proteica, y ciertas interacciones entre el mismo y los anillos aromticos de los aminocidos componentes, mientras que en el mtodo de Lowry ocurre una reaccin de xido reduccin entre el reactivo de Lowry y los aminocidos aromticos en la protena. Ambos mtodos resultan, entonces, ser destructivos y se deben utilizar para el dosaje de protenas de las cuales se disponga una masa apreciable y cuya destruccin no suponga una prdida considerable.

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