Bio Tecnologia

CURSO DE
BIOTECNOLOGÍA
APLICADA
7ª Edición
DIRECCIÓN DEL CURSO

DR. JUAN BUEREN Y DR. JOSÉ LUIS MOTELLÓN
7º Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA

Fundación
Centro Nacional de
Investigaciones
Cardiovasculares
Carlos III
Este curso es posible gracias a una aportación educacional de
Madrid, 13-16 de febrero de 2007

Grupo
saned
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BIOTECNOLOGÍA APLICADA
Índice
ÍNDICE
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes ......................... 5

Miguel A. Piris. Programa de Patología Molecular. CNIO. Madrid
Proteómica y Medicina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Fernando Vivanco. Departamento de Inmunología. Fundación Jiménez Díaz
Inmunoterapia humoral .......................................................... 31

Dr. Manuel Hidalgo. The Johns Hopkins University
Introducción a la inmunoterapia celular .......................................... 41

José R. Regueiro. Departamento de Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad
Complutense. Madrid
Eduardo Martínez Navas. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid
Células embrionarias pluripotentes ............................................. 57

Miguel Torres. Científico titular del Departamento de Inmunología y Oncología.
Centro Nacional de Biotecnología. CSIC-Pfizer
Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre .................. 65

Felipe Prósper. Servicio de Hematología y Área de Terapia Celular. Clínica
Universitaria. Universidad de Navarra
Avances en terapia regenerativa ................................................. 89

María Dolores Herreros Marcos, Isabel Pascual Migueláñez, Jacobo Trébol López,
Damián García Olmo
Cátedra UAM-CELLERIX de Terapia Celular y Medicina Regenerativa
Unidad de Terapia Celular del Hospital Universitario La Paz. Madrid
Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas ................ 103

Laura M. Lechuga. Grupo de Biosensores. Centro Nacional de Microelectrónica
(IMM-CNM). CSIC
Vectores de transferencia en terapia génica .................................... 119 1

Jesús M. Fominaya. Centro Nacional de Investigaciones oncológicas
Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA 7ª edición
Índice
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer ...................... 137

Juan A. Bueren1 y Antonio Bernad2
1Divisiónde Hematopoyesis y Terapia Génica. CIEMAT
2Departamento de Inmunología y Oncología
Centro Nacional de Biotecnología. CSIC
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología . . . . . . . . . 157

Alfonso Domínguez-Gil Hurlé. Servicio de Farmacia. Hospital Universitario de
Salamanca
Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica

humana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
Fernando Ponz. Departamento de Biotecnología. INIA, Madrid
Innovación tecnológica y nuevas terapias: obtención de anticuerpos

monoclonales totalmente humanos: panitumumab . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 185
José Luis Motellón. Amgen S.A.
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la Agencia Europea

de Medicamentos (EMEA). BWP (Grupo de Biológicos) y CHMP
(Comité de Medicamentos de uso Humano) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 197
Sol Ruiz y Gonzalo Calvo. Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios
Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised

pharmacotherapy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 209
Arnold G. Vulto PharmD PhD and Monique J. Bijl MPharm. Department of Hospital
Pharmacy, Erasmus University Medical Centre Rotterdam. The Netherlands
2
Introducción
INTRODUCCIÓN
U
n año más nos complace presentar una nueva edición
del curso de Biotecnología Aplicada. La buena acogi-
da y el entusiasmo de ponentes y asistentes en cursos
previos nos ha servido de incentivo para trabajar en esta sexta
edición.
El rápido avance que durante los últimos años han experi-
mentado nuestros conocimientos en los múltiples campos de la
Biología y la Medicina ha puesto a nuestro alcance una infor-
mación abundante y crítica que crece de manera exponencial. Nunca anterior-
mente habíamos podido observar, desde una perspectiva tan múltiple y diversa,
el complejo escenario existente en la investigación y el desarrollo de nuevos
tratamientos. Nuevos problemas necesitan nuevas soluciones y, ahora más que
nunca, la innovación terapéutica se presenta como la clave para la consecución
de nuevos tratamientos eficaces y seguros.
La búsqueda de nuevas aproximaciones en investigación y desarrollo se ha
beneficiado de las aportaciones de nuevas y revolucionarias herramientas, entre
las que la Biotecnología brilla con luz propia. Ella nos ha permitido, por pri-
mera vez en la historia, ser capaces de producir mediante manipulación genéti-
ca los compuestos deseados y crear o modificar nuevos fármacos, siguiendo un
diseño determinado para mejorar sus propiedades terapéuticas.
Los productos biotecnológicos han pasado de ser una parte minoritaria en
el arsenal terapéutico, a ser cada vez más indispensables en el tratamiento de
millones de pacientes. Gracias a esta incorporación de la Biotecnología a la
práctica clínica habitual, enfermedades graves pueden ser hoy día tratadas con
éxito, y pacientes con una deteriorada calidad de vida pueden realizar ahora sus
tareas cotidianas.
La Biotecnología alcanza hoy múltiples campos de la investigación médi-
ca, en los que hemos asistido gracias a ella a notables avances. Así ha ocurrido
por ejemplo en el campo del diagnóstico, en el descubrimiento de nuevas dia-
nas celulares, en la potenciación de proteínas naturales y en la mejora de trata- 3
mientos previos biotecnológicos que permiten aumentar su eficacia y tolerabili-
Introducción
dad. Un buen ejemplo de ello son las nuevas tecnologías que han permitido de-
sarrollar anticuerpos totalmente humanizados, o pequeñas moléculas de síntesis
química que actúan sobre múltiples dianas terapéuticas.
La Biotecnología ha recorrido un largo camino, pero las posibilidades que
puede brindar en el futuro son enormes. La interdependencia absoluta entre to-
das las partes implicadas hace de la buena combinación de esfuerzos y siner-
gias entre todas estas partes el factor, probablemente, más importante para se-
guir avanzando. El reto está en potenciar la innovación y la defensa de la
calidad de los productos biotecnológicos. Sólo a través de la continua y estre-
cha interacción entre los diferentes sectores de la investigación, tanto públicos
como privados, con profesionales del ámbito clínico, será posible encontrar
nuevos horizontes en este campo. Para que nuestro país logre ser puntero en
este sector, todo ello deberá estar potenciado por un ambiente de apoyo a la in-
novación dentro del marco macroeconómico.
En el marco de esta colaboración, el Curso de Biotecnología Aplicada en
su 7ª edición que ahora se presenta ofrece de nuevo la oportunidad de que pro-
fesionales de diversos sectores: centros de investigación, farmacia hospitalaria,
clínicos y la industria biofarmacéutica se reúnan en una plataforma de forma-
ción sobre los aspectos más relevantes ligados con la investigación biotecnoló-
gica, especialmente desde el punto de vista más básico y técnico en busca de
nuevas perspectivas y aplicaciones prácticas de la investigación biotecnológica,
y explorar las nuevas líneas de trabajo que han de arrojar, en breve plazo, nue-
vas opciones terapéuticas de relevancia científica y clínica.
Agradecemos su interés por esta nueva edición del curso y esperamos que
encuentren esta iniciativa útil y provechosa.
José Luis Motellón

Juan Bueren Roncero
4
Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes
TÉCNICAS DE ANÁLISIS MASIVO

DE LA EXPRESIÓN DE GENES
Miguel A. Piris. Programa de Patología Molecular. CNIO. Madrid
Los conocimientos sobre el genoma humano hacen posible

la utilización de tecnologías en Genómica y Proteómica,
capaces de analizar la diversidad y complejidad de cada
tipo de cáncer, enfocadas hacia el diagnóstico molecular
de tumores, adecuando la terapia a cada paciente y
contribuyendo a la identificación de genes relevantes en
cáncer esporádico y familiar1.
De interés particular es la aplicación de los sistemas de
análisis molecular masivo a la predicción de respuesta a
tratamientos individuales. Numerosos estudios han
demostrado la capacidad de generar estos modelos
predictivos aplicados a supervivencia, metástasis, respuesta
a tratamientos concretos2-5. Todos ellos, en mayor o menor
grado, adolecen del mismo defecto, la insuficiente
reproducibilidad de los resultados generados, cuando son
aplicados en un contexto distinto; es decir, en otros centros,
por otros especialistas, o usando una tecnología diferente4,6.
SISTEMAS DE ANÁLISIS MOLECULAR MASIVO
Matrices tisulares (tissue arrays)
Permiten utilizar en bloques parafinados sistemas de análisis masivo. Para

ello crean un nuevo bloque de parafina en el que se insertan en posiciones pre-
definidas hasta 800 cilindros de 600 a 1000µ, procedentes de biopsias de aguja
efectuadas sobre bloques de parafina preexistentes.
Es un sistema adaptado para investigar un marcador o un panel de marca- 5
dores relacionados en una serie amplia de muestras, útil en IHQ, FISH, HIS,
complementario a microarrays de cDNA. Indicaciones típicas de esta técnica

son control de calidad, análisis de nuevos anticuerpos, estudio molecular de
cánceres de pequeño tamaño, establecimiento de modelos predictivos basados
en expresión de proteínas.
La posibilidad de digitalizar el resultado de las inmunotinciones, así como
de cuantificar la expresión de una marcador preciso, abre el camino de un uso
más ambicioso de las matrices tisulares (MTA)7,8.
SNPs
Variaciones naturales de la secuencia entre dos copias del genoma debi-

das a sustituciones de una base. Hay actualmente descritos por encima de tres
millones en todo el genoma -SNP Consortium (TSC) & Human Genome Pro-
ject (HGP)-, con una densidad mínima de 1 SNP/1.9 kb. De ellos, hay 60.000
SNPs en exones, lo que refleja una mayor densidad de los mismos en regio-
nes exónicas, más investigadas, hasta una densidad de 1 SNIP/1.08 kb. El
numero de polimorfismos existente está en el rango de 10 a 15 millones por
individuo9,10.
El análisis de SNPs permite realizar estudios de genética de poblaciones,
estudio de genes candidatos para asociación con enfermedades precisas, análi-
sis de resistencia a fármacos, sensibilidad/toxicidad a drogas, así como infor-
mar de la predisposición individual a contraer enfermedades complejas, multi-
génicas 9,10 . Así, la mejora en las posibilidades de detección masiva de
polimorfismos abre el camino a estudios que relacionen variabilidad genética
con riesgo a formas precisas de cáncer y sensibilidad individual a drogas.
CGH-Arrays
Hay diferentes opciones para arrays de CGH, esencialmente BACs u

oligonucleótidos. BACs son cromosomas artificiales humanos conteniendo
secuencias de DNA de longitud variable entre 100 a 200 kb. Hay actualmen-
te clones disponibles para todo el genoma, que cubren el genoma con una
alta densidad. Su uso permite el diagnóstico preciso de deleciones, duplica-
ciones, inserciones y reordenamientos. La disponibilidad de miles de BACs
6 ha permitido el desarrollo de chips de BACs (CGH-arrays), que permiten
detectar duplicaciones y deleciones con una sensibilidad de 100 Kb 11. Para
ello se realiza hibridación comparativa entre DNA de un paciente/DNA suje-

to sano, o DNA tumoral/DNA constitucional. Un ejemplo de ello es la re-
ciente publicación de un array de BACs especifico para la LLC-B, desarro-
llado por P Lichter12.
Existen también microarrays comerciales de CGH basados en oligonucleó-
tidos, con resolución más fina que los basados en BACs y un alto potencial en
investigación y diagnóstico13.
Matrices de cDNA (Oncochip) u oligonucleótidos
Un microarray de DNA es un sistema miniaturizado en el que fragmentos

de DNA se inmovilizan en soportes sólidos. Desde un punto de vista de longi-
tud de la sonda usada, hay 2 tipos de microarrays de DNA: microarrays de cD-
NA que presenta sondas de cientos de bases y arrays de oligonucleótidos con
sondas de 20-25 bases o 50-80.
Estos chip o microarrays consisten en un soporte sólido, por ejemplo un
portaobjetos, sobre el que un robot ha impreso de manera ordenada miles de
cDNAs específicos (u oligonucleótidos) representantes de otros tantos genes.
Por analogía con el término chip micro-electrónico (dispositivo con una alta
densidad de circuitos electrónicos), en biología molecular también se ha utili-
zado el término de biochip de expresión para denominar a los arrays de DNA,
ya que son dispositivos de pequeño tamaño (chip) en los que se alcanza una
gran densidad de material biológico (bio) inmovilizado sobre una superficie
sólida. Un chip puede ser hibridado simultáneamente con dos sondas de
cDNA marcadas diferencialmente (por ejemplo con los fluorocromos Cy3 y
Cy5) generadas a partir del RNA mensajero de las muestras a comparar (por
ejemplo, tejido normal versus tejido tumoral), o bien ser marcado con un úni-
co fluorocromo.
Después de la hibridación, y utilizando un scanner, puede medirse para ca-
da spot de cDNA la intensidad de cada uno de los fluoróforos, siendo el nivel
de señal detectado proporcional al número de copias de mRNA en la muestra;
de modo que el cociente de la intensidad de fluorescencia (Cy3/Cy5) constitu-
ye una medida de la expresión génica diferencial relativa al cDNA representa-
do en el chip ("ratios" de expresión).
El alto grado de integración del array permite, en un solo ensayo, obte-
7
ner multitud de valores de expresión génica relativa para distintas condicio-
nes biológicas, lo que convierte a esta técnica en una herramienta de alto

rendimiento para trabajos en el área de la genómica funcional. El gran volu-
men de datos generados debe ser tratado con herramientas y métodos bioin-
formáticos14,15.
ANÁLISIS DE RESULTADOS DE MICROARRAYS
Los datos generados en estos experimentos precisan de análisis bioinfor-

mático, que esencialmente pretenden:
• Agrupar muestras o genes expresados de forma sincronizada.
• Identificar genes cuya expresión se asocia a eventos específicos.
• Asignar función biológica a los genes resultado del experimento.
• Identificar cambios tiempo-dependientes, ordenados a lo largo del tiempo.
• Simplificar series de genes al mínimo numero de datos posible.
• Asignar riesgos específicos derivados de la expresión de genes concretos.
Diversas herramientas informáticas están disponibles para este objetivo,
entre otras las desarrolladas en el CNIO (GEPAS) y alojadas en la pagina web:
http://gepas.bioinfo.cnio.es/index.html
LIMITACIONES DE LOS MICROARRAYS DE DNA
Como otras técnicas usadas en investigación, los microarrays tienen limi-

taciones, como:
1. Secuencias no verificadas. Hay un proceso constante de reasignación y
edición de las secuencias inicialmente descritas. No obstante, las últimas ver-
siones de los sistemas más comercializados contienen muy escasos errores de
asignación.
2. Dificultad de trasladar datos cuantitativos a estados funcionales. Nive-
les altos de expresión de ARN o proteína no necesariamente implican activa-
cion funcional del gen preciso, y de hecho ocasionalmente implican secuestro o
anulación funcional. En este sentido, conclusiones elaboradas a partir de datos
generados por estudios de microarrays deben de ser entendidos como hipótesis
necesitadas de verificación experimental.
8 3. Ruido biológico. Sistemas celulares críticos están caracterizados por
una alta redundancia. En parte, la variabilidad Inter.-experimental es depen-
diente de fenómenos azarosos, u oscilaciones cíclicas, no relacionadas con el

objeto del experimento.
4. Falta de estandarización de técnicas de análisis. La mayoría de las
plataformas usadas para análisis genómico han alcanzado un alto gado de ro-
bustez, pero aún adolecen de una reproducibilidad subóptima, cuando los resul-
tados obtenidos con diversas plataformas son comparados entre sí. El impres-
cindible gold standard en validación de datos sigue exigiendo comprobar el
valor de los datos obtenidos en una nueva población de casos.
PCR CUANTITATIVA
Aunque sobre un número menor de genes, existen actualmente plataformas

comerciales que permiten investigar un numero limitado de genes en sistemas
de PCR a tiempo real, dotados de una alta sensibilidad y reproducibilidad. Adi-
cionalmente, datos cada vez mas numerosos muestran que esta técnica es apli-
cable, en determinadas condiciones, a RNA extraído de material parafinado.
El carácter multigénico de alguno de estos análisis (realizados sobre plata-
formas o tarjetas de hasta 384 pocillos) ha llevado a su denominación como
chips de baja densidad.
La alta reproducibilidad de estos experimentos facilita la expansión de esta
tecnología y su uso en la aplicación clínica de datos surgidos de análisis reali-
zados con microarrays de alta densidad. Así, existen en la actualidad diversos
ensayos clínicos enfocados a la predicción de respuesta a terapia basada en da-
tos de expresión obtenidos con PCR en tiempo real, por ejemplo en carcinoma
de mama.
DETECCIÓN DE PROTEÍNAS COMO MARCADORES SÉRICOS
Múltiples grupos de investigación coinciden en el objetivo de identificar

