2070305 DEDUCCIN DE LA ECUACIN DE MICHAELIS-MENTEN V

CURVA CINTICA DE MICHAELIS-MENTEN PARA UNA REACCIN ENZIMTICA Al aumentar la consentracin del substrato se observa un aumento en la velocidad de la reaccin,pero en forma de una isoterma que tiene tres segmentos uno de primer orden seguido por otro de segundo y el final de orden cero.

[S] MODELO CINTICO DE MICHAELIS-MENTEN Se debe haber hecho ya la deduccin de la KM, con todos los supuestos cinticos que involucra, de tal manera que debe tenerse ya: E+S v1 V2 ES v3 E+P

POSTULADOS DE LA TEORA DE MICHELIS-MENTEN 1. La enzima debe unirse al substrato para llevar a cabo la reaccin 2. Se forma un complejo enzima-substrato 3. La velocidad de formacin del producto depende de la cantidad de complejo enzima-substrato Segn el tercer postulado, la concentracin del complejo enzima-substrato ( [ES] ) determina la velocidad total de la reaccin al medirla por la aparicin del producto, de tal manera que es necesario enfatizar que la concentracin del complejo depende del balance de su velocidad de formacin con la de su descomposicin. A saber: + d[ ES ] = velocidad de formacin del complejo ES = v 1 dt d[ ES ] = velocidad de descomposi cin del complejo ES = v 2 + v 3 dt

para continuar, se hace necesario hacer algunas definiciones: [S] = concentracin del substrato (muy superior a la de la enzima) [E] = concentracin total de enzima [ES] = concentracin del complejo enzima-substato [E ES] = concentracin de enzima libre en cualquier momento Por otro lado, de acuerdo con la ley de accin de las masas pueden escribirse las siguietnes relaciones: v 1 [ E ES ] [ S] v 2 [ ES ] v 3 [ ES] las que, para transformarse en ecuaciones, requieren de una constante de proporcionalidad v 1 = k 1[ E ES ] [ S] v 2 = k 2 [ ES ] v 3 = k 3 [ ES]

esta constante se conoce como constante de velocidad de reaccin y esta relacionada con la afinidad, lo que la convierte en especfica para cada mezcla reaccionante, adems, depende solamente de la temperatura. En el equilibrio de la reaccin, las velocidades de formacin y descomposicin del complejo enzima-substrato deben ser iguales: d[ ES ] d[ ES ] = dt dt tendr + factorizando y al reacomodar por lo que deber cumplirse k1[E-ES][S] = k2[ES] + k3[ES] k1[E-ES][S] = (k2 + k3)[ES] v1 = v2 + v3 as, se

[E ES][ S] = k 2 + k 3 [ES] k1

con lo cual queda definida la constante de Mchaelis-Menten: K M = De conformidad con los postulados de la teora, es fcil entender que se llegar a una concentracin de substrato con la que se obtiene el mximo de velocidad (VMAX); en ese momento, el total de las molculas de enzima permanecen todo el tiempo unidas al substrato y se dice que la enzima se ha saturado. As, es lgico pensar que a la mitad de la velocidad mxima, slo el 50 % de las molculas de enzima se encuentran unidas al substrato y el otro 50% estn libres, con

[E ES] [ S] [ ES]

V VMAX

VMAX

KM

[S]

50% [ S] = [ S] , y como puede verse en la 50% grfica, es posible definir prcticamente la KM como la concentracin molar del substrato a la mitad de la velocidad mxima. Es claro que mientras mayor sea la KM la enzima necesitar myor concentracin de substrato para trabajar adecuadamente, es decir la afinidad entre enzima y substrato es menor. Vase por ejemplo el caso de la hexocinasa que fosforila monosacridos, en igualdad de concentracin del azcar, por cada 100 molculas de glucosa fosforiladas, sufren la reaccin 110 de galactosa y 70 de fructosa. lo que la expresin anterior se transforma en K M = V VMAX

