2 mtodos generales y los parmetros de la cultura La familiaridad con algunos conceptos biolgicos y mtodos es esencial cuando se comprensin ampliacin

de un sistema de cultivo. En pequeos cultivos de escala no es margen para un error. Si la cultura no es una molestia, pero no necesariamente un desastre. El fracaso de gran escala de la cultura no slo es ms grave en trminos de coste, pero Tambin el sistema exige que las condiciones son ms crticos se reunieron. En esta seccin describe los factores que deben tenerse en cuenta que el tamao de la cultura se hace ms grande. 2.1 cuantificacin celular Medir el nmero total de clulas (por cuenta hemocitmetro de clulas enteras o ncleos teidos) y la masa total de clulas (mediante la determinacin de la protena o el peso seco) fcil de lograr. Es mucho ms difcil obtener una medida fiable de la viabilidad celular debido a los mtodos empleados ya sea el estrs de las clulas o utilizar un programa especfico, y no necesariamente tpicos, los parmetros de la fisiologa celular. Una dificultad adicional es que en muchos sistemas de cultivo de las clulas no pueden ser incluidos en la muestra (ms anchoragedependent culturas), o un examen visual, y una medicin indirecta de se hizo. 2.1.1 Viabilidad celular La prueba de exclusin del colorante se basa en el concepto de que las clulas viables no ocupan ciertos tintes, mientras que las clulas muertas son permeables a estos colorantes. El azul tripn (0,4%) es el tinte ms utilizado, pero tiene la desventaja de manchas solubles protenas. En presencia de suero, por lo tanto, Erythrocin B (0,4%) es a menudo preferido. Las clulas en la forma estndar con un hemocitmetro. Algunos se debe tener precaucin cuando los resultados de la interpretacin como la captacin del colorante es Phand dependiente de la concentracin, y hay situaciones en las que engaosa resultados se pueden obtener. Dos ejemplos relevantes son filtracin de membrana causado por tripsinizacin recientes y la congelacin y descongelacin de la presencia de dimetil sulfxido. Un mtodo colorimtrico utilizando el ensayo de MTT (vase el captulo 7) puede ser utiliza tanto para medir la viabilidad despus de la liberacin de los contenidos en el citoplasma medio de las clulas lisadas artificialmente, y para la visualizacin microscpica dentro de la celda adjunta (1). 2.1.2 Las mediciones indirectas Medidas indirectas de la viabilidad se basan en la actividad metablica. La mayora de los parmetro utilizado es la utilizacin de glucosa, pero la utilizacin de oxgeno, cido lctico o la produccin de cido pirvico, o la produccin de dixido de carbono tambin se puede utilizar, como Puede la expresin de un producto, tal como una enzima. Cuando las clulas estn creciendo logartmica, existe una correlacin muy estrecha entre la utilizacin de nutrientes y el nmero de clulas. Sin embargo, en otras fases de crecimiento, las tasas de utilizacin, causados por el mantenimiento en lugar de crecimiento, puede dar resultados falsos. Las mediciones obtenidos se puede expresar como un crecimiento del rendimiento (Y) o la utilizacin especfica / tasa de respiracin (Q): cambio en la concentracin de biomasa (dx) Crecimiento del rendimiento (Y) = - 1 cambio en la concentracin de sustrato (ds) Especficas de utilizacin / tasa de respiracin (GC) = cambio en la concentracin de sustrato (ds) 2

tiempo (dt) x masa celular / nmero (dx) Los valores tpicos de los rendimientos de crecimiento de la glucosa (106 clulas / g) son 385 (MRC-5), 620 (Vero), y 500 (BHK). Un mtodo que no est tan influenciada por las fluctuaciones de la tasa de crecimiento es el lactato deshidrogenasa (LDH). LDH se mide en medio libre de clulas a 30 C por despus de la oxidacin del NADH por el cambio de absorbancia a 340 nm. La reaccin se inicia mediante la adicin de piruvato (2). Una unidad de actividad es define como un mol / min NADH consumido. LDH es liberada por las clulas muertas de la / muerte y por tanto es una medida cuantitativa de la prdida de la viabilidad celular. Para medir clulas viables un ensayo inversa puede llevarse a cabo mediante lisis controlada de las clulas y medir el aumento de la LDH. 2.2 Equipo y reactivos 2.2.1 Cultura buque y las superficies de crecimiento La norma no desechables de material para el crecimiento de las clulas animales es de vidrio, aunque esto se sustituye por