marcadores séricos informativos de riesgo de contraer enfermedades específi-
cas, o adecuados para el seguimiento de enfermedad residual mínima16. La idea
no necesita apenas justificación, el análisis de suero es una técnica mínima-
mente invasiva, que permite monitorizar con frecuencia cambios previos al
diagnóstico clínico o a lo largo de la enfermedad. Resultados iniciales obteni-
9
dos en cáncer de ovario, páncreas o próstata alentaron esta línea de trabajo,
usando SELDI-TOF-MS. Sin embargo, estos estudios han demostrado una baja
reproducibilidad y una elevada tasa de falsos positivos, lo que prejuzga su uso
como técnica de análisis rutinario en análisis de poblaciones a riesgo de contra-
er enfermedades específicas17,18.
DETECCIÓN DE FOSFOPROTEÍNAS EN CÉLULAS INDIVIDUALES
Recientes datos experimentales coinciden en que tanto el mecanismo de

acción de drogas, como la sensibilidad a las mismas, es desvelado con mayor
precisión recurriendo a análisis de proteínas inducidas por la acción de estas
drogas, bien en modelos o pacientes. Así, agentes que dañan el DNA inducen
fosforilación de sensores de daño a DNA, mientras que agentes cuya diana está
constituida por rutas de traducción de señal inducen cambios en el estado de
fosforilación de proteínas críticas en estas rutas. La disponibilidad de anticuer-
pos contra diferentes estados funcionales de estas proteínas permite usar la ci-
tometría de flujo como técnica de análisis de estos cambios, con la ventaja de
que esto nos permite reconocer la existencia de cambios sutiles en subpobla-
ciones celulares minoritarias19-21.
APLICACIONES EN FARMACOGENÓMICA
Las matrices de cDNA permiten también establecer el llamado perfil genó-

mico de un fármaco, o firma molecular del mismo, además de establecer fir-
mas moleculares predictivas de sensibilidad/resistencia. Aunque desde un punto
de vista clínico tiene mayor interés identificar marcadores iniciales, al diagnós-
tico, de sensibilidad a drogas precisas, alcanzar este objetivo tropieza con los
mecanismos de acción múltiples de la mayoría de las drogas en uso, así como
con la existencia de múltiples sistemas redundantes de promoción de la super-
vivencia de las células neoplásicas. En la práctica, se ha demostrado que los
cambios inducidos por drogas son más informativos que alteraciones molecula-
res al diagnóstico3. Estos cambios pueden ser analizados in vitro -células tumo-
rales expuestas a la acción de drogas precisas- o in vivo - cambios en el tiempo
en células leucémicas tras tratamiento-.
10 De hecho, el tratamiento con un fármaco concreto de una línea celular es-
pecífica permite identificar el conjunto de genes inducidos en respuesta a ese
fármaco. Estos genes muestran variabilidad en función de la droga, estirpe ce-

lular, alteraciones génicas precisas e intervalo de tiempo transcurrido hasta el
análisis. Su conocimiento permite proponer mecanismos de acción de una dro-
ga precisa.
Uno de los objetivos en análisis farmacogenómico es la identificación de
pacientes sensibles o resistentes a drogas concretas. La resistencia a una droga
depende de múltiples factores, incluyendo sobreexpresión de genes de resisten-
cia a drogas, incremento en la reparación de DNA, o alteraciones en la sensibi-
lidad celular a quimioterapia, afectando a múltiples rutas. Marcadores de resis-
tencia o sensibilidad identificados en modelos experimentales en el laboratorio
o en pacientes aislados pueden perder interés cuando se estudian sobre series
largas de pacientes. Consecuentemente, es preciso analizar la relevancia clínica
de los genes así identificados en series de pacientes tratados de forma randomi-
zada.
Una aplicación extremadamente relevante de estos estudios es la identifi-
cación de dianas terapéuticas y el análisis de rutas. Esencialmente, la informa-
ción derivada de estos estudios brinda la oportunidad de proponer nuevas dia-
nas que, después de validación experimental, permitan el desarrollo de drogas
racionalmente dirigidas.
FUTURO EN LA APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE GENÓMICA

Y PROTEÓMICA
El alto potencial aplicado a investigación y diagnóstico de estas técni-

cas aún precisa de numerosos estudios adicionales, previamente a su aplica-
ción clínica masiva. Este carácter novedoso y el alto nivel de complejidad
de estos experimentos queda subrayado por el hecho de que aún se publican
muchas más revisiones o comentarios editoriales sobre técnicas de genómica
y proteómica que resultados originales. No obstante, cabe esperar que la
aplicación clínica de estas técnicas siga en incremento, cubriendo primero
una etapa de identificación de marcadores diagnósticos y, posteriormente,
propuesta y validación de dianas terapéuticas. El desarrollo de estas técnicas
de análisis molecular masivo, al mismo tiempo, está ofreciendo un reto para
el desarrollo de sistemas de análisis estadístico de múltiples variables y vali-
11
dación de datos.
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13
Proteómica y Medicina
PROTEÓMICA Y MEDICINA
Fernando Vivanco. Departamento de Inmunología. Fundación Jiménez Díaz
La medicina molecular se está desplazando muy rápidamente

de la genómica a la proteómica ya que, al permitir el estudio
de tejidos, células y líquidos biológicos, las alteraciones en las
proteínas constituyen auténticas firmas moleculares de los
procesos patológicos. Aunque todavía está en desarrollo en
muchas áreas, la proteómica ya está madura para empezar a
ser trasladada a la clínica. La proteómica clínica favorece la
detección precoz de la enfermedad, su monitorización, el uso
de terapias más efectivas y un entendimiento más profundo y
global de la patogénesis. La utilización de perfiles proteicos
diagnósticos y pronósticos, de suero y de tejidos, constituye
una auténtica revolución que puede cambiar el panorama de la
analítica clínica, acercándose a la medicina personalizada.
Además, es un atajo para la detección de biomarcadores (hay
mas de 500 nuevas proteínas con interés clínico identificadas
por proteómica, frente a las 150 proteínas actualmente
utilizadas como marcadores clínicos) y dianas diagnósticas y
terapéuticas, en un mercado claramente en expansión. Los
perfiles proteicos de muestras tratadas con fármacos
permiten, además, identificar posibles efectos secundarios
desconocidos, ya que permite detectar todas las proteínas
que el fármaco altera. La proteómica clínica es ya una realidad
de la Medicina del siglo XXI. En España es un área sin
desarrollar, que debería ir implantándose en todos los grandes
hospitales y centros de investigación biomédica.
INTRODUCCIÓN
Una de las consecuencias más beneficiosas derivadas del conocimiento del

15
Genoma Humano ha sido el gran impulso que se ha producido en el desarrollo
de la Proteómica. La descripción del genoma de los organismos (Genómica)

aporta un conocimiento esencial para el estudio de cualquier proceso biológico.
Sin embargo, tal conocimiento es tan necesario como insuficiente, porque las
funciones celulares dependen en última instancia de los productos finales de los
genes: las proteínas y sus interacciones, asociaciones macromoleculares, vías de
señalización, etc. De esta forma, la era post-genómica de la medicina molecular
se está desplazando rápidamente de los listados de genes, la transcriptómica y la
genómica funcional, a la proteómica. Ésta ha dejado de ser (como en sus ini-
cios) la producción de listas de proteínas que incrementan o decrecen su expre-
sión como causa o consecuencia de diversas condiciones o alguna patología.
Actualmente, la proteómica implica el conocimiento global de las proteínas, su
estructura y funciones, interacciones y modificaciones postraduccionales, rutas
de señalización, localización intra e intercelular, etc., para generar el mapa celu-
lar que permita entender los procesos biológicos en condiciones normales y pa-
tológicas (lo que ha venido a denominarse la biología de sistemas). En suma, la
proteómica es una actividad científica lo suficientemente madura, co-
mo para ser aplicada a la clínica humana con notables beneficios.
Figura 1. Esquema de las
relaciones entre genoma y El proteoma comprende el conjunto de todas las proteínas que
proteoma. Mientras que el resultan de la expresión del genoma de las células, tejidos u organis-
genoma es comun a todas mos. No es algo estático como el genoma (relativamente) sino una
las células y colección dinámica de proteínas que refleja tanto el programa gené-
relativamente estático, el
tico propio de la célula como el efecto de su entorno (Figura 1).
proteoma está cambiando
Comparado con el genoma, el proteoma proporciona una visión más
constantemente en
respuesta a las
realista del status biológico y se espera, por tanto, que tenga una
condiciones de cada mayor utilidad que el análisis genómico, para evaluar y conocer la
momento. enfermedad, su progresión y la respuesta al tratamiento farmacológi-
co. Así, la proteómica es el puente entre la
mera descripción de la secuencia de los ge-
nes y el comportamiento celular.
Cada gen puede producir varias formas
moleculares de una(s) proteína(s) que poste-
riormente son modificadas post-traduccio-
nalmente. Se han descrito más de 200 tipos
de tales modificaciones químicas (glicosila-
16 ción, prenilación, fosforilación, acetilación,
etc.), pudiéndose dar varias en una misma
proteína de manera permanente o transitoria. Tales modificaciones afectan a su

estructura y propiedades funcionales, vida media, localización intra y extrace-
lular, interacciones proteína-proteína, etc. El proteoma viene definido, por tan-
to, en términos de secuencia, estructura, abundancia, localización, modifica-
ción, interacción y función de las proteínas y constituye el fenotipo
característico de cada célula o tejido. Esta información no puede obtenerse del
genoma ni del transcriptoma (conjunto de ARN mensajeros transcritos), por lo
que el estudio de los proteomas es imprescindible y complementario de los da-
tos genómicos. Entre las muestras biológicas más importantes cuyo conoci-
miento del proteoma es esencial se encuentran los líquidos fisiológicos (suero),
ya que no tienen ácidos nucleicos. Por otra parte, las proteínas son la diana de
más del 90% de los fármacos, por lo que su estudio cobra mayor relevancia.
La proteómica se define habitualmente como el análisis del conjunto de
las proteínas que componen las células y se lleva a cabo mediante tres tipos
fundamentales de estudios:
A) Identificación y catalogación de las proteínas (y sus modificaciones
post-traduccionales) que constituyen los distintos proteomas, cuya in-
formación, almacenada en bases de datos, es un elemento esencial para
el resto de estudios proteómicos.
B) Proteómica de expresión diferencial, cuya finalidad es el estudio com-
parativo de una célula (o muestra biológica) en dos condiciones distin-
tas (un control sano frente al patológico, o tratado y sin tratar con un
fármaco, etc.) para detectar las proteínas que sufren modificaciones
químicas o alteraciones en sus niveles de expresión. Permite identificar
proteínas que puedan representar biomarcadores pronósticos, diagnósti-
cos y de seguimiento de una enfermedad y que, con frecuencia, pueden
ser nuevas dianas terapéuticas.
C) Proteómica del mapa celular, cuyo objetivo es el estudio de las interac-
ciones proteína-proteína, asociaciones macromoleculares, rutas de se-
ñalización, etc. Pretende construir un mapa físico de las interacciones
existentes entre las proteínas celulares, haciendo uso de técnicas es-
tructurales (rayos X, resonancia magnética nuclear) y cinéticas y de
herramientas bioinformáticas.
Una de las áreas con mayor actividad actualmente en proteómica es la
identificación de nuevos biomarcadores para el diagnóstico y la prevención de
17
las enfermedades prevalentes, cáncer, cardiovasculares, neurológicas, etc. Los
avances en las estrategias diagnosticas convencionales (técnicas de imagen,

RMN, PET), están suponiendo una notable mejora, pero no poseen ni la sensi-
bilidad ni la especificidad requerida para detectar estados preclínicos, y además
su coste es muy elevado. Es bien conocido que mas del 50% de los infartos
agudos de miocardio ocurren sin síntomas previos y que más del 60% de los
pacientes con cáncer de mama, pulmón, colon y ovario, presentan ya metásta-
sis cuando son diagnosticados, y en ese estadio, las terapéuticas convencionales
tienen un éxito muy limitado. Hay, por tanto, una necesidad urgente de identifi-
car nuevos biomarcadores que eviten estas situaciones. Un marcador biológico
(biomarcador) es una molécula o característica, que puede ser medi-
do objetivamente y evaluado como un indicador de un proceso bio-
Figura 2. Esquema del lógico normal o patológico, o de la respuesta farmacológica a una
funcionamiento de la intervención terapéutica. La búsqueda de biomarcadores puede lle-
microdisección mediada varse a cabo en tejidos, en células (circulantes) o en líquidos fisioló-
por láser. Parte izquierda: gicos (fundamentalmente plasma o suero). En el caso de los tejidos
observación al microscopio
(biopsias por ejemplo) uno de los mayores obstáculos es la heteroge-
del corte de tejido y
neidad celular, que puede complicar mucho el diseño y sobre todo
selección de la zona de
interés. Centro: disparo del los resultados de los análisis proteómicos, al no tratarse de poblacio-
láser sobre la zona nes celulares homogéneas. Sin embargo, recientemente se ha desa-
seleccionada que catapulta rrollado una técnica muy útil para la obtención y purificación de es-
a las células al tubo de tirpes celulares puras a partir de cortes de tejidos, denominada
recogida. Parte derecha:
microdisección, mediante captura con láser que se ilustra en la Figu-
ampliación de la figura del
ra 2. Las preparaciones celulares homogéneas así obtenidas son muy
centro donde se observa el
grupo de células que son
apropiadas para el análisis proteómico. Sin embargo, el tipo de
selectivamente extraídas muestra idóneo para los estudios clínicos es el plasma o el suero, del
del tejido. que puede obtenerse un perfil o patrón del conjunto de las proteínas
(y/o péptidos) presentes en cada momento y
que puede contener biomarcadores que refle-
jen el estado patológico y que posean valor
diagnóstico y/o pronóstico. Sin embargo, el
estudio de los proteomas o de los perfiles
proteicos de los líquidos biológicos (ver más
adelante), presenta un grado de complejidad
considerable que no existe en los estudios
18 genómicos, debido fundamentalmente a las
siguientes causas:
a) El amplísimo rango dinámico de la concentración de proteínas en teji-

dos y especialmente en el plasma humano. Entre la concentración de
albúmina (milimolar; 50 mg/ml) y algunas interleuquinas (picomolar;
1-5 pg/ml) hay una diferencia de más de 10 logs. Ninguna técnica ana-
lítica ni proteómica abarca mas de 4-5 órdenes de magnitud. Además,
20 proteínas representan el 99% del contenido total de las proteínas
plasmáticas, lo que dificulta enormemente el análisis de las proteínas
presentes a baja concentración, donde con frecuencia se en-
cuentran los potenciales biomarcadores. Para el análisis de
Figura 3. Depleción de las
plasma es necesario deplecionar de estas proteínas mayorita-
seis proteínas mayoritarias
rias (Figura 3). del plasma utilizando un
b) La presencia de diferentes formas moleculares de cada pro- cromatógrafo líquido
teína e isoformas. Muchos genes producen múltiples mR- (FPLC) y una columna de
NAs, mediante diversos mecanismos (splicing alternativo, afinidad que posee
mRNA editing, modificaciones co- y post traduccionales). anticuerpos específicos

frente a las 6 proteínas. Al
En promedio, en humanos, se estima que un gen genera al
aplicar el plasma sobre la
menos 3-4 proteínas, por lo que considerando 30.000 genes,
columna la mayoría de las
pueden esperarse un mínimo de 100-200.000 proteínas. Ob- proteínas fluyen sin ser
viamente no todas las proteínas estarán presentes en todas retenidas ("low abundant
las células, tejidos, etc., pero el plasma contiene una gran re- proteins") y
presentación de muchas de ellas. posteriormente las
proteínas mayoritarias son
c) Diversidad estructural. Dada su presencia en distintos entor-
eluidas ("high abundant
nos (solubles, membranas, matriz, etc.) las proteínas son de
proteins"). En la parte
naturaleza muy diversa. Solo en tamaño pueden variar desde inferior se muestra el
50 aminoácidos (hay 2.500 anotados en el Swiss-Prot) hasta análisis mediante 2-DE de
casi 10.000 aminoácidos, como la Nesprina 1 (8746 aa). ambas fracciones.
Además, hay que considerar la pre-
sencia de múltiples modificaciones
postraduccionales que afectan a la
función, localización, etc., de las
proteínas.
d) Una gran mayoría de las proteínas
no actúan solas sino en asociación
con otras, creando por un lado, aso-
ciaciones macromoleculares, y por 19
otro, participando en multitud de ru-
tas de señalización, metabólicas, etc. El conocimiento de las interaccio-

nes proteicas y la descripción del mapa celular es esencial para enten-
der la fisiopatología de cualquier sistema biológico.
Sin embargo, el conocimiento de los proteomas ofrece la visión óptima de
lo que ocurre en la célula, tejido, líquido fisiológico, etc., por lo que es necesa-
rio su determinación.
PROTEÓMICA CLÍNICA
A pesar de la complejidad antes citada, el rápido y notable desarrollo de

