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Evaluacin inmunoserolgica del paciente

Viviana Lifschitz, Luis A. Merino

La presencia de anticuerpos contra un antgeno en particular en el suero de un paciente o de antgenos en una muestra clnica se demuestra efectuando una reaccin serolgica. Para realizar estos estudios, se cuenta con una gran variedad de metodologas basadas en una reaccin antgeno-anticuerpo, la cual puede ser puesta en evidencia mediante diferentes tcnicas. La eleccin de una prueba inmunolgica en particular, ya sea para realizar el diagnstico de una enfermedad infecciosa o evaluar su evolucin, se fundamenta en diferentes puntos: 1. Etapa probable de la enfermedad que se desea diagnosticar (aguda o crnica) 2. Sensibilidad y Especificidad de la reaccin (se explicarn ms adelante). 3. Costo de la prueba a aplicar (Generalmente se comienza el estudio con pruebas de screening o tamizaje las cuales son menos costosas). 4. Factibilidad de realizacin (debido a su complejidad algunas pruebas slo se realizan en grandes laboratorios o centros de referencia) 5. Urgencia en la obtencin de resultados (Algunas pruebas serolgicos slo insumen 3 a 5 minutos en su realizacin mientras que otras llevan varias horas hasta obtener el resultado) En la Tabla I, al final del captulo, se presenta un resumen de las pruebas inmunoserolgicas ms empleadas y su utilidad en el diagnstico de enfermedades infecciosas. De acuerdo al objetivo que se persigue en su realizacin, las pruebas inmunolgicas se clasifican en: a) Directas: cuando lo que se desea detectar son antgenos del microorganismo en una muestra b) Indirectas: cuando lo que se desea detectar son los anticuerpos formados contra un agente infeccioso en particular. En cuanto a la metodologa empleada, las tcnicas inmunolgicas ms utilizadas para el diagnstico de enfermedades infecciosas pueden clasificarse en: a) b) c) d) e) f) Precipitacin Aglutinacin Anticuerpos marcados Tcnicas de inmunoblotting Pruebas de inhibicin Fijacin del complemento

Influyen en el desarrollo de estas reacciones los siguientes factores: a) la concentracin relativa de anticuerpos y antgenos, b) el pH del medio, la clase y concentracin de iones, c) la presencia de sustancias interferentes, d) la temperatura, e) la calidad de los anticuerpos empleados en las tcnicas directas y f) la calidad de los antgenos en las pruebas indirectas. Cuando lo que se intenta es estudiar la presencia de anticuerpos frente a un determinado agente infeccioso, podemos tener resultados cualitativos (el anticuerpo est presente o no) o cuantitativos (qu cantidad relativa de anticuerpos existen). En el primer caso, slo se realiza una sola determinacin cuyo resultado ser positivo o negativo, en el segundo caso,

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deben realizarse diluciones seriadas del suero del paciente (generalmente son diluciones al medio, p.e.: , , 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 128, etc. La prueba se aplica a todas las diluciones del paciente y se considera como ttulo de anticuerpos a la inversa de la mxima dilucin que presente un resultado positivo. Por ejemplo: si en una reaccin dada tenemos resultados positivos en las diluciones , , 1/8, 1/16 y 1/32, y negativos en las diluciones 1/64, 128, etc., el ttulo de anticuerpos de ese paciente para esa reaccin ser de 32. En la mayora de las reacciones en las cuales se titulan anticuerpos, especialmente en las utilizadas para diagnosticar infeccin aguda viral (p.ej. Rubola, sarampin, etc), lo que se busca es un aumento de al menos 4 veces el ttulo inicial, para ello se extrae al paciente una muestra de sangre en fase aguda y otra en el perodo de convalescencia y se realiza la titulacin de anticuerpos en ambas muestras (Muestras pareadas). Ejemplo: si en fase aguda el paciente tiene un ttulo de anticuerpos de 4 frente al virus de la varicela y en fase de convalescencia un ttulo de 32, es evidencia de que el paciente sufri una infeccin reciente por dicho virus. En otras enfermedades, principalmente aquellas poco frecuentes o frente a las cuales es poco probable que la poblacin general haya estado expuesta y presente anticuerpos especficos, (P.e.: Herpes tipo II, SIDA), el solo pasaje de ser seronegativo a presentar serologa positiva ya es evidencia de infeccin reciente (Seroconversin) Reacciones de precipitacin Ocurren cuando el antgeno es una molcula soluble. Al unirse en cantidades equivalentes del anticuerpo, se forma una red de precipitacin hacindose visible la reaccin. Son ejemplos de estas tcnicas las de:
a) Pocillos sembrados

a) Inmunodifusin doble (IDD): el antgeno y el anticuerpo se enfrentan en gel de agarosa y luego de permitir su difusin durante 72 horas, la presencia de bandas de precipitacin indica resultado positivo. (Figura 1). Esta prueba se aplica principalmente en la deteccin de anticuerpos dirigidos contra ciertos gneros de hongos como ser Aspergillus, Cndida, Paracoccidioides e Histoplasma. b) Contrainmunoelectroforesis (CIEF): se basa en el mismo principio que la IDR con la diferencia que la placa de agarosa se somete a un campo elctrico, con lo cual se fuerza la migracin del antgeno y los anticuerpos, acortando el tiempo de reaccin y aumentando hasta 10-20 veces la sensibilidad de la prueba (Figura 2).