el acero inoxidable en las grandes culturas. Es preferible el uso de vidrio de borosilicato (por ejemplo Pyrex), porque es menos alcalina que el vidrio de soda y resiste el uso y tratamiento en autoclave mejor. Las clulas suelen conectar fcilmente con el vidrio pero, si es necesario, el apego se puede aumentar por diversos tratamientos de superficie (Ver seccin 3.2). En cultivo en suspensin, la adhesin celular que hay que desalentar, y esto se logra mediante el tratamiento del recipiente de cultivo con una silicona de propiedad preparacin (siliconado). Ejemplos de ello son Dow Corning 1107 (que tiene que cocer al horno encendido) o dimetildiclorosilano (Repelcote, Hopkins y Williams) que requiere un lavado profundo de la embarcacin en agua destilada para eliminar el tricloroetano solvente. Los sistemas complejos usan una combinacin de acero inoxidable y los tubos de silicona para conectar los diversos componentes del sistema. Tubo de silicona es muy permeable a gases, y la prdida de dixido de carbono disuelto puede ser un problema. Tambin es responsable de desgaste rpido cuando se utiliza en una bomba peristltica. De paredes gruesas con tubos adicionales fortalecimiento (manga) debe ser utilizado. A medida conectores se debe utilizar para asegurar una buena conexin asptica durante la operacin del proceso. (Estos estn disponibles de todas las empresas de suministro fermentador, vase Anexo). La eliminacin segura de las muestras de la cultura a intervalos frecuentes, es esencial. Un entrada con un tapn de la vacuna a travs del cual una jeringa hipodrmica se puede insertado proporciona una solucin simple, pero slo es adecuado para pequeas culturas. BRYAN GRIFFITHS Perforacin repetida del tapn de la vacuna puede llevar a una prdida de integridad de la cultura. El uso de dispositivos de muestreo especializadas, tambin est disponible desde el suministro de fermentador empresas, se recomienda. Estos activan de forma automtica la lnea que desea borrar de medio esttico que contiene las clulas muertas, evitando as la necesidad de tomar pequeas muestras iniciales que luego son desechados, y aumentar las posibilidades de mantener la esterilidad. Filtros de aire son necesarios para la entrada y salida de gases. Incluso si continua gas no se utiliza un filtro de entrada es generalmente necesaria para equilibrar la presin y para la entrada forzada o la retirada del medio. Los filtros deben tener un 0,22 um de calificacin y no ser humectable. 2.2.2 No suplementos nutricionales medio Carboximetilcelulosa sdica (15-20 centrepoise, unidades de la viscosidad) es a menudo aadido a los medios de comunicacin (en el 0,1%) para ayudar a minimizar el dao mecnico a las clulas causado por corte las fuerzas generadas por el impulsor de agitacin, la aireacin forzada, o la perfusin.

Este compuesto es ms soluble que la metilcelulosa, y tiene una mayor solubilidad a 4 C que a 37 C. Pluronic F-68 (nombre comercial de poliglicol) (BASF, Wyandot) se aade con frecuencia a los medios de comunicacin (en el 0,1%) para reducir la cantidad de espuma que se produce en agitacin y / o culturas gaseosas, especialmente cuando el suero est presente. Tambin es til en la reduccin de apego a la clula de vidrio mediante la supresin de la accin del suero en el archivo adjunto proceso. Sin embargo, su accin ms beneficiosa es para proteger a las clulas del estrs de cizallamiento y el dao de burbujas en las culturas se agit y roci, y es especialmente eficaz en los medios de comunicacin bajo el suero o suero libre. 2.3 Consideraciones prcticas (A) La temperatura del medio. Siempre pre-calentar el medio de la operacin temperatura (generalmente 37 C) y estabilizar el pH antes de aadir las clulas. Los cambios en la pH durante las etapas iniciales de una cultura de crear muchos problemas, incluyendo un fase de latencia largo y rendimiento reducido. (B) Fase de crecimiento de las clulas. Evite el uso de clulas en fase estacionaria como inculo ya que esto significa una fase de latencia largo, o ningn crecimiento. Lo ideal sera que las clulas de la fase logartmica tarda se debe utilizar. (C) Inoculacin de densidad. Siempre inocular a una densidad celular lo suficientemente alto. Hay no como conjunto de reglas para el nivel de inculo por debajo del cual las clulas no crecer, ya que este vara entre las lneas