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Strategie di screening per i canali ionici.

1.

Introduzione

I canali ionici svolgono un ruolo centrale nella fisiologia umana contribuendo a mantenere lomeostasi ionica cellulare, a generare lattivit elettrica di cellule nervose e muscolari, e a controllare il rilascio di ormoni e trasmettitori. Lapplicazione della biologia molecolare e degli approcci genetici assieme alle tecniche di elettrofisiologia hanno enormemente facilitato la caratterizzazione delle funzioni dei canali ionici. Un importante sviluppo di questi progressi la comprensione che molti disturbi del sistema nervoso, cardiovascolari e metabolici derivano da specifici difetti nella funzione dei canali ionici. Il corollario di questosservazione che la modulazione dellattivit dei canali ionici rappresenta uneffettiva strategia terapeutica per una grande variet di disturbi. Bench piccole molecole e tossine di natura peptidica che interagiscono con i canali ionici sono conosciute da tempo, la tecnologia per identificare nuove classi di composti lead tramite high-throughput screening (HTS) in ritardo rispetto ai rapidi progressi nella caratterizzazione dei canali ionici. Questa recensione riassume la tecnologia stabilita come pure quella recentemente sviluppata per configurare, invalidare e iniziare studi di HTS per i canali ionici. Comunque le continue scoperte nella funzione dei canali ionici e la voglia di ulteriori miniaturizzazioni e saggi di screening spediti significano che le tecnologie emergenti nei saggi di fluorescenza e nei saggi su cellule saranno importanti per il successo di futuri sforzi per scoprire nuovi composti lead.

2. Funzione dei canali ionici


Il trasporto di ioni e piccole molecole attraverso la membrana cellulare effettuato da diverse classi di proteine integrali, inclusi canali ionici, trasportatori passivi e pompe attive che stabiliscono un gradiente chimico. Lazione delle pompe ioniche, per esempio la Na-K ATPasi consuma pi del 30% della spesa energetica della cellula e permette alla cellula di immagazzinare energia potenziale sottoforma di gradiente ionico. Questa energia pu dopo essere usata per trasmettere segnali elettrici, per esempio il potenziale dazione, o per guidare il trasporto di piccole molecole. Una propriet fondamentale dei canali ionici la capacit di formare uno stretto poro acquoso che attraversa la membrana e che permette il passaggio selettivo di uno o pochi tipi di ioni, Na, K, Ca o Cl. Poich il flusso ionico passivo, la velocit e la direzione del flusso ionico determinata dal gradiente elettrochimico, una combinazione del gradiente chimico e del potenziale elettrico di membrana. Il potenziale di membrana, generalmente da 50 a 80 mV a riposo, determinato dalla relativa conduttanza attraverso la membrana dei singoli ioni. Unimportante caratteristica dei canali ionici che sono pori dotati di cancello, permettono cio un flusso di ioni controllato piuttosto che continuo. Uneccezione sembra essere un canale fessura che stabilisce una continua e bassa conduttanza al potassio e crea cos un potenziale di membrana a riposo carico negativamente (iperpolarizzata). Il meccanismo del cancello coinvolge di solito un legame con un ligande, o un meccanismo voltaggio dipendente ma pu anche includere un meccanismo di attivazione meccanica. I meccanismi ligande cancello sono abbastanza differenti tra loro e vanno da legami con ligandi extracellulari a regolazione intracellulare tramite proteine G, ATP, nucleotidi ciclici, ioni calcio e fosfoinositidi. Un sottotipo del recettore NMDA per il glutammato presenta un duplice meccanismo di regolazione da parte di un ligande e dal potenziale di membrana. Un aspetto critico dellapertura e della chiusura dei canali ionici il risultante cambiamento del potenziale di membrana che avviene quando le conduttanze ioniche attraverso la membrana cambiano rapidamente. Pi che un massiccio movimento di cariche, il flusso di relativamente pochi ioni attraverso i canali aperti genera cambiamenti nel potenziale di membrana. In altri termini,