Fig. 1: Inmunodifusin doble: Ag (antgeno), Ab (anticuerpo). Ejemplo para deteccin de anticuerpos en el paciente.

Esta prueba tiene aplicacin principalmente en la deteccin de polisacridos capsulares en LCR de pacientes con meningitis por Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis o Haemophilus influenzae tipo b.

Fig. 2: Esquema de la tcnica de CIEF

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Gel que contiene el Ac

Anillo de precipitacin

Dimetro

c) Inmunodifusin radial (IDR): permite cuantificar protenas sricas. Se siembra el suero del paciente en pocillos practicados sobre un gel de agarosa conteniendo los anticuerpos contra la protena (antgeno) que desea cuantificarse. La protena difunde y va precipitando con el anticuerpo especfico, dejando cocin, mo resultado un halo de precipitacin, siendo la concentracin de protenas proporcional al cuadrado del halo de precipitacin formado (Figura 3). Esta tcnica no se utiliza para diagnosticar una enfermedad infecciosa sino para evaluar el estado inmune del paciente (Ver ms adelante). Una forma especial de las reacciones de precipitacin es la reaccin de floculacin, en la cual el antgeno que se utiliza es lipdico y en vez de estar disuelto se encuentra emulsionado en una fase acuosa. Un ejemplo es la prueba de V.D.R.L. (Venereal Diseases Research Laboratory) para la deteccin de anticuerpos inespecficos (reaginas) en pacientes con sfilis.
a) Aglutinacin directa b) Aglutinacin indirecta
Anticuerpo

Fig. 3: Esquema de los halos obtenidos en una reaccin de IDR y del grfico correspondiente que muestra la relacin entre el cuadrado del dimetro y la concentracin de antgenos (Protenas) en la muestra.

Concentracin del Ag

Reacciones de aglutinacin Estas reacciones pueden ser de dos tipos diferentes: a) Las que utilizan antgenos particulados (aglutinacin directa o activa) como ser bacterias o parsitos. Tienen amplia aplicacin, principalmente en la deteccin de anticuerpos anti Brucella (Reaccin de Huddleson), anti Salmonella Typhi (Reaccin de Widal), y para el diagnstico y seguimiento de enfermedades como la de Chagas y Toxoplasmosis.

Antgeno eritrocitario

Eritrocito Sensibilizado

b) Las que utilizan antgenos solubles unidos a partculas que actan como soporte inerte (aglutinacin pasiva o indirecta) como ser hemates o partculas de ltex (Figura 4). En el caso particular en que los antgenos se fijen a hemates la tcnica se denomina hemaglutinacin indirecta (HAI). Estas pruebas se realizan en portaobjetos o en policubetas; la formacin de redes de aglutinacin se manifiesta como grumos en las pruebas en portaobjetos (Figura 5) y como mantos en pruebas en policubetas (Figura 6). Una forma particular de tcnica de aglutinacin es la coaglutinacin, en la cual se utilizan anticuerpos especficos unidos por su fraccin Fc a la protena A de Staphylococcus aureus (la bacteria actuara de soporte inerte) y se utiliza preferentemente para detectar antgenos solubles de Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus

Fig. 4. Esquema de partculas insolubles que reaccionaron con anticuerpos del paciente

Fig. 5: Aglutinacin indirecta en portaobjetos. Izquierda: prueba positiva Derecha: prueba negativa

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agalactiae y Criptococcus neoformans en lquidos orgnicos como ser LCR.

Fig. 6: Prueba de hemaglutinacin en policubetas con diluciones seriadas del suero del paciente. El manto indica resultado positivo. El botn indica resultado negativo. El ttulo de anticuerpos es la mayor dilucin que arroja resultado positivo. Para cada suero se incluyen controles positivos (pos) y negativos (neg)

Cuando la partcula que se utiliza para fijar los anticuerpos es un eritrocito, la tcnica se denomina hemaglutinacin reversa (Figura 7). Esta tcnica se utiliza principalmente para detectar antgeno de superficie del virus de Hepatitis B (HBAgs) en suero de pacientes. La identificacin serolgica de bacterias a partir de colonias recuperadas sobre medios de cultivo slidos se realiza mediante pruebas de aglutinacin directa con antisueros comerciales (Escherichia coli, Vibrio cholerae, Salmonella, Shigella) o mediante pruebas de coaglutinacin (Estreptococos betahemolticos). Estas pruebas permiten determinar el serotipo de la bacteria estudiada y es de suma importancia en clnica y en epidemiologa

Fig. 7: Reaccin de hemaglutinacin reversa

Reacciones que utilizan anticuerpos marcados En ciertos casos, la unin entre un antgeno y un anticuerpo puede ponerse de manifiesto por el uso de un anticuerpo especfico marcado con fluorescena (inmunofluorescencia directa o IFD) o utilizando una antiinmunoglobulina marcada con fluorescena (inmunofluorescencia indirecta o IFI). La marcacin tambin puede realizarse con peroxidasa (reaccin de inmunoperoxidasa), istopos radiactivos (Radioinmunoensayo o RIA) o fosfatasa alcalina (Enzymelinked immunosorbent assay o ELISA tambin denominada enzimoinmunoensayo o EIA). Estas prue-

Fig. 8: Esquema de las tcnicas de inmunofluorescencia directa (A) e indirecta (B).