celulares y depende de la complejidad de la medio que se utilice. Como una gua, que puede estar entre 5 x 104 y 2 X 105 clulas / ml, o 5 x 103 y 2 x 104 clulas/cm2. (D) velocidad de agitacin. Buscar empricamente la tasa ptima de agitar durante una determinada cultura buque y la lnea celular. Esto puede variar entre 100-500 r.p.m. para la suspensin las clulas, pero por lo general en el rango de 200 a 350 rpm, y entre 20-100 rpm de las culturas microportadores. (E) medio y la superficie de la zona. La productividad del sistema depende de la calidad y cantidad del medio y, por clulas dependientes de anclaje, el superficie para el crecimiento celular. Una unidad de volumen medio es el nico capaz de dando un rendimiento limitado de clulas. Factores que afectan el rendimiento son las siguientes: pH, oxgeno limitacin, la acumulacin de productos txicos (por ejemplo, NH4), la limitacin de nutrientes (por ejemplo, glutamina), restricciones de espacio, y el estrs mecnico / corte. Tan pronto como un de estos factores entre en vigor, la cultura est terminado y que quedan en el los recursos del sistema se pierde. El objetivo es, por tanto, retrasar la aparicin de cualquier factor hasta que el efecto acumulado hace que el cese del crecimiento, en que punto el sistema se ha utilizado al mximo. Formas sencillas de lograr esto son: un mejor sistema de amortiguacin (Hepes por ejemplo, en lugar de bicarbonato), gas continua, el volumen del espacio de cabeza un generoso lugar de medio basal, con nutrientes para preservar los suplementos como aminocidos no esenciales cidos o hidrolizado de lactoalbmina, loops perfusin a travs de ultrafiltracin membranas o tubos de dilisis para la desintoxicacin (3) y la oxigenacin, y atencin a la cultura y el diseo del proceso. 2.4 Cintica de crecimiento El formato estndar de un ciclo de cultivo a partir de una fase de latencia, procedimiento a travs de la fase logartmica a una fase estacionaria y, finalmente, a la disminucin y la muerte de las clulas, est bien documentado. Aunque el crecimiento celular por lo general implica aumento en el nmero de clulas, aumento de la masa celular puede ocurrir sin ningn tipo de

replicacin. La diferencia en la masa celular media entre las poblaciones de clulas es considerable, como era de esperar, pero tambin lo es la variacin dentro de la misma poblacin. El crecimiento (aumento del nmero de clulas o masa) se puede definir en los siguientes trminos. (A) Tasa de crecimiento especfico, u (es decir, la tasa de crecimiento por unidad de cantidad (peso / nmeros) de la biomasa): donde dx es el aumento de la masa celular, dt es el intervalo de tiempo, y x es la clula de masas. Si la tasa de crecimiento es constante (por ejemplo, durante el crecimiento logartmico), entonces donde X0 es la biomasa en el tiempo t0 (B) El tiempo de duplicacin, td (es decir, el tiempo para que una poblacin se duplique en nmero / masa): (C) Grado de la multiplicacin del nmero, n, o nmero de duplicaciones (es decir, de los tiempos el inculo se ha replicado): 2.5 Media y nutrientes Una determinada concentracin de nutrientes slo pueden soportar un cierto nmero de las clulas. Nutrientes alternativos a menudo se puede encontrar una clula cuando uno se convierte en agotado, pero esto es una mala prctica debido a que la tasa de crecimiento se reduce siempre (Por ejemplo, mientras que las enzimas alternativas estn siendo inducidos). Si un medio mnimo, por ejemplo como medio basal de Eagle (BME) o medio mnimo esencial (MEM) se utiliza con el suero como el nico suplemento, entonces el problema va a ser cumplido antes que en las culturas utilizando los medios de comunicacin completa (por ejemplo, 199), o en los medios de comunicacin complementado con hidrolizado de lactalbmina, peptona, o BSA (que proporciona muchos de los cidos grasos). Nutrientes probable que se agoten primero son la glutamina, en parte porque se cicla espontneamente a pirrolidona carboxlico y se enzimticamente convertido (por las enzimas sricas y celulares) para el cido glutmico, leucina e isoleucina. Clulas diploides humanas son casi nicos en la utilizacin de cistina en gran medida. Un punto a recordar es que los nutrientes se limitantes del crecimiento antes de que se agoten. A medida que la concentracin de aminocidos se cae, el celular se encuentra cada vez ms difcil