Estudio del proceso de transformacin del colgeno en gelatina

POR

M. C. Bonmat Limorte y G. Len Albert

RESUMEN Se ha realizado un estudio del proceso de transformacin de colgeno en gelatina utilizando la viscosidad reducida como parmetro de control. Se ha observado una gran influencia de la temperatura y del tiempo de calentamiento sobre este proceso, as como sobre la temperatura de desnaturalizacin. Se han determinado igualmente las entalpia y entropa de desnaturalizacin. SUMMARY A study of the process of conversin of collagen to gelatin has been carried out using reduced viscosity as indicative parameter. We have observed an important influence of temperature and heating time on that process as well as on denaturalization temperature. Denaturalization entalphy and entrophy have been also determined. INTRODUCCIN El colgeno, el ms comn de los componentes orgnicos de los tejidos conectivos (tejidos relacionados fundamentalmente con aspectos es-

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tructurales y mecnicos del organismo animal), es el material estructural dominante en el reino animal. Se encuentra en los tejidos de todos los tipos de organismos plucicelulares, desde los pluricelulares invertebrados ms primitivos hasta el hombre. Es, sin duda, la protena ms abundante en los mamferos, encontrndose en una proporcin aproximada del 25 % de la protena total. La molcula de colgeno tropocolgeno es una macromolcula muy alargada, en forma de varilla, constituida por tres cadenas polipeptdicas, de unas 1.000 unidades aminoacdicas cada una, arrolladas entre s constituyendo una triple hlice estabilizada fundamentalmente por interacciones o enlaces por puente de hidrgeno. Es conocido desde hace tiempo que cuando los tejidos colaginosos se calientan a temperaturas moderadas en agua o en disoluciones acuosas de cidos o bases se disuelven parcialmente, dndose, a la porcin de protena solubilizada, el nombre genrico de gelatina. Puesto que ese calentamiento suave solamente puede provocar la ruptura de los enlaces de hidrgeno que estabilizan la triple hlice del colgeno, el proceso de transformacin de colgeno en gelatina puede ser considerado como un proceso tpico de desnaturalizacin que, en este caso, supone tan slo el desmoronamiento de la estructura triple hlice del colgeno nativo, sin afectar para nada a la estructura primaria de la protena. La estructura de la gelatina resulta ser, por lo tanto, altamente simplificada con relacin a la del colgeno, estando constituida por las cadenas originarias de la molcula de aqul, pero en un claro ordenamiento al azar. La anterior hiptesis ha sido comprobada por los autores del presente trabajo en un estudio llevado a cabo sobre colgeno y gelatina obtenidos a partir de un mismo material biolgico, observando que las composiciones aminoacdicas de ambos son prcticamente idnticas, mientras que existe una gran diferencia en las propiedades relacionadas de alguna manera con aspectos estructurales de niveles superiores de la molcula proteica en disolucin. En el presente trabajo se ha estudiado este proceso de desnaturalizacin aceptando que la transformacin de colgeno en gelatina est ntimamente relacionada con la variacin del valor de determinadas propiedades fisicoqumicas, reflejo de la estructura de la molcula proteica en disolucin. Como parmetro indicativo de este proceso de desnaturalizacin se ha seleccionado la viscosidad reducida.