la Proteómica en los últimos años, ha conducido a su aplicación a los proce-
sos patológicos o Proteómica Clínica. La proteómica está especialmente "ca-
pacitada" para el estudio de la enfermedad porque se puede aplicar a las célu-
las, tejidos y líquidos biológicos. La aplicación clínica de la proteómica
implica el uso de las tecnologías proteómicas para todos aquellos aspectos que
puedan beneficiar a los pacientes: desde la búsqueda de nuevos marcadores de
enfermedad o de perfiles proteicos diagnósticos, hasta la descripción de facto-
res predictivos y preventivos que permitan un tratamiento y seguimiento tera-
péutico personalizado.
La Proteómica Clínica se ocupa de la identificación sistemática y exhausti-
va, a gran escala, de patrones proteicos de enfermedad y la aplicación de esos
datos a los pacientes (estudio de la enfermedad, susceptibilidad, prevención,
selección de terapias, seguimiento de los tratamientos, etc.). Dada la compleji-
dad de los procesos patológicos, la integración de las nuevas tecnologías prote-
ómicas con las bases de datos clínicas y las técnicas analíticas clásicas, sería
altamente beneficioso para la comprensión y el tratamiento de la enfermedad.
Entender, por ejemplo, las alteraciones tempranas en diversas enfermedades (tí-
picamente en cáncer o en los síndromes coronarios agudos), produce una nota-
ble mejora en la prevención e identificación de pacientes con riesgo y/o en es-
tado preclínico. La Proteómica Clínica pretende definir patrones de proteínas
que puedan generar información de valor clínico acerca de la susceptibilidad,
diagnóstico, pronóstico y terapia de la enfermedad. Testar hipótesis clínicas re-
levantes, frente a conjuntos de datos (masivos) derivados de medidas proceden-
20 tes de técnicas de alto rendimiento como las proteómicas, y poblaciones huma-
nas fenotipadas correctamente, es una función esencial de la proteómica
clínica. Para que la proteómica clínica impacte de manera real en la mejora de

la salud debe descubrir y seleccionar patrones proteicos, validarlos en estudios
poblacionales muy amplios y trasladarlos a la práctica clínica.
Aunque no se describe aquí, no debe olvidarse que el aprovechamiento
óptimo de la relación entre patrones proteicos y enfermedad, depende a su vez
de la integración con la información sobre la variación genética y la expresión
génica (arrays de DNA, genotipado, SNPs, etc.).
OBJETIVOS DE LA PROTEÓMICA CLÍNICA
La finalidad de la Proteómica Clínica está, actualmente, centrada en al

menos los siguientes tipos de actividades:
Identificación de biomarcadores
La búsqueda e identificación de biomarcadores individuales se lleva a

cabo siguiendo la metodología proteómica clásica de separación de proteínas
(2-DE, DIGE, cromatografía multidimensional y electroforesis ca-
pilar) y su identificación por espectrometría de masas (MS; MAL- Figura 4. Esquema del
análisis proteómico
DI-TOF, ESI-Q-TOF o ESI-Trap, MALDI-TOF/TOF). Su estrate-
diferencial. La
gia fundamental es el análisis de la expresión diferencial de
comparación de los geles
proteínas entre controles y muestras patológicas (Figura 4), de 2-D permite identificar las
proteomas completos (lisados celulares) o subproteomas específi- proteínas
cos (mitocondrias, membranas, etc.). Recientemente se está utili- diferencialmente
zando la cromatografía líquida (en una o varias dimensiones) apli- expresadas.
cando diversos métodos de proteómica

cuantitativa que permiten la comparación
de los perfiles proteicos de varias muestras
simultáneamente (iTRAQ, SILAC, etc.).
Un aspecto fundamental es la determina-
ción de las modificaciones postraducciona-
les y su potencial implicación en patología.
En muchos casos los biomarcadores se
convierten simultáneamente en nuevas dia- 21
nas terapéuticas.
Obtención de perfiles proteicos
Consiste en el estudio sistemático, a gran escala, de las proteínas de una

muestra para la identificación de patrones o perfiles proteicos (huellas dactilares
proteicas), con carácter diagnóstico (discriminatorio) y/o pronóstico. Los escasos
biomarcadores identificados, y aprobados (por la FDA) en los últimos años, son
un reflejo de la estrategia habitual de testar una proteína individual, o llevar a ca-
bo análisis en pequeña escala, etc. Aunque existen excepciones (paraproteínas de
los mielomas, déficit de α1-antitripsina) es muy posible que no existan marcado-
res únicos de las enfermedades complejas, por lo que la estrategia proteómica de
estudiar paneles proteicos supone un paso cualitativo de gran trascendencia. Este
estudio se puede llevar a cabo mediante al menos tres estrategias:
Figura 5. Diferentes formas

A) Perfiles proteicos de plasma o suero
de representar el
resultado del análisis Se lleva a cabo analizando el suero/plasma de los pacientes con
mediante SELDI-TOF de una la patología objeto de estudio (cardiovascular, neurodegenerativa, in-
muestra de suero. En el fecciosas, cáncer, etc.) y alternativamente en otros líquidos fisiológi-
panel superior se muestra
cos (lavado broncoalveolar, líquido cefalorraquído, orina). Se utiliza
el resultado experimental
la técnica denominada SELDI-TOF (Surface Enhanced Laser De-
y en los dos inferiores tras
su procesamiento
sorption/Ionization-Time of Flight) para la generación de los perfiles
informático. Sólo se proteicos, que combina la retención de las proteínas del suero en
muestra la sección biochips con la determinación de sus masas moleculares mediante
correspondiente a las MS, permitiendo generar gráficos donde se representa la abundancia
masas (m/z) comprendidas frente a la masa molecular de las proteínas, a modo de código de ba-
entre 3000 y 7000 m/z.
rras proteicos constituidos por miles de líne-
as que caracterizan el suero de cada indivi-
duo (Figura 5). La comparación de los
perfiles normales (individuos sanos) con los
obtenidos del suero de pacientes con distin-
tas patologías (se está utilizando en cáncer y
en patologías cardiovasculares, neurodege-
nerativas, osteoarticulares, respiratorias, in-
fecciosas...) permite obtener perfiles pronós-
22 ticos, diagnósticos, de seguimiento, de
tratamiento farmacológico, etc. Su poder
discriminatorio es muy superior al de marcadores únicos con los que se han

comparado (por ejemplo, PSA en cáncer de próstata, proteína C reactiva en in-
fección e inflamación). Como el análisis mediante SELDI-TOF utiliza muy po-
ca muestra (1 µl) y, además, es muy rápido (se pueden analizar cientos de
muestras al día) y automatizado, su potencial en clínica analítica es enorme y
puede ir sustituyendo muchas de las técnicas habituales de los laboratorios de
bioquímica clínica (enzimo-inmunoanálisis), que son más lentos, más caros
(utilizan anticuerpos fluorescentes), usan mayor cantidad de muestra y sólo in-
forman de un único marcador, frente a los miles que proporciona el SELDI-
TOF. A pesar de sus indudables ventajas, el sistema SELDI-TOF decrece su
sensibilidad y exactitud en la determinación de la masa para proteínas mayores
de 70 kDa, lo que es el caso de muchas de las proteínas plasmáticas humanas
(se conocen más de 3.000 actualmente). Por otra parte, su reproducibilidad no
es bien conocida, dado el todavía reducido número de investigadores que utili-
zan esta plataforma; además, en muestras tan complejas como el plasma huma-
no, el sistema de fraccionamiento inicial en los chips de retención necesita es-
tandarizarse mejor, por lo que se están definiendo actualmente unos estándares
cuantitativos de referencia. Sin embargo, el número de potenciales biomarcado-
res de enfermedad, identificados mediante SELDI-TOF, no deja de aumentar de
manera constante. Algunas de las críticas al sistema SELDI-TOF tienen un ori-
gen más económico que científico, dado el enorme mercado por el que compi-
te, el de la bioquímica clínica.
B) Perfiles proteicos de tejidos: MS-Imaging
En tejidos, pueden obtenerse perfiles o imágenes (mapas) bidimensionales

de proteínas (MS-Imaging), aplicando directamente la MS sobre cortes histoló-
gicos del tejido (cortes habituales sobre portaobjetos para microscopia óptica,
de 5-20 m de grosor), utilizando el MALDI-TOF o el MALDI-TOF/TOF. El
mapa bidimensional se obtiene haciendo incidir el láser (que "barre" la superfi-
cie de la muestra) del espectrómetro sobre los cortes histológicos recubiertos
de matriz (compuestos orgánicos que cristalizan atrapando las proteínas en el
cristal y absorben la energía del láser, siendo el conjunto sublimado) y anali-
zando las proteínas que son vaporizadas. Típicamente se obtienen 500-1.000
señales de proteínas individuales en cada punto del tejido, con masas entre 2-
23
70 kDa. De esta forma se obtiene la masa (m/z) de las moléculas (péptidos,
proteínas) presentes en cada zona del tejido.

Seleccionando una masa dada (m/z) en los
distintos espectros de las diferentes zonas, se
genera un mapa bidimensional de la distri-
bución de esa proteína (esa m/z) a lo largo
del corte de tejido (a modo de cartografía
proteica). Se pueden obtener dos tipos de
datos: Perfiles proteicos (mediante una apli-
cación puntual de matriz y adquisición de
datos de cada punto) e Imágenes (recubrien-
do todo el tejido y haciendo un barrido del
Figura 6. Representación
mismo con el láser) (Figura 6).
esquemática de los
fundamentos del MS- Las imágenes son generadas mediante un software específico
Imaging. Sobre el corte de que clasifica y agrupa las proteínas y compara diversas muestras,
tejido recubierto de permitiendo obtener imágenes tridimensionales de la distribución de
matriz, se hace incidir un las proteínas del tejido. Este software también puede integrarse con
láser que va recorriendo la
software de análisis histológico, permitiendo la cuantificación de su-
superficie del tejido y logra
perficies e intensidades, así como la superposición con imágenes de
vaporizar las proteínas
presentes en cada punto de
microscopia (histoquímica e inmunohistoquímica). Esta tecnología
la superficie, obteniéndose implica un tipo de información totalmente nuevo para la descripción,
un espectro de masas de clasificación y caracterización de muestras histológicas, que está
cada punto. Seleccionando permitiendo la identificación de biomarcadores, la localización de
una masa (m/z) dada (que proteínas específicas y en el campo de la oncología, por ejemplo, la
corresponderá a una
reclasificación de tumores. La técnica es compatible con los méto-
proteína particular) a lo
dos de tinción clásicos, lo que permite la integración de ambos tipos
largo del tejido (en sus
correspondientes de datos. El MS-Imaging puede aplicarse a preparaciones homogé-
espectros), puede neas de células, obtenidas del propio corte histológico mediante mi-
reconstruirse una imagen o crodisección por captura con láser, incrementando así su resolución.
mapa bidimensional de la Esta tecnología puede complementar, o sustituir, muchas de las téc-
presencia de dicha
nicas manuales actuales (microscopia óptica, fluorescencia) en los
proteína.
departamentos de anatomía patológica de los hospitales.
Una técnica muy similar (SIMS-TOF; secondary ion mass spectrometry)
permite el análisis (identificación y caracterización) de moléculas de bajo peso
molecular presentes en la superficie de una muestra (determinación del meta-
24 boloma). Hasta hace pocos años no se utilizaba con muestras biológicas debi-
do a la alta fragmentación que producía sobre los componentes biológicos. Sin
embargo, el desarrollo de nuevas fuentes de

iones como los clústeres de metal líquido
(oro o bismuto) han ampliado el rango de
masa que puede ser analizado hasta los
1.000 Da. Esta limitación en el reducido
rango de masas analizado es compensada en
parte por la alta resolución obtenida (subce-
lular; hasta 200 nm/pixel) y por no necesitar
la utilización de ningún tipo de matriz (evi-
tando interferencia y deslocalización de las
muestras, se usa el tejido directamente) lo
Figura 7. Esquema del
que la convierte en una herramienta muy va-
fundamento del SIMS-TOF.
liosa en patología. Además, como esta técnica se aplica para locali- Es similar a lo descrito
zar y mapear en el tejido moléculas pequeñas, particularmente fár- para el MS-Imaging
macos (y su colocalización con proteínas), es de gran interés para la (Figura 6), salvo que la
industria farmacéutica. fuente de láser se
Los fundamentos del SIMS-TOF Imaging son muy semejantes a sustituye por una fuente
de iones (bismuto) y que
los descritos anteriormente para MALDI Imaging, siendo la princi-
las moléculas liberadas del
pal diferencia las fuentes de ionización. Los iones primarios se gene- tejido corresponde a
ran utilizando un dispositivo denominado "liquid metal ion gun", compuestos de bajo peso
siendo seleccionados los clústeres de iones incidentes en base a su molecular (<2000 Da). No
masa y carga, focalizándolos en la muestra. El impacto de los iones es necesario aplicar la
primarios en cada punto de la muestra (corte de tejido) genera iones matriz sobre el tejido.
de la misma (secundarios), que son extraidos mediante un campo
eléctrico entre la muestra y las lentes de extracción. Cuando los iones secunda-
rios alcanzan el detector son convertidos en señales digitales y representados
en forma de un espectro de masas para cada posición de la superficie de la
muestra (x,y). Para cada ion detectado se puede representar su intensidad a lo
largo del tejido en forma de imagen tridiemensional, mostrando su abundancia
relativa, utilizando el mismo software que en el MALDI Imaging (Figura 7).
C) Micromatrices (chips o arrays) de proteínas
La obtención de perfiles proteicos, tanto de suero (u otros líquidos fisioló-

gicos) como de células o tejidos, puede también obtenerse a partir de la utiliza- 25
ción de chips (o micromatrices) de proteínas. Este es el sector de mayor creci-
miento en el mercado proteómico, especial-

mente en el área de la proteómica funcional
(análisis de las propiedades bioquímicas y
celulares de las proteínas). No deben con-
fundirse los chips de proteínas (micromatri-
ces de proteínas capturadas o depositadas en
una superficie) con la miniaturización (y au-
tomatización) de las distintas técnicas bioa-
nalíticas proteómicas (2-DE, electroforesis
capilar, cromatografías) que se están desa-
rrollando en formato tipo chip ("the lab-on-
Figura 8. Esquema del
a-chip") basados en la tecnología de micro-
análisis comparativo de
dos muestras (marcadas fluídica. Los chips de proteínas pueden clasificarse según muchos
con dos fluoróforos parámetros (modo de fabricación, química de la superficie, especifi-
diferentes, Cy3 y Cy5) cidad, densidad, etc.). Sin embargo, es mejor sistematizarlos en dos
mediante chips o grandes grupos, en base a lo que capturan o analizan:
microarrays
(micromatrices) de
Chips analíticos: se utilizan para determinar las proteínas presen-
anticuerpos.
tes en una muestra (perfil de expresión) y su cuantificación. La disolu-
ción de la mezcla de proteínas a analizar se aplica sobre el chip, que
contiene agentes de captura que actúan como sondas. Los agentes de captura más
conocidos son los anticuerpos (Ab) en sus distintas modalidades: monoclonales
completos, Fab, scFv, afibodies (Ab sintéticos), dominios de Ab, etc. (Figura 8).
El uso de Ab no está exento de problemas: inespecificidad, reacciones cruzadas,
orientación, afinidad, etc. Otra alternativa son los chips de antígeno para analizar
el perfil sérico de Ab (y autoAbs en enfermedades autoinmunes), como los chips
de alergénos para la detección de IgEs en respuestas alérgicas.
Recientemente se están generando una plétora de agentes de captura distintos
a los Abs, como péptidos, moléculas orgánicas, polímeros sintéticos, oligonucleóti-
dos, aptámeros, ribozimas, trinectinas (derivados de la fibronectina), MIPs (mole-
cular imprinted polymers: compuestos que se polimerizan sobre las proteínas cre-
ando moldes para su uso posterior), etc. A pesar de esta diversidad, la captura de
las proteínas (y los métodos de detección) constituye el gran problema de los chips
proteicos: no existen todavía agentes de captura de alta calidad que puedan inmovi-
26 lizarse en la superficie de un chip y que permitan unir, detectar y cuantificar una
mezcla compleja de proteínas. Este problema está retrasando no sólo el desarrollo
de los chips proteicos, sino de la industria proteómica en general. La investigación

proteómica está generando multitud de biomarcadores potenciales y nuevas dianas
terapéuticas, pero tiene el cuello de botella del cribado y la validación de fármacos
y los chips de proteínas parece el método adecuado para solucionarlo.
Los chips de fase reversa son de especial relevancia en Medicina porque
permiten determinar las proteínas implicadas en las rutas de señalización celu-
lar en las biopsias de los pacientes. En ellos, las biopsias (típicamente de tumo-
res o cardíacas) se lisan y se depositan en diluciones sucesivas como microgo-
tas (utilizando los mismos robots que para la fabricación de los chips de ADN);
posteriormente, son revelados con Abs validados (que reconocen proteínas fos-
foriladas y kinasas, a fin de determinar el grado de activación de las diferentes
rutas de señalización), obteniéndose información cualitativa y cuantitativa para
cada paciente, lo que permite un tratamiento personalizado. Existen actualmen-
te cerca de 1.000 Abs validados. Mediante estos arrays puede determinarse si-
multáneamente el estado de fosforilación de las proteínas implicadas en las
principales rutas de señalización intracelular. En este tipo de chip se depositan
pequeños volúmenes (nl) de lisados de tejidos (biopsias de tumores, segmentos
de carótidas procedentes de las endarterectomías) o de células obtenidas me-
diante LCM de los mismos tejidos, sobre una superficie plana (portaobjetos)
usando un microarrayer. Cada microgota contiene el conjunto de todas las pro-
teínas, fosforiladas y no fosforiladas, contenidas en una muestra. Las proteínas
de interés (fosforiladas) se detectan con anticuerpos específicos y se comparan
con las no-fosforiladas. Con arrays de alta densidad pueden detectarse miles de
muestras en un porta. La utilización de los arrays de fase reversa permite así
obtener un tipo de información molecular único e individualizado de cada
muestra, y por tanto de cada paciente. Este nuevo tipo de array proporciona
perfiles de señalización intracelular, incluyendo las modificaciones postraduc-
cionales, datos que no son accesibles mediante técnicas genómicas.
Chips funcionales: estos chips se utilizan para determinar actividades bio-