mantener suficientes niveles de reserva intracelular. Esto es una exageracin en cultivos en monocapa porque las clulas se vuelven ms bien embalarse en comn, la superficie disponible para la absorcin de nutrientes se hace ms pequeo (4). La glucosa es a menudo un factor limitante, ya que es destructiva utilizada por las clulas y, en lugar de aadir altas concentraciones al principio, es ms beneficiosa para complementar a los dos o tres das. A fin de mantener una cultura, algo de alimentacin adicional a menudo tiene que ser llevado a cabo por completo, o parcial, los medios de comunicacin los cambios o por perfusin. Muchos tipos de clulas son totalmente dependientes de determinados aditivos o puede slo funciona de forma ptima cuando estn presentes. Para muchos propsitos, es muy deseable, o incluso esenciales, para reducir el nivel de suero al 1% o menos. En orden para lograr esto sin una reduccin significativa en el rendimiento de la clula, el crecimiento de varios factores y las hormonas se aade al medio basal. Los ms comunes aditivos son la insulina (5 mg / l), transferrina (5-35 mg / litro), etanolamina (20 UM), y el selenio (5 ug / litro) (5).

La agregacin de clulas es a menudo un problema en cultivos en suspensin. Los medios de comunicacin que carecen de los iones de calcio y el magnesio han sido diseados especficamente para la suspensin las clulas debido a la funcin de estos iones en el archivo adjunto (ver seccin 3.1). Este problema ha sido superado mediante la inclusin de niveles muy bajos de la tripsina en el medio (2 ug / ml). 2.6 pH Lo ideal sera que el pH debe estar cerca de 7,4 en el inicio de una cultura y no caer por debajo de un valor de 7,0 durante el cultivo, aunque muchas lneas de hibridomas parecen prefieren un pH de 7,0 o inferior. Un pH por debajo de 6,8 es por lo general inhibidor para el crecimiento celular. Factores que afectan la estabilidad del pH del medio son la capacidad de amortiguacin y el tipo, la concentracin de espacios vacos, y la glucosa. El sistema de amortiguacin normal en los medios de cultivo de tejidos es el dixido de carbono sistema de bicarbonato anloga a la de la sangre. Este es un sistema de amortiguacin dbil, en que tiene un pKa muy por debajo del ptimo fisiolgico. Tambin requiere que el Adems del dixido de carbono a la cmara de aire por encima de la media para evitar que el la prdida de dixido de carbono y un aumento de iones hidroxilo. La capacidad de amortiguacin del medio se incrementa por los fosfatos presentes en la sal equilibrada solucin (BSS). Medio de la intencin de equilibrar con el dixido de carbono al 5% por lo general contienen BSS de Earle (25 mM NaHCO3), pero una alternativa es BSS de Hanks (4 mM NaHCO3) para el equilibrio con el aire. Amortiguacin y estabilidad en el pH los medios de comunicacin es posible mediante el uso de un tampn de ion hbrido (6), como Hepes (10-20 mm), ya sea como complemento o en lugar de bicarbonato (bicarbonato de incluir en el 0,5 mM). Sistemas alternativos de amortiguacin se proporcionan mediante el uso de los medios de comunicacin especializados como L-15 de Leibovitz (7). Este medio utiliza la capacidad de amortiguacin de amino libre cidos, sustitutos de la galactosa y la piruvato para la glucosa, sodio y omite bicarbonato. Es adecuado para los cultivos abiertos. El volumen del espacio de cabeza en una cultura cerrada es importante porque, en la fase inicial etapas de la cultura, el 5% de dixido de carbono es necesario para mantener un pH estable en el medio, pero, como las clulas crecen y generan dixido de carbono, se acumula en el espacio de cabeza y esto impide que la difusin de este medio. El resultado es una aumento de bicarbonato dbilmente disociados produciendo un exceso de hidrgeno iones en el medio y una cada en el pH. Por lo tanto, un espacio de cabeza grande se requiere en culturas cerradas, por lo general diez veces mayor que el volumen medio (en este volumen tambin es necesaria para el suministro de oxgeno adecuado). Este espacio de cabeza no es generosa posible que las culturas son ampliados, y un sistema abierto con un flujo continuo de aire, suministrada a travs de un filtro y se extrae a travs de otro, se requiere. El metabolismo de la glucosa por las clulas de los resultados en la acumulacin de piruvato y cido lctico. La glucosa es metabolizada