Deteccin de patgenos en alimentos

Consuelo Vanegas / Johanna Rojas

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Deteccin de patgenos en alimentos

Consuelo Vanegas / Johanna Rojas

Los grupos de mayor riesgo son los nios, ancianos, mujeres embarazadas y pacientes inmunosuprimidos, aunque se presenten casos en poblacin sana entre quince y cuarenta y cuatro aos. Segn reportes de la Secretaria Distrital de Salud de Bogot, los lugares en los cuales se ha presentado la mayora de casos son en casas, colegios, escuelas, hogares infantiles, restaurantes escolares y sitios tursticos.

A diario consumimos diferentes alimentos que son la principal fuente de energa para realizar las actividades de nuestra vida, pero estos alimentos pueden causar enfermedades si no han sido elaborados bajo normas de higiene adecuadas. Este tipo de enfermedades se conocen con el nombre ETAs Enfermedades Transmitidas por Alimentos. A nivel mundial las ETAs son una de las causas ms preocupantes en salud pblica ya que ocurren de 24 a 81 millones de casos y ms de diez mil muertes por consumo de alimentos contaminados. Los alimentos y el agua pueden ser la va de transmisin de bacterias, parsitos, virus, priones causantes del mal de las vacas locas, toxinas de bacterias y hongos. En Colombia se ha reportado que los alimentos potencialmente dainos son aquellos con alto contenido proteico, baja acidez y alta humedad tales como la carne, mariscos, lcteos, huevos, arroz y pastas. Entre los factores de riesgo asociados con la presentacin de estas enfermedades tenemos deficientes hbitos higinicos, el manejo inapropiado de temperaturas enfriamiento, calentamiento, descongelamiento y almacenamiento inadecuado.

Los sntomas tpicos de la gastroenteritis causada por estos microorganismos son dolor de cabeza, nuseas, diarrea, vmito, dolor abdominal y, en algunos casos, escalofro o fiebre. El perodo de incubacin depende del agente etiolgico implicado y puede ser muy corto, o hasta de setenta y dos horas despus de ingerido el alimento contaminado. Las ETAs, adems de causar la gastroenteritis, ameritan especial atencin porque pueden generar complicaciones y secuelas como meningitis, artritis, desrdenes auto inmunes, enfermedades cardiovasculares, neoplasias, y abortos. Por otra parte los gastos econmicos causados por incapacidades laborales y por prdidas industriales debido al rechazo de productos contaminados con estos patgenos son bastante altos. Por estas razones, es necesario que

Figura 1. Casos de ETAs en Colombia de 1998 a 2001. Datos tomados de SIVIGILA, consultados en http://www.col.ops-oms.org/sivigila/2002/BOLE06_02.htm el 8 de noviembre de 2004

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Figura 2. Placa de electroforesis de productos de amplificacin del gen para la identificacin de cepas de Salmonella spp. Los nmeros de las columnas corresponden a: 0 y 11-escala DNA Ladder; 1- Salmonella typhi ATCC 6539. 2-9. Cepas de Salmonella sp. aisladas de alimentos. 10. Control

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Figura 3. Placa de electroforesis de productos de 235 pares de bases que identifican a las cepas de Listeria monocytogenes. Los nmeros de las columnas corresponden a: 0 y 13-escala DNA Ladder; 1-L. monocytogenes ATCC 7644. 2-10 Cepas de Listeria sp., las columnas 6 y 7 no fueron identificadas como L. monocytogenes; 11-Control Negativo: S .aureus ATCC 25923. 12. En blanco

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se preste la atencin adecuada a esta problemtica y se optimicen los mtodos de deteccin de estos microorganismos en los laboratorios de microbiologa. En Colombia, como en otros pases del mundo, han aumentado las ETAs bacterianas debido a que no se ha logrado controlar efectivamente la contaminacin de los alimentos (figura 1). Estos reportes no muestran la dimensin real del problema, las estadsticas pueden ser mayores debido a que falta mejorar el registro de la informacin ante las entidades pertinentes, ya que el consumidor se automedica y desconoce la magnitud de la enfermedad. Adems, los mdicos no siempre ordenan los exmenes adecuados para determinar el agente causante de la sintomatologa. Por lo tanto, es necesario desarrollar la investigacin en esta rea e implementar mtodos de microbiologa ms sensibles y especficos para detectar los patgenos en los alimentos.
1 Para una explicacin de las tcnicas de PCR y de electroforesis, se recomienda el artculo Detectives del Mal de Chagas en Hiptesis No. 1

Deteccin de los microorganismos Para aislar e identificar bacterias de alimentos en el laboratorio se han utilizado, tradicionalmente, mtodos de microbiologa clsica en los cuales los protocolos tardan mucho tiempo en generar resultados y son poco sensibles, permitiendo el crecimiento de otras bacterias, lo que dificulta la deteccin del patgeno. Por esta razn y teniendo en cuenta la necesidad de detectar con rapidez los microorganismos en los alimentos, para evitar que estos salgan a la venta contaminados, se est implementando el uso de la reaccin en cadena de la polimerasa, PCR, que permite identificar de manera ms rpida y especfica los microorganismos productores de ETAs en alimentos destinados al consumo humano. Esta tcnica permite multiplicar el fragmento de un gen especfico de la bacteria patgena, para que se evidencie su presencia al observarlo por el mtodo de electroforesis. Este mtodo permite identificar el gen al compararlo con un patrn de escala (DNA-Ladder) que indica el nmero de pares de bases del gen1. (Figuras 1 y 2).