químicas e interacciones moleculares. Las proteínas de interés se inmovilizan
en el chip y se analizan sus funciones biológicas e interacciones incubándolas
con distintas moléculas (otras proteínas, metabolitos, sustratos de enzimas,
DNA, etc.). Los dos problemas principales de estos chips son la producción de
colecciones extensas de proteínas y su mantenimiento en forma activa en el
27
chip. Sin embargo, para grupos de proteínas con características funcionales si-
milares (factores de transcripción, receptores, kinasas) hay un gran campo por

desarrollar en clínica humana.
Análisis y procesamiento de datos: Bioinformática
La enorme cantidad de datos que se están generando mediante la enumera-

ción de los componentes celulares (genes y proteínas), sus funciones e interac-
ciones, a partir de la genómica y la proteómica, está transformando la Biología
y la Medicina. Esta información está siendo recopilada en diversas bases de da-
tos como las relativas a los geles 2-D de proteínas, proteomas de las distintas
estirpes celulares y sus subproteomas, etc. Se están desarrollando multitud de
herramientas informáticas dedicadas al análisis de imagen de los geles 2-D, a
la interpretación de los espectros de masas, a la secuenciación de las proteínas
de forma automática fiable, a los métodos de cuantificación, etc. Uno de los
objetivos fundamentales de la proteómica clínica es la utilización de herra-
mientas bioinformáticas (y bioestadísticas) para el almacenamiento y procesa-
miento analítico de los datos masivos generados por proteómica. Su finalidad
esencial es el desarrollo y aplicación de métodos de jerarquización y clustering,
visualización de datos, algoritmos estadísticos multivariable, para definir los
perfiles específicos de las distintas patologías. Una necesidad inmediata es la
creación de bases de datos de proteínas implicadas en las distintas patologías,
sus interacciones, participación en rutas de señalización, etc., así como su rela-
ción con los datos genómicos. La aplicación de estos métodos a gran escala no
está desarrollada y deben implementarse para poder definir claramente cuál es
el patrón "normal"(no existe actualmente) y poder discriminar, posteriormente,
los patológicos y su gradación. Esto es esencial para poder definir y establecer
test multiparámetricos. Además, hay que desarrollar métodos que integren de
forma efectiva la información procedente de diversos niveles biológicos (perfi-
les proteicos, niveles o concentraciones, imágenes histológicas, datos clínicos,
etc.). Es evidente que el análisis masivo de datos, y la integración de los distin-
tos niveles de información, sólo puede llevarse a cabo mediante una plataforma
bioinformática proteómica, que constituye uno de los elementos claves de cual-
quier unidad de Proteómica Clínica.
Sin embargo, lo más destacado es la aparición de nuevas herramientas in-
28 formáticas y bases de datos, con una orientación totalmente diferente, fisiológi-
ca y funcional, que intentan integrar el catalogo de proteínas y genes, para re-
flejar el comportamiento celular, analizando las rutas de señalización, las inte-

racciones proteína-proteína, los biomarcadores, los perfiles proteicos, etc. Ade-
más, esos datos deben ser integrados con los de la Medicina clásica (historia
clínica, analítica, imágenes de rayos X y resonancia magnética nuclear, histolo-
gía, tratamiento) para obtener un verdadero valor fisiopatológico. De esta for-
ma, se están generando auténticas plataformas bioinformáticas dedicadas a in-
tegrar todos los datos relativos a patologías concretas. En España, ésta es un
área incipiente.
Creación de bancos de muestras clínicas (suero, tejidos)
Tanto los ensayos clínicos como los estudios de validación de biomarcado-

res o de perfiles proteicos necesitan colecciones amplias de muestras biológicas
y sus protocolos de obtención y recogida de muestras, conservación, uso, etc.
Tales estudios son particularmente necesarios para demostrar la especificidad
diagnóstica del perfil proteico, esto es, su ausencia en los controles (incluyendo
otras enfermedades) y su presencia en la enfermedad estudiada. Se contemplan
dos tipos de grupos de muestras:
a) Grupos reducidos de muestras clínicas muy bien caracterizadas, para la
fase de descubrimiento de biomarcadores o perfiles y estudios piloto.
b) Grandes colecciones de muestras clínicas bien caracterizadas necesarias
para la validación de los biomarcadores o perfiles y el progreso hacia
su uso clínico de rutina.
CARÁCTER MULTIDISCIPLINAR DE LA PROTEÓMICA CLÍNICA
Con lo expresado hasta aquí, parece obvio que la proteómica clínica debe
llevarse a cabo por equipos multidisciplinares, con médicos clínicos y anato-
mopatólogos, químicos de proteínas, expertos en MS, bioinformáticos, farma-
cólogos, etc. Con frecuencia, los análisis proteómicos proporcionan una avalan-
cha de datos de difícil evaluación. Una de las funciones esenciales de los
equipos multidisciplinares es la priorización de patrones candidatos que han de
ser validados. La fiabilidad de los datos, avalados en las bases de datos, su po-
tencial valor clínico y un riguroso análisis bioinformático, son algunos de los
29
criterios que deben seguirse en la priorización.
BIBLIOGRAFÍA
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30
Inmunoterapía humoral
INMUNOTERAPIA HUMORAL
Dr. Manuel Hidalgo. The Johns Hopkins University
El uso de anticuerpos monoclonales es actualmente una

modalidad terapéutica de enorme importancia en el
tratamiento de pacientes con enfermedades neoplásicas.
Los anticuerpos se han utilizado como agentes únicos o
conjugados con agentes radioactivos o como vehículos de
fármacos y toxinas. Actualmente existen anticuerpos frente
a receptores de factores de crecimiento, factores de
crecimiento per se y otras dianas celulares como antigenos
de membrana. Estos fármacos han demostrado actividad
clínica en pacientes con tumores de de mama, colon,
pulmón, linfomas y leucemias. Áreas de investigación y
desarrollo incluyen la generación de agentes con mejores
propiedades farmacológicas y menos tóxicos.
INTRODUCCIÓN
El desarrollo de anticuerpos con fines terapéuticos ha crecido de forma

importante en la última década. Inicialmente se utilizaron anticuerpos de origen
murino. Estas moléculas tienen el inconveniente de que generan una respuesta
immunológica frente a ellos. Los anticuerpos murinos se pueden transformar
en moléculas humanizadas de forma que no son reconocidos por el sistema im-
mune. Los anticuerpos humanos o "humanizados" se caracterizan también por
una mayor vida media. Más recientemente, se han desarrollado estructuras con
capacidad para reconocer multiples antígenos, y con distintos tamaños y pro-
piedades. Junto a la creciente identificación de dianas terapéuticas, el uso de
anticuerpos tanto "desnudos" como conjugados con toxinas, fármacos y com-
puestos radiactivos ha aumentado notablemente. Los anticuerpos más frecuen-
temente utilizados en el tratamiento contra el cáncer son las IgG. Los avances
en genética humana y molecular han permitido la síntesis de fragmentos de
31
IgG. Estos anticuerpos modificados se caracterizan por tener distinta afinidad
antigénica, número variable de sitios de unión al antígeno y distintas propieda-

des farmacológicas. Las más utilizadas son los fragmentos variables de cadena
única (scFV) que están compuestos por las cadenas variables pesadas y ligeras
unidas por un péptido. Estas moléculas tienen un peso molecular de ≈ 25 kDa
y son eficaces como vehículos de radionucleótidos. También se han desarrolla-
do estructuras de mayor envergadura como los llamados diabodis y minibodis.
El menor peso molecular de estas estructuras facilita su eliminación renal y es-
pecificidad en la localización tumoral con menor toxicidad que la asociada con
IgG completas.
MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS ANTICUERPOS

MONOCLONALES COMO AGENTES TERAPÉUTICOS
Los anticuerpos monoclonales ejercen sus actividades de forma muy di-

versa y varía en función de las dianas afectas. Los anticuerpos dirigidos contra
receptores de factores de crecimiento, como el receptor del factor de creci-
miento epidérmico, inhiben la unión de ligandos con sus receptores y, en con-
secuencia, inhiben las funciones del receptor resultando en inhibición de la
proliferación celular y apoptosis. Los anticuerpos también generan actividad
antitumoral a través de mecanismos inmunológicos, induciendo anticuerpos an-
tiidiotipo, citotoxicidad dependiente de celulas (ADCC) y citotoxicidad media-
da por complemento. Como se ha mencionado anteriormente, los anticuerpos
también se utilizan como vehículos de otros agentes terapéuticos como fárma-
cos, toxinas y sustancias radioactivas. En estos casos, los mecanismos de ac-
ción están en función de las moléculas asociadas.
LIMITACIONES DEL EMPLEO DE ANTICUERPOS TERAPÉUTICOS
Inicialmente, los anticuerpos terapéuticos usados en Oncología eran anti-

cuerpos murinos. Una de las limitaciones más importantes de estos fármacos es
la generación de HAMA (human antimouse antibodies). Este problema limita
el número de tratamientos que los pacientes pueden recibir. Técnicas más mo-
32 dernas han permitido la generación de anticuerpos quiméricos que comparten
estructuras humanas y murinas y que tienen menor immunogenicidad. Actual-
mente, es posible la generación de anticuerpos totalmente humanizados que no

generan HAMA. Un segundo problema es la unión del anticuerpo a antígenos
circulantes con la consiguiente reducción en la disponibilidad del anticuepo pa-
ra llegar al tumor. Otras limitaciones a la distribución de los anticuerpos en el
tejido tumoral incluyen las alteraciones en la vasculatura de los mismos, eleva-
da presión hidrostática y la distribución heterogénea de los antígenos dentro de
los tumores. Además, la inmunoterapia humoral se ve limitada por las dificul-
tades de acceso de las células efectoras a los tejidos tumorales. Finalmente, es
bien conocido que los tumores secretan sustancias que disminuyen la respuesta
inmunológica.
ANTICUERPOS TERAPÉUTICOS
Neoplasias hematológicas
CAMPATH-1: El CAMPATH-1 es un anticuerpo moclonal específico fren-

te al antigeno CD52, un glicopéptido que se expresa en linfocitos B y T. Se ha
empleado en pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia pro-
mielocítica y linfomas no Hodgkin (LNH) así como para depleccionar de célu-
las T la médula en transplantes alogénicos. El fármaco tiene aproximadamente
un 50% de respuesta en pacientes con LMC resistente a fludarabina. En pa-
cientes con enfermedad no tratada el fármaco ha demostrado también actividad
en pacientes con enfermedad no tratada, si bien la actividad es menor en pa-
cientes con afectación esplénica y de ganglios linfáticos. En pacientes con
LNH se ha estudiado una versión humanizada del anticuerpo. Un 20% de pa-
cientes respondieron, aunque de forma transitoria. Las principales toxicidades
observadas fueron anemia, trombocitopenia e infecciones oportunistas.
Rituximab: El rituximab es un anticuerpo monoclonal humanizado frente
al antigeno CD20. En estudios fase II, el fármaco resultó en un 40-50% de res-
puestas objetivas en pacientes con recidivas de LNH de bajo grado con muy
buena tolerancia. En algunas ocasiones, el tratamiento con rituximab resultó en
reacciones infusionales caracterizadas por fiebre, escalofríos, lisis tumoral, pla-
quetopenia, broncoespasmo e hipoxemia. Estos síntomas se suelen resolver con
tratamiento de soporte y los pacientes pueden continuar el tratamiento sin se-
33
cuelas. En raras ocasiones se han descrito reacciones cutáneas de gran intensi-
dad, siendo algunas incluso fatales. En pacientes con linfomas de grado alto e
intermedio, las respuestas fueron de un 30% con independencia de la dosis em-
pleada. En combinación con quimoterapia CHOP, el índice de respuestas es
mayor del 90% con hasta un 55% de respuestas completas de larga duración.
Es importante resaltar que pacientes con translocacion del gen blc2 negativiza-
ron dicho marcador en sangre medido por PCR. En pacientes ancianos, el trata-
miento combinado de quimioterapia con rituximab ha demostrado superioridad
al tratamiento con quimioterapia sola. En linfomas de bajo grado, el tratamien-
to combinado de rituximab y fludarabina resultó en un 93% de respuestas glo-
bales, con una duración de más de 14 meses. Una observación importante en el
desarrollo clínico del rituximab es que la presencia de células CD-20 positivas
circulantes puede afectar a la actividad del fármaco, actuando como un santua-
rio en el que se deposita el anticuerpo, pudiendo necesitar dosis más altas del
mismo. De hecho, en otros estudios se ha observado una relación entre niveles
séricos del anticuerpo y actividad clínica, de forma que pacientes con enferme-
dad avanzada puedan necesitar una dosis de anticuerpo más alta. En casos oca-
sionales, los pacientes desarrollan resistencia a rituximab debido a la prolifera-
ción de poblaciones linfocitarias sin expresión del antígeno. En estas
situaciones se puede considerar la combinación de este agente con otros fárma-
cos dirigidos contra las poblaciones linfocitarias emergentes.
Tumores sólidos
Trastuzumab: El Her2/Neu, también llamado ErbB2, es uno de los miem-

bros de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR).
Este receptor de membrana se encuentra sobreexpresado, debido a una amplifi-
cación genética en el 30% aproximadamente de pacientes con cáncer de mama.
El trastuzumab (Herceptin®), también conocido como herceptin, es una versión
humanizada del anticuerpo murino 4D5. El anticuerpo va dirigido frente a epi-
topos en el dominio extracelular del Her2. En estudios de fase II, en pacientes
con carcinoma de mama avanzado, el tratamiento con este fármaco resultó en
un 10-15% de respuestas objetivas, y aproximadamente, 9 y 13 meses de tiem-
po a la progresión y supervivencia respectivamente. El fármaco es activo en
aquellos tumores que sobreexpresan el Her2, determinado bien mediante im-
34 muhistoquimica o mediante amplificación genética por FISH. En combinación
con quimioterapia, el tratamiento con trastuzumab ha mostrado superioridad
frente al tratamiento con quimioterapia sola en pacientes con cáncer de mama