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bas pueden utilizarse para la deteccin de antgenos (directas) o para la deteccin de anticuerpos (indirectas). a) Inmunofluorescencia directa: La muestra del paciente se fija a un portaobjetos y se agrega una solucin de anticuerpos especficos marcados con fluorescena. Luego de una incubacin, se lava para eliminar restos de anticuerpos no reaccionantes y se observa con microscopio de luz UV. La presencia de elementos fluorescentes indica reaccin positiva (Figura 8). Se aplica especialmente en el diagnstico de sfilis, infecciones por virus respiratorios, uretritis y endocervicitis por Chlamydia trachomatis, etc. b) Inmunofluorescencia indirecta: Se utilizan portaobjetos con el antgeno contra el cual se desea estudiar la presencia de anticuerpos. Se agrega el suero del paciente, se incuba y se lava para eliminar las sustancias no reaccionantes. Finalmente se agrega una inmunoglobulina anti inmunoglobulinas totales, anti IgG o anti IgM y luego se observa al microscopio de luz UV. La presencia de elementos fluorescentes indica reaccin positiva (Figura 8). Esta tcnica puede aplicarse para la deteccin de anticuerpos del tipo IgG o IgM para diagnosticar un gran nmero de enfermedades infecciosas como ser Sfilis, Herpes, Listeriosis, Chagas, Toxoplasmosis, infecciones por Mycoplasmas, Chlamydias y Rickettsias, etc. Existe una prueba, en la cual se absorbe el suero del paciente con una cepa no patgena de Treponema pallidum para eliminar las reacciones cruzadas y luego se realiza, con ese suero libre de anticuerpos inespecficos, una reaccin de IFI. Esta tcnica se denomina de anticuerpos fluorescentes absorbidos (FTAabs) y se aplica para confirmar los resultados positivos de la prueba de V.D.R.L. a) E.L.I.S.A. directo: permite detectar antgenos presentes en una muestra clnica. La muestra se coloca sobre un soporte slido (papel, policubetas, esferas de vidrio, etc) que contiene fijados anticuerpos especficos contra el antgeno que queremos detectar. Luego de una incubacin se lava para eliminar las sustancias no reaccionantes y se agrega un anticuerpo marcado con una enzima, especfico contra el antgeno en estudio. Luego de incubar, se lava y agrega un sustrato cromognico para la enzima utilizada. La presencia de color indica una prueba positiva. Esta prueba tiene mltiples aplicaciones, siendo algunas de las ms corrientes la deteccin de antgenos de Chlamydia trachomatis en muestra urogenitales, de Rotavirus en materia fecal, de Listeria en alimentos, etc. Esta prueba permite determinar adems la concentracin de diversas protenas y hormonas en el suero del paciente por lo que se utiliza para cuantificar IgE, TSH, T3, T4, marcadores tumorales, etc. b) E.L.I.S.A. indirecto: permite detectar anticuerpos contra la mayora de los agentes infecciosos conocidos, ya sean del tipo IgG o IgM (Figura 9). Se coloca el suero del paciente sobre un soporte slido conteniendo el antgeno del microorganismo en estudio, se incuba, se lava y agrega una antigammaglobulina humana marcada con una enzima. Esta Ig puede ser anti inmunoglobulinas totales, anti IgG o anti IgM. Luego de una incubacin, se lava y agrega el sustrato cromognico para la enzima. La presencia de color indica una prueba
Fig. 9: Esquema del desarrollo de una tcnica de E.L.I.S.A. para la deteccin de anticuerpos especficos contra un antgeno determinado

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positiva o sea presencia de anticuerpos en el paciente. Si esta prueba se realiza sobre diluciones seriadas del suero del paciente, podr obtenerse el ttulo de anticuerpos y poder seguir el curso de una infeccin (Figura 10). Entre las aplicaciones ms corrientes estn la deteccin de anticuerpos contra: H.I.V., Chlamydias, Mycoplasmas, Herpesvirus, Virus Dengue, Virus de la Rubola, antgenos del virus de Hepatitis B, etc.
Fig. 10: Imagen de una policubeta para determinacin cuantitativa de anticuerpos mediante tcnica de E.L.I.S.A.

Tcnica de inmunoblotting Esta tcnica, tambin de nominada Western-blot, se utiliza para detectar anticuerpos contra fracciones antignicas proteicas especficas de un microorganismo. Si bien puede aplicarse en diferentes enfermedades infecciosas, el ms frecuente es su uso para confirmar el diagnstico de infeccin por Virus de la Inmunodeficiencia humana, ya que permite identificar contra qu antgeno del virus estn dirigidos los anticuerpos presentes en el paciente. Bsicamente, consiste en tiras de acetato de celulosa sobre la cual se ha realizado una electroforesis de protenas virales. Sobre estas tiras se coloca el suero del paciente y luego de lavar se agrega una antiinmunoglobulina marcada con peroxidasa. Se incuba nuevamente, se lava y se agrega un sustrato cromognico para la enzima peroxidasa. La presencia de anticuerpos se manifiesta por la aparicin de color en el sitio de cada banda antignica. (Figura 11)

Estructura del HIV

Tiras para Western-Blot

Bandas asociadas al HIV

gag p17, p24, p55 (Core) pol p31 (Endonucleasa), p51, p65 (Transcriptasa reversa) env gp41, gp120, gp160 A: control positivo fuerte B: control positivo dbil C: control negativo D: muestra positiva

Fig. 11: Tcnica de Western-blot para confirmar el diagnstico de infeccin por HIV.