appena i canali si aprono per un determinato ione, il potenziale di membrana cambia in direzione del potenziale di equilibrio dello ione. Un classico esempio quello del potenziale dazione dei nervi e dei muscoli dove lapertura e la chiusura sequenziale di canali sodio e potassio voltaggio dipendenti risulta in un autopropagante depolarizzazione e iperpolarizzazione della superficie della membrana. Il canale sodio inoltre mostra un'altra importante caratteristica dei canali ionici, cio la loro abilit ad adottare uno stato di inattivazione o desensitizzazione che chiude il canale e temporaneamente previene la riattivazione. Nel caso del potenziale dazione, questo meccanismo permette la propagazione di discreti segnali elettrici e previene una continua stimolazione. Questa rapida desensitizzazione per pone un grande ostacolo per lo sviluppo di saggi HTS.

3. Struttura e modulazione allosterica


I canali ionici sono generalmente assemblati omomerici o eteromerici di varie subunit. Il segmento peptidico transmembrana determina la selettivit ionica, e il dominio peptidico terminale spesso funziona per inattivare il canale tramite il blocco del poro transmembrana. Le subunit sono correlate a una grande famiglia di geni. Possono esserci numerose varianti delle subunit e dei canali che esse formano dovute al processo di splicing alternativo dellmRNA, o alla differente combinazione delle subunt nei canali eteromerici. Inoltre le varie combinazioni di subunit differiscono funzionalmente o farmacologicamente, mostrando differenze nelle propriet di conduttanza del canale e nella desensitizzazione. Fosforilazione da parte di Kinasi citoplasmatiche il principale meccanismo post-traduzionale di regolazione della funzione del canale. La conformazione a multisubunit e lesistenza di molteplici stati funzionali rende i canali ionici un bersaglio ideale di modulatori allosterici. In molti casi, i siti di legame per i ligandi sembrano trovarsi allinterfaccia delle subunit, o tra lobi separati contenuti in una singola subunit. Anche i siti allosterici con ogni probabilit si trovano alle interfacce tra le subunit, inclusi i segmenti che formano il poro del canale. Modulatori allosterici sono stati identificati per numerosi canali ionici, compresi il recettore ionotropico per il glutammato, il nicotinico, il GABAergico. Le Benzodiazepine sono modulatori allosterici del recettore GABAa e hanno dimostrato di essere dei buoni agenti terapeutici. Anche se nuovi agonisti e antagonisti di canali ionici sono obiettivi comuni per HTS, i modulatori allosterici sono unimportante classe di molecole.

4. Malattie e disturbi connessi ai canali ionici


Difetti nei canali ionici sono o responsabili direttamente o fortemente implicati in un certo numero di malattie, riflettendo la loro espressione ubiquitaria e il loro ruolo centrale nellomeostasi cellulare. In alcuni casi la caratterizzazione molecolare di un canale ionico ha portato alla scoperta di difetti genetici nella struttura e/o funzione del canale. In altri casi, la ricerca genetica su malattie umana, o pi generalmente topi e mosche mutanti, hanno portato allidentificazione di nuovi membri o classi di canali ionici. Poich ci sono numerose recensioni sulle patologie da canale sufficiente accennare brevemente ad alcuni esempi principali di malattie umane correlate a disfunzione dei canali. E anche da sottolineare che nonostante molte malattie siano rare, rappresentano la chiave di comprensione per altre malattie pi comuni. Per esempio la sindrome long QT causata da un difetto nei canali potassio cardiaci, colpisce uno su 15mila individui e si manifesta con aritmia e morte improvvisa. In ogni caso la comprensione del long QT pu portare a migliorare nuove strategie terapeutiche per aritmia ventricolare, causa frequente di morte improvvisa. Altri disturbi collegati a difetti dei canali sono iperinsulinemia, fibrosi cistica, ipertensione ereditaria, miopatie, paralisi periodiche, ipertermia maligna, sindrome miastenia congenita. E probabile che il numero di canali ionici come possibili bersagli farmacologici crescer con la comprensione delle funzione e disfunzioni dei canali.