avanzado. En un estudio fase III, el tratamiento combinado de herceptin con
paclitaxel o ciclofosfamida-adriamicina demostró superioridad en repuestas ob-
jetivas así como supervivencia. El tratamiento combinado con antraciclinas re-
sultó en casos de disfunción miocárdica y no se recomienda su utilización. Re-
cientemente se han publicado los estudios de herceptin en pacientes con
carcinoma de mama operado en combinación con quimioterapia. Estos estudios
han demostrado una mejor supervivencia libre de enfermedad en pacientes tra-
tadas con este fármaco, lo cual ha resultado en la aprobación de los mismos
para uso clínico. La mejor supervivencia de las pacientes tratadas indica que
posiblemente se logre un mayor número de curaciones de la enfermedad.
Cetuximab: El EGFR, o sus ligandos, está sobreexpresado en la gran mayo-
ría de los tumores sólidos epiteliales y es una diana muy interesante para el desa-
rrollo de fármacos antitumorales. Farmacológicamente se han desarrollado dos
estrategias contra esta diana, que se basan en el uso de anticuerpos monoclonales
contra el dominio extracelular del receptor o moléculas pequeñas dirigidas frente
al domino intracelular del mismo. Ambas estrategias han demostrado ser efecti-
vas y actualmente se están aprobando fármacos inhibidores de este receptor en
estas dos categorías. Los anticuerpos monoclonales bloquean la interacción del
ligando receptor e inhiben la función del mismo. Además, los anticuerpos mono-
clonales inducen la degradación del receptor, siendo este otro mecanismo de ate-
nuación de la señal. A nivel celular, estos eventos producen una inhibición de la
proliferación celular. Estudios preclínicos han demostrado, además, que estos fár-
macos reducen la expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular, con
lo que se produce una disminución del potencial angiogénico. En estudios preclí-
nicos se ha visto también que los anticuerpos monoclonales frente al EGFR ejer-
cen efectos sinérgicos con quimioterapia y radioterapia.
Actualmente existen varios anticuerpos de esta clase en desarrollo. Los
más avanzados son el cetuximab (Erbitux®), aprobado para el tratamiento de
pacientes con carcinoma de colon refractario a irinotecán en combinación con
este agente, en combinación con radioterapia en pacientes con carcinoma epi-
dermoide de cabeza y cuello con enfermedad localmente avanzada así como en
pacientes con enfermedad avanzada como agente único. En diferentes estudios
clínicos se ha observado que este anticuerpo tiene actividad como agente único
y en combinación con irinotecán en pacientes con cáncer de colon avanzado.
35
En un reciente estudio fase III, la combinación de cetuximab con irinotecán re-
sultó ser superior a cetuximab sólo en pacientes con cáncer de colon avanzado
que habían progresado al tratamiento con irinotecan. El fármaco tiene también
actividad en otros tumores tanto como agente único como en combinación con
quiotereapia y radioterapia. En particular, varios estudios recientes han demos-
trado que este fármaco tiene actividad como agente único en pacientes con tu-
mores de cabeza y cuello. Asimismo, la adición de cetuximab al tratamiento
con quimioterapia basada en platino en pacientes con carcinoma de cabeza y
cuello resistentes a esta quimioterapia resultó en un aumento de las respuestas
objetivas. Finalmente, en un estudio fase III, la combinación de cetuximab con
radioterapia resultó superior a la radioterapia sola en pacientes con carcinoma
de cabeza y cuello localmente avanzado. La toxicidad principal observada con
este fármaco cutanea y se manifiesta como acne. En estudios clínicos se ha ob-
servado, de forma muy interesante que los pacientes que desarrollan toxicidad
cutanea tienden a evolucionar mejor.
El otro anticuerpo monoclonal aprobado para uso clínico es panitumumab.
Este anticuerpo, a diferencia de cetuximab, es totalmente humano, lo cual dis-
minuye la indicencia de reacciones de hipersensiblidad. En un reciente estudio
fase III en pacientes con carcinoma de colon resistente a tratamiento con qui-
mioterapia, el panitumumab resultó en un aumento significativo en el tiempo a
la progresión frente a placebo. Estos resultados han llevado a la aprobación clí-
nica de panitumumab para pacientes con carcinoma de colon refractario a qui-
mioterapia.
Edrecolomab: El anticuerpo 17-1A (Panorex®) reconoce el antígeno Ep-
CAM. El anticuerpo desarrollado clínicamente es un anticuerpo humanizado
que tiene una larga vida media, induce ADCC y no produce HAMA. Debido a
observaciones preclínicas que indican una mayor actividad del anticuerpo
cuando se combina con citokinas como interferón, interleukinas y factores de
crecimiento hematopoyéticos, este anticuerpo se ha desarrollado en combina-
ción con estos otros agentes. Los estudios clínicos realizados con esta molécula
han dado resultados conflictivos. La combinación con citoquinas ha resultado
en mejores respuestas inmunólogicas, pero no en mejores respuestas clínicas.
Los estudios iniciales en pacientes con estadio III de cáncer de colon demostra-
ron un aumento en la supervivencia del grupo tratado con anticuerpo frente al
control. Estudios posteriores en pacientes con estadio II de cáncer de colon y
36 en combinación con quimioterapia en pacientes con estadio III no han confir-
mado dicha actividad.
Bevacizumab: El VEGF es uno de los mediadores más importantes de la

angiogénesis. Bevacizumab es un anticuerpo monoclonal dirigido contra este
factor de crecimiento que ha sido recientemente aprobado para el tratamiento
de pacientes afectos de carcinoma de colon en combinación con quimiotera-
pia. El fármaco ha demostrado en estudios fase III en pacientes con carcino-
ma de colon avanzado, mama y pulmón un mayor índice de respuestas objeti-
vas y mejor supervivencia. La droga tiene también actividad en pacientes con
carcinoma de pulmón y está siendo extensivamente estudiada en estas otras
enfermedades. Los principales efectos secundarios más notorios han sido hi-
pertensión, hemorragias (tumorales, epistaxis, hemoptisis) y cuadros de per-
foración intestinal.
RADIOINMUNOTERAPIA
Radioinmunoconjugados
En esta modalidad terapéutica, los anticuerpos se utilizan como vehículos

de sustancias radioactivas. Los anticuerpos utilizados pueden ser anticuerpos
sin actividad terapéutica per se o con actividad terapéutica, como por ejemplo
rituximab. La gran disponibilidad actual de anticuerpos y radioisótopos con
propiedades físicas y biológicas muy diversas permite mucha flexibilidad en
la combinación de los mismos, de manera que es posible generar reactivos de
muy diversa índole. Hasta recientemente, el único radioisótopo disponible era
el 131I. Más recientemente está disponible también el 90Y, cuyo uso está au-
mentando de forma progresiva. Estos agentes se clasifican en dos grandes ca-
tegorías dependiendo del tipo de energía que emiten, alfa o beta. Estas sustan-
cias se han utilizado mayormente en el tratamiento de neoplasias
hematológicas. Tositumomab (Bexxar®) está compuesto por 131I -anti CD 20.
Dosis mieloablativas de este agente han sido eficaces en el tratamiento de pa-
cientes con linfoma refractario a tratamiento convencional y también ha de-
mostrado actividad a dosis más bajas en pacientes con linfomas refractarios.
Ibritumomab (Zevalin®) combina un anticuerpo frente al CD20 con 90Y. El es-
tudio más relevante con este fármaco es un estudio randomizado fase III en
pacientes con linfoma de bajo grado. Ciento cuarenta y tres enfermos se ran-
37
domizaron a recibir tratamiento con ibritumomab o rituximab resultando en un
mayor índice de respuestas objetivas tanto completas como parciales en el

grupo tratado con ibritumomab. Otros fármacos RAIT incluyen Lym-1 y
M195. Esta modalidad terapéutica se ha ensayado también en tumores sólidos
con menor éxito hasta el momento.
CONCLUSIONES
Los anticuerpos monoclonales se han establecido como una importante

modalidad terapéutica y actualmente existen varios aprobados para el trata-
miento de pacientes con diversos tipos de tumores. Los anticuerpos ofrecen
una gran versatilidad en cuanto a su posible utilización como agentes únicos o
combinados con radioinmunoconjugados, fármacos y toxinas.
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39
Introducción a la inmunoterapia celular
INTRODUCCIÓN A LA INMUNOTERAPIA CELULAR

José R. Regueiro. Departamento de Inmunología. Facultad de Medicina. Universidad Complutense. Madrid
Eduardo Martínez Navas. Facultad de Medicina. Universidad Complutense de Madrid
¿QUÉ ES LA INMUNOTERAPIA?
La inmunoterapia es la utilización de he-

rramientas inmunológicas para tratar enferme-
dades como las que se indican en la Figura 1.
• Cáncer (Blattman 2004).
• Infecciones (Casadevall 2004).
• Enfermedades inmunitarias.
– Por exceso de respuesta a antígenos.
■ Propios: autoinmunidad (Stein-
man 2004, Feldmann 2004).
■ Ajenos: alergia, rechazo (Hu
ggins 2004, Waldmann 2004). Figura 1.
– Por defecto de respuesta a patógenos: inmunodeficiencias.
LA INMUNOTERAPIA FUNCIONA (Blattman 2004)

41
La extraordinaria capacidad de reconocimiento del sistema inmunita-
rio ya se puso de manifiesto en siglos anteriores con la inmunoprofilaxis,
Figura 2. Figura 4.
que ha permitido erradicar, por ejemplo, la viruela o el sarampión. De

igual manera, la inmunoterapia ha demostrado en los últimos años que
funciona, como acreditan los ejemplos que se citan en la Figura
Figura 3: Manipulación de la 2. Por ejemplo, el linfoma no-Hodgkin se trata con éxito con
inmunidad adaptativa anticuerpos monoclonales anti-CD20, ya que la célula tumoral
humoral. (A) Los antígenos expresa CD20 y, por tanto, queda marcada para su eliminación
tumorales pueden inducir, sistemática y concienzuda merced a todos los mecanismos des-
mediante vacunación, la
tructivos que la
producción por los linfocitos
inmunidad dedica
B de anticuerpos capaces
de eliminar tumores o normalmente a los
mejorar la presentación de patógenos (Figura
sus antígenos por las 3). La Figura 4 re-
células dendríticas (DC). Los sume algunos de
monoclonales, como el anti-
ellos y otras estra-
CD20 o anticuerpos
tegias que aprove-
biespecíficos, reconocen
tumores y activan diversas
chan la exquisita
células efectoras. BCR/lg, B especificidad de
cell receptor; Ag:Ab, los anticuerpos.
antígeno:anticuerpo. (B) Los Otro ejemplo es el
monoclonales pueden uso de anti-CD25
eliminar tumores por
para tratar el re-
mecanismos independientes
chazo renal agudo,
de células efectoras. MAC,
42 que es debido al
membrane attack complex.
Tomado de Blattman 2004. reconocimiento de
Figura 5. Figura 6.
Figura 7. Figura 8.
las células renales por los linfocitos T alogénicos (Figura 5). Como dichos
linfocitos expresan CD25 para su expansión (Figura 6), el tratamiento los
elimina eficazmente sin dañar a otros linfocitos T. Los linfocitos T, en es-
te caso autorreactivos, son los responsables de la síntesis de un importante
mediador de la inflamación (TNFα) en patologías autoinmunitarias como
la esclerosis múltiple (Figura 7) o la artritis reumatoide. Es dicho media-
dor el que bloquean los anticuerpos anti-TNFα, que tanto éxito han tenido
en esta enfermedad. En realidad, los mecanismos implicados en la inmu-
noterapia de la aloreactividad podrían aplicarse a todas las inmunopatías
(Figura 8), ya que en todas existen linfocitos "malos" (alo, auto o alerre- 43
activos).
LA INMUNIDAD ADAPTATIVA ES MUCHO MÁS

QUE LOS ANTICUERPOS
Los ejemplos precitados tienen en común que se aprovechan de la enorme

diversidad de los anticuerpos, normalmente dirigidos contra los patógenos, para
eliminar o bloquear la causa de la patología tratada (sea ésta el tumor, el linfocito
malo o la citocina, Figura 9). Pero los linfocitos T también tienen esa capacidad,
aún no explotada suficientemente, aunque su concepto de antígeno (péptido ex-
terno o interno presentado por moléculas MHC) difiere del que tienen los linfoci-
tos B (epítopo externo del antígeno nativo, Figura 10). Además los linfocitos T,
especialmente los Th, tienen una enorme capacidad reguladora de la inmunidad
Figura 9. Figura 10.
44
innata y adaptativa, y entre

otras cosas son los responsables
de la propia función de los B
(Figura 11, 12). Por tanto, inten-
tar redirigir la actividad defensi-
va anti-patógeno de los linfoci-
tos T y sus células auxiliares
sobre el tumor, el linfocito malo
o la citocina, es una estrategia
con enormes posibilidades tera-
péuticas (Figura 13).
Figura 13.
¿QUÉ ES LA INMUNOTERAPIA CELULAR?
La inmunoterapia celular es la utilización de células como herramien-

tas inmunológicas para tratar las enfermedades que se listan más arriba,
especialmente el cáncer (Paul 1998 y Figura 14). La Figura 15 propone al-
gunos ejemplos, más deseos que realidades salvo quizá el tratamiento de la
leucemia por trasplante de médula ósea compatible. La técnica se resume
en la Figura 16: se obtienen precursores hematopoyéticos del paciente, que
se limpian ex vivo de posibles células tumorales, y se congelan. Entretan-
to, el paciente se trata agresivamente para erradicar el tumor, y después se
reconstituye con los precursores congelados. Los recientes avances en la
45
reconstitución del linaje T, que es el

más importante clínicamente, mejorarán
previsiblemente esta opción terapéutica
(van den Brink 2004). También se puede
aplicar el procedimiento a enfermedades
autoinmunitarias graves (esclerosis múl-
tiple, artritis reumatoide resistente a
otros tratamientos), ya que los linfocitos
autorreactivos, como la leucemia, pue-
den ser eliminados dentro y fuera del
paciente (Sykes 2005).
Figura 16.
DAME UN BUEN ANTÍGENO Y ELIMINARÉ EL CANCER
Aunque el sistema inmunitario ha evolucionado para defendernos de los pató-

genos, y parece poco preocupado por los tumores (o por constituir una molesta ba-
rrera frente a los trasplantes), lo cierto es que elimina con rapidez tumores siempre
que tengan un buen antígeno asociado. Dos ejemplos: el virus de Epstein-Barr y
los idiotipos (regiones variables de las Igs) en linfomas B de bajo grado (Figura
17), aunque hay otros (Figura 18). El caso del virus de Epstein-Barr es muy ilustra-
tivo (Figura 19), ya que infecta a casi toda la población e in vitro transforma a los
linfocitos B (su diana) para que crezcan indefinidamente. Pero in vivo se mantiene
a raya por los linfocitos Tc principalmente. La inmunosupresión lo puede liberar de
46
Figura 19.
Figura 20.
este control permitiendo la proli-
feración de los linfocitos B in-
fectados, que con el tiempo pue-
Figura 21. den acumular mutaciones que
los hacen tumorales (Figura 20). La Figura 21 explica el mecanismo de las vacunas
antitumorales con idiotipos del BCR del linfoma, que se convierten por sobreex-
presión en antígenos tumorales (de distribución mucho más restringida que CD20,
por cierto, y por tanto mucho más específicos). Sin embargo, pocas veces hay un
buen antígeno tumoral (ver último párrafo del siguiente apartado).
INMUNOTERAPIA CELULAR DEL CÁNCER
Por tanto, la inmunoterapia celular pretende convencer a los linfocitos Tc (y

Th) de que destruyan a las células tumorales (propias, aunque descarriadas) como
si estuvieran infectadas por EBV (Figuras 22, 23). Para ello, utiliza células diver- 47
sas: linfocitos alogénicos de médula ósea, células dendríticas, las propias células
Figura 23.
Figura 22.
tumorales modificadas, o linfo-

citos propios (T, NK NKT…,
Figuras 24, 25) (Plunkett 1999).
Figura 24.
Linfocitos alogénicos
Las preparaciones de médula

ósea alogénica contienen siempre
cierto porcentaje de linfocitos T
maduros (Figura 26). Mientras
que los precursores se diferencian
en el timo del receptor para dar
lugar a linfocitos T autotolerantes
restringidos por el MHC del re-
ceptor, los linfocitos contaminan-
48 tes pueden contener una propor-
ción variable de linfocitos T Figura 25.
alogénicos, que son los responsables de la reacción injerto contra huésped en los tras-
plantes de médula no purgada de linfocitos. Esta reacción es más peligrosa que la re-
acción alogénica de los linfocitos T del receptor contra el injerto de médula y su pro-
genie (que puede provocar el rechazo del injerto), ya que puede comprometer la vida
del receptor. Por esa razón se suele purgar la médula alogénica con monoclonales an-
ti- CD2, CD3, CD5, CD7 o CD52 en el caso de pacientes sin cáncer. Pues bien, esa
misma actividad anti-huésped aparentemente indeseable es la responsable del efecto
injerto contra leucemia, que elimina con efectividad a todas las células tumorales por
razones alogénicas, las mismas que operan en el rechazo renal (Figura 27), pero aho-
ra dirigidas contra el tumor. Este efecto antitumoral de las células T alogénicas ha si-
do claramente demostrado en dos enfermedades: leucemia mieloide crónica (CML) y
la enfermedad linfoproliferativa de linfocitos B inducida por el virus de Epstein-Barr
(EBV). Pero, en este caso, la razón por la que el
tumor es eliminado es porque, en realidad, no
es propio. También se ha demostrado el efecto
beneficioso del rechazo del huésped en algunas
enfermedades autoinmunitarias (Sykes 2005).
Células dendríticas y tumorales

(Irvine 2000, Berzofsky 2004a)
Las células dendríticas y tumorales au-

tólogas (Figura 28) son también objeto de 49
las estrategias de inmunoterapia celular que Figura 28.
a menudo se denominan vacunas celulares. El diseño es sencillo (Figuras 29,

