FORMULAO, DETERMINAO DA DOSE LETAL (DL50) E ENSAIO ECOTOXICOLGICO DO BIOINSETICIDA BTI Adriana Ramos Arcy(1) u ano do curso de Engenharia

Ambiental da Universidade da Regio de Joinville UNIVILLE. Ketlyn Vollmann Farmacutica pela Universidade da Regio de Joinville UNIVILLE. Mestre em Engenharia Qumica pela Universidade Federal de Santa Catarina UFSC. Millena da Silva Qumica Industrial pela Universidade da Regio de Joinville - UNIVILLE. Mestre em Engenharia Qumica pela Universidade Federal de Santa Catarina UFSC. Doutoranda em Engenharia Qumica pela Universidade Federal de Santa Catarina UFSC. Professora colaboradora nos Departamentos de Engenharia Ambiental, Engenharia Qumica, Engenharia de Produo, Farmcia e Biologia na UNIVILLE. Ozair Souza Engenheiro Qumico pela Universidade de So Paulo USP. Mestre em Biotecnologia pela Universidade de So Paulo USP. Doutor em Biotecnologia pela Universidade de So Paulo USP. Professor do Programa de Mestrado em Engenharia de Processos e dos departamentos de Engenharia Qumica, Ambiental e de Produo Mecnica da UNIVILLE. Endereo(1): Avenida Santos Dumond, 1225 Bom Retiro Joinville SC CEP: 89223-000 Brasil Tel: (47) 91776243 e-mail: adriana.ramos@univille.net

FORMULAO, DETERMINAO DA DOSE LETAL (DL50) E ENSAIO ECOTOXICOLGICO DO BIOINSETICIDA BTI

INTRODUO A excessiva populao de borrachudos o resultado do desequilbrio ambiental por ns concretizado nos ltimos anos. So sugadores de sangue e por isso podem transmitir doenas para os homens e animais. Algumas espcies servem de veiculadores da oncocercose, doena causada por um verme fininho que se desenvolve no sangue do homem e que produz grandes tumores sob a pele (PAIVA, 2002). O controle, tanto das espcies transmissoras de doenas como das populaes incmodas pela densidade do seu ataque, tem sempre se constitudo um grande desafio na rea de sade pblica (ANDRADE; BRANCO Jr., 1991). Pestes na agricultura e em setores da sade pblica tm sido tradicionalmente controladas por pesticidas qumicos (BRAR et al., 2005). Existe uma preocupao pblica e cientfica sobre a utilizao indiscriminada de substncias qumicas sintticas para o controle de insetos. O acmulo dessas subst ci s o so o e e is dgu pode ter diversos efeitos ocivos sobre o mbie te e ao prprio homem. Alm destes danos ao meio ambiente, em razo de no serem especficos para o inseto alvo, existe ainda o problema da resistncia desenvolvida pelas espcies s diferentes formulaes (GOBATTO, 2006). A ausncia de especificidade e os riscos para a sade humana e para o ambiente apresentados pelos defensivos agrcolas sintticos acentuam a necessidade de ferramentas como o controle biolgico na otimizao dos sistemas de agricultura sustentvel (BATISTA Jr. et al., 2002). O biocontrole pode ser conseguido atravs de prticas que favoream os antagonistas nativos ou atravs da introduo no solo de microrganismos selecionados cultivado em substratos no solo. O seu sucesso depende das propriedades antagonsticas e dos mecanismos de ao do hiperparasita (REMUSKA; PRIA, 2007). O Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) uma bactria entomopatognica, Gram-positiva, formadora de esporos que, durante a esporulao, sintetiza um cristal protico parasporal (-endotoxina) em adio ao endsporo que, quando ingeridos, so solubilizados no intestino de larvas susceptveis, onde as protoxinas so liberadas, formando poros na membrana, causando a morte da larva (Figura 01). Normalmente, para o controle de mosquitos, os bioinseticidas so aplicados em corpos de gua limpos e muitas vezes, em crregos e rios com fortes correntezas. A variedade de locais de aplicao exige formulaes complexas dos bioinseticidas, envolvendo o uso de antioxidantes, dispersantes e floculantes, entre outros aditivos. A busca de maior potencialidade do produto no controle biolgico de insetos-alvo no pode contrapor conservao do meio ambiente. O objetivo do presente estudo foi produzir, formular e realizar testes de bioensaio (Aedes albopictus) com o produto Bti-Univille em comparao aos produtos comerciais Vactobac AS e Teknar HP-D e do qumico ABATE 500E (Temephos). Paralelamente a estes ensaios, foram feitos testes de ecotoxicidade a organismos no-alvo de diferentes nveis trficos: o flagelado Euglena gracilis (produtores), o microcrustceo Daphnia similis (consumidores primrios) e o peixe Danio rerio (consumidores secundrios).