Pruebas de inhibicin Tambin podemos detectar anticuerpos basndonos en su capacidad para inhibir alguna actividad biolgica de los microorganismos. Por ejemplo, la prueba de antiestreptoli-

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sina O para el diagnstico de secuelas postestreptoccicas en la que la toxina es neutralizada por los anticuerpos, impidiendo que destruya los hemates. Ciertos virus poseen la capacidad de inducir cambios en la morfologa de las clulas en un cultivo celular (efecto citoptico). La presencia de anticuerpos en el paciente puede detectarse por inhibicin del efecto citoptico cuando se enfrenta una suspensin del virus, el suero del paciente y las clulas en cultivo. Algunos virus poseen la capacidad de aglutinar glbulos rojos por accin de protenas de su envoltura (hemaglutininas). Pueden detectarse anticuerpos en un paciente por inhibicin de la hemaglutinacin cuando se enfrenta el suero de dicho paciente, una suspensin del virus y glbulos rojos.
Tabla I: Utilidad de las diferentes pruebas inmunolgicas en patologas ms prevalentes
Microorganismo Aspergillus fumigatus Brucella abortus Cndida albicans Chlamydia trachomatis Chlamydia pneumoniae Chlamydia psittaci Citomegalovirus Clostridium botulinum Escherichia coli H.I.V Haemophilus influenzae b Helicobacter pylori Histoplasma capsullatum Listeria monocytogenes Mycoplasma pneumoniae Neisseria meningitidis Paracoccidioides brasiliensis Rotavirus Salmonella enterica Salmonella Typhi Shigella spp Streptococcus agalactiae Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Toxocara canis Toxoplasma gondii Treponema pallidum Tripanosoma cruzi Virus Dengue Virus Hepatitis A Virus hepatitis B Virus Rubola Virus sincitial respiratorio Patologa Aspergilosis pulmonar Brucelosis Candidemia Uretritis, endocervicitis Neumona Atpica Psitacosis Hepatitis Botulismo Diarrea SIDA Meningitis lcera gstrica Histoplasmosis Listeriosis Neumona atpica Meningitis Paracoccidioidomicosis Diarrea Gastroenteritis Fiebre tifoidea Disentera Meningitis Meningitis Faringitis Larva migrans visceral Toxoplasmosis Sfilis Enfermedad de Chagas Dengue Hepatitis A Hepatitis Rubola Neumona Tcnica utilizada IDD Aglutinacin directa IDD IFD, EIA directo, IFI, EIA IgG, EIA IgM IFI IgG, IFI IgM IFI IgG, IFI IgM EIA IgG, EIA IgM IDR Aglutinacin directa EIA Western-blot Coaglutinacin, CIEF EIA IgG, EIA IgA IDD Aglutinacin directa, IFI IFI IgG, IFI IgM Coaglutinacin, CIEF IDD AL, EIA Aglutinacin directa Aglutinacin directa Aglutinacin directa Coaglutinacin, CIEF Coaglutinacin, CIEF Coaglutinacin Aglutinacin directa EIA HAI, AD, IFI IFD VDRL, FTAabs HAI, AD, IFI EIA, IHA EIA IgG, EIA IgM EIA, CIEF, HAR EIA IgG, EIA IgM EIA IgG, EIA IgM, IHA Detectar Ac Titular Ac Detectar Ac Detectar Ag Titular Ac Titular Ac Titular AC Detectar Ac Detectar toxina Serotipificacin Detectar Ac Confirmar EIA Detectar Ag Detectar Ac Detectar Ac Detectar Ac Titular Ac Detectar Ag Detectar Ac Detectar Ag Serotipificacin Detectar Ac Serotipificacin Detectar Ag Detectar Ag Detectar Ag Serotipificacin Titular Ac Titular Ac Detectar Ag Detectar/titular AC Titular Ac Detectar Ac Detectar Ac Detectar Ag HBs Detectar Ac Detectar/Titular Ac Objetivo

IFD Detectar Ag IFI, EIA Detectar Ac Abreviaturas: EIA: enzimoinmunoanlisis, IFD: inmunofluorescencia directa, IFI, inmunofluorescencia indirecta, IHA: inhibicin de la Hemaglutinacin, HAI: Hemaglutinacin indirecta, AD: aglutinacin directa, HAR: Hemaglutinacin reversa, IDD: inmunodifusin doble, CIEF: contrainmunoelectroforesis. FTAabs: inmunofluorescencia absorbida, AL: aglutinacin de ltex