30): consiste en hacer crecer las células dendríticas ex vivo a partir de monoci-
tos (si es que al resultado se le puede llamar células dendríticas), madurarlas y
cargarlas con lisados del tumor, o vectores virales que expresen antígenos tu-
morales, o péptidos antigénicos de origen tumoral (Curti 2004, Figura 31). Se
espera que así las células dendríticas carguen en su MHC péptidos tumorales y,
al reinyectarse al paciente, consigan disparar una respuesta vigorosa de linfoci-
tos Tc (y Th) antitumorales. Más recientemente se ha demostrado en ratón que
los antígenos tumorales podrían expresarse con vectores en precursores hema-
topoyéticos que, al diferenciarse en dendríticas, activarían a los linfocitos T an-
titumorales (Cui 2003). Otra estrategia complementaria es modificar las propias
50
células tumorales con vectores que produz-

can localmente moléculas inmunoestimula-
doras (por ejemplo, citocinas, o bien molé-
culas coestimuladoras, como B7/CD80) con
la esperanza de que, al volver al enfermo,
estimulen una fuerte respuesta presentadora
en las células dendríticas y, por tanto, una
respuesta Th y Tc muy potente (Figura 30),
o bien una respuesta directa por parte de es-
tas últimas (Figura 32). Otra estrategia es
utilizar el propio tumor autólogo o bien uno
Figura 33.
alogénico del mismo tipo (Cancervax).
Linfocitos T, NK, NKT (Khanna 1999, Kessels 2001, Alvarez-Vallina 2001)
Por último, la extraordinaria capacidad de los linfocitos propios para

eliminar células infectadas ha propiciado su aplicación a la eliminación de
tumores, con diversas estrategias (básicamente despabilar linfocitos, Figura
34). Una es la transferencia adoptiva de grandes números de linfocitos T
anti-tumor generados in vitro por estimulación con citocinas como la IL-2,
a partir de linfocitos infiltrantes o TIL (B). Los resultados de las fases I y
II de estos ensayos fueron bastante desesperanzadores, aunque recientemen-
te las estrategias linfoablativas han hecho renacer las esperanzas (Rosen-
berg 2004). Otra es la modificación genética de los linfocitos T, antes de su
transferencia adoptiva, para que expresen
nuevos receptores de reconocimiento tu-
moral (TCR, anticuerpos biespecíficos o
quiméricos), o de proliferación autocrina,
o proteínas que bloquean las señales inhi-
bidoras que limitan las respuestas T (D y
Figura 35).
El tratamiento con IL-2 también se ha em-
pleado para la transferencia adoptiva de linfoci-
tos NK expandidos in vitro (las LAK, Figura
36). La α-galactosilceramida es un análogo del 51
ligando natural de los linfocitos NKT que per- Figura 34.
Figura 36.
Figura 35.
mite expandirlos y que ha acredi-

tado su potencial antitumoral.
En el caso de los linfocitos
T y las células dendríticas, exis-
ten dos problemas importantes Figura 37.
(Figura 37): el riesgo de autoin-
munidad, y la necesidad de que exista un verdadero antígeno tumoral. Este último
obstáculo no puede destacarse lo suficiente, porque confunde enormemente el pa-
norama científico. CD20, CEA (antígeno carcinoembrionario), AFP (alfa feto pro-
teína) no son verdaderos antígenos tumorales, ya que se expresan normalmente en
el enfermo en cantidades que garantizan la autotolerancia. Por tanto, es muy difí-
cil convencer al sistema inmunitario que los considere ajenos, a no ser que se le
proporcione un sistema de reconocimiento generado en otra especie, para la que sí
son verdaderos antígenos (por ejemplo un anti-CD20 de ratón). En cambio, los
antígenos (inmunógenos para ser más precisos) de los oncovirus (EBV, HTLV-I) o
la p53 mutada o el antígeno oncofetal sí son verdaderos antígenos tumorales, ya
52 que para ellos no existe autotolerancia y puede, por tanto, estimularse la inmuni-
dad contra las células tumorales que los portan (Coggin 2005).
INMUNOTERAPIA CELULAR DE OTRAS ENFERMEDADES
Pero la inmunoterapia celular, al menos en teoría, tendría una enorme apli-

cación potencial en diversas patologías, como se sugiere en la Figura 38. Por
ejemplo, células dendríticas cultivadas con un antígeno de melanoma deberían
generar in vivo linfocitos Tc anti-melanoma. O expandiendo linfocitos Tc autó-
logos anti-EBV in vitro debería poderse tratar la mononucleosis (Khanna 1999,
Berzofsky 2004b). Una vacuna celular a base de los linfocitos T responsables
de la artritis reumatoide, el asma o el rechazo podría eliminarlos completamen-
te. Pero también injertar TCR anti-EBV, o -tumor, o -linfocito malo puede redi-
rigir a linfocitos normales contra las dianas implicadas en cada una de esas pa-
tologías (Figura 39).
Por último, las inmunodeficiencias (ID)
congénitas son desafortunados experimentos
de la Naturaleza que afectan a la inmunidad.
Resulta especialmente apropiado que puedan
curarse mediante afortunados experimentos
diseñados por el ser humano. Ya fue así en
1968, cuando una ID ligada al cromosoma X
se convirtió en la primera enfermedad huma-
na curada con éxito por trasplante de médula
ósea, un procedimiento terapéutico que aho-
ra es estándar para muchas otras patologías,
Figura 38.
incluido el cáncer. Naturalmente, se observa-
ron efectos adversos graves, como la enfer-
medad del injerto contra el huésped. Más de
30 años después, la misma ID ha sido la pri-
mera en ser curada por terapia génica. Hay
obstáculos que superar, como ha demostrado
la leucemia de células T desarrollada por on-
cogénesis insercional en tres pacientes. La
propia inmunidad puede ser un obstáculo pa-
ra la terapia génica cuando se dirige contra
el vector o incluso la proteína terapéutica. 53
Pero la terapia génica seguirá adelante. El
Figura 39.
cáncer, las enfermedades infecciosas, inclui-
do el síndrome de la inmunodeficiencia adquirida, y otras enfermedades congé-

nitas, son las siguientes de la lista. Los beneficios globales serán probablemen-
te más que los riesgos, como se demostró para el trasplante (Regueiro 2004).
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55
Células embrionarias pluripotentes
CÉLULAS EMBRIONARIAS PLURIPOTENTES

Miguel Torres. Científico titular del Departamento de Inmunología y Oncología
Centro Nacional de Biotecnología. CSIC-Pfizer
INTRODUCCIÓN
El cuerpo humano se compone de una gran variedad de células especiali-

zadas en diferentes funciones. Esta especialización determina una divergencia
extrema en la apariencia externa y capacidad funcional de cada una de las cla-
ses de células que componen un organismo. Por ejemplo, una célula ósea difie-
re extraordinariamente en su apariencia externa de una neurona y no podría re-
alizar sus funciones especializadas. La composición y diversidad celular de
nuestro cuerpo, salvo excepciones, está presente en el momento de nacer y nos
acompaña hasta la muerte. Sin embargo, a pesar de su gran heterogeneidad, to-
das nuestras células descienden de una única célula embrionaria: el zigoto. Du-
rante el desarrollo embrionario ocurren dos importantes procesos que conducen
a la composición final del recién nacido; por un lado el zigoto se multiplica
por división, generando el número de células necesarias para la construcción
del organismo, y en paralelo, distintos linajes celulares se diferencian en pobla-
ciones celulares que adoptan las características propias de su identidad.
Una vez diferenciadas, las células disponen de un periodo de vida limitado
y deben ser reemplazadas por otras nuevas para mantener la función de los teji- 57
dos y órganos del individuo. En el embrión temprano existe una población de
células, las células troncales embrionarias, capaz de diferenciarse en cualquier

tipo celular del organismo, y por lo tanto, capaz de aportar todos los tipos celu-
lares necesarios para la construcción de los distintos tejidos y órganos. En el
individuo ya desarrollado, son las células troncales adultas las que heredan esta
capacidad y aportan a cada tejido u órgano un flujo constante de nuevas células
que sustituyen a las envejecidas o dañadas por enfermedad o accidente, regene-
rando órganos y tejidos. Sin embargo, la capacidad de regeneración es muy va-
riable según el tejido; desde casi nula en el caso del Sistema Nervioso Central,
o muy reducida en el caso del páncreas, hasta muy activa en el caso de la piel,
el sistema hematopoyético o el hígado. Esta circunstancia determina que la pér-
dida o deterioro de una población celular concreta durante la vida adulta sea,
en muchos casos, insustituible de manera espontánea.
La carencia de las funciones realizadas por las células dañadas provoca el
sufrimiento de enfermedades crónicas como la diabetes, el Parkinson, la escle-
rosis múltiple, etc. o la pérdida de determinadas funciones, como las parálisis
sufridas tras una lesión de médula. Una de las soluciones para resolver este ti-
po de enfermedades sería la disponibilidad de células embrionarias totipotentes,
capaces de especializarse en las funciones perdidas durante la vida adulta. Sin
embargo, las células troncales embrionarias se encuentran de manera natural en
el embrión en estadio de blastocisto, en número muy limitado y en una ventana
de tiempo muy restringida. Por esta razón, la posibilidad de usarlas depende de
la capacidad de aislar y multiplicar las células troncales embrionarias de mane-
ra controlada en el laboratorio.
LAS CÉLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS: OBTENCIÓN,

CARACTERÍSTICAS Y APROXIMACIONES TERAPÉUTICAS
EXPERIMENTALES
El aislamiento y cultivo de células troncales embrionarias se consiguió por

primera vez a partir de blastocistos de ratón en el año 1981 (Figura 1), cono-
ciéndose universalmente como células ES (según la denominación inglesa
"Embryonic Stem")1,2. Las células aisladas mostraron características excepcio-
nales; por un lado se multiplican indefinidamente en cultivos in vitro, y a la
58 vez, si se les proporciona las condiciones adecuadas, se diferencian dando lu-
gar a las distintas células especializadas del organismo. Las conclusiones deri-
vadas del cultivo y

uso de las células ES
en el ratón son con-
tundentes. Células
ES mantenidas en
cultivo por periodos
prolongados son ca-
paces de mezclarse
con células de un
embrión en desarro-
llo, contribuyendo
células sanas y fun-
cionales a todos los
tejidos de un animal
adulto (Figura 2). A
pesar de haber acu-
mulado un número
indefinido de divi- Figura 1. Establecimiento
siones in vitro, las células ES no parecen "envejecer", ya que los ani- de líneas de células
males generados a partir de éstas células no presentas síntomas de troncales embrionarias.
envejecimiento prematuro. Estas características se relacionan con una

alta actividad telomerasa y con la expresión de otros marcadores re-
lacionados con el mantenimiento del estado indiferenciado y prolife-
rante. Figura 2. Contribución
En 1998 se consiguió por primera vez obtener y propagar in de las células ES a la
formación de quimeras
vitro líneas de células pluripotentes aisladas de blastocistos y de
de ratón con colonización
gónadas fetales humanas3,4. Al igual que sus homólogas de ratón,
de la línea germinal.
59
las células pluripotentes embrionarias humanas se multiplican indefinidamen-

te en cultivos artificiales, pero si se les proporciona las condiciones adecua-
das, se diferencian dando lugar a las distintas células especializadas del orga-
nismo. Los cultivos de células ES humanas representan por lo tanto una
fuente ilimitada de células jóvenes capaces de contribuir a cualquier tejido
del organismo adulto5,6.
En modelos experimentales animales se han producido ya varios ejem-
plos del potencial terapéutico de las células ES. Se ha descrito, por ejemplo,
la diferenciación de células ES de ratón hacia músculo cardíaco y su im-
plantación con éxito en el corazón de un animal adulto7. En estudios simila-
res, se han observado mejorías de lesiones medulares y enfermedades neuro-
degenerativas trasplantando, respectivamente, poblaciones de neuroblastos o
gliales diferenciadas in vitro a partir de células ES de ratón 8,9. También se
han conseguido derivar células beta-pancreáticas funcionales a partir de cé-
lulas ES, mediante un proceso de diferenciación y purificación. La posterior
implantación de estas células en modelos experimentales de diabetes ha eli-
minado los síntomas de la enfermedad, demostrando la eficacia de la aproxi-
mación10.
LIMITACIONES PRESENTES A LA APLICACIÓN DE LAS

CÉLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS EN TERAPIA HUMANA
Existen al menos tres problemas conocidos que impiden prever qué enfer-
medades se beneficiarán de la nueva técnica y cuándo será posible su aplica-
ción.
En primer lugar, las células ES de ratón forman teratocarcinomas al ser
implantadas en estado indiferenciado en animales de laboratorio. Este problema
desaparece si se implantan después de su diferenciación total o parcial in vitro,
por lo que cualquier protocolo de transferencia de células ES deberá incluir un
paso previo de diferenciación in vitro.
Un segundo problema para la aplicación terapéutica de las células ES re-
side en la dificultad de obtener células diferenciadas a un linaje celular puro.
Cuando se estimula su diferenciación, las células ES son capaces de originar
60 cualquier tipo celular, pero raramente lo hacen de manera homogénea, sino
que dan lugar a poblaciones de células en que se mezclan distintos tipos es-
pecializados. Idealmente deberíamos ser capaces de controlar las vías elegi-

das por las células ES cuando se diferencian 6,11. Gracias a experimentos en
células en cultivo y a modelos animales como el ratón, hoy conocemos genes
de diferenciación que controlan estas vías. Por ejemplo, existen genes miogé-
nicos que determinan la diferenciación hacia músculo, neurogénicos que in-
ducen la diferenciación hacia neuronas, genes que determinan los distintos ti-
pos celulares pancreáticos, otros implicados en determinar los diferentes tipos
celulares de la hipófisis y un largo etcétera. La activación controlada de ge-
nes de diferenciación en las células ES podría producir el tipo celular desea-
do para cada aplicación. Un ejemplo práctico de esta aplicación es la estimu-
lación de la producción in vitro de células troncales hematopoyéticas a partir
de células ES de ratón por la sobreexpresión del factor de transcripción
HoxB412. Alternativamente, se pueden exponer los cultivos a factores difusi-
bles capaces de instruir a las células sobre la vía de diferenciación a seguir.
Muchos de estos factores de crecimiento tienen ya aplicaciones terapéuticas y
su utilización sería fácil y directa. Algunas de estas aproximaciones se han
aplicado ya con éxito para dirigir la diferenciación de células ES a determi-
nados linajes in vitro11.
El tercer problema sería que las células implantadas podrían sufrir el mis-
mo tipo de rechazo inmune que se produce en el trasplante de órganos. Antes
de su utilización habría que establecer bancos de distintas líneas celulares com-
patibles con el sistema inmune de cada uno de los posibles receptores, una ta-
rea abordable con la tecnología disponible en este momento, pero sin duda la-
boriosa. Una posibilidad en este contexto sería utilizar técnicas de clonación
por transferencia nuclear, mediante lo cual se pueden generar líneas de células
troncales personalizadas a partir de células somáticas de cada individuo13. Esta
aproximación se ha demostrado viable en animales de experimentación y sería
la solución definitiva al problema del rechazo.
COMBINACIÓN DE TERAPIA CELULAR Y TERAPIA GÉNICA POR

MUTAGÉNESIS DIRIGIDA: ¿UNA VENTAJA TERAPÉUTICA DE
LAS CÉLULAS TRONCALES EMBRIONARIAS?
En aquellos casos en que una población celular determinada esté daña-

61
da debido a un defecto genético congénito o adquirido, el autotransplante,
simple o por clonación, no sería eficaz. Por otro lado, el trasplante de célu-
las sanas ajenas plantearía los problemas de rechazo antes mencionados. De
nuevo, el modelo experimental de ratón ofrece una posible solución idónea
a este problema. La tecnología de células ES en el ratón se ha explotado
fundamentalmente como una vía para la producción de animales modifica-
dos genéticamente14,15. La repercusiones de esta aplicación han sido, y se-
rán en el futuro, de gran importancia. Baste mencionar la disponibilidad de
modelos de ratón que reproducen patologías humanas como el cáncer, la es-
clerosis múltiple o la diabetes, o el avance en el conocimiento sobre cómo
los genes determinan los distintos linajes celulares que componen el orga-
nismo. Gracias a esto, las técnicas de modificación dirigida del genoma del
ratón se han desarrollado enormemente, y en la actualidad permiten realizar
de manera "limpia" mutaciones puntuales, deleciones, inserciones, sustitu-
ciones, translocaciones, inversiones, mutaciones inducibles etc…El poten-
cial terapéutico de estas aproximaciones sería extraordinario en el caso de
que se pudieran aplicar a la reparación del genoma en células ES humanas.
La reparación genética mediante estas técnicas representaría la terapia géni-
ca idónea, al reestablecer un genoma intacto, en lugar de añadir material
genético de manera incontrolada. Este tipo de modificaciones genéticas se
han realizado extensivamente en células ES de ratón, pero se pueden reali-
zar en cualquier línea celular establecida. Sin embargo, por el momento, no
se ha tenido éxito al intentar aplicarlas en células troncales humanas, ya sea
adultas o embrionarias. En caso de no conseguir aplicar estas técnicas en
células troncales, existiría un argumento añadido en favor de la utilización
de la clonación terapéutica, ya que se podría realizar la corrección genética
en una línea establecida de células somáticas y utilizar sus núcleos como
donadores para obtener, primero blastocistos y luego células troncales co-
rregidas. En un experimento paradigmático, que supera todas las limitacio-
nes previsibles a la aplicación terapéutica de las células ES16, se han com-
binado las diferentes aproximaciones mencionadas en este artículo para
sanar ratones inmunodeficientes a causa una mutación en el gen Rag-2.
Mediante biopsia, se obtuvieron núcleos celulares de los ratones adultos in-
munodeficientes y, por trasplante nuclear, se clonaron blastocistos genética-
mente idénticos al ratón original. Posteriormente, de estos blastocistos se
62 derivaron células ES y se corrigieron por modificación dirigida, reparando
el defecto en el gen Rag-2. A continuación, se utilizó una combinación de
diferenciación espontánea, y dirigida por el gen selector HoxB4, para obte-

ner in vitro células troncales hematopoyéticas reparadas. Finalmente, se
trasplantaron las células obtenidas en los ratones deficientes en Rag-2, re-
constituyendo establemente un sistema inmune completamente sano.
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
En resumen, la disponibilidad de células ES humanas representa un gran
avance que proporciona accesibilidad ilimitada a tejidos especializados y a
su proceso de diferenciación. De manera inmediata, representan un modelo
excelente para el estudio de los procesos de generación de diversidad celular
en nuestro organismo y para la caracterización de fármacos que puedan diri-
girlos. Los resultados de los ensayos terapéuticos realizados en animales mo-
delo permiten pensar en la aplicación a corto/medio plazo de la tecnología
de células troncales embrionarias en terapia humana. Una de las
perspectivas más prometedoras en este campo es la combinación
del uso de células troncales embrionarias con la reparación genó- Figura 3. Esquema
mica dirigida, lo que representaría la terapia génica ideal. En cual- propuesto para la
aplicación de nuevas
quier caso, existen limitaciones técnicas a la aplicación terapéutica
estrategias en terapia
de las células troncales embrionarias que impiden determinar con
celular.
certeza qué enfermeda-
des se van a beneficiar
de las nuevas terapias y
en qué plazos. La com-
binación de la tecnolo-
gía de células troncales
embrionarias con la clo-
nación terapéutica per-
mitirá, al menos, elimi-
nar los problemas de
rechazo, y además, pue-
de ser esencial para
conseguir la reparación
genómica dirigida (Fi- 63
gura 3).
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Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre
TRASPLANTE CELULAR Y TERAPIA REGENERATIVA