5. Strategie per i saggi primari


I canali ionici posseggono una variet di propriet biofisiche che includono conduttanza, direzione, selettivit, apertura ligande o voltaggio dipendente, desensitizzazione. Le strategie dei saggi sono improntate sulla registrazione delle modulazione di queste propriet. Spesso lo sviluppo di un saggio guidato dallattivazione e dalla selettivit ionica del canale bersaglio. Per esempio canali ionici regolati da ligande sono adatti per saggi che registrano lo specifico evento di legame. In altri casi ci sono modulatori allosterici per canali ligande e voltaggio dipendenti che sono usati per sviluppare saggi di binding del ligande. In generale ci sono difficolt maggiori nello sviluppo di saggi per canali ionici attivati dal voltaggio o da ligandi intracellulari. Saggi che registrano cambiamenti nel flusso ionico attraverso la membrana o cambiamenti nel potenziale dazione sembrerebbero essere i migliori formati per questo tipo di bersagli. In particolare saggi su cellule per lattivit di un canale ionico sono adatti per identificare modulatori allosterici. Il pi grande ostacolo nello sviluppo dei saggi la rapida desensitizzazione o in attivazione, che una caratteristica comune ai canali voltaggio e ligande dipendenti. Luso di bloccanti della desensitizzazione (ciclotiazide per recettore AMPA, Concanavalina per recettori Kainato) prolunga il tempo di apertura del canale in modo da misurare il massiccio flusso ionico e registrare i cambiamenti del potenziale di membrana. Naturalmente se lo scopo di identificare nuovi bloccanti della desensitizzazione non necessario usare un bloccante. particolarmente difficile sviluppare saggi per un canale bersaglio se il potenziale di membrana a riposo vicino al potenziale dequilibrio dello ione. Metodi HTS tipo sensori di voltaggio a fluorescenza, possono non avere la sensibilit per registrare queste risposte, e possono richiedere spostamenti artificiali del potenziale di riposo in modo da aumentare lintensit del segnale. Per alcuni saggi pu essere usata la Valincomicina per aumentare la conduttanza al potassio e iperpolarizzare la cellula, incrementando la forza sul flusso ionico entrante, permettendo cos un gran cambiamento nel potenziale di membrana allapertura dei canali depolarizzanti. Alternativamente lespressione di canali addizionali potrebbe servire a iperpolarizzare la cellula. Altri problemi sorgono per quei canali ionici la cui attivazione uso dipendente o che hanno una componente voltaggio dipendente accoppiata con unattivazione mediata da ligande. Infine esistono casi in cui il bersaglio dinteresse il sito dazione di un effettore endogeno, e per la convalida del saggio ogni elemento funzionale deve essere ottimizzato per preservare il profilo farmacologico conosciuto per quel tipo di canale. Un aspetto importante la fonte di canali ionici bersaglio, e pi specificatamente luso di cellule primarie o ricombinanti. Luso di linee cellulari primarie in studi HTS risente di problemi derivanti dal livello despressione del canale bersaglio, ma ci sono metodi per ingegnerizzare lespressione anche in neuroni post-mitotici. Sincontrano problemi anche nella preparazione di cellule e membrane derivanti da materiale neuronale. Inoltre cellule primarie possono esprimere una variet di canali ionici eterologhi voltaggio o ligande dipendenti, confondendo cos la conferma dellattivit di un composto sullobiettivo dinteresse. Non di meno c un valore intrinseco nel testare la funzione di un canale nellambiente nativo cellulare in presenza di proteine accessorie critiche. Pi comunemente sono usati cDNA per esprimere proteine canale ricombinanti in cellule dinsetto o in cellule di mammifero immortalizzate. Un potenziale svantaggio che lespressione eterologa in cellule dinsetto, uova di rana o linee cellulari di mammifero pu privare i canali bersaglio dellinterazione in situ con proteine necessarie per il normale funzionamento. Preferibilmente le cellule ospiti esibiscono una limitata espressione endogena di altri canali ionici. Per esempio le cellule HEK293 sono comunemente usate per testare canali ionici attivati da ligande a causa della mancanza di espressione di canali ionici. Altre pubblicazioni riportano canali del virus dellinfluenza M2 e IRK-1 umano espressi nel lievito,