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Figura 4. Curvas generadas por la PCR en tiempo real de la deteccin de Salmonella enteritidis

El Laboratorio de Ecologa Microbiana y de Alimentos, LEMA, de la Universidad de los Andes, ha realizado estudios para identificar dos de las bacterias ms importantes dentro del grupo de productoras de ETAs: Salmonella spp., causante de gastroenteritis y fiebre tifoidea y Listeria monocytogenes causante de abortos y meningitis. Para Salmonella se estandariz la tcnica de PCR mediante identificacin de un fragmento del gen invA, que permite la invasividad de la bacteria en las clulas epiteliales del intestino. Mediante esta tcnica se han confirmado cincuenta cepas de Salmonella spp. aisladas de

diferentes tipos de alimentos como pollo, tocineta y jamn de cerdo, entre otros. (Figura 2). Para Listeria monocytogenes se amplific el gen que codifica para la Listeriolisina O, que es el factor de virulencia que inicia la infeccin. Se trabajaron sesenta cepas de L. monocytogenes, provenientes de derivados lcteos, las cuales fueron identificadas por la banda de amplificacin de 235 pares de bases (figura 3). Los alimentos estaban disponibles para su venta en plazas de mercado de Bogot.

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A pesar de que la PCR es una tcnica rpida, se ha desarrollado una modificacin a sta, en la cual no se realiza electroforesis, de tal forma que los resultados se obtienen simultneamente con la amplificacin del gen. Esta tcnica se conoce con el nombre de PCR en tiempo real y se realiza utilizando un marcador, como SYBR GREEN-I, que produce fluorescencia al unirse al ADN de cadena doble, con un equipo que la detecta y genera una curva de la intensidad de fluorescencia contra temperatura. El pico de la curva indica la temperatura de fusin melting peak, en la cual el 50 por ciento del ADN se encuentra en doble cadena. De esta manera, cada cepa bacteriana genera una temperatura de fusin especfica que indica su presencia. En la figura 4 se observan los picos de amplificacin obtenidos para la deteccin de Salmonella enteritidis. Esta bacteria genera una temperatura de fusin de 86.47C mientras las otras cepas evaluadas, utilizadas como controles negativos (vase la tabla de la figura 4), expresan temperaturas de fusin diferentes, indicando que no son Salmonella enteritidis. Esto demuestra la alta especificidad de la prueba. En el Laboratorio de Ecologa Microbiana y de Alimentos, LEMA, de la Universidad de los Andes, se est utilizando la tcnica de PCR en tiempo real para la deteccin de Salmonella enteritidis en muestras de pollo a la venta en supermercados de Bogot, Listeria monocytogenes en leches crudas distribuidas en Boyac, y Campylobacter, utilizando menudencias de pollo distribuidas en Bogot. El uso de estos mtodos permite obtener resultados ms rpidos y seguros, por lo cual deberan utilizarse en la industria para tener un control de calidad ms estricto y reducir el riesgo de distribucin y venta de alimentos contaminados. De esta forma se podra disminuir la circulacin de bacterias patgenas en los alimentos y reducir la generacin de infecciones e intoxicaciones.

> Referencias
[1] D. De Medici, L. Croci, E. Delibato, D. Pasquale, E. Filetici & L. Toti. Evaluation of DNA extraction methods for use in combination with SYBR Green I real-time PCT to detect Salmonella enterica serotype Enteritidis in poultry. Applied Environmental Microbiology 69(6), 34563461 (2003). C. Jaramillo, A. Diaz. Detectives del mal de Chagas. Revista Hiptesis No. 1, 4249 (2003). A. D. Sails, A. J. Fox, D. R. Wareing & D.L. Greenway. A real-time PCR assay for the detection of Campylobacter jejuni in foods after enrichment culture. Applied Environmental Microbiology 69(3): 13831390 (2003). J. S. Way, K. L. Josephson, S. D. Pillai, M. Abbaszadegan, C. P. Gerba & L. I. Pepper. Specific Detection of Salmonella spp. by multiplex polymerase chain reaction. Applied Environmental Microbiology 59(5), 14731479 (1993). Sistema Nacional de Vigilancia en Salud Pblica. Enfermedades transmitidas por alimentos en Santa Marta durante la temporada de vacaciones. Boletn epidemiolgico Semanal. Semana Epidemiolgica No. 6. febrero 03 a 09 de 2002. Consultado en http://www.col.ops-oms.org/ sivigila/2002/BOLE06_02.htm el 8 de noviembre de 2004.

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> Resea de los autores

Mara Consuelo Vanegas Lpez. mvanegas@uniandes.edu.co Profesora asistente, Microbiologa. Directora del Laboratorio de Ecologa Microbiana y de Alimentos, LEMA, Universidad de los Andes. Johanna Rojas. Microbiloga. in-rojas@uniandes.edu.co Asistente graduada, Laboratorio de Ecologa Microbiana y de Alimentos, LEMA. Estudiante de Maestra en Ciencias Biolgicas con nfasis en Microbiologa de Alimentos en la Universidad de los Andes.

> Agradecimientos
A la Facultad de Ciencias y a Roche-Diagnstica por el apoyo financiero prestado para la realizacin de estas investigaciones.

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