Los anticuerpos monoclonales Brevsima historia.

En 1975 Georges Khler y el investigador argentino Csar Milstein fusionaron por primera vez linfocitos con clulas de un mieloma y obtuvieron un hibridoma: una lnea celular inmortal capaz de producir anticuerpos especficos (monoclonales). Por este trabajo, que no patentaron, recibieron el premio Nobel de Fisiologa y Medicina en 1984. La importancia de la produccin de anticuerpos monoclonales no se evidenci hasta 1987 cuando estos anticuerpos se produjeron en forma regular en ratones y fueron utilizados en el diagnstico ya que son anticuerpos de pureza excepcional capaces de reconocer y unirse a un antgeno especfico. Los anticuerpos monoclonales se utilizan de rutina en muchos procedimientos diagnsticos como por ejemplo: mediciones de niveles de protenas y drogas presentes en el suero tipificacin de tejidos y de sangre identificacin de agentes infecciosos tipificacin de leucemias y linfomas identificacin de antgenos tumorales identificacin de clulas especficas involucradas en la respuesta inmune. identificacin y cuantificacin de hormonas.

Cmo surgi la idea de obtener anticuerpos monoclonales? Qu mejor respuesta que recurrir a las palabras del Dr. Milstein : Imaginemos una gran mezcla de sustancias qumicas entre las cuales nos interesa slo una de ellas. Una sustancia entre millones y millones. Es como una aguja en un pajar. Si tenemos un anticuerpo especfico contra una sustancia, ese anticuerpo puede funcionar como un imn capaz de ignorar la existencia del pajar y reconocer exclusivamente la aguja. A los ojos de un anticuerpo, el pajar no existe. Este simple concepto dio lugar a lo que se dio en llamar Inmunoensayos (ver captulo 9) que permitieron la medicin precisa de hormonas y otras muchas sustancias no slo en medicina sino en qumica analtica en general. Los inmunoensayos introdujeron los anticuerpos para su uso como herramienta analtica de importancia fundamental en reas que nada tenan que ver con la inmunologa.
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El problema era que para preparar un anticuerpo especfico era necesario utilizar agujas puras. Algo ms sobre los anticuerpos Vimos en el captulo 9 la estructura bsica de los anticuerpos, vamos a repasar y agregar aqu, una serie de conocimientos sobre esas molculas mgicas. Las inmunoglobulinas o anticuerpos o abreviados (Ab) son una mezcla heterognea de protenas que presentan dos tipos de variaciones estructurales. Cambios sutiles en la estructura de los sitios de combinacin al antgeno (regiones variables) que determinan la especificidad de unin al antgeno (reconocimiento de un antgeno entre varios parecidos) y diferencias estructurales fuera de la regin de unin al antgeno, en las llamadas regiones constantes que se relacionan con otras funciones del anticuerpo denominadas efectoras. Estas actividades efectoras son por ejemplo: activar al complemento o unirse a ms de un receptor conocido con el nombre de Fc que estn presentes en las membranas de losmonocitos y granulocitos (ver captulo 7). Existen cinco clases de inmunoglobulinas que adems de las IgG incluyen a las IgA, IgD, IgE, e IgM. Cada clase de anticuerpos se distinguen entre s por algunas de sus funciones efectoras y constitucin estructural. No vamos a complicar las explicaciones pero para dar una idea concreta diremos que el primer tipo de anticuerpos que aparece en una persona infectada con un virus es del tipo IgM y que recin pasado cierto tiempo aparecen las IgG que son ms duraderas. Como las molculas son estructuralmente diferentes se pueden distinguir fcilmente mediante procedimientos de rutina en el laboratorio clnico. Esta situacin es vital para el diagnstico clnico. Volviendo al virus de la rubola si una mujer embarazada tiene un contacto con un enfermo de rubola es importante averiguar si ya est protegida o no. Si se le detectan anticuerpos IgM se trata de una infeccin reciente y hay que preocuparse por el porvenir del beb ya que el virus de rubola es teratognico (puede producir malformaciones en el embrin). Si la mujer tiene anticuerpos IgG la infeccin fue anterior y no hay de qu preocuparse. Modo de obtencin de los anticuerpos monoclonales. Problemas que hubo que resolver: Pasaje de la heterogeneidad a la homogeneidad o del anticuerpo policlonal al anticuerpo monoclonal.