recettori AMPA espressi in cellule renali, canali sodio espressi in cellule CHO, recettori GABA/Benzodiazepine espressi in ovociti di Xenopus. In altri casi pu essere necessario isolare farmacologicamente il canale ionico di interesse. In farmacologia sperimentale il canale dinteresse viene isolato bloccando i canali competitivi. Test che usano queste tecniche includono comunemente la misurazione di un flusso ionico radioattivo (Na25 o Ca45 o Rb86) in cellule coltivate stimolate da un agonista o dal campo elettrico o depolarizzante con ioni potassio. Nuovi bloccanti selettivi dei canali possono essere usati per isolare pi precisamente canali poco caratterizzati per sviluppare studi e saggi. Metodi standard usati per lespressione includono transfezioni transienti con plasmidi o stabili espressioni con plasmidi e vettori virali con lobiettivo di raggiungere alti livelli despressione per saggi di binding e di flusso ionico. da notare che per saggi che impiegano sensori di voltaggio non necessaria una over espressione. Questo perch cambiamenti relativamente grandi del potenziale di membrane possono derivare dallapertura di relativamente pochi canali. La convalida di linee cellulari ricombinanti dipende dallesibizione di un profilo farmacologico per composti noti che sono stati precedentemente caratterizzati da tecniche di elettrofisiologia tipo patch-clamp o whole-cell. Poich molti canali ionici sono assemblati eteromerici, specialmente canali attivati da ligande nel sistema nervoso, configurare un saggio spesso implica la scelta dellespressione o di una singola subunit o di multiple subunit rispettivamente per lo screening di canali omomerici o eteromerici. Alcune singole subunit sono in grado di formare un canale funzionale, e per analizzare assemblati omomerici lapproccio pi diretto. Per canali eteromerici pi facile ingegnerizzare linee cellulari che coesprimono due o pi cDNA, anche se difficile raggiungere un ottimale livello despressione per ogni subunit. Inoltre importante determinare la composizione delle popolazioni dei canali espressi sulla superficie cellulare. Infine pu essere problematico riconoscere i composti attivi in termini di interazione con la variegata popolazione di canali. Pu essere una strategia ragionevole analizzare cellule che esprimono canali eteromerici ed escogitare saggi secondari, di tipo elettrofisiologico, per caratterizzare lo specifico sito (i) di attivit del composto. La scelta delle specie chimiche da testare in analisi di canali ionici non differisce tanto da altri tipi di bersagli farmacologici. Peptidomimetici, analoghi di aminoacidi e altri composti hanno strutture tridimensionali che possono interagire specificatamente con le proteine del canale. Molti prodotti vegetali interagiscono specificamente e potentemente con i canali ionici. Tossine prodotte da insetti, serpenti e altri animali sono utili strumenti per lo studio delle funzioni dei canali ionici e possono essere utilizzati per lo sviluppo di farmaci lead. Analisi dei canali ionici sono particolarmente sensibili a composti ionofori o ad agenti che distruggono lintegrit della membrana.

6. Strategie per saggi secondari


In pratica il saggio primario dar risposte piuttosto imprecise a riguardo del comportamento dei canali ionici. Per esempio saggi basati sui cambiamenti del flusso ionico misurato con ioni radioattivi non distinguer gli agenti capaci di cambiare laffinit dellagonista o la sua dipendenza dal voltaggio da quelli che influenzano il meccanismo di desensitizzazione del canale. Inoltre cambiamenti nel potenziale di membrana misurati con indicatori di fluorescenza non danno informazioni riguardanti le specifiche conduttanze coinvolte nella risposta. In quasi tutti i casi, i composti attivi identificati nelle analisi primarie devono essere testati con una serie di saggi secondari prima che la loro attivit possa essere dichiarata specifica. Un importante fattore chiave nella scelta dei saggi secondari e come questi vanno inseriti nel progetto di analisi linsieme di criteri per definire un composto lead cio meritevole di test prolungati. Tali criteri possono descrivere un profilo di potenza e selettivit per il canale bersaglio oppure limitata tossicit e buonattivit in modelli animali. Alcuni saggi secondari