Estudio del proceso de transformacin del colgeno en gelatina

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PARTE EXPERIMENTAL

El colgeno utilizado en este estudio se obtuvo a partir de tendn de ternero de la raza frisona (Holstein jrisia). El material biolgico se cortaba en trozos lo ms pequeos posible (aproximadamente cubitos de unos 0,5 cm de lado), lavndose stos varias veces con agua destilada. El lavado con agua se continuaba prolongadamente con el fin de eliminar los componentes solubles en ella, realizndose, cuando menos, tres tratamientos de lavado sucesivos, de 4 horas cada uno, con agitacin continua. Para eliminar acompaantes proteicos solubles en sales, el material biolgico se trataba a continuacin con cloruro sdico al 10 % (1) (4 lavados de 10 horas, con agitacin continua). Despus de lavar varias veces con agua destilada, y con el objeto de eliminar los componentes lipideos del material de partida, el residuo insoluble en la etapa anterior se trataba con ter de petrleo (4 lavados de 10 horas, con agitacin continua). El rriaterial insoluble se lavaba de nuevo varias veces con acetona y agua, pasndose a continuacin a extraer selectivamente el colgeno con tampn cido ctrico/citrato, de pH = = 3,6 (2). Despus de tres extracciones sucesivas de 12 horas de duracin (agitando continuamente), los extractos se unan y se filtraban con un embudo de vidrio sinterizado nmero 2, centrifugando seguidamente el filtrado a 8.000 g, durante 2 h. El sobrenadante se dializaba frente a fosfato disdico 0,02 M (3), obtenindose el colgeno precipitado en forma de fibras. Con objeto de purificar este colgeno as obtenido, se extraa de nuevo despus de lavar varias veces con agua y centrifugar con tampn ctrico-citrato de pH = 3,6, repitiendo todo el proceso antes indicado. Una vez vuelto a lavar y a centrifugar, se dejaba secar al aire. Todas las etapas del proceso seguido, de obtencin y purificacin, as como el secado y almacenamiento, se realizaron a 5 C. Porciones alcuotas de una disolucin del 0,043 % de colgeno en tampn cido ctrico-citrato, pH = 3,6, se calentaron a 30, 36, 37, 38, 39 y 41 C, durante 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60 y 90 minutos, pasndose seguidamente a determinar su viscosidad reducida a 30 C. La medida de la viscosidad de las disoluciones se realiz siguiendo bsicamente la tcnica descrita por Kragh (4), con utilizacin de un viscosmetro Ostwald. A partir de las medidas de tiempo y de acuerdo con la proporcionalidad existente entre viscosidad y tiempo (se admite que en estas disoluciones tan diluidas la densidad de la disolucin es aproximadamente igual a la del disolvente puro) se obtiene la viscosidad reducida mediante la expresin.

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Limarte

y G. Len

Albert

''lie

t-to
to C

donde t es el tiempo de flujo de la disolucin, to el tiempo de flujo del disolvente puro (ambos en segundos) y c la concentracin proteica (gramos por mililitro). No se aplicaron a las medidas realizadas las correcciones debidas a energa cintica, flujos anmalos cercanos a la pared del viscosmetro, tensin superficial y drenaje, por ser las condiciones experimentales las adecuadas para minimizar hasta valores totalmente despreciables los errores inherentes a estos efectos.

RESULTADOS Y DISCUSIN Puede apreciarse, en el examen de los resultados obtenidos (tabla I), que el proceso de desnaturalizacin supone la disminucin de la viscosidad reducida desde un valor inicial constante con el tiempo (para nosotros el determinado a 30 G), que representa la totalidad de la protena en estado nativo (es decir, cuando no se ha iniciado la desnaturalizacin) hasta otro valor igualmente constante (el determinado a 41 C), que representa la totalidad de la protena en estado desnaturalizado (es decir, cuando se ha completado el proceso de desnaturalizacin). Los valores intermedios de la viscosidad reducida representan etapas o estados tambin intermedios en el proceso de desnaturalizacin, en los que coexisten distintas proporciones de colgeno nativo y colgeno desnaturalizado.

TABLA I

VALORES MEDIOS A DISTINTOS TIEMPOS Y TEMPERATURAS DE LA VISCOSIDAD REDUCIDA DE UNA DISOLUCIN DE COLGENO DE TENDN DE TERNERO (CONCENTRACIN 0,043% EN TAMPON CITRICO-CITRATO DE p H 3,6) Valores de viscosidad reducida (ml/g) Tiempo (mirlutos) 10 15 20 30 45 60 1.480 1.296 1.482 1.154 1.485 1.071 1.482 1.484 1.483