CON CÉLULAS MADRE
Felipe Prósper. Servicio de Hematología y Área de Terapia Celular. Clínica Universitaria
Universidad de Navarra
Uno de los campos de la Medicina que más expectativas ha

levantado en los últimos años es la terapia celular con
células madre. El aislamiento de células embrionarias
humanas, la aparente e inesperada potencialidad de las
células madre adultas y el desarrollo de la terapia génica
nos lleva a imaginar un futuro esperanzador para un
importante número de enfermedades actualmente
incurables. A lo largo de las siguientes páginas vamos a
tratar de dibujar el panorama de la investigación con
células madre, describiendo los principales logros en este
campo así como algunas de las preguntas pendientes de
responder. A pesar de las grandes expectativas, es
fundamental que mantengamos un espíritu crítico y realista
a la hora de analizar los avances científicos en este área.
INTRODUCCIÓN
Las primeras evidencias científicas de que en el organismo adulto existen

células madres proviene de experimentos realizados por Till y McCulloch a fi-
nales de los años 50 centrados en las células madre hematopoyéticas. Sin em-
bargo, la capacidad de regenerar tejidos en organismos adultos, e incluso de re-
generar organismos completos, como en el caso de planarias, se conoce desde
mucho antes. Clínicamente, hemos explotado la potencialidad de las células
madre adultas, concretamente de las células madre hematopoyéticas, desde ha-
ce más de 50 años, y podemos afirmar que gracias al trasplante de médula ósea
(trasplante de células madre hematopoyéticas) miles de pacientes han podido
ser curados de enfermedades incurables de otra forma. Aunque la forma más
65
ampliamente utilizada de TC es el trasplante de progenitores hematopoyéticos,
el término Terapia Celular (TC), en un sentido amplio, incluye cualquier tipo

de tratamiento que utiliza células como agente terapéutico.
El interés por la utilización de las células madre, sin embargo, ha crecido
de forma exponencial en los últimos años a raíz de la identificación, caracteri-
zación y aislamiento de las células madre embrionarias humanas1 y de las ex-
pectativas, de alguna forma prematuras, de que las células madre podrían ser
capaces de curar innumerables enfermedades (enfermedades neurodegenerati-
vas, cardíacas, endocrinológicas, etc.) gracias a su enorme potencial de diferen-
ciación. Desgraciadamente, el debate científico sobre las aplicaciones terapéuti-
cas de las células madre, adultas o embrionarias, se ha transformado en un
debate político y mediático en detrimento del ambiente necesario que facilite el
progreso científico.
Quizá el mensaje más importante que me gustaría trasmitir es que, a pesar
de las enormes perspectivas que existen en relación con las células madre, es
esencial que seamos capaces de trasmitir un sentimiento de prudencia y pacien-
cia a nuestros enfermos y colegas: las células madre pueden llegar a contribuir
al tratamiento de distintas enfermedades, pero estos avances no son esperables
a corto plazo. Solamente, la investigación seria y continuada podrá contribuir a
medio o largo plazo a determinar la utilidad terapéutica real de las células ma-
dre adultas o embrionarias.
CÉLULAS MADRE
Una célula madre, o más adecuadamente denominada troncal, es aquélla

que es capaz de dividirse indefinidamente y diferenciarse a distintos tipos de cé-
lulas especializadas, no sólo morfológicamente sino también de forma funcio-
nal. Las células madre se pueden clasificar según su capacidad de diferenciarse
a distintos tipos de tejidos o lo que es lo mismo según su potencialidad: las cé-
lulas madre totipotenciales son aquellas capaces de producir tanto tejido embrio-
nario, es decir, un embrión completo, como extraembrionario (placenta y anejos
placentarios). En sentido estricto, solamente los estadios iniciales del zigoto
constituirían células madre totipotenciales; las células madre pluripotenciales
son aquéllas que tienen la capacidad de diferenciarse a cualquiera de los tejidos
66 existentes en un organismo adulto y, por tanto, tejidos procedentes de cualquiera
de las tres capas embrionarias incluyendo las células germinales; por último, las
células madre multipotenciales serían capaces de diferenciarse a distintos tipos

celulares, pero siempre restringiendo su potencial a tejidos derivados de una
única capa embrionaria, es decir, tejidos derivados mesodérmicos, ectodérmicos
o endodérmicos2. Desde el punto de vista de su origen dividimos a las células
troncales en embrionarias (derivan del embrion, bien del blastocisto o de la
cresta gonadal) y adultas (derivan de alguno de los tejidos adultos).
Células madre embrionarias
Las células madre embrionarias se han obtenido bien a partir de la masa

celular interna del blastocisto en el estadio de embrión preimplantatorio1, o
bien de las cresta gonadal3. Aunque las líneas de células embrionarias de ratón
se utilizan desde hace más de 20 años4, hasta 1998 no fue posible obtener célu-
las embrionarias humanas1,3. La posibilidad de obtener y utilizar terapéutica-
mente las células embrionarias humanas ha disparado las expectativas de la te-
rapia celular con células madre.
Las células madre embrionarias son pluripotenciales, es decir, son capaces de
proliferar de forma continua sin diferenciarse, siendo prácticamente inmortales, y
además son capaces de diferenciarse a cualquier tejido del organismo, incluyendo
tejidos somáticos (corazón, hígado, hueso, pulmón, cerebro, etc.. y células germi-
nales (oocitos y espermatozoides), como se ha podido demostrar recientemente5-8.
Obviamente, la posibilidad de obtener cualquier tipo de tejido, y sin limitaciones
en cuanto a número de células, ha abierto expectativas de tratamiento de enferme-
dades tradicionalmente incurables (infarto de miocardio, enfermedades neurodege-
nerativas, enfermedad de Parkinson, diabetes y otras muchas).
Sin embargo, las células madre embrionarias tienen, a día de hoy, impor-
tantes limitaciones que, de momento, han hecho que no exista ningún estudio
clínico abierto en pacientes. Por una parte, la misma capacidad proliferativa de
estas células lleva a que en los distintos modelos animales en los que se han
utilizado, se detecte de forma invariable la producción de tumores (teratomas y
teratocarcinomas). Con el objetivo de limitar este problema, diferentes grupos
han realizado estudios utilizando células embrionarias prediferenciadas con re-
sultados positivos. Junto a este problema, se encuentra el hecho de que el tras-
plante de células embrionarias se produciría entre dos sujetos inmunológica-
mente incompatibles, lo cual exigiría la utilización de medicación
67
inmunosupresora y los consiguientes efectos adversos. Aunque en este sentido,
la trasferencia nuclear, al menos teóricamente, permitiría eludir el problema de

histoincompatibilidad, desde el punto de vista económico e incluso científico
no es una solución viable hoy en día.
Células madre adultas
Se conoce desde hace muchos años que distintos tejidos del organismo tienen
la capacidad de auto-regenerarse, gracias a la existencia de células madre residen-
tes en dichos tejidos. Estas células madre obtenidas de tejidos adultos poseen las
dos características de auto-renovación y diferenciación que hemos mencionado
anteriormente. Sin embargo, a diferencia de las células madre embrionarias, se
considera que su capacidad proliferativa y su potencial de diferenciación es signi-
ficativamente menor9. Se han identificado células madre adultas en la médula
ósea, músculo esquelético, epidermis, intestino, testículo, hígado, y de forma más
reciente en tejidos como el sistema nervioso central o el corazón.
Las células madre adultas se consideran multipotenciales, es decir, capaces
de diferenciarse a un número limitado de tejidos, principalmente en función de
su origen embrionario (células de origen mesodérmico pueden diferenciarse a te-
jidos derivados mesodérmicos etc.). Sin embargo, cada vez parece más evidente
que las células madre adultas son capaces de generar células maduras de tejidos
derivados de capas embrionarias distintas, siendo el caso más típico el de las cé-
lulas madre hematopoyéticas capaces de diferenciarse a hepatocitos, músculo
cardíaco, endotelio o incluso a tejidos derivados de las tres capas embrionarias9-
12. Este fenómeno, denominado versatilidad o capacidad de transdiferenciación
de las células madre adultas no está exento de controversia, ya que mientras al-
gunos estudios lo apoyan, otros trabajos recientes cuestionan la existencia de esta
capacidad de transdiferenciación de las células, justificando algunos de los ha-
llazgos de versatilidad en función de fenómenos de fusión celular13,14 o incluso
cuestionando abiertamente los resultados experimentales15.
TERAPIA CELULAR CON CÉLULAS MADRE
A día de hoy, las aplicaciones clínicas de la terapia celular se limitan a las

68 células madre adultas. Es posible que en el futuro las células madre embriona-
rias se apliquen de forma terapéutica, pero hoy en día las limitaciones que he-
mos mencionado anteriormente hacen inviable su utilización. Existen, sin em-

bargo, ensayos clínicos con células madre embrionarias previstos en un futuro
próximo.
Terapia celular en Endocrinología
La prevalencia de la diabetes mellitus se está incrementado hasta adquirir

proporciones epidémicas en el mundo. Se estima que actualmente 100 millones
de personas padecen la enfermedad, debido a la incapacidad de las células β
del páncreas de secretar insulina, hormona fundamental para el control de la
glucemia. En la actualidad, no existe un tratamiento curativo de la diabetes si-
no que el pronóstico de los pacientes está supeditado al control de su glucemia
mediante el tratamiento sustitutivo.
Recientemente, los resultados positivos obtenidos mediante el trasplante
de islotes de páncreas en pacientes diabéticos ha incrementado el interés por
utilizar células capaces de producir insulina. Mientras que el escaso número de
islotes, y la imposibilidad de expandir dichas células in vitro, impide que el
trasplante de islotes de cadáver sea utilizable en un número importante de pa-
cientes, la posibilidad de utilizar células madre con capacidad de diferenciarse
en células productoras de insulina se plantearía como una estrategia mucho
más atractiva16.
En modelos experimentales, se ha podido demostrar que las células madre
embrionarias se pueden diferenciar a células secretoras de insulina y que cuan-
do estas células se implantan en el bazo de ratones, en los que previamente se
ha inducido una diabetes mediante la inyección de estreptozotozina, son capa-
ces de inducir una normalización de las cifras de glucosa. Uno de los principa-
les problemas para la utilización de células embrionarias es que en el proceso
de diferenciación, además de células productoras de insulina, se producen otros
tipos celulares diferentes, que habría que eliminar de forma previa a su utiliza-
ción17.
Aunque hasta el momento no ha sido posible caracterizar la célula madre
pancreática, distintos estudios sugieren el potencial de células obtenidas a par-
tir de hígado, conductos pancreáticos o islotes pancreáticos, o incluso células
de médula ósea para producir células secretoras de insulina18-19. En cualquier
caso, una de las principales limitaciones con cualquiera de los tipos celulares
69
descritos es que el porcentaje de células secretoras de insulina que se puede
obtener es muy pequeño, lo cual limita su aplicación terapéutica. A pesar del

enorme interés en esta área de investigación, no existe ningún estudio clínico
publicado utilizando células madre en pacientes con diabetes tipo I, aunque las
expectativas sean enormes.
Terapia celular en enfermedades neurológicas
Las células madre tienen un enorme potencial como células capaces de re-
construir las neuronas y estructuras dañadas en enfermedades como la enferme-
dad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, enfermedad de Alzheimer, es-
clerosis en placas, infartos cerebrales o las lesiones medulares, por mencionar
algunas. El sistema nervioso central añade una dificultad adicional a la terapia
celular. Al ser un órgano con una sofisticada organización estructural, las célu-
las implantadas han de ser capaces no sólo de injertarse, sino también de esta-
blecer nuevas conexiones sinápticas e integrarse con el resto del tejido circun-
dante.
La enfermedad de Parkinson (EP) es una enfermedad neurodegenerativa
que afecta a más del 2% de la población mayor de 65 años. Se caracteriza por
una degeneración progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia ne-
gra20 que origina la aparición de los signos y síntomas característicos de la en-
fermedad. A pesar del tratamiento farmacológico, la evolución de la enfermedad
conlleva complicaciones motoras y psiquiátricas que disminuyen la calidad de
vida de los pacientes y dificultan su manejo clínico. La utilización de células
con capacidad de sintetizar y liberar dopamina y restablecer los circuitos neuro-
nales dañados se perfila como nuevas expectativas en el tratamiento de la EP21.
En la EP se han utilizado células de origen fetal en ensayos clínicos en humanos
con resultados cuando menos controvertidos22,23. Estudios in vitro e in vivo han
demostrado que tanto las células madre embrionarias como las adultas (células
madre de médula ósea, células madre neurales) son capaces de diferenciarse a
neuronas dopaminérgicas. Sin embargo, no está claro hasta que punto dichas cé-
lulas son capaces de restablecer los circuitos neuronales destruidos en la EP y,
por tanto, eliminar los síntomas de la enfermedad.
Las lesiones medulares, principalmente secundarias a traumatismos, son
una de las causas más frecuentes de patología neurológica en edades jóvenes.
70 No existe un tratamiento curativo para esta enfermedad incapacitante, por lo
que la posibilidad de utilizar células madre para restablecer las conexiones axo-
nales aparece como una estrategia especialmente atractiva. Estudios recientes

sugieren que las células madre embrionarias poseen la capacidad de diferen-
ciarse a neuronas motoras y facilitar la recuperación motora en animales con
lesiones espinales24,25. Sin embargo, parece que el mecanismo por el cual di-
chas células contribuyen a restablecer las neuronas motoras estaría relacionado
con la liberación de factores de crecimiento, que contribuirían al recrecimiento
de los axones destruidos. Otros tipos celulares, como las células de la glía en-
volvente o las células mesenquimales (o estromales) de la médula ósea también
han demostrado su capacidad para favorecer el recrecimiento de los axones tal
como se ha demostrado en modelos animales26-28.
La esclerosis múltiple es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada
por la degeneración de las células productoras de mielina (oligodendrocitos) y
que se manifiesta por una afectación tanto motora como sensitiva como conse-
cuencia de la desmielinización de los axones. La posibilidad de favorecer la
formación de mielina mediante la utilización de células madre capaces de dife-
renciarse a oligodendrocitos ha sido explorada en modelos animales. Un estu-
dio reciente ha podido demostrar en un modelo de esclerosis múltiple en ratón
(más concretamente de encefalitis autoinmune experimental), que la inyección
de neuroesferas (células madre neurales) tanto de forma intravenosa como in-
tratecal promueve la remielinización multifocal. Indudablemente, estos resulta-
dos están muy lejos de justificar experimentos en pacientes, en una enferme-
dad, que aunque incapacitante, tiene una supervivencia prolongada29.
Por la gran incidencia y el elevado coste económico y humano que gene-
ran, los accidentes cerebrovasculares son uno de los objetivos más atractivos
para la terapia celular. Las evidencias recientes que indican la presencia de un
proceso de neurogénesis tras producirse una isquemia cerebral han estimulado
el interés por utilizar células madre para suplementar la regeneración autóloga
que se produce espontáneamente30,31. El beneficio de la terapia celular con cé-
lulas madres podría deberse al aporte exógeno de células con capacidad de
neurogénesis o de angiogénesis, o debido a la modulación del microambiente,
estimulando la supervivencia y diferenciación de las células residentes en el te-
jido dañado. El trasplante de células madre neurales en modelos de rata ha de-
mostrado ciertos beneficios y de hecho se han realizado pequeños estudios en
humanos utilizando neuronas obtenidas a partir de una línea celular de terato-
carcinoma32-34. Estudios realizados en animales sugieren que las células de mé-
71
dula ósea son reclutadas a las zonas de infarto cerebral y que contribuyen a la
mejoría funcional cuando son inyectadas focalmente e incluso intravenosamen-

te. La inyección de células se asocia con la formación de nuevos vasos, libera-
ción de factores tróficos así como con la expresión de marcadores neurales por
parte de las células implantadas.
No son estas las únicas enfermedades neurológicas susceptibles de benefi-
ciarse de la terapia celular con células madre, pero si las más frecuentes o las
que representan un paradigma, como es el caso de la enfermedad de Parkinson.
Terapia celular en enfermedades cardiovasculares
La cardiopatía isquémica es una de las causas más importantes de mortalidad