possono essere definitivi e in linea con questi criteri. Per altri possono servire informazioni addizionali sulle molecole candidate, ma possono non dare risultati go/no go. Poich in molte operazioni di scoperta di farmaci vengono analizzati intere serie di canali e vari sottotipi, studi incrociati possono fornire importanti informazioni su selettivit e citotossicit senza dover sviluppare nuovi saggi. Deve essere prestata attenzione nelluso di misure biochimiche di selettivit per scegliere, tra le varie molecole, le candidate prioritarie. In vari casi saranno disponibili risultati di studi pre-clinici o clinici per dimostrare se lattivit del composto sui canali ionici in questione produrr o no effetti secondari indesiderati e inaccettabili. Molto spesso per questi dati non sono disponibili ed un esatto criterio di selettivit verso un dato canale quasi una supposizione. Le strategie applicate nei saggi secondari per i canali ionici non differiscono tanto da quelle applicate per altre classi di molecole. Spesso viene effettuato un saggio di conferma usando la stessa metodologia delle analisi primarie e utilizzando concentrazioni multiple di composto per determinare un valore approssimativo della potenza. I saggi secondari sono progettati per: 1) dimostrare che lattivit dei composti scoperti nei saggi primari effettivamente dipendente dal bersaglio e non dovuta a interazioni con altri canali endogeni, 2) valutare la selettivit delle molecole nei confronti del canale bersaglio paragonati ad altri canali correlati, 3) scoprire informazioni sui meccanismi, 4) identificare molecole con attivit tramite saggi con tessuti che presentano il canale bersaglio, 5) classificare le molecole secondo parametri farmacocinetici e citotossici. Poich i saggi secondari non necessitano dellefficienza dei saggi primari, si usano le tradizionali tecniche usate dai farmacologi. La pi importante tecnica lelettrofisiologia per confermare lattivit, spesso usata in cellule primarie in cui il composto viene testato sul bersaglio che si trova nel suo ambiente cellulare nativo. La scelta dei saggi secondari e lordine in cui sono eseguiti richiedono attenzione, in particolare la natura complessa dei saggi di canali ionici su cellule richiede un attenta pianificazione in modo da concentrare gli sforzi su quei composti che hanno una autentica attivit sul bersaglio.

7. Tecniche di ricerca non adatte per HTS


Senza dubbio i metodi di elettrofisiologia hanno rivoluzionato la nostra comprensione riguardo le propriet e il comportamento dei canali ionici e le interazioni con i farmaci. La tecnica usata in elettrofisiologia detta patch clamp si riferisce a una tecnica che forma un solido sigillo sulla superficie della cellula con una pipetta che contiene un piccolo elettrodo. Questo permette alla corrente di scorrere attraverso il piccolo sigillo (pochi micron) ed essere registrata per analizzare le propriet elettriche di un singolo canale o di tutta la cellula. Metodi tradizionali con elettrodi non sono molto veloci a testare migliaia di molecole al giorno, a causa di problemi inerenti luso di un adatto preparato biologico o per effettuare registrazione stabili con le caratteristiche desiderate. Molti studi hanno introdotto delle estensione ai metodi tradizionali con lo scopo di aumentare le prestazioni. Uno studio ha impiegato elettroforesi capillare per la ricerca di antagonisti attraverso una pipetta che registra corrente indotta da recettori NMDA in membrane di bulbo olfattorio di cervello di ratto. Un altro ha sviluppato luso di un multielettrodo per registrare simultaneamente in pi punti. Sforzi di questo tipo stimoleranno gli elettrofisiologi a trovare applicazioni ad alte prestazioni con i loro metodi. In genere comunque i metodi di elettrofisiologia sebbene indispensabili per capire in dettaglio il comportamento dei canali e linterazione con farmaci, non sono ancora arrivati ad avere un ruolo importante in HTS, tranne in saggi secondari o di conferma. Una variet di approcci alternativi per scoprire lattivit dei canali ionici stata riportata: flusso ionico attraverso doppi strati planari, elettroforesi capillare, incorporazione sito specifica di una sostanza fluorescente per determinare cambi di conformazione, misura di attivazione di una cellula tramite un microfisiometro. Queste tecnologie sono in fase di studio e richiedono ulteriori sviluppi per essere applicabili a HTS.