a un ritmo mucho mayor de lo que se necesita. Por lo tanto, la glucosa no debe idealmente ser incluidos en los medios de comunicacin en concentraciones superiores a 2 g / litro, y es mejor para complementar en la cultura que para aumentar la concentracin inicial. Una alternativa es sustituir la glucosa por galactosa o fructosa, ya que reduce significativamente la formacin de cido lctico, pero por lo general resulta en una tasa de crecimiento ms lento. Estas precauciones retrasar la aparicin de una no fisiolgica pH y son suficientes para que las culturas pequeas. Como ampliacin de los aumentos, espacio libre del volumen y el rea de superficie de cultivo en relacin con el volumen medio disminucin. Adems, muchos sistemas estn desarrollados con el fin de aumentar la superficie para la adhesin celular y la densidad celular por volumen de unidad. As, los problemas de pH se

producen mucho antes en el ciclo de cultivo porque el dixido de carbono no puede escapar tan fcilmente, y ms clulas significa una mayor produccin de cido lctico y el dixido de carbono. La respuesta es llevar a cabo frecuentes cambios de medio o la perfusin de uso, o tienen un pH de control del sistema. La base de un sistema de control de pH es un electrodo de pH esterilizable en autoclave (disponible en Pye Ingold, Russell). Esto alimenta una seal al controlador de pH que se convierte para dar a una pantalla digital o analgica del pH. Este es un sistema de monitoreo del pH. Control de pH requiere la definicin de los valores de pH altos y bajos a partir del cual el pH no debe ir. Estos dos puntos de set en la escala de pH a su vez en un rel de activar una bomba o vlvula de solenoide, que permite la adicin de cido o un lcali que se hecho a la cultura para que vuelva dentro de las unidades permitidas. Es raro tiene el aumento de pH por encima del punto medio, una vez se haya equilibrado con el espacio de cabeza, por lo que la adicin de cido pueden ser ignorados. Si un lcali se aade, continuacin, el bicarbonato de sodio (5,5%) se recomienda. El hidrxido de sodio (0,2 M) se puede ser usado solamente con una tasa de agitacin rpida, lo cual diluye el lcali antes localizadas concentraciones puede daar las clulas, o si un circuito de perfusin est instalado. Por lo general, bombas para lquidos de entrega se suministran como parte del controlador de pH. Suministro de gas es controlada por una vlvula solenoide y el 95% de aire directamente. Por encima del punto de ajuste de carbono de dixido de ser mezclado con el aire, pero por debajo de este punto slo el aire se entregar a la cultura. Esto en s mismo es un factor de control en que ayuda a eliminar de dixido de carbono, as como el cumplimiento de los requerimientos de oxgeno de las culturas. pH la regulacin es muy fcil adaptarse a los sistemas de control de la computadora. 2.7 Oxgeno La ampliacin de los cultivos de clulas animales depende mucho de la capacidad de suministro suficiente oxgeno sin causar dao celular. El oxgeno es slo ligeramente soluble en medios de cultivo (7,6 ug / ml) y un estudio de las tasas de utilizacin de oxgeno reportados por las clulas (8) revela un valor promedio de 6 ug/106 clulas / h. Una cultura tpica de 2 x 106 clulas / ml, por lo tanto, reducen el contenido de oxgeno del medio (7,6 ug / ml) en menos de 1 h. Es necesario el aporte de oxgeno al medio a lo largo de la vida de la cultura y la capacidad de hacer esto depende de la forma adecuada de oxgeno velocidad de transferencia (OTR) del sistema: donde OTR es la cantidad de oxgeno transferido por unidad de volumen por unidad de tiempo, Kl es el coeficiente de transferencia de oxgeno, y es el rea de la interfaz a travs del cual la transferencia de oxgeno se produce (ya que esto slo se puede medir en estacionario y surfaceaerated culturas, la JCLA valor se utiliza, lo que es el coeficiente de transferencia de masa (Vol / h). C * es la concentracin de oxgeno disuelto en medio est saturado, y C es la concentracin real de oxgeno en un momento dado. El ELK (OTR / C cuando C = 0) se expresa en unidades de h "1 hora" 1 y por lo tanto una medida de el tiempo necesario para oxigenar un recipiente de cultivo dado por completo bajo un conjunto particular de condiciones. Una cultura puede ser aireado por una, o una combinacin de los siguientes mtodos: aireacin de la superficie, aspersin, difusin de la membrana, la perfusin medio, el aumento de la presin parcial de oxgeno, y el aumento de la presin atmosfrica (9). 2.7.1 Superficie de aireacin: las culturas estticas En un sistema cerrado, como un frasco sellado, los factores ms importantes son la cantidad de oxgeno en el sistema y la disponibilidad de este oxgeno a las clulas en crecimiento en 6.3 mm de media. Normalmente, un espacio libre / medio volumen de 10:1