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En general, los resultados de una reaccin serolgica no deben ser interpretados en forma aislada, sino en relacin a un contexto clnico y epidemiolgico. EVALUACIN DE LAS PRUEBAS INMUNOLGICAS A la hora de elegir una prueba inmunoserolgica y evaluar sus resultados debe tenerse en cuenta la especificidad y sensibilidad de la misma. Decimos que una prueba es ms sensible cuando menor sea la cantidad de antgeno o anticuerpo detecte, es decir, cuando ms precoz sea el diagnstico que nos permite realizar. Por otra parte, una prueba serolgica es ms especfica cuando menor capacidad posea para dar reacciones cruzadas (reacciones inespecficas) o sea resultados positivos frente a antgenos o anticuerpos no buscados. Si realizamos una tabla imaginaria donde colocamos los resultados obtenidos para una determinada prueba serolgica frente a un determinado grupo de pacientes tendremos las siguientes posibilidades: Pacientes Sanos Enfermos FP PV FP+PV VN FN VN+FN FP+VN PV+FN Total

Resultados

Positivos Negativos

En la cual: Positivo verdadero (PV): resultado positivo en paciente enfermo. Falso positivo (FP): resultado positivo en un paciente sano. Verdadero negativo (VN): resultado negativo en un paciente sano. Falso negativo (FN): resultado negativo en un paciente enfermo. Sensibilidad es = PV x 100 PV+FN Especificidad es = PV x 100 FP+PV

Observando las frmulas podemos decir que: Una prueba serolgica es ms sensible cuando menos resultados falsos negativos arroje. Una prueba serolgica es ms especfica cuando menos resultados falsos positivos arroje. A continuacin daremos un ejemplo: se desea evaluar la calidad de una nueva tcnica de ELISA para el diagnstico de infeccin por Chlamydia trachomatis, en una poblacin de 100 pacientes en los cuales se estudi la mediante cultivo en clulas HeLa (Mtodo estndar o de referencia). Los resultados son los siguientes:
Cultivo de Chlamydia trachomatis Negativo Positivo 1 56 40 3 41 59

Test de ELISA

Positivo Negativo

57 43 100

PV = 56; FP = 1; VN = 40 y FN = 3

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Sensibilidad = 56x100 = 95% 56+3

Especificidad = 56x100 = 98% 1+56

EVALUACIN DE LA INMUNIDAD DE UN PACIENTE La evaluacin inicial del paciente debe incluir una historia clnica completa con todos los antecedentes del paciente y de sus familiares y un examen fsico detallado. Se puede sospechar una inmunodeficiencia por la presencia de infecciones crnicas, infecciones recurrentes, agentes infecciosos raros, curacin incompleta o respuesta incompleta al tratamiento. Se sospecha un defecto de los linfocitos B ante infecciones a repeticin como neumona, sepsis y meningitis. Sugieren anormalidades de los leucocitos las infecciones primarias de la piel y osteomielitis crnica por Klebsiella o Serratia. Una evaluacin inicial incluye: dosaje de concentraciones totales de IgG, M y A, recuento leucocitario total y diferencial (hemograma), pruebas cutneas de hipersensibilidad retardada, estudio funcional de los neutrfilos, medicin de la cantidad de complemento hemoltico (CH50) y C3 y C4. Empezaremos por una evaluacin del estado de las barreras fsicas (presencia de quemaduras, heridas, vas endovenosas que alteren la continuidad del epitelio, etc.). Cuando existe una falla en este nivel es comn encontrar infecciones recurrentes, abscesos cutneos, neumonitis y septicemia. En las dcadas del 60 y 70 eran frecuentemente debidas a S. aureus, al mejorar los tratamientos antibiticos este lugar fue ocupado por Pseudomonas aeruginosa y Enterobacterias en la dcada del 80 y actualmente se encuentran principalmente infecciones por Staphylococcus coagulasa negativos, Aspergillus spp y Candida albicans. Estas manifestaciones tambin se presentan cuando la falla se encuentra en los leucocitos polimorfonucleares y el sistema monocito macrfago. Agregaremos a la evaluacin un hemograma para obtener la cuenta leucocitaria total y diferencial y estudios funcionales de opsonizacin (dosando C3 y anticuerpos), y capacidad de migracin o respuesta a la quimiotaxis (tcnica in vivo de la ventana cutnea de Rebuck), fagocitosis (viendo la ingestin de Candida spp, polisacrido de E. coli recubierto de aceite de parafina con colorante rojo), lisis (evaluando la destruccin de bacterias, prueba del NBT, quimioluminiscencia), y evaluacin de los sistemas enzimticos con coloraciones especficas y estudio de poblaciones con anticuerpos monoclonales. En casos de deficiencias del complemento, por defectos de produccin o exceso de catabolismo, se observan infecciones recidivantes por bacterias pigenas (cocos Gram positivos) cuando el C3 se encuentra disminuido, o principalmente por gonococos y meningococos cuando la deficiencia es de C5 u otros factores del complemento. El nivel del complemento en el suero se puede determinar verificando la actividad hemoltica total del mismo al incubarlo con eritrocitos de carnero sensibilizados con anticuerpos de conejo anti-eritrocito de carnero. Tambin se puede evaluar cada una de sus componentes por inmunodifusin radial (C3 y C4), nefelometra, RIA (properdina) y prueba de hemlisis (se colocan en exceso todas las protenas del complemento, a excepcin de la que se quiere dosificar).