8. Saggi di binding
Saggi di binding per composti che interagiscono con canali ionici attivati da ligande sono molto adatti per HTS e sono stati usati in programmi di ricerca riguardanti recettori GABA, recettori nicotinici, recettori per il glutammato, per la serotonina, purine, inositolo - 1,4,5 trifosfato. Anche per i canali voltaggio dipendenti sono stati eseguiti saggi di binding, sebbene non abbiano unattivazione da parte di un ligande endogeno. stato possibile con farmaci o tossine radio marcati che si legano al canale in un sito dimportanza farmacologia. Metodi di binding sono stati anche usati in studi di coagonisti e modulatori allosterici. Alcuni esempi sono il binding di TBPS o TBOB sul sito delle benzodiazepine sul recettore GABA o ligandi sul sito per la glicina sul rettore NMDA per il glutammato.

9. Flusso ionico e traccianti radioattivi


Radiotraccianti ionici sono stati usati ampiamente nello screening di farmaci ed hanno il vantaggio di essere molto efficienti e pratici. Comunque gli svantaggi includono la sicurezza e lelevato costo dei reagenti e lo smaltimento dei prodotti radioattivi. Applicazioni di radiotraccianti nello screnning dei farmaci includono luso di Na22 per misurare il potenziale dazione in cellule di neuroblastoma, lefflusso di K42 via pompa Na/K in astrociti, attivazione dei recettori GABA tramite Cl36 e Ca45 per lo studio di antagonisti e per misurare lattivit di un canale. La specificit di questo tipo di saggi controllata e convalidata tramite luso di agonisti selettivi. Un alternativa ai radio-marcati sono i surrogati degli ioni come Rb86 come sostituto del potassio o C14-guanidina per il sodio. Altri studi coinvolgono, per esempio, lucifer giallo che si propaga attraverso i canali delle giunzioni gap per misurare la loro funzione, oppure luso di litio attraverso canali cationici per induzione mitogena. Queste tecniche hanno in comune il vantaggio di misurare la funzione di un canale con metodi HTS senza dover sviluppare tecniche speciali. Sono quindi utilizzate queste tecniche per lo screening di vaste quantit di sostanze.

10.Trasportatori
I trasportatori sono bersagli dei farmaci strettamente correlati ai canali ionici e sono adatti allHTS tramite lo sviluppo di saggi di accumulazione di binding e di radiotraccianti. Saggi di binding competitivi che usano substrati radio-marcati ad alta affinit offrono un metodo sensibile per scoprire nuovi bloccanti dei trasportatori, e sono avvantaggiati dai miglioramenti apportati alle metodologie dei radioligandi. Questi saggi sono stati usati per studiare i trasportatori di serotonina, dopamina, adenosina, norepinefrina, colina e GABA. Anche se i saggi di binding sono stati usati per la scoperta di utili inibitori, i saggi di accumulazione hanno il vantaggio di misurare la funzione, facilitando la scoperta siti secondari o catalitici. Saggi di accumulazione sono stati sviluppati per controllare il clonaggio dei geni dei trasportatori, e per studiare le propriet biochimiche, cinetiche e farmacologiche dei trasportatori. Tra gli esempi ci sono i trasportatori del glutammato, serotonina, dopamina, epinefrina, glicina, prolina e GABA. Saggi di accumulazioni sono stati applicati a cellule che esprimono trasportatori clonati e trasportatori endogeni, e generalmente consiste in incubazione di cellule con un substrato radiomercato, lavaggio, solubilizzazione delle cellule e conteggio in scintillazione liquida. Questo formato molto adatto a operazione HTS quando possono essere impiegati pipette multiple, lavatori e lettori in saggi semiomogenei usando le tecnologie Cytostar-T o Flashplate. interessante notare che molti trasportatori sono debolmente elettrogenici, poich utilizzano il gradiente ionico per cotrasportare piccole molecole. La maggior parte dei neurotrasmettitori pu essere studiata utilizzando i tradizionali metodi di elettrofisiologia. In effetti, studi recenti

indicano che i trasportatori dei neurotrasmettitori sono capaci di assumere uno stato funzionale simile a un canale mostrando di incrementare il flusso ionico. Questo permette di progettare HTS basati sia le conduttanze ioniche che accompagnano il trasporto del trasmettitore sia i cambiamenti del potenziale di membrana.