Figura 01: Mecanismo de ao da toxina do Bti

MATERIAIS E MTODOS Para a produo e formulao foi empregada metodologia utilizada por Silva (2007) que consistia na utilizao do micro-organismo Bacillus thuringiensis var. israelensis IPS 82, sorotipo H-14, com meio de cultura composto de gua de macerao de milho e farelo de soja m dos sais essenciais ao crescimentoe esporulao. O cultivo submerso foi realizado no biorreator BIOSTAT B, da B. BRAUN com cuba de 4L, condies de agitao variando de 450 a 750min-1, aerao 0,5vvm e temperatura de 30oC. A determinao de acares redutores foi feita atravs do mtodo do DNS e para a determinao do nmero de esporos foi empregada diluio seriada de amostra do meio de cultivo, seguida de plaqueamento e contagem do nmero de colnias aps 24 e 48 horas. Posteriormente o caldo fermentado foi submetido centrifugao para reduo de volume e, ento, formulado com a adio xido de zinco (1), ster de sorbitol (2), lecitina de soja (3) e cafena (4). 1, 2 e 3 com propriedades dispersantes e 4 como um potencializador da atividade larvicida. As quantidades dos aditivos foram adicionadas de acordo com trabalho realizado por Fischer (2010). Esta formulao acrescida de aditivos recebeu o nome de Bti-Univille. Para os bioensaios a metodologia utilizada foi a proposta por Draft (1999) onde larvas de 4 nstar inicial do organismo Aedes albopictus foram ento coletadas com auxlio de micropeneira malha 1 mm e transferidas para copos circulares de polietileno transparente e preenchidos com 100 mL de gua destilada. Cada copo recebeu um total de 25 larvas. Foram testadas cinco diferentes concentraes de bioinseticida, alm da testemunha, sendo realizadas trs repeties para cada, em dias alternados. A leitura da atividade larvicida do bioinseticida em questo foi realizada 24 horas aps a adio do produto no respectivo copo quantificando-se as larvas vivas, e determinando-se o nmero de imaturos mortos. A concentrao letal responsvel pela morte/inibio de 50% dos organismos testados (LC50) foi determinada a partir do programa estatstico Probit. As anlises de mobilidade foram realizadas utilizando o sistema automtico ECOTOX, que consiste de uma cmera CCD montada em um microscpio compacto fixado em posio horizontal conectados a um computador compatvel IBM equipado com software. O software baseado na anlise de movimentos da alga verde unicelular Euglena gracilis. Nove movimentos e parmetros de orientao como mobilidade, direo de nado, velocidade e forma celular so calculados durante uma medio. Os parmetros de orientao so controlados por dois fatores: luz (fototaxia) e gravidade (gravitaxia). A concentrao letal responsvel pela morte/inibio de 50% dos organismos testados (LC50) foi determinada a partir do programa estatstico Probit. Para os testes de ecotoxicidade com Daphinia, a metodologia seguiu o descrito na NBR 12.713 (ABNT, 2003) e no Manual de Implementao de Testes de Toxicidade no Controle de Efluentes Lquidos (CETESB, 1990). Este teste consiste na exposio de indivduos jovens de Daphnia similis a vrias concentraes do agente txico por um perodo de 48 horas, nas condies prescritas neste procedimento. A norma ABNT: NBR 15088:2004 foi utilizada para os testes com o organismo Danio rerio. Em cada concentrao testada, foram colocados 5 peixes, inclusive no recipiente controle. Foi observada a mortalidade e comportamento dos indivduos aps 24 e 48 horas. RESULTADOS E DISCUSSO Laranja e Bicudo (2001), demonstraram em seu estudo que a borra de caf bloqueia a postura e o desenvolvimento de ovos de A. aegypti. Segundo os autores 500 g de cafena, da borra de caf, por mililitro de gua, bloqueiam o desenvolvimento da larva no segundo estgio de seu desenvolvimento e reduz o tempo de vida de mosquitos adultos. A potencialidade do uso da cafena no combate larvas do mosquito Aedes aegypti j foram demonstradas em vrios trabalhos desenvolvidos por Itoyama (Itoyama et al, 1992; 1995; 1997; 1998; 2000). Contudo, em nenhum dos trabalhos foi avaliado o efeito ecotoxicolgico do produto no meio ambiente; A formulao bioinseticida produzida demonstrou ser eficiente para o controle de larvas de A. albopictus com valores de LC50 de 3,97 mg/L. Comparando o produto Bti-Univille com os bioinseticidas comerciais Vectobac AS (LC50 = 0,019mg/L) e Teknar HP-D (LC50= 0,013mg/L) possvel observar que para atingir