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Una disminucin de C3 y C4 indicaran una activacin del sistema complemento por la va clsica mientras que una disminucin de los niveles sricos de C3 y valores conservados de C4 indicaran la activacin por la va alterna. Por ltimo, en el caso de deficiencias de la inmunidad humoral encontraremos principalmente infecciones del tracto respiratorio superior y neumonas por grmenes como: S. pneumoniae (diplococo Gram positivo), Moraxella catharralis (cocos Gram negativos) y Haemophilus influenzae (bacilo Gram negativo). Los linfocitos B pueden estudiarse con: hemograma (recuento total de linfocitos) y estudio de subpoblaciones con anticuerpos monoclonales(en estudios de leucemias). Para estudiar los anticuerpos podemos realizar un dosaje de: protenas totales y gama globulinas; proteinograma electrofortico ( evaluacin inicial para detectar deficiencias, o diferenciar aumentos policlonales de monoclonales), dosaje de inmunoglobulinas G, M y A totales por inmunodifusin radial y de Ig E por RIA, inmunoelectroforesis para estudio de componentes monoclonales o deteccin de protena de Bence Jones en orina, etc. La evaluacin de los distintos componentes de la respuesta inmune inespecfica puede realizarse con numerosas pruebas de laboratorio. Tambin se dispone de estudios que nos permiten determinar la produccin de anticuerpos contra un microorganismo en particular o buscar antgenos en las distintas muestras remitidas al laboratorio. La actividad biolgica global del complemento en suero se puede medir por su capacidad para producir la lisis de hemates sensibilizados con anticuerpos, mediante la activacin de la va clsica. Las actividades de los componentes individuales del sistema del complemento se pueden evaluar por su capacidad para ser tituladas en un sistema ltico dependiente del complemento que carece del componente sometido a prueba (se colocan en exceso los componentes del complemento menos el estudiado y un sistema de deteccin como ser glbulos rojos recubiertos de anticuerpos) el grado de hemlisis depender de la concentracin del componente en estudio y de su actividad, o medir su concentracin usando reacciones de precipitacin en gel (inmunodifusin radial) en esta tcnica no se diferencian fracciones activas de inactivas. Los neutrfilos se evalan primeramente con el hemograma, con el que se obtiene su concentracin absoluta y relativa, y luego funcionalmente estudiando el proceso de fagocitosis. Anlisis para las deficiencias del funcionalismo de los neutrfilos: Los defectos de la quimiotaxis, fagocitosis y muerte bacteriana determinan un aumento de la susceptibilidad del husped a la infeccin. Probablemente, la enfermedad granulomatosa crnica representa el ejemplo mejor estudiado y mejor definido de enfermedad relacionada con una funcin defectuosa de los neutrfilos. Los PMN de pacientes con esta enfermedad poseen actividad fagoctica normal, pero muestran un defecto en el proceso de muerte de las bacterias. Los microorganismos implicados generalmente son catalasa positivos. El defecto reside en un metabolismo anormal del oxgeno, con reduccin del consumo de oxgeno, reduccin de la generacin de perxido de hidrgeno y superxido, y ausencia de la estimulacin por el shunt de la hexosa monofosfato. La pequea cantidad de perxido de hidrgeno presente en la vacuola fagoctica del PMN queda inactivada rpidamente por los organismos catalasa positivos. La deteccin de esta anomala se favorece empleando la prueba de reduccin del colorante nitroazul de tetrazolio. El nitroazul de tetrazolio oxidado es incoloro, pero durante la fagocitosis se reduce y precipita en el citoplasma como azul de formazn. El fracaso para es-