Temperatura

m
30 36 37 38 39 41

5
1.483 1.410 1.207

90 1.482

552 230 70

923 265 77 68

768 205 69 69

685 149 68 67

942 498 89 67 68

829 386 72 69 68

786 307 68 68 69

715 248 69 67 68

Estudio

del proceso de transformacin

del colgeno

en gelatina

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De acuerdo con lo anterior, hemos de admitir que el proceso de transformacin de colgeno en gelatina se encuentra muy influenciado por la temperatura a la que el mismo tenga lugar (fig. 1). As, a temperaturas de 36 a 37 C, el trnsito se realiza de forma gradual e incompleta, llegndose a un estado de equilibrio en el que coexisten colgeno nativo y colgeno desnaturalizado en determinadas proporciones {54 % de gelatina y 46 % de colgeno a 36 C, y 87 % de gelatina y 13 % de colgeno a 37 C). Por el contrario, a temperaturas iguales o superiores a 38 C el trnsito es ya muy rpido y prcticamente total. Para caracterizar de una forma completa el proceso de desnaturalizacin de una protena es necesario conocer algunos parmetros caractersticos, como son temperatura, entalpia y entropa de desnaturalizacin. Si se tiene en cuenta que la temperatura de desnaturalizacin de una protena se define como aquella temperatura a la que se ha desnaturalizado el 50 % de las molculas ^lo que corresponde a un 50 % de variacin de la viscosidad reducida, es posible calcular la temperatura de desnaturalizacin del colgeno representando el porcentaje de disminucin de la viscosidad reducida frente a la temperatura y determinando, en la grfica as obtenida, la temperatura a la que se ha producido el 50 % de disminucin (fig. 2). Los resultados as obtenidos (tabla II) ponen de manifiesto la gran dependencia entre el valor de la temperatura de desnaturalizacin y el tiempo de calentamiento, observndose que al aumentar ste disminuye la temperatura de desnaturalizacin. Se hace, pues, necesario, al hablar 'de una temperatura de desnaturalizacin, especificar la temperatura de calentamiento a la que ha sido obtenida.

TABLA II

VARIACIN DE LA TEM'PERATURA DE DESNATURALIZACIN (TD) CON EL TIEMPO DE CALENTAMIENTO (t) t(min) TD C C ) 5 37,67 10 37,21 15 36,95 20 36,75 30 36,42 45 36,13 60 35,98 90 35,95

No obstante, puede tambin apreciarse (tabla II, fig. 3) que las diferencias entre las temperaturas de desnaturalizacin disminuyen al aumentar el tiempo de calentamiento, pudindose considerar, en el presente caso, prcticamente constantes las obtenidas para tiempos de calentamieno iguales o superiores a 60 minutos.

red
ISOOr .o
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1 lo

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soo .
37'C

^c
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0
1 6fi 1 10

tiempo
FIGURA

(minutos)

1.Variacin de la viscosidad reducida con el tiempo para distintas temperaturas de calentamiento.

100--

75

50

Tiempos de calentamiento:

2 5

30

35

,0 temperatura (C)

FIGURA 2.Porcentaje de variacin de la viscosidad reducida (% Atir.a) con la temperatura para distintos tiempos de calentamiento.

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Esto sugiere la posibilidad de definir una temperatura de desnaturalizacin independiente de la velocidad de calentamiento por extrapolacin a tiempo infinito de las obtenidas a distintas velocidades de calentamiento. Tal temperatura de desnaturalizacin independiente del tiempo es para el caso del colgeno de tendn de ternero 'la de 35,95 C. El segundo parmetro de inters que caracteriza el proceso de desnaturalizacin es la entalpia de desnaturalizacin (AHD) que viene a ser una medida de la variacin energtica que se produce como consecuencia de la ruptura de las interacciones por puente de hidrgeno. Si admitimos que el proceso de desnaturalizacin tiene lugar en una sola etapa (protena nativa 5 ^ protena desnaturalizada), puede conside= rarse regido por la ecuacin de Van't Hoff: log K = cte.

2,303 RT

donde K es da constante del equilibrio de transicin entre la protena en estado nativo y la pro tena en estado desnaturalizado: [protena desnaturalizada] K =: [protena nativa] La representacin de log K frente a da una recta de cuya pendien-

te obtenemos la entalpia de desnaturalizacin. En la tabla III se indican los porcentajes de protena en estado nativo y protena en estado desnaturalizado para cada temperatura y tiempo de calentamiento obtenidos a partir del porcentaje de variacin de la viscosidad reducida.