VMAX

[S] En la figura se ilustra este fenmeno, la KM1 corresponde a la glucosa, a la galactosa la KM2 y la KM3 a la fructosa. Es evidente que entre la constante de Michaelis y la afinidad entre enzima y substrato existe una relacin inversa. Tomando en cuenta que la velocidad de la reaccin enzimtica es entendida como la velocidad de aparicin del producto, es natural que a partir de v3 pueda escribirse V = k[ES] por lo que resulta indispensable poner [ES] en funcin de parmetros de ms fcil medida. Para ello, considrese la definicin de la KM KM =

KM2 KM1

KM3

[E ES] [ S] [ ES]

al pasar [ES] al primer miembro y desarrollar el producto del numerador se obtiene KM[ES] = [E][S] [ES][S] si se pasa al primer miembro el trmino con [ES] y se factoriza se ve [ES](KM + [S]) = [E][S]

que despejando [ES] queda

[ES] = [E] [ S] K M + [ S]
k [ E] [ S ] K M + [ S]

y al substituir este valor en la ecuacin de la velocidad se ve como V=

pero como [E] es la cantidad total de la enzima , se tiene que k[E] = VMAX y al substituir este valor nos queda la conocida ecuacin de Michaelis-Menten: V= VMAX [ S] K M + [ S]

VMAX , se tiene 2 VMAX VMAX [ S] = 2 K M + [ S] que al reagrupar para tener la VMAX en el mismo miembro queda En esta expresin, si V = K M + [ S] VMAX [ S] = 2 VMAX y al simplificar y reacomodar que despejando KM nos da K M + [ S] = 2[ S] K M = 2[ S] [ S] = [ S]

resultado que coincide con la deduccin intuitiva presentada arriba. En la prctica, dados los nmeros de recambio que tienen habitualmente las enzimas y las pequesimas cantidades de ellas que es posible aislar, es poco prctico intentar obtener suficientes datos para dibujar con cierta precisin una curva de actividad enzimtica. Por ello Linewaver y Burk, al ver que la curva cintica de Michaelis-Menten es de tipo hiperblico, sugirieron la transformacin que lleva su nombre, que consiste en obtener la inversa de la ecuacin completa que queda

1 V

1 VMAX

V= y al simplificar se obtiene VMAX [ S] K M + [ S]

1 KM
1 K M + [ S] = V VMAX [ S]

K 1 1 1 = M + V VMAX [ S] VMAX que es una recta, por cual bastan unos cuantos puntos experimentales para construir, por regresin lineal, una grfica como la que aparece a la derecha, en la que la interseccin con el eje de las ordenadas es la inversa de la velocidad mxima, y la interseccin con el eje de las abscisas es la inversa negativa de la KM. As, por ejemplo, si en un experimento se obtiene una grfica como la que aparece a la izquierda,

1 V

0.2

- 2.5

[ S]
1 VMAX entonces VMAX = 1 =5 0.2 y KM = = 0. 2 y 1 = 2 .5 KM 1 = 0.4 2. 5

EJEMPLO. La isocitrato liasa de Escherichia coli, cataliza la reaccin: Ls-ISOCITRATO GLIOXILATO + SUCCINATO en un experimento tpico, se midi la actividad de la enzima en un cultivo de la bacteria que tena cido actico como nica fuente de carbono, a pH 6.8 y 30C. La concentracin del sustrato se dio en mol dm-3 y la actividad como velocidad inicial en nmol min-1; los siguientes son datos de un experimento tpico:

Velocidad inicial (nmol min )

[LS-Isocitrato] (mol dm-3) 6 18 24 30 40 100

Velocidad inicial (nmol min-1) 1.96 4.08 4.64 5.10 5.62 6.90

Cintica de Isocitrato liasa

8
-1

7 6 5 4 3 2 1 0 0 50 100 -3 [LS-Isocitrato] (mol dm ] 150

Es evidente que se trata de una hiprbola del tipo MichaelisMenten V= VMAX [ S] K M + [ S]

que al hacer la transformacin de Lineweaver-Burk se normaliza

1/[S] 0.6000 0.1667 0.0556 0.5000 0.0417 0.0333 0.0250 0.4000 0.0100
1/V 0.3000 0.2000 0.1000 0.0000 0.0000

1/V 0.4926 0.2451 0.2155 0.1961 0.1779 0.1437

0.0500

0.1000 1/[S]