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timular el metabolismo oxidativo, como en el caso de la enfermedad granulomatosa crnica, impide la reduccin del nitroazul de tetrazolio. En una prueba simple los PMN, ltex y nitroazul de tetrazolio se colocan en forma de gota en un portaobjetos de vidrio y la reduccin a formazn se verifica bajo microscopio. La normalidad de los resultados debe confirmarse siempre por un mtodo cuantitativo ms preciso. Una prueba similar consiste en la medicin de la luz emitida durante la fagocitosis (quimioluminiscencia). La fagocitosis estimula el metabolismo oxidativo de los granulocitos a travs de una descarga de luz (es decir, quimioluminiscencia), la cual se mide con un espectrmetro de centelleo lquido. Los defectos de la activacin oxidativa disminuyen la cantidad de quimioluminiscencia. Se han identificado otros defectos con alteracin de la actividad bactericida de los neutrfilos. Las deficiencias de mieloperoxidasa y glucosa6fosfato deshidrogenasa tambin conllevan un proceso de muerte bacteriana intracelular defectuoso. Los defectos adquiridos del proceso de muerte bacteriana intracelular pueden aparecer en ciertos pacientes tratados con fenilbutazona o corticosteroides o irradiados, as como consecuencia de una infeccin vrica. Antes de que acontezca la lisis bacteriana es necesario que haya tenido lugar la fagocitosis. La fagocitosis granuloctica puede medirse por la ingestin del polisacrido de Escherichia coli recubierto por gotas de aceite de parafina que contengan colorante rojo o de aceite. La presencia del colorante en el interior de los neutrfilos puede determinarse por espectrofotometra. Adems de las pruebas in vitro de estimulacin del metabolismo oxidativo y fagocitosis neutrfila, es posible medir el proceso de muerte bacteriana con una prueba bactericida. Los granulocitos aislados se incuban con suero (como fuente de opsoninas) y bacterias. A diferentes intervalos de tiempo, se extraen muestras de neutrfilos para medir la poblacin bacteriana viable total, la poblacin extracelular y los microorganismos asociados con las clulas en la mezcla de reaccin. Aunque laboriosos, estos procedimientos pueden medir la actividad bactericida de los granulocitos. Las tcnicas de citometra de flujo con anticuerpos monoclonales tambin se han mostrado tiles para la evaluacin de las alteraciones de la fagocitosis. La ausencia de una o varias glicoprotenas adhesivas a la superficie de los granulocitos, identificadas por los anticuerpos monoclonales MAC 1, LFA 1 o p150,95, se asocia a infecciones recurrentes de los tejidos blandos y alteracin de la curacin de heridas, granulocitosis y funcin leucocitaria anmala, inclusive quimiotaxis, adherencia y fagocitosis de partculas recubiertas por complemento. Recuento de eosinfilos: los valores normales varan de 200 a 500 eosinfilos por milmetro cbico de sangre. En las manifestaciones alrgicas del rbol respiratorio superior su concentracin en moco nasal y esputo aumenta considerablemente, y su determinacin ayuda a definir como de origen alrgico muchos casos de rinitis, bronquitis y asma. En cuanto a la inmunidad especfica podemos estudiar las inmunoglobulinas y las poblaciones linfocitarias. Determinaciones tiles para la cuantificacin de -globulinas sricas totales e inmunoglobulinas individuales. La electroforesis de las protenas sricas contina siendo una prueba inicial til para valorar las concentraciones totales de -globulinas, as como para detectar aumentos monoclonales o policlonales. La electroforesis de zona se emplea para separar componentes en el suero, orina, lquido cefalorraqudeo y otros lquidos orgnicos. En la mayora de los patro-

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nes electroforticos de protenas sricas se observan cinco bandas. Dichas bandas incluyen albmina y globulinas 1, 2, y . Se pueden observar los siguientes patrones: 1) banda o zona normal de - globulina total, 0.6 a 1.2 g/dl. 2) Hipogamaglobulinemia: disminucin o ausencia de banda Ig. 3) Hipergamaglobulinemia: intensificacin y amplificacin de la banda, lo que significa que dos o ms de las inmunoglobulinas sricas principales estn elevadas (Ig G, Ig A o Ig M); ello acontece en muchas enfermedades inflamatorias crnicas, tales como el lupus eritematoso sistmico y la hepatitis crnica activa. Este patrn no tiene validez diagnstica, pero es til para seguir el curso de muchas enfermedades. 4) Un componente M o pico monoclonal, cuyo isotipo debe ser identificado. Inmunoelectroforesis: es una tcnica que combina los principios de la electroforesis de zona con los de las reacciones antgeno anticuerpo. Se efecta en gel y en dos secuencias. En primer lugar, se separa la protena por electroforesis de zona en un medio de soporte como agar o agarosa. Seguidamente los grupos de protenas separados se hacen reaccionar con antisuero especfico para obtener arcos de precipitacin. Un corte largo y estrecho, paralelo a la direccin de la separacin electrofortica, se llena con antisuero; los antgenos y el anticuerpo difunden uno a travs de los otros, y aparecen las lneas de precipitacin en forma de arcos elpticos. La inmunoelectroforesis se emplea para separar e identificar antgenos de una mezcla compleja. La inmunoelectroforesis srica que emplea antisueros antiIgA, antiIgM, antiIgG, anti- y anti- pueden determinar con precisin virtualmente todos los componentes M. La deteccin e identificacin de la protena urinaria homognea de cadena ligera (protenas de Bence Jones) puede llevarse a cabo mediante una combinacin de electroforesis en acetato de celulosa e inmunoelectroforesis de orina concentrada. Inmunodifusin radial: permite determinar con precisin la concentracin tanto de antgeno como de anticuerpo de una solucin. En dos tipos de circunstancias, las pruebas de inmunodifusin radial pueden conducir a concentraciones equvocas de inmunoglobulinas. Si el suero contiene IgM monomrica de bajo peso molecular (7S), tal como puede ocurrir en la macroglobulinemia de Waldenstrm, se pueden hallar concentraciones incorrectamente elevadas de IgM, ya que la IgM 19S usada como estndar difunde con mayor lentitud que a igual concentracin de IgM 7S. Como resultado la Ig M 7S forma un anillo de precipitacin mayor que la misma cantidad de IgM 19S. La situacin opuesta acontece cuando en el suero hay altas concentraciones de factor reumatoide IgG 7S. La interaccin del factor reumatoide con la regin Fc de la IgG produce complejos de IgG que difunden ms lentamente que la IgG nativa, resultando un anillo menor de precipitacin y, por ende, una subestimacin de las concentraciones totales de IgG. El dosaje de Ig E total requiere de mtodos que permitan detectar cantidades del orden 0,004 por 100 ml, por ello se recurre al RIA. Su elevacin moderada refuerza la presuncin diagnstica de un proceso de tipo alrgico, los ttulos altos de IgE con o sin eosinofilia sugieren la presencia de parasitismo. La medida cuantitativa en suero para IgE especficos para el alergeno requiere mtodos especiales para detectar las cantidades extremadamente pequeas (picogramos por mililitro) que se encuentran en los pacientes. La tcnica estndar es la prueba del radioalergosorbente (RAST). ste es un sistema de dos fases (slido/lquido) que utiliza un alergeno insolubilizado que se incuba primero con el suero del paciente y despus con anti IgE humana marcada con istopos radioactivos para detectar los anticuerpos especficos para el alergeno del isotipo IgE. Las desventajas de estos mtodos in vitro son biolgicas y tcnicas. La cantidad de anticuerpo IgE srico no es necesariamente un reflejo directo del anticuerpo con relevancia bio-