se utiliza con el fin de proporcionar suficiente oxgeno. As, un frasco de 1 litro (por ejemplo, un Roux botella) con 900 ml de aire y 100 ml de medio inicialmente contienen 0,27 g oxgeno (Tabla 1). Esta cantidad ser de apoyo 108 clulas por 450 h por lo que es claramente adecuado. El segundo factor es si el oxgeno puede ser puesto a disposicin del las clulas. La velocidad de transferencia de oxgeno de la fase gaseosa en una fase lquida ha Se calcula en alrededor de 17 (jug/cm2/h (8). De nuevo, esto est bien por encima de la requerido por las clulas en un frasco de 1 litro. Sin embargo, si la superficie se supone que es mesa saturada de oxgeno disuelto y la concentracin en la capa celular es casi cero, entonces, la aplicacin de la ley de Fick de la difusin, la velocidad a la que el oxgeno puede difundir a las clulas es de aproximadamente 1,5 ug/cm2/h. A este ritmo, slo hay oxgeno suficiente para el apoyo de 50 x 106 clulas en un frasco de 1 litro, una densidad celular que en la prctica muchos cultivadores de tejidos tomen como norma. Estos clculos muestran la importancia de mantener un volumen de espacio de cabeza grande, de lo contrario, el oxgeno limitacin podra convertirse en uno de los factores limitantes del crecimiento en esttica culturas cerradas. A una explicacin ms completa de estos clculos, incluyendo la ley de Fick de la difusin, se puede encontrado en una revisin de Spier y Griffiths (8). 2.7.2 aspersin Este es el burbujeo del gas a travs de la cultura, y es un medio muy eficaz de efectuar la transferencia de oxgeno (como qued demostrado en la fermentacin bacteriana). Sin embargo, puede ser perjudicial para las clulas animales, debido al efecto de la alta energa superficial de la burbujas en la membrana celular. Este efecto perjudicial puede ser minimizado mediante el uso de burbujas de aire (que tienen las energas de menor superficie que las burbujas pequeas), por utilizando un tipo de gas muy baja (por ejemplo, 5 ml / 1 min), y mediante la adicin de Pluronic F68. A forma especializada de aspersin, el fermentador de transporte areo (ver seccin 4.7) tambin se ha utilizados en cultivos de gran unidad de monocapa proceso (por ejemplo, propagadores de la placa mltiple). Cuando aspersin se utiliza, la eficiencia de la oxigenacin se incrementa mediante el uso de una cultura buques con una gran altura / dimetro. Esto crea una mayor presin en el base del reactor, lo que aumenta la solubilidad del oxgeno. 2.7.3 membrana de difusin Tubo de silicona es muy permeable a los gases, y si de gran longitud de pared delgada tubos pueden ser dispuestos en el recipiente de cultivo despus de difusin de oxgeno suficiente en la cultura se puede obtener. Sin embargo, una gran cantidad de tubera se requiere (por ejemplo, 30 m de 2,5 cm de los tubos para una cultura de 1.000 litros). Este mtodo es costoso e inconveniente de usar, y tiene el problema inherente de que ampliacin de la tubera requerida principalmente en dos dimensiones mientras que la de la cultura es tridimensional. Sin embargo, varios sistemas comerciales disponibles (por ejemplo, Braun). 2.7.4 perfusin Media Un sistema de circuito cerrado de perfusin continua (o bajo demanda) lleva medio de la cultura, que pasa a travs de una cmara de oxigenacin, y lo devuelve al la cultura. Este mtodo tiene muchas ventajas si el medio puede ser convenientemente separado de las clulas de la perfusin a travs del lazo. El medio en la cmara se puede burbujear vigorosamente para asegurar la saturacin de oxgeno y otras adiciones, como el hidrxido de sodio para el control de pH, lo que daara las clulas si se pone directamente a la cultura, se puede hacer. Este mtodo se utiliza en los sistemas de cuentas de vidrio (Seccin 3.3.4) y ha demostrado ser particularmente eficaz en microportadores sistemas (Seccin 3.3.4), donde especialmente modificado filtros spin se puede utilizar.