Mientras algo de la heterogeneidad de los anticuerpos deriva de la existencia de clases y subclases de Ig lo ms importante radica en la naturaleza polimrfica de sus regiones variables. Se han hecho estimaciones del nmero de anticuerpos diferentes que pueden producir las clulas B del organismo y se llega al fantstico nmero de ms de 10 millones. En resumen: la respuesta del sistema inmune a cualquier antgeno por ms simple que sea ste, es una respuesta policlonal. Lo que quiere decir que el sistema fabrica anticuerpos contra un rango amplio de estructuras presentes en el antgeno que involucran tanto a la regin de unin al antgeno como a las zonas efectoras. Por otro lado, MacFarland Burnet (premio Nobel 1960) postul la teora clonal de la generacin de anticuerpos es decir la generacin de molculas idnticas en su estructura y en su capacidad de reconocer a un antgeno (qu alivio!, gracias a Dolly todos saben qu es un clon). Cada clula plasmtica B (clon B) fabrica un solo tipo de anticuerpo. Este hecho vino en ayuda de Milstein y Khler que pensaron que si aislaban clones de clulas B y las cultivaban en placas de plstico de cubetas mltiples, el anticuerpo que produciran las clulas sera monoclonal. Pero... haba un gran inconveniente, las clulas B mueren a los pocos das de ser cultivadas in-vitro. Entonces, se les ocurri que si las fusionaban con una clula con potencial de inmortalidad, los hbridos de ambas clulas podran fabricar anticuerpos monoclonales casi indefinidamente. Efectivamente fue as, obtuvieron hibridomas la clave para producir anticuerpos monoclonales. Fusin celular La tcnica consiste bsicamente en fusionar clulas linfoides (productoras de anticuerpos) con clulas de mieloma (tumorales) en presencia de poli-etilen-glicol (PEG), que provoca la fusin de las membranas y la formacin de hbridos celulares. Las clulas productoras del anticuerpo se obtienen a partir de los rganos linfoides perifricos (bazo y/o ganglios linfticos) de animales hiper-inmunizados con un antgeno o patgeno concreto. Las clulas de mieloma a utilizar deben reunir, al menos, las siguientes caractersticas: Ser histocompatibles con las clulas productoras de anticuerpos No secretar inmunoglobulinas No tener la enzima hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (HGPRT). Los hbridos resultantes pueden ser de cualquier tipo: Linfocito-Linfocito, Linfocito-Mieloma o Mieloma-Mieloma. Los que conocemos como Hibridomas son los hbridos LinfocitoMieloma. Seleccin Los hibridomas se recuperan cultivando la mezcla celular anterior en un medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina. La aminopterina es un inhibidor del cido flico, sustancia que interviene en la sntesis de los nuclesidos y nucletidos necesarios para la replicacin del DNA. En este medio (y en cualquiera que se use) los hbridos LB-LB y los LB no fusionados mueren, ya que tienen una vida media limitada.

Los hbridos M-M y las clulas de mieloma no fusionadas mueren por carecer de la enzima HGPRT. La clulas que sobreviven son los hibridomas LB-M, que heredan la capacidad de vivir indefinidamente y la alta capacidad biosinttica propias de la clula tumoral y la capacidad de producir anticuerpos y sintetizar guanina va HGPRT de los linfocitos B. HGPRT participa en la llamada va de salvamento, mediante la cual una clula puede usar la hipoxantina como precursor de otras bases nitrogenadas aun en presencia de aminopterina . Como en la fusin se usan clulas linfoides procedentes de un animal hiper-inmunizado, una parte de los hibridomas obtenidos son productores de anticuerpos y cada hibridoma produce un solo anticuerpo (monoclonal). Tras la seleccin en medio HAT las clulas supervivientes se reparten en los pocillos de placas de cultivo (rico en nutrientes e idneo para la proliferacin celular) y se incuban para que se produzca su crecimiento. En aquellos pocillos que presentan un crecimiento adecuado se recogen muestras del sobrenadante y se analizan en ELISA para ver si contienen anticuerpos especficos para el antgeno inicial (con el que se hiper-inmuniz inicialmente al animal utilizado). La clulas de los pocillos positivos se recuperan y, mediante un proceso de dilucin lmite o clonacin, se reaparten en los pocillos de nuevas placas a 1 clula por pocillo. Los pocillos que producen buenos clones se muestrean en busca de los anticuerpos y, los positivos, se vuelven a cionar. Mantenimiento Los hibridomas productores de anticuerpos se expanden en recipientes de cultivo de mayor capacidad y se recogen las clulas por centrifugacin, se suspenden en medio de cultivo suplementado con suero fetal de ternera y dimetil-sulfxido (DMSO) para congelarlas, primero a -70C y luego en nitrgeno lquido. La produccin del anticuerpo monoclonal se hace a partir del sobrenadante de cultivos en masa o tras la inoculacin intraperitoneal del hibridoma en animales histocompatibles. En este ltimo caso se produce un tumor que produce anticuerpos en esa localizacin acompaado de ascitis (acumulacin de lquido en el peritoneo) y en el liquido asctico (que se recupera por puncin) hay una gran concentracin de anticuerpos. En ambos casos los anticuerpos monoclonales se separan y purifican por los mtodos convencionales. Aunque son susceptibles de mutar, los hibridomas mantienen sus caractersticas durante muchas generaciones. Aplicaciones. Estos anticuerpos monoclonales (mAb) han permitido identificar y purificar gran nmero de marcadores celulares tales como los CD, receptores de citoquinas, etc. Tambin se usan en investigacin como herramientas para identificar y aislar molculas, en las pruebas inmunolgicas de diagnstico en el laboratorio clnico, como vehculos para el transporte de drogas y radio-istopos, etc. Pero quizs su aplicacin mas prometedora es en el campo de la terapetica. As ya se han desarrollado algunos contra enfermedades como el cancer de colon, de mama, contra el linfoma no Hodgkin y otras leucemias y enfermedades como artritis, enfermedad de Crohn, asma..etc