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lgica unido a clulas cebadas. El resultado de la prueba es falso positivo en pacientes con un nivel total alto de IgE, debido a unin inespecfica, y es falsamente bajo en pacientes desensibilizados con niveles altos de anticuerpo IgG. Estudios cuantitativos de los linfocitos Tanto las clulas B como las clulas T presentan caractersticas particulares de antgenos de superficie y receptores, y cada una de estas clases celulares es responsable de fases especficas de la respuesta inmune. Bajo microscopa ptica y electrnica los linfocitos B y T son morfolgicamente idnticos, aunque difieren en ciertas propiedades fsicas, tales como densidad y adherencia a ciertas superficies (nylon, lana). Los linfocitos humanos de la sangre perifrica pueden ser asignados a las categoras de B, T o clula nula sobre la base de ciertas caractersticas de la superficie celular. La inclusin en una u otra categora se efecta mediante pruebas con clulas mononucleares de sangre perifrica aisladas por centrifugacin en soluciones Ficoll Hypaque, o con sangre total si se emplea la citometra de flujo lser. Dentro de las clulas mononucleadas, casi todo son linfocitos, y de ellos hasta un 80% se identifican como clulas T con base en su capacidad para formar rosetas con eritrocitos de carnero, o con base en la presencia de antgenos de superficie especficos de la clula T identificados por anticuerpos monoclonales. Del 10 a 15% son clulas B, identificadas por presentar molculas de inmunoglobulinas incorporadas en su superficie que pueden detectarse con facilidad con antisuero marcado con fluorescena contra las inmunoglobulinas humanas, o mediante antgenos de superficie especficos para la clula B. La clula B posee un receptor de superficie para el componente C3 del complemento y un receptor para la porcin Fc de las molculas de inmunoglobulinas. Los linfocitos no identificados como clulas T o B se llaman clulas nulas. Esta poblacin engloba a las clulas asesinas naturales, una poblacin celular de gran importancia para la defensa del husped contra las clulas malignas. Estudios funcionales in vitro Activacin linfocitaria: se separan los linfocitos y se incuban con mitgenos (PHA, Con A, fitolaca), esto provoca la divisin celular en linfocitos funcionalmente normales. Se mide el grado de divisin a travs de la sntesis de ADN a partir de precursores radiomarcados (timidina tritiada) o por evaluacin morfolgica y estableciendo el porcentaje de linfoblastos. Este procedimiento evala la sumatoria de los mecanismos involucrados en: reconocimiento del antgeno, interaccin linfocito macrfago y mediadores solubles. Mide la capacidad funcional de los linfocitos T o B para proliferar despus de una provocacin antignica. Se puede realizar con antgenos especficos como PPD, toxoide tetnico, suspensiones de cndidas, etc. Cultivo mixto de linfocitos (CML): Constituye una prueba especial de estimulacin antignica en la cual los linfocitos responden contra antgenos de histocompatibilidad de otra poblacin linfocitaria. Las clulas estimulantes se tratan con radiacin o mitomicina para que no puedan dividirse. Linflisis mediada por clulas (LMC): Sirve para detectar linfocitos T citotxicos. El primer paso es igual al de las pruebas anteriores, luego los linfocitos estimulados se enfrentan con

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clulas blanco marcadas con 51Cr. El grado de liberacin del 51Cr es proporcional a la lisis de clulas blanco, y este a su vez a la cantidad de linfocitos T citotxicos. Reacciones inmunohistolgicas: la presencia de antgenos o anticuerpos unidos a un tejido se puede estudiar mediante la tincin de cortes histolgicos con anticuerpos especficos marcados con un colorante fluorescente (inmunofluorescencia) o con enzimas con sustratos cromognicos (inmunoperoxidasa). Evaluacin in vivo de la inmunidad celular La inmunidad celular se evala in vivo mediante pruebas de intradermorreaccin. Para ello se emplean antgenos obtenidos de diversos microorganismo los cuales se aplican en forma intradrmica y se lee la reaccin inmediata y la reaccin retardada. La presencia de un eritema (zona enrojecida) dentro de las 24 hs alrededor del sitio de inoculacin indica una respuesta alrgica (humoral) a alguno de los componentes del antgeno inoculado mientras que una ppula (induracin) luego de las 48hs en el sitio de inoculacin indica una respuesta celular debido a un contacto previo con el antgeno, ya sea por infeccin o por vacunacin. Son ejemplos de estas reacciones las de Mantoux (tuberculosis), la de Mitsuda (lepra) y la melitina (brucelosis). Los antgenos utilizados y la forma de interpretacin de estas pruebas se tratarn con cada tema en particular

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