11.Flusso ionico: metodi basati sulla fluorescenza


Bersagli dei canali ionici sono sempre pi stati sviluppati per HTS come saggi funzionali con readouts a fluorescenza, una tendenza osservata pi generalmente in tutte le operazioni HTS. Coloranti fluorescenti sono disponibili per monitorare la concentrazione ionica di Na e Cl, anche se problemi di sensibilit limitano la loro applicazione in HTS. Saggi basati su coloranti fluorescenti sono stati usati per lo studio della mobilizzazione del Ca intracellulare e sono degli strumenti importanti per lo studio della fisiologia dei canali ionici, particolarmente per chi non fisiologo, e sono stati ampiamente adattati a saggi HTS. Coloranti Ca sensibili sono stati usati per monitorare il segnale di trasduzione dei GPCR che porta indirettamente a un flusso di ioni Ca dai depositi intracellulari, o direttamente tramite lancoraggio di canali per il Ca alla superficie. Comunque dai canali Ca voltaggio dipendenti (VGCCs) e da molti canali ligande dipendenti passa sufficiente Ca per essere facilmente rilevato da coloranti fluorescenti. Alternativamente, VGCCs possono essere usati come reporter di canali bersaglio da cui non passa sufficiente Ca, per esempio canali depolarizzanti attivanti da ligande. Sorprendentemente lindividuazione tramite fluorescenza di Ca intracellulare pu essere pi sensibile rispetto ai metodi elettrofisiologici nei casi in cui dai canali passa una piccola corrente Ca ma che si inattivano lentamente. I coloranti di scelta sono Fura-2, Indo-3 e Fluo-3 per saggi HTS. Strumentazione sempre pi sensibile e versatile ha accelerato lo sviluppo dei saggi e la capacit di screening. Strumenti quali microscopio laser scanning fluorescence accoppiato ad un fotomoltiplicatore o ad una videocamera possono essere molto utili nella scoperta e caratterizzazione dei dinamici cambi di cellule che contengono calcio, ma soffrono di basse prestazione per HTS. Allo stesso modo il flusso citometrico stato applicato allo studio delle risposte Ca, ma lefficienza attualmente limitata dalla complessit del campione, anche se sono stati fatti dei tentativi per automatizzare il sistema. Strumenti pi nuovi che posseggono ottiche sofisticate, configurazione per formati ad alta densit, pipette multicanale, permettono di raggiungere prestazione pi alte negli screen basati su sostanze calcio o voltaggio sensibili. HTS per canali bersaglio che usano per misurare il Ca 2-Fura, sono stati eseguiti su piastra fluorimetrica. Introdotta nel 96, il lettore dimmagini fluorimetrico (FLIPR) stato progettato per misurare accuratamente cambi nella fluorescenza in formati ad alta densit, ed stato ampiamente usato in saggi basati su Ca o sul voltaggio in lavori HTS. Il FLIPR utilizza un laser ad Argon per leccitazione della sostanza colorante, integrated liquid handling, e rilevatori ottici CCD per fornire in tempo reale dati cinetici sulle risposte cellulari ai composti e ai ligandi. Unapplicazione molto utile di questa tecnologia luso di addizioni di soluzioni multiple accoppiate al profilo cinetico dellattivit del bersaglio per identificare agonisti, antagonisti e modulatori allosterici, tutti in un singolo test.