a mesma potencialidade em DL50 dos produtos comerciais seria necessrio empregar 200 vezes mais produto em relao ao Vectobac e 300 vezes mais em relao ao Teknar. Outros autores encontraram resultados semelhantes, Majori e colaboradores (1984) obtiveram resultados de LC50 contra o organismo Anopheles gambiae na ordem de 0,011 mg/L para Vectobac e 0,066 mg/L para Teknar. J Bisset et al (2009), encontraram um valor de LC50 de 0,0012 mg/L para Temephos contra larvas de Aedes aegypti. Na determinao da LC50 o qumico Themephos mostrou-se mais eficiente (LC50 = 0,002mg/L) no combate as larvas do mosquito. Tais resultados podem ser explicados devido ao qumico possuir alto grau de toxidez. Para os ensaios com E. gracilis, observa-se que, pra todos os bioinseticidas testados as concentraes foram muito superiores (1,5 g/L para Bti-Univille; 1,2 g/L para Vectobac e 0,9 g/L para Teknar) aos valores de LC50 encontrados para Aedes albopictus indicando que estes produtos no afetariam a populao de algas do ecossistema ao qual o bioinseticida seria empregado. J para o inseticida qumico estes valores foram muito pequenos (abaixo de 10-4), ou seja, uma concentrao menor que a LC50 suficiente para afetar a populao de E.gracilis comprometendo assim os organismos produtores do ecossistema. O bioinseticida Bti-Univille formulado demonstrou ser mais seguro ao organismo no-alvo Daphnia similis (LC50E= 130mg/L) que os produtos comerciais Vectobac AS (LC 50E= 50 mg/L) e Teknar HP-D (LC50E= 32 mg/L) requerendo uma maior dose para provocar a mesma letalidade. J o qumico Temephos apresenta uma LC50E abaixo de 10-5 (limite mximo de diluio testado at o momento para este produto), indicando que este produto tem um efeito altamente txico para D. similis. Para todas as formulaes bioinseticidas testadas os valores de LC50E D. similis foram superiores aos de LC50 estimados para o inseto-alvo. Frente ao peixe Danio rerio, nenhuma das amostras bioinseticida testadas demonstrou toxicidade em doses at 100 mg/L. Apenas o inseticida qumico apresentou valores inferiores (13,5mg/L) aos definidos na ABNT: NBR 15088:2004 (100mg/L). O uso da cafena como aditivo na formulao do bioinseticida Bti possibilitou a obteno de um produto de maior eficincia no controle biolgico de larvas do mosquito Aedes. CONCLUSES Os bioinseticidas comerciais testados, bem como o bioinseticida Bti-Univille apresentaram valores de LC50 inferiores aos valores de LC50E. Isto significa dizer que estes bioinseticidas so seguros para serem aplicados em um ecossistema complexo, pois a concentrao requerida para eliminar a populao de larvas de mosquitos inferior concentrao requerida para afetar a populao de organismos produtores e consumidores primrios. O inseticida qumico Temephos apesar de ter apresentado o melhor valor de LC50 comparado aos bioinseticidas, foi tambm o que apresentou menores valores de LC50E, isto , a aplicao do inseticida qumico alm de controlar a populao de larvas de mosquitos tambm afeta a populao de organismos produtores e consumidores primrios no se apresentando seguro. Embora tenha-se obtido resultados satisfatrios quanto ao bioinseticida da amostra Bti-Univille, seu processo de formulao ainda deve ser desenvolvido, visando potencializar seu efeito larvicida e equiparar sua efetividade aos produtos comerciais disponveis no mercado, bem como, manter nveis aceitveis de LC50E. REFRNCIAS BIBLIOGRFICAS 1. ABNT - ASSOCIAO BRASILEIRA DE NORMAS TCNICAS. NBR 12.713: Ecotoxicologia aqutica - Toxicidade aguda - Mtodo de ensaio com Daphnia spp. (Cladocera, Crustacea). Rio de Janeiro, 2003. 16 p. 2. ABNT - ASSOCIAO BRASILEIRA DE NORMAS TCNICAS. NBR 15.088: Ecotoxicologia aqutica - Toxicidade aguda - Mtodo de ensaio com peixes. Rio de Janeiro, 2004. 19 p.

3. DRAFT. Determination of the Toxicity of Bacillus thuringiensis subsp. Israelensis and B. sphaericus products, p. 29 33. Ln: WHO/CDS/CPC/WHOPES/99.2 Guideline Specifications for bacterial larvicides for public health use, p. 33, 1999. 4. LARANJA, A. T.; BICUDO, H. E. M. C. O uso da cafena e da borra do caf no controle de Aedes aegypti. In: 47 Congresso Nacional de Gentica, guas de Lindia, 2001. 5. SILVA, M. Alternativas para a produo de bioinseticida Bti: uso do processo semicontnuo e do processo em estado slido. 2007. Dissertao De Mestrado. Universidade Federal De Santa Catarina - UFSC, 2007.