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BIOINFORMTICA
Microarrays
Soportes
1.- Filtros o membranas de nitrocelulosa o nylon 2.- Silicio 3.- Portaobjetos de vidrios cubiertos con: aminosilanos aldehdos epoxi polilisina
Urza 2006
Superficies qumicas
Fabricacin
1.- Sntesis in situ sobre un soporte slido (vidrio) a) Fotolitografa (Affymetrix) Sondas cortas Muy caro b) Tecnologa a chorro de tinta (ink-jet) Sondas ms largas Ms barato, se basa en qumica convencional
Fabricacin
2.- Deposicin mecnica de sondas presintetizadas: a) Oligonucletidos b) Productos de PCR c) EST (Expressed Sequence Tagged)
Urza 2006
Tipos de microarrays
1.- Microarrays de DNA: DNA o cDNA depositado sobre soporte slido 2.- Microarrays de oligonucletidos: Oligonucletidos directamente sintetizados in situ sobre el soporte slido Generalmente se sintetizan en el mismo punto hasta 20 oligos perteneciente al mismo cDNA.
Identificacin de una secuencia de DNA (gen/mutacin de un gen) Determinacin del nivel de expresin (abundancia) de genes
Tcnica de Microarrays
RNA de muestras control RNA de muestras estimuladas
Anlisis computacional
Software GenePix Pro 3.0
Marcacin fluorescente
(Herrera 2007)
- Cyanine 3-dUTP
Fluorforos ms utilizados
Hibridacin
Urza 2006
Cmara de hibridacin
TE
Nmero (marca)
Lavados
Urza 2006
Escaner
Urza 2006
Pureza Integridad
4) Transcripcin in vitro
Pregunta biolgica
Diseo experimental Experimento de microarrays
Anlisis de imgenes
Software GenePix Pro 3.0 (imgenes en tiff a gpr y jpg)
Image
Analyze Image
Gal file
(Gene array list file)
Control
Experiment
DNA Samples
Bloque alineado
Resumen de las etapas del anlisis de imagen Programa Gene Pix Pro
- Se abren las imgenes escaneadas (.tif) - Se descarga el archivo GAL apropiado (.gal) - Se alinea la grilla con los bloques impresos del array - El programa realiza las mediciones - Los resultados se obtienen como archivos .gpr
Normalizacin
Correccin tcnica (experimental) Ajuste de los resultados a un estndar comn que permite corregir la diferencias de las intensidades de hibridaciones entre experimentos (genes housekeeping)
Preprocesamiento
1.- Remover los replicados inconsistentes 2.- Exclusin de los genes que aparecen en menos del 70% de los arrays 3.- Inputacin (KNN-Inpute)
2.- Exclusin de los genes que aparecen en menos del 70% de los arrays
Preprocesamiento
1.- Remover los replicados inconsistentes 2.- Exclusin de los genes que aparecen en menos del 70% de los arrays 3.- Inputacin KNN-Inpute
Preprocesamiento Normalizacin
Anlisis estadstico
Datos crudos
Set de genes
Anlisis funcional
Bases de datos
mAdb
(microarray database)
http://nciarray.nic.nih.gov
Image
Analyze Image
Control
Experiment
MGD
KEGG
TIGR
DNA Samples
UniGene
dbEST*
GeneCards
External Databases
Internal Databases
Creacin de un proyecto
Subir los archivos de cada array, obtenidos mediante GenePix Pro 3.0 a la base de datos. Anlisis inicial basado en la calidad de los spots del array
(dimetro, pixeles, spots malos, razn seal/background)
Subir los archivos de cada array, obtenidos mediante GenePix Pro 3.0 a la base de datos. Anlisis inicial basado en la calidad de los spots del array
(dimetro, pixeles, spots malos, razn seal/background)
Subir los archivos de cada array, obtenidos mediante GenePix Pro 3.0 a la base de datos. Anlisis inicial basado en la calidad de los spots del array (dimetro, pixeles, spots malos, razn seal/background) Filtros adicionales % de arrays, Razn mayor o igual a 2 (simtrico) Anlisis de datos (Anotacin GO Tier 3, Tier 2 y Biocarta)
Exclude any Spots indicated as Bad or Not Found Signal >= 200 and 200 Override if Chan B Signal >= 5000 Override if Chan A Signal >= 5000
Resultado
Subir los archivos de cada array, obtenidos mediante GenePix Pro 3.0 a la base de datos. Anlisis inicial basado en la calidad de los spots del array
(dimetro, pixeles, spots malos, razn seal/background)
Filtros adicionales
Anlisis estadstico
Anlisis funcional
Clustering
GEPAS (http://gepas.bioinfo.cipf.es)
Diagrama de Venn
131 131
19 19
Grupo 1
113 113
Figura 1: Se ingresaron 2 listas de genes, una con 150 y la otra con 132 genes. En el diagrama se observa el nmero de genes que se expresan diferencialmente en cada grupo de estudio.
2) SOURCE Search
(http://smd-www.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch)
3) Chilibot (http://www.chilibot.net)
Figura 3: Se ingres una lista con 44 genes y se realiz la bsqueda utilizando la palabra clave calcio. En el esquema se observan todos los genes que de alguna manera estn relacionado con calcio, segn la base de datos del pubmed.
Pregunta biolgica
Diseo experimental Experimento de microarrays