TQ{C)

38

37

35--

36--

30

60

tiempo

90 (minutos)

FIGURA 3.Variacin de la temperatura de desanturalizacin (TD) con el tiempo de calentamiento

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y G. Len

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TABLA

III

PORCENTAJES DE PROTEINA EN ESTADO NATIVO, ?, Y PROTEINA EN ESTADO DESNATURALIZADO, PD, EXISTENTES DESPUS DE CALENTAMIENTO A LOS TIEMPOS Y TEMPERATURAS QUE SE INDICAN Temperatura CC) 30 36 37 38 39 41 PN
PD

5 100 0 95,04 4,96 80,67 19,33 34,28 65,72 11,47 88,53

10 100 0

Tiempo 15

(minutos) 20 30 99,86 0,14 61,90 38,10 30,45 69,55 1,49 98,51 O 100 0 100

45 99,72 0,28 53,90 46,10 22,52 77,48

60 99,79 0,21 50,85 49,15 16,93 83,07

90 99,86 0,14 45,82 54,18 12,75 87,25 0,07 99,93 O 100

99,86 100 0,14 O 76,91 23,09 49,58 50,42 9,70 90,30 71,03 28,97 43,70 56,30 5,74 94,26

PN PD PN PD PN PD
PN

86,97 13,03 60,55 39,45 13,95 86,05 0,66 99,34

1,35 O 98,65 100 0,07 O 99,93 100 0 100

PD
PN

0,07 O 99,93 100 0,07 0 99,93 100

PD

0,14 O 99,86 100

0,07 O 99,93 100

El clculo de la entalpia de desnaturalizacin debe hacerse utilizando valores de porcentajes de protena nativa y desnaturalizada corresponpondientes al trnsito en este proceso de desnaturalizacin. De acuerdo con ello, utilizamos las temperaturas de 37, 38 y 39 C para el tiempo de calentamiento de 5 minutos y de 36, 37 y 38 C para los tiempos de calentamiento de 10, 15 y 20 minutos. Para tiempos de calentamiento superiores, los porcentajes de protena nativa y desnaturalizada estn muy cercanos al O % y 100 %, respectivamente, do que hace poco fiables los resultados obtenidos. Calculadas las entalpias de desnaturalizacin para los distintos tiempos de calentamiento (tabla IV), puede observarse que la entalpia de desnaturalizacin resulta independiente de la velocidad de calentamiento, pudindose considerar como valor medio de los obtenidos el de 1,14 cal/g.
TABLA IV

ENTALPIAS DE DESNATURALIZACIN DE COLGENO DE TERNERO OBTENIDAS PARA LAS DISTINTAS VELOCIDADES DE CALENTAMIENTO Tiempo (minutos) Pendiente \HD(Kcal mot^) S.HD(cal g-') (*)

5 72,871 10 77,562 15 71,641 20 77,158 (*) Valores calculados considerando un lcula de colgeno de 300.000.

333,461 1,11 354,927 1,18 327,832 1,09 353,075 1,17 peso molecular medio para la mo-

Estudio

del proceso de transformacin

del col-geno en gelatina

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El clculo de la entropa de desnaturalizacin variacin entrpica consecuencia de la mayor libertad configuracional que supone la transformacin de una estructura triple hlice en tres cadenas desordenadas puede realizarse a partir de la ecuacin AG = AH T A S, admitiendo que en el punto de transicin, es decir, cuando la temperatura y la entalpia son las correspondientes a la desnaturalizacin (TD, AHD) la variacin de enerAFT ga libre es cero (AG = 0) (5). De ah que ASo = \ , de donde se
TD

obtiene un valor de 1,108

r-rr^ para la entropa de desnaturalizacin. mol. K

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BIBLIOGRAFA

1. 2. 3. 4. 5.

YouNG, E. G., y LoRiMER, J. W., Archs. Biochem. GALLOP, P . M . , y SEIFTER, S., Meth. Enzimol, GALLOP, P . M . , Archs. Biochem. KRAGH, A. M . , Anal. Methods Biophys.,

Biophys.,

88 (1960), 373.

6 (1963), 635. 54 (1955), 486.

Prot. Chem., 3 (1960), 175.

CANTOR, C H . R., y SCHIMMEL, P . R . , Biophysical Chemistry, parte 3.', cap. XX, pg. 1052, Ed. W. H. Freeman and Co., San Francisco, 1980.