2.7.5 la oferta ambiental La concentracin de oxgeno disuelto se puede aumentar mediante el aumento del espacio de cabeza pO2 (de la atmsfera un 21% a cualquier valor, utilizando mezclas de oxgeno y nitrgeno) y elevando la presin de la cultura en 100 kPa (alrededor de 1 atm) (que aumenta la solubilidad del oxgeno y su velocidad de difusin). Estos mtodos deben deben utilizar slo cuando la cultura est muy avanzada, de lo contrario toxicidad del oxgeno podra ocurrir. Por ltimo, la geometra de la hoja de agitacin tambin afecta el oxgeno velocidad de transferencia. 2.7.6 Scale-up La limitacin de oxgeno suele ser el primer factor que hay que superar en la cultura de la ampliacin. Esto se convierte en un problema en las culturas tradicionales se agit a cantidades superiores a 10 litros. Sin embargo, con el uso actual de los cultivos de alta densidad que mantiene la perfusin, la limitacin de oxgeno puede ocurrir en una cultura de dos litros. La eficacia relativa de algunos de los sistemas de oxigenacin alternativa en biorreactores a gran escala es se muestra en la Tabla 2, y la gama de procedimientos de la oxigenacin en los distintos tipos de recipientes de cultivo ha sido revisada (9, 10) mesa 2.7.7 potencial Redox El potencial de oxidacin-reduccin (ORP), o el potencial redox, es una medida de la de carga del medio y se ve afectada por la proporcin de la oxidacin y la reduccin de productos qumicos, la concentracin de oxgeno, y el pH. Cuando un nuevo medio se prepara y se coloca en el recipiente de cultivo que se necesita tiempo para que el potencial redox para equilibrar, un fenmeno conocido como blandiendo. El nivel ptimo para muchos lneas celulares es 75 mV, que corresponde a una pO2 disuelto de 8.10%. Algunos Los investigadores encuentran que es beneficioso para controlar el suministro de oxgeno a la cultura medio de redox, en lugar de un electrodo de oxgeno. Alternativamente, si el redox potencial se controla por medio de un electrodo de redox y pH-metro (con mV pantalla), luego una indicacin de cmo est progresando el crecimiento celular se pueden obtener (11). Esto es as porque el valor redox cae durante el crecimiento logartmico y alcanza un valor mnimo de aproximadamente 24 horas antes del inicio de la fase estacionaria (Figura i). Esto proporciona una gua til para el crecimiento celular en cultivos de clulas en muestreo no es posible. Tambin es til ser capaz de predecir el final de la fase de crecimiento logartmico de manera que cambia el medio, adems de virus, o de productos los promotores se pueden dar en el momento ptimo. El efecto del potencial redox en cultivos celulares ha sido revisado por Griffiths (12). Grafica 2.8 Tipos de proceso de la cultura 2.8.1 lotes y cultivo continuo En la cultura estndar, conocido como la cultura de lotes, las clulas se inoculan en un fijo volumen de medio y, a medida que crecen, los nutrientes consumidos son los metabolitos se acumulan. El medio ambiente es por lo tanto, en constante cambio, y esto a su vez impone cambios en el metabolismo celular, a menudo referida como la diferenciacin fisiolgica. Con el tiempo la multiplicacin celular cesa a causa de agotamiento de los nutriente (s), acumulacin de residuos txicos, o la limitacin dependiente de la densidad de crecimiento en cultivos en monocapa. Hay forma de prolongar la vida de un cultivo por lotes, y por lo tanto aumentar el rendimiento, por diversos mtodos de sustrato de alimentacin. (A) incorporacin gradual de un nuevo medio, con lo que aumenta el volumen de la cultura (Alimentado por lotes). (B) De forma intermitente, mediante la sustitucin de una fraccin constante de la cultura con un igual