En este ltimo apartado, Cuando se comenzaron a dar los primeros pasos en este campo cundi un optimismo ilimitado, ya que se pensaba que podran utilizarse, por ejemplo para el cancer a modo de misiles teledirigidos, portadores de txicos o istopos radiactivos que podran orientarse contra las clulas tumorales y depositar su carga letal, eliminando las clulas cancerosas y dejando intactas las normales. As hay en el mercado una decena de anticuerpos monoclonales. Cubren desde la prevencin del rechazo de un rgano trasplantado hasta la oncoterapia. Pero la realidad mostro que las cosas son ms difciles. Los anticuerpos monoclonales son protenas del sistema inmunitario muy puras que atacan dianas moleculares especficas. Para su infortunio, los individuos que recibieron la primera hornada de anticuerpos monoclonales con fines teraputicos tendan a desarrollar sus propios anticuerpos contra los anticuerpos inyectados. Eso hizo que, por causas que no acabamos de conocer, progresaran an ms en su patologa. El hgado secuestraba tales anticuerpos monoclonales y los eliminaba antes de que pudieran alcanzar sus objetivos. Este fracaso hizo pasar del optimismo al desanimo a las empresas y laboratorios que apostaron por este mtodo. Esto era debido fundamentalmente a que tales anticuerpos eran de origen murino y eran reconocidos como extraos por el sistema inmunitario humano, produciendose, por tanto la respuesta frente a ellos. No obstante mas adelante se descubrieron vas para corregir las deficiencias de los primeros frmacos surgiendo los anticuerpos quimricos y humanizados. Anticuerpos quimricos Estos Ac son molculas artificiales en la cual, las porciones constantes de las cadenas pesada y liviana provienen de una Ig humana y las regiones variables VE y VE son obtenidas de un AcMo murino. El objetivo perseguido con la construccin de un AcQ es reducir la inmunogenicidad para el humano de los AcMo de ratn o rata, pero sin afectar la especificidad del Ac. Estos anticuerpos presentaban un 70% de componente humano y un 30% era de origen murino, por lo que a pesar de ser menos inmunognicos que los denominados anticuerpos monoclonales de primera generacin seguan presentando problemas de inmunogeneicidad. Por ello se recurrio a los denominados: Anticuerpos humanizados Estos solo tienen de ratn los genes que entran en contacto con el antgeno. El 90 por ciento del anticuerpo es as de origen humano, por lo que al ser inyectado en los pacientes no se produce respuesta del S.I. En teora solo llevan del ratn el paratopo de unin al antgeno. El argumento que la soporta se basa en el supuesto de que el sitio de combinacin al antgeno, el paratopo, se forma a partir de la combinacin espacial de las asas hipervariables y que el resto de la regin variable (regan denominada M) slo funcionan como un andamio cuya nica funcin es servir de soporte estructural al paratopo. De esta manera en estos los epitopos asociados a las regiones M mridas, los cuales estn presentes en los AcQ no se encuentran en los AcH. Para producir un AcH es necesario, por tanto conocer la secuencia entera de los dominios V mridos y la localizacin de las secuencias de ADN correspondientes a las 3 RDC

Hay dos aspectos que pudieran considerarse desventajosos en la produccin de un AcH. En primer lugar, la manipulacin de las RDC y su posterior insercin en el contexto de regiones M humanas, por lo general, conlleva a una disminucin de la afinidad del Ac. Ello se debe a que las regiones M no son slo andamios; ellas juegan un rol determinante en el arreglo tridimensional de las RDC El otro aspecto tiene que ver con la complejidad de la tcnica. Mientras que producir un AcQ es un procedimiento relativamente expedito, la creacin de un AcH es, comparativamente, ms laborioso, consume un tiempo considerable. En todo caso, el objetivo fundamental perseguido por la produccin de un AcH (eliminar la inmunogenicidad del Ac mrido) no siempre es alcanzado. Se ha reportado cierta inmunogenicidad "residual" en molculas de Ac completamente humanizadas, ello debido, aparentemente, a epitopos asociados con el idiotipo del Ac Anticuerpos bifuncionales. Ahora es posible construir anticuerpos con sitios de combinacin diferentes que pueden, por tanto, reconocer simultneamente a dos antgenos. Son producidos artificialmente al cruzar dos anticuerpos, uno dirigido contra el antgeno de superficie de la clula tumoral y el otro contra una molcula estimuladora de la clula efectora (complejo clula T receptora).

http://www.gen-es.org/assets_db/publications/documents/pub_77_d.pdf http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/contratapa/aprendiendo/capitulo10.htm http://ucmfarmaciadatos.netai.net/segund0/Inmunologia/fity/19.pdf