0.1500

0.2000

Esta es una recta para regresin lineal, por lo que se elabora la tabla de regresin como aparece a continuacin:
X 0.1667 0.0556 0.0417 0.0333 0.0250 0.0100 0.3322 Y 0.4926 0.2451 0.2155 0.1961 0.1779 0.1437 1.4709 X2 0.0278 0.0031 0.0017 0.0011 0.0006 0.0001 0.0344 XY 0.0821 0.0136 0.0090 0.0065 0.0044 0.0014 0.1171 Y2 0.2427 0.0601 0.0464 0.0384 0.0317 0.0206 0.4399

Las ecuaciones normales quedan como: 1.1709 = a0(6) + a1(0.3322) 0.1171 = a0(0.3322) + a1(0.0344) y se resuelven por determinantes: 6 0.3322 A= det A = 6(0.0344) (0.3322)(0.3322) = 0.0962 0.3322 0.0344 1.1709 A0 = 0.1171 6 A1 = 0.3322 0.1171 0.0344 1.1709 det A1 = 6(0.1171) (0.3322)(1.1709) = 0.2140 0.3322 det A0 = (1.1709)(0.0344) (0.1171)(0.3322) = 0.0117

utilizando estos determinantes es posible usar la regla de Cramer para calcular los valores de los coeficientes de regresin: a0 = 0.0117/0.0962 = 0.122 y a1 = 0.2140/0.0962 = 2.2239 K 1 1 1 = M + , quedando en la V VMAX [ S] VMAX

con estos, se plantea la ecuacin de la recta tipo forma

1 1 = 18.2266 + 0.122 , de tal suerte que para obtener los valores de KM y VMAX basta V T con hacer las igualaciones siguientes y despejar: 1 VMAX = 0.122 por tan to VMAX = 1 = 8.1958 , y 0.122

KM = 2.2239 por tanto KM = 2.2239 x 8.1958 = 18.2266 8.1958 con lo que la ecuacin de Michaelis-Menten quedara V = con la puede hacese la tabla siguiente
[LS-Isocitrato] (mol dm-3) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 30 40 50 60 70 80 90 100 Velocidad inicial (nmol min-1) experimental calculada 0.0000 0.8104 1.4749 2.03 2.0298 2.5000 2.9036 3.2537 3.5604 3.8313 4.08 4.0722 4.2880 4.4823 4.64 4.6582 5.10 5.0983 5.62 5.6302 6.0063 6.2862 6.5026 6.6750 6.8155 6.96 6.9322

8.1958 [ S] 18.2266 + [ S]

que sirve para desarrollar la grfica de presentacin que aparece a continuacin

Cintica de la Isocitrato liasa

8 Velocidad inicial (nmol min -1) 7 6 5 4 3 2 1 0 0 20 40 60 80 100 120

[LS-isocitrato] ( mol dm -3)

Para validar el trabajo se hace anlisis de varianza de la manera siguiente:

X 6 18 24 30 40 100 Ym = Yi 2.03 4.08 4.64 5.10 5.62 6.96 4.7383 r2 = 0.9929 Yc 2.0298 4.0722 4.6582 5.0983 5.6302 6.9322 (Yi-Ym)2 7.33506944 0.43340278 0.00966944 0.13080278 0.77733611 4.93580278 13.6220833 r = 0.9964 (Ym-Yc)2 7.336299949 0.443677005 0.006428724 0.129558663 0.795506527 4.813224917 13.52469578 (Yi-Yc)2 5.16019E-08 6.01789E-05 0.000329568 2.97246E-06 0.000104961 0.000770637 0.001268369

F = 42652.2

Con lo cual puede verse lo bien que se pueden ajustar las ecuaciones empricas de tipo Michaelis-Menten.