volumen de medio fresco (semi-continuo por lotes). Todos los sistemas de cultivo por lotes mantener los productos de desecho que se acumulan, hasta cierto punto, y tienen un medio ambiente fluctuante. Todos son adecuados tanto para monocapa y suspensin las clulas. (C) de perfusin, por la adicin continua de medio a la cultura y la retirada de un volumen igual de utilizar (sin clulas) medio. Perfusin puede ser abierto, con la remocin completa del medio de el sistema, o cerrado, con recirculacin del medio, por lo general a travs de un vaso secundario, de nuevo en el la cultura del vaso. El recipiente secundario se utiliza para "regenerar" el medio por el gas y la correccin de pH. (D) de flujo continuo la cultura, lo que da verdadero condiciones homeostticas sin las fluctuaciones de los nutrientes, metabolitos, o el nmero de clulas. Depende medio de ingresar a la cultura con la retirada correspondiente de medio adems de las clulas. Por lo tanto, slo es adecuado para las clulas de cultivo en suspensin, o monocapa clulas que crecen en microvehculos. De flujo continuo cultura se describe ms detalle en la Seccin 4.6. 2.8.2 Comparacin de los lotes, la perfusin y de flujo continuo cultura (Figura 2) De flujo continuo la cultura es el nico sistema en el que el contenido celular es homognea, y se puede mantener homognea durante largos perodos de tiempo (meses). Esto puede ser vital para los estudios fisiolgicos, pero no puede ser la ms econmica mtodo para la generacin de productos. Economa de la produccin se calculan en trminos del tiempo del personal, medios, equipos, y aguas abajo los costos de procesamiento. Tambin se en cuenta es la complejidad y sofisticacin de los equipos y procesos, ya que esto afecta el calibre del personal necesario y la fiabilidad de los proceso de produccin. La cultura de lote es ms caro en el tiempo del personal y la cultura los ingredientes, ya que para cada cosecha solo una secuencia de la acumulacin de inculo pasos y el crecimiento en el ltimo buque ha de llevarse a cabo, y tambin hay el tiempo de inactividad, mientras que el cultivo se prepara para su prxima ejecucin. Rutinas de alimentacin para tabla y grafica cultivos discontinuos puede dar cosechas repetidas, pero ms pequeo, y cuanto ms tiempo una cultura se puede mantener en un estado productivo entonces el ms econmico de toda proceso se vuelve. La cultura de flujo continuo en el quimiostato implica que los rendimientos celulares no son mxima debido a un factor limitante del crecimiento se utiliza para controlar la tasa de crecimiento. Si los mximos rendimientos se desean en este tipo de cultura, entonces la opcin turbidostato tiene que ser utilizado (ver seccin 4.6). Algunas aplicaciones, como por ejemplo la produccin de un virus citoptico, no dejan otra opcin que la cultura del lote. Mantenimiento de alta rendimientos, y por lo tanto la concentracin de productos de alto, puede ser necesario reducir la costos indirectos de procesamiento y estos podran ser mayores que los gastos de mediano plazo. Para este fin de perfusin tiene que ser utilizado. Aunque para muchos procesos es ms econmico que la cultura de lote, que se aade a la complejidad del equipo y el proceso, y aumenta el riesgo de una falla mecnica o elctrica, o la contaminacin microbiana terminar prematuramente el ciclo de produccin. No hay clara respuesta a qu tipo de proceso de cultivo se debe utilizar, depende sobre la clula y el producto, la cantidad de producto, los procesos posteriores problemas, y las regulaciones de licencias de productos (definicin de lote de producto, clulas la estabilidad, y el nmero de generacin). Sin embargo, una proporcin relativa de los costos unitarios de

la perfusin, de flujo continuo, y la cultura de lotes en la produccin de anticuerpos monoclonales anticuerpo es 1:2:3.5.