12. Potenziale di membrana: fluorescenza


Formati dei saggi che rilevano cambi nel potenziale di membrana sono utili alternative ai formati che misurano il flusso ionico o il legame con il ligande. Lo stimolo per questo approccio che relativamente piccoli cambi nella conduttanza ionica genera un relativamente grande cambiamento nel potenziale di membrana. Un prerequisito per il successo nello sviluppo del saggio che la sensibilit dellindicatore deve essere adeguata al range dinamico del saggio. Questo approccio impiega di solito indicatori a fluorescenza ed vantaggioso da in punto di vista HTS a causa dei

costi relativamente bassi e la possibilit di incorporare sistemi automatici. Lavori precedenti con coloranti fluorescenti a singola lunghezza donda hanno rivelato dei problemi nelladattare questo approccio allHTS. Coloranti impermeabili che cambiano rapidamente la loro distribuzione allinterno della membrana in risposta a cambiamenti del potenziale risentono di bassa sensibilit, tipicamente un 2 10 % di cambio in fluorescenza per 100mV di cambiamento nel potenziale di membrana. Al contrario, coloranti permeabili che si suddividono tra la superficie della membrana e il citoplasma, in risposta a depolarizzazione sono abbastanza sensibili, sebbene le risposte si hanno in minuti piuttosto che in millisecondi. Un importante e recente miglioramento stato lo sviluppo di coloranti fluorescenti a trasferimento di energia di risonanza (FRET) come sensori che hanno un aumentata sensibilit al voltaggio rispetto al tradizionale oxonolo, una risposta veloce e un output radiometrico. Il sensore FRET formato da due componenti, un donatore di energia fisso, e un accettore di energia mobile.

13. Considerazione sugli automatismi


HTS richiede un moderato/alto livello di automazione. Gli elementi che richiedono automazione dipenderanno dalla prestazioni desiderate, possono includere 1) preparazione campioni, 2) manipolazione piastra, 3) manipolazione liquidi, 4) readout e 5) elaborazione dati. Questi elementi possono essere o no altamente integrati, ma in ogni caso richiedono accurata programmazione. Le limitazioni che lautomazione pone sugli screen diretti ai bersagli dei canali ionici non differiscono molto dagli altri tipi di bersagli dei farmaci.

14. Conclusioni
Difetti nella funzione di canali ionici sono alla base di numerose malattie umane clinicamente ed economicamente importanti. La corrispondente importanza dei canali ionici come bersagli di farmaci si riflette nellaccresciuta importanza che stanno avendo queste proteine nei programmi di ricerca farmaceutica negli ultimi anni. Sfortunatamente lelettrofisiologia la tecnologia di scelta per caratterizzare il comportamento dei canali ionici ma non adatta allHTS. Invece metodi tradizionali che hanno meno sensibilit ed eleganza, incluso binding di radioligandi, sono pi utilizzati per lo screening su larga scala. Saggi funzionali pi recenti basati su coloranti fluorescenti per misurare la concentrazione ionica e sensori di voltaggio a fluorescenza forniscono informazioni pi ricche sui composti attivi. Tutti questi metodi sono stati migliorati poich le richieste di screening di farmaci si sono focalizzate sui canali ionici, e nuove tecniche stanno emergendo per rispondere pi dettagliatamente ai livelli di HTS. Queste ultime tecniche includono studi genetici sullattivit del canale, microfluorimetria, varie tecnologie miniaturizzate, e un nuovo livello di sofisticazione nella misura della fluorescenza. In principio, le strategie di HTS per i canali ionici non differiscono dagli altri tipi di bersagli. I saggi primari saranno seguiti da una serie di saggi di conferma e saggi secondari, inclusa lelettrofisiologia, con lo scopo di identificare composti che pi si avvicinano ai criteri stabiliti per il progetto, la ricerca in questione. A causa delle propriet di desensibilizzazione e voltaggio dipendenza dei canali ionici, il bersaglio pu subire delle manipolazioni non comuni, per generare un segnale forte. La combinazione di alta tecnologia, biologia molecolare, biochimica e farmacologia ha guidato i progressi attuali in questo campo e continuer ad apportare strategie ed approcci agli sforzi nello screening dei canali ionici. Lingegnosit con la quale i ricercatori applicheranno questi strumenti determiner probabilmente il numero e la qualit di composti lead che emerger dai progetti di screening e determiner infine la riuscita o il fallimento della ricerca farmaceutica.