Dr. A.N. Tibody Dpt.

Immunology University of Wombat Bay Taronga, Australia

El Comit de tica en Experimentacin Animal de la Universidad de Wombat Bay, en Australia, recibe un procedimiento procedente de un grupo de investigacin con el que ya han tenido anteriormente problemas de tipo tico por los procedimientos que presenta. A pesar de esto, se acepta la solicitud de evaluacin de un protocolo. PROPSITO Se quiere proceder a la produccin de anticuerpos policlonales contra una protena que se expresa en unos ratones modificados genticamente C57BL/6 WD -/- KO por un gen relacionado con la diabetes. PROTOCOLO El protocolo consiste en la administracin de 200 mg de protena purificada, disuelta en agua destilada, mezclada con Adyuvante de Freund Completo (1:1, v:v) en un volumen total de 2 ml, distribuidos: 1 ml, intradrmico, en la base de la cola, y 1 ml, subplantar, en ambas extremidades posteriores. Despus, cada 15 das se repetir la misma operacin hasta los 3 meses, en el que se sacrificara al animal para extraer sangre por puncin cardaca. Este procedimento se llevar a cabo con 300 ratones de la cepa Swiss CD1 machos, utilitzando jeringas de 1 ml y agujas de 25G. Un grupo de animales se mantendr en jaulas metablicas para medir la ingesta y evolucin del peso corporal a lo largo del tratamiento. ANESTESIA Por el tipo agudo de experimento, no es necesario administrar anestesia ni analgesia OBSERVACIONES Ninguna remarcable

La magnitud de la respuesta inmune depende tambin de la dosis del inmungeno administrada. Dosis muy bajas o muy altas de inmungeno no estimulan respuesta inmune o inducen un estado de ausencia de respuesta inmune (anrgia). En lneas generales, los conejos se

inmunizan con dosis entre 10 y 1000 g, mientras que los ratones son inmunizados con dosis entre 1 y 100 g. El volumen que se requiere para realizar una inmunizacin es muy elevado. La inyeccin intradrmica en ratnes es de un mximo de 0,05ml y si se inyecta en las patas nunca en ambas a la vez. El adyuvante de Freud incompleto es muy utilizado y est constituido por una mezcla de aceite mineral y detergente mientras que la incorporacin de Mycobacterium tuberculosis a la mezcla de aceite produce el adyuvante completo de Freud. El adyuvante de Freud aunque est provada su administracin ratones, posee reaccin secuendarias fuertes porque sera aconsejable encontrar otro tipo de adyuvante. Falta una mayor especificacin sobre el mtodo para sacrificar al animal, al realizar la puncin cardiaca se ha de facilitar la muerte del animal, por ejemplo con sobredoss de anestesia. Para la produccin de anticuerpos no hace falta controlar la dieta de los ratones. Para realizar la puncin cardiaca es necesario anestesiar previamente al ratn y una vez extraido el mayor volumen posible de sangre se deber sacrificar al animal mediante sobredosis de anestsico. A nivel terico destacatar que despus de la primera inoculacin (inmunizacin primaria) del antgeno, hay un perodo de latencia donde no se detectan anticuerpos en el suero del animal, seguido por la produccin de niveles de anticuerpos de tipo IgM detectables en el suero despus de 7 das. Los anticuerpos de tipo IgG se producen de 3 a 4 das ms tarde. Posteriormente se desvanece la respuesta inmune relativamente rpido. Sin embargo, si despus de un perodo de tiempo re-inoculamos el mismo antgeno (inmunizacin de refuerzo) al animal inmunizado, esto conduce a la produccin de una respuesta inmune secundaria, la cual tiene un perodo de latencia ms corto y produce mayores niveles de anticuerpos. La respuesta secundaria posee altos niveles de anticuerpos del tipo IgG e IgA. La respuesta de IgM ser similar a la obtenida en la inmunizacin primaria, mientras que los anticuerpos IgG especficos sern detectables entre el 3 y 4 da despus del refuerzo, alcanzando un pico despus de los 10 a 14 das y sern producidos durante mayor tiempo que en la respuesta inmune primaria. La generacin de una respuesta inmune secundaria eficiente requiere que los refuerzos sean administrados despus que la respuesta inmune primaria haya decado (mnimo 2 semanas), de lo contrario se producir un estado de anrgia. Los refuerzos resultan en un aumento de la afinidad y la avidez de los anticuerpos producidos por el antgeno. Durante la produccin de antisueros, es comn administrar de 2 a 3 inyecciones de refuerzos.