y morbilidad en el mundo occidental y un problema de salud pública. Dentro de
ésta, el infarto de miocardio tiene una especial trascendencia ya que el músculo
cardíaco posee una limitada capacidad de regenerarse, por lo que la necrosis de
una región lleva a la formación de una cicatriz fibrosa. Dependiendo del área a la
que afecte esta cicatriz, y debido a los mecanismos que condicionan el remodela-
do ventricular, el infarto puede llevar a una disminución progresiva e irreversible
de la función cardiaca, que conduce al síndrome de la insuficiencia cardíaca (IC).
La prevalencia de la IC en la población general en EEUU o el Reino Unido es del
orden del 1% y si nos fijamos en los mayores de 75 años oscila entre el 5 y
10%35. En los últimos años se han desarrollado nuevos tratamientos para la fase
aguda del infarto de miocardio (fibrinolisis, angioplastia primaria) que han tenido
un gran impacto en el pronóstico de estos pacientes pero que, desgraciadamente,
no han conseguido detener la evolución de la enfermedad que prosigue hasta el
desarrollo de la IC terminal. Para su tratamiento el único recurso real del que dis-
ponemos en la práctica clínica es el trasplante cardiaco, cuyas limitaciones más
importantes son la desproporción entre el número de donantes y receptores poten-
ciales, así como la necesidad de tratamiento inmunosupresor de por vida.
La posibilidad de utilizar células madre para regenerar el músculo cardía-
co destruido ha abierto enormes esperanzas para un número muy importante de
pacientes. Es probablemente en este campo donde la experiencia clínica es ma-
yor, habiéndose publicado en la actualidad más de 20 ensayos clínicos de tera-
pia celular en pacientes con infarto de miocardio. Por limitaciones de espacio
nos limitaremos a detallar los tipos de células empleadas y algunos aspectos
72 concretos de los resultados obtenidos (se han publicado excelentes revisiones
recientes en este sentido)36-40.
Diversos estudios, inicialmente en modelos experimentales y posterior-

mente en humanos, han utilizado las células madre del músculo para regenerar
el músculo cardíaco en pacientes con infarto de miocardio (mioblastos esquelé-
ticos)41. La plasticidad de las células de músculo esquelético junto con su capa-
cidad de responder a estímulos eléctricos sugieren la posibilidad de que células
musculares individuales (mioblastos) puedan ser convertidos en fibras muscula-
res capaces de producir trabajo cardíaco (cardiomioplastia celular)42. Los estu-
dios iniciales con mioblastos obtenidos de músculo esquelético han permitido
determinar que dichas células son capaces de injertar en el corazón de animales
de experimentación y contribuir a mejorar la función contractil del corazón 43
constituyendo la base de la aplicación de esta técnica en pacientes con infarto
de miocardio.
El grupo de Menasche ha sido pionero en la utilización de mioblastos es-
queléticos, realizando el primer implante de mioblastos autólogos en un pa-
cientes con un IM en junio del 200044. La estrategia diseñada por este grupo, y
posteriormente utilizada por otros grupos, consiste en la obtención de una biop-
sia muscular del propio paciente entre las 2-3 semanas previas a la cirugía de
revascularización en pacientes con IM antiguo. Durante la cirugía se procede al
implante por inyección intramiocárdica de las células cultivadas in vitro en la
región peri-infarto. Los estudios realizados por el grupo de Menasche y por
nuestro grupo han permitido demostrar la seguridad del procedimiento y su efi-
cacia45,46. Otros grupos, de forma muy reciente, han utilizado una vía de admi-
nistración percutanea, evitando por tanto la necesidad de la cirugía47. Tanto los
estudios en modelos experimentales como los estudios clínicos indican la capa-
cidad de los mioblastos para implantarse y diferenciarse a células músculares
esqueléticas, Sin embargo, no se ha podido demostrar que las células origina-
das a partir de los mioblastos sean capaces de trasmitir las señales electromecá-
nicas derivadas de las células musculares cardiacas o de transdiferenciarse a
células musculares cardíacas.
Estudios recientes apoyan la existencia de diferentes poblaciones celulares
en la médula ósea (MO) con capacidad de diferenciarse a fibras musculares
cardíacas, así como a células endoteliales, contribuyendo a la angiogénesis o
vasculogénesis48-53. En la mayoría de estos estudios los investigadores han uti-
lizado poblaciones celulares heterogéneas, lo que limita de forma importante
las conclusiones, ya que no es posible determinar cuáles son exactamente las 73
células responsables del beneficio terapéutico. Frente a estudios en los que se
han utilizado células mononucleadas de MO48, el grupo de Anversa y Orlic ha

utilizado poblaciones seleccionadas de células madre hematopoyéticas de MO
(Lin- Kit+) demostrando la capacidad de dicha células de injertarse, diferen-
ciarse a células musculares cardíacas y endoteliales y contribuir a la mejoría de
la función cardíaca.
Además de las células madre hematopoyéticas, en la médula ósea existen
progenitores y células madre angioblásticas, identificables por la presencia de
una serie de marcadores y antígenos celulares como CD34, AC133 o el recep-
tor de VEGR tipo 2, expresados a su vez en células madre hematopoyéticas53-
57. Estudios realizados en modelos animales de isquemia periférica e IM indi-
can que en la MO existen células madre endoteliales con capacidad de
contribuir a la neo-angiogénesis, favoreciendo la regeneración miocárdica49, 53,
58, 59. Estas células madre endoteliales pueden ser movilizadas a sangre perifé-
rica y contribuir también a la angiogénesis en extremidades isquémicas59.
Las células madre mesenquimales (MSC) son capaces de diferenciarse a
tejidos mesodérmicos como osteoblastos, condrocitos, adipocitos o músculo es-
quelético60 pero, a su vez, estudios recientes indican que las MSC son capaces
de diferenciarse tanto in vitro como in vivo a cardiomiocitos48, 61. In vitro, el
cultivo de MSC en presencia del agente desmetilante 5-azacitidina induce dife-
renciación hacia células con características fenotípicas y electrofisiológicas de
músculo cardíaco62. Utilizando modelos animales de IM, varios grupos han de-
mostrado que las células madre mesenquimales inyectadas en la cicatriz mio-
cárdica no sólo son capaces de injertarse, sino que adquieren características de
cardiomiocitos y, lo que es más importante, contribuyen a mejorar la función
cardíaca48, 63.
A pesar del número de incógnitas existentes, la acumulación de resultados
derivados de los estudios preclínicos en los últimos 5 años ha impulsado el de-
sarrollo de los primeros ensayos clínicos de factibilidad y seguridad de regene-
ración cardíaca con células madre. Tales ensayos hasta el momento no han es-
tado desprovistos de cierto grado de controversia, derivada de la opinión de
distintos investigadores cuyo argumento es la falta de suficientes evidencias
que apoyen el inicio de la investigación clínica. No vamos a detenernos en ar-
gumentar las distintas posturas, sino en poner en perspectiva los esfuerzos clí-
nicos realizados. Hasta el momento se han publicado al menos 20 estudios clí-
74 nicos en los que se han utilizado las vías percutánea, intracavitaria o
intramiocárdica, se han implantado células mononucleadas de médula ósea, cé-
lulas enriquecidas en progenitores hematopoyéticos o endoteliales o mioblastos

y los resultados se han monitorizado mediante técnicas de imagen y función
como resonancia, ecocardiografia o tomografía con positrones. Algunos estu-
dios han utilizado pacientes controles con los que comparar los resultados entre
los pacientes que han recibido células y los que no, pero en cualquier caso to-
dos los pacientes han recibido además de las células tratamientos adicionales.
La acumulación de estos resultados apoya la continuidad de los estudios en
marcha y el desarrollo de nuevos ensayos clínicos.
Terapia celular en Oftalmología
La visión, junto con los otros sentidos, provee la relación con el mundo
exterior, y es de gran valor para la supervivencia de muchas especies animales
y tiene un gran valor para los hombres. A pesar de su importancia, sólo en al-
gunas especies de anfibios se conserva una capacidad de regeneración impor-
tante de los tejidos del ojo. Es, por tanto, de gran valor conocer en profundidad
los distintos tipos de células madre del ojo y sus mecanismos de renovación y
regeneración, para intentar terapias capaces de recuperar los distintos tejidos
oculares que se pueden dañar. Las estructuras que tienen más interés desde el
punto de vista de la Medicina Regenerativa son el epitelio corneal, el epitelio
conjuntival y la retina.
La fuente de células del epitelio corneal son las células madre que se en-
cuentran en la región del limbo corneal. Estas células, que se encuentran en la
zona de transición entre la córnea y la esclera, tienen todas las características
de las células madre, ya que poseen una gran capacidad de renovación, que se
mantiene a lo largo de la vida y son capaces de originar células hijas que pue-
den sufrir un proceso de diferenciación terminal a células especializadas (64).
Sin embargo, no se ha podido demostrar que estas células sean pluripotentes y
parece que sólo dan lugar a células del epitelio corneal y conjuntival. Actual-
mente no existe un marcador biológico definitivo de las células madre del lim-
bo corneal, aunque se han propuesto varios, como la alfa-enolasa, y más re-
cientemente el factor de transcripción p63, aunque ciertamente estos antígenos
pueden aparecer en otras células65.
En condiciones fisiológicas, las células madre del limbo corneal son capa-
ces de suplir la necesidad de renovación de la córnea. Sin embargo, en algunas
75
situaciones patológicas, como traumatismos, quemaduras, sustancias químicas,
síndrome de Stevens Johnson o penfigoide ocular, la capacidad de regeneración

de las células limbocorneales se ve desbordada (o se produce una disminución
o ausencia de éstas) y se origina un daño corneal permanente66. Aunque el tras-
plante de córnea es una opción, no es eficaz en los casos donde es necesario
restaurar el epitelio corneal. Kenyon y Tseng en 1989 fueron los primeros en
llevar a cabo un autotrasplante de limbo conjuntival67. Posteriormente, tras el
conocimiento de las células madre corneales, Kinoshita modificó la técnica pa-
ra transplantar células madre del limbo corneal en conejos.
Actualmente el trasplante de limbo corneal es una práctica reconocida,
usándose células del ojo contralateral cuando el daño es en un solo ojo, y célu-
las de un donante cuando el daño es bilateral. Se pueden usar células histocom-
patibles de un donante vivo, o células no compatibles de donantes cadáver. La
posibilidad de expandir ex vivo estas células puede reducir el riesgo de defi-
ciencia de células del limbo del ojo sano o del donante68. La combinación de
células del limbo con membrana amniótica se usa con éxito para promover una
rápida reepitelización de la córnea. En españa al menos 2 grupos de investiga-
ción (Vall d'Hebron y Clínica Universitaria) han implantado células madre lim-
bocorneales con éxito en pacientes con insuficiencia limbocorneal completa,
resultando en la re-epitelización de la cornea con mejoría de la agudeza visual
de los pacientes.
La retina neural y el epitelio pigmentario de la retina se desarrollan duran-
te el periodo postnatal temprano, y no hay evidencia de regeneración en la
edad adulta. Ha sido ampliamente documentada la presencia de células madre
en la retina de peces y anfibios. Sin embargo, hasta el año 2000 no se habían
identificado células progenitoras de la retina en mamíferos. Estas células se en-
cuentran en muy baja frecuencia en la zona ciliar marginal y tienen muchas
propiedades asociadas con las células madre: son capaces de proliferar y expre-
san el marcador neuroectodérmico nestina, son multipotentes y pueden autorre-
novarse. La identificación de células progenitoras de la retina abre la posibili-
dad de su uso para tratamiento en degeneraciones retinianas como la retinitis
pigmentosa, el glaucoma y la degeneración macular. El éxito del uso de células
madre retinianas para la regeneración de la retina depende de la posibilidad de
restaurar los complejos circuitos establecidos en la retina, ya que aunque el en-
tendimiento actual de las conexiones dentro de la retina es muy importante, se
76 conoce menos como se controla el proceso que lleva a estas conexiones entre
las células.
Además, se están llevando a cabo estudios experimentales con otros tipos

de células madre, como células madre neurales, células madre embrionarias,
células madre derivadas de la médula ósea, etc., que tratan de confirmar el po-
tencial del trasplante de células madre en este contexto y contribuyen al cono-
cimiento de los mecanismos de diferenciación y de integración de las células
transplantadas en la retina, que conduzca a un adecuado procesamiento visual.
Terapia celular en enfermedades musculares
El músculo ha sido reconocido recientemente como otra importante fuente

de células madre adultas. Las células progenitoras musculares más importantes
son las células satélite, que no sólo contribuyen a la regeneración de miofibras,
sino que se han demostrado capaces de diferenciarse en otras líneas celulares
como osteoblastos, condrocitos y adipocitos. Si embargo, además de las células
satélite, existen otras poblaciones de células madre en el músculo con un ma-
yor potencial de diferenciación. El origen de estas células, bien existentes en el
músculo69 o procedentes de otros órganos como la médula ósea70, se desconoce
con precisión, pero en cualquier caso estas células serían las progenitoras de
las propias células satélite.
La mayoría de las lesiones musculares son reparadas espontáneamente,
sin que quede deterioro funcional, pero en algunas circunstancias, debido a la
importancia de la herida, ésta no cura completamente y se forma tejido cicatri-
cial que impide la recuperación funcional completa. En estos casos, la cura-
ción de la lesión podría ser mejorada aumentando la regeneración de fibras
musculares e inhibiendo la fibrosis. El trasplante de células progenitoras mus-
culares podría curar esas importantes lesiones. Muchos de los esfuerzos de los
investigadores que trabajan en patología muscular se centran en determinar la
forma de corregir miopatías congénitas tales como la distrofia muscular de
Duchenne, enfermedad caracterizada por la ausencia de expresión de distrofi-
na, una proteína de membrana imprescindible para mantener la integridad es-
tructural de las miofibras. A lo largo de la vida del enfermo se produce una
destrucción crónica del tejido muscular y aunque, inicialmente, las células sa-
télites son capaces de regenerar el músculo, progresivamente van agotando su
capacidad de proliferar. El objetivo del tratamiento sería conseguir células
musculares con genoma normal capaces de formar miofibras que se injerten y
77
regeneren el músculo atrofiado.
Se han utilizado modelos experimentales de enfermedad de Duchenne,

más concretamente en ratones mdx1 (ratones transgénicos deficientes en dis-
trofina) para determinar la capacidad de distintos tipos de células madre de
contribuir a regenerar el músculo esquelético. De forma análoga a la regene-
ración cardíaca, los primeros estudios en modelos de distrofia muscular se
realizaron con mioblastos esqueléticos, es decir, células progenitoras muscu-
lares. Aunque los resultados iniciales en los año 90 no fueron positivos, per-
mitieron determinar una serie de aspectos como la importancia de la inmuno-
supresión y la forma de administración de células que posteriormente han
sido de gran utilidad a la hora de diseñar estudios nuevos71. De forma más
reciente, distintos grupos han utilizado otras fuentes de células madre con la
esperanza de poder utilizar una vía sistémica de administración 72, 73. En estos
estudios se ha podido demostrar que utilizando células obtenidas de médula
ósea de ratones, un pequeño número de células contribuyen a formar fibras
musculares con expresión de distrofina. A pesar de intentos posteriores, el
grado de contribución de las células de médula ósea que se ha observado en
los distintos estudios hasta el día de hoy es muy escaso (menor del 1%). Una
de las principales limitaciones para el éxito de la terapia celular en pacientes
con distrofias musculares es la escasa supervivencia de las células una vez
implantadas, a pesar de que el implante se realice directamente en el múscu-
lo74, asi como el hecho de que el tratamiento se tendría que realizar entre un
donante y un receptor no idénticos y, por tanto, supeditado a problemas de
rechazo inmunológico.
Terapia celular en Traumatología
El organismo tiene una importante capacidad de reconstruir los huesos,

cartílagos y tendones dañados, gracias a la capacidad regenerativa de las célu-
las progenitoras presentes en las estructuras lesionadas. Por ahora estamos lejos
de conocer el origen y características fenotípicas de estas células progenitoras y
los factores que gobiernan la formación y remodelación de los huesos. A pesar
de este desconocimiento, ha sido posible la utilización de células maduras co-
mo forma de contribuir a la regeneración de tejidos óseos y cartilaginosos y,
concretamente, la utilización de células de cartílago cultivadas es un ejemplo
78 de cómo el autotrasplante de células maduras puede ser un tratamiento eficaz
para la reparación de la superficie articular75.
Más atractiva resulta la posibilidad de utilizar células madre con capacidad

de diferenciarse hacia tejidos de estirpe mesenquimal, como el hueso o el cartí-
lago. Las células madre mesenquimales (MSC) se pueden obtener a partir de
médula ósea, pero también de grasa e incluso otros tejidos. Son capaces, in vi-
tro, de autorenovarse y proliferar extensamente, sin perder su capacidad de di-
ferenciarse hacia osteoblasto, condrocitos, adipocitos o incluso músculo esque-
lético según las condiciones en las que se cultivan. Estas cualidades han
permitido su utilización para la reparación de lesiones óseas extensas, normal-
mente utilizando algún tipo de soporte en la colocación de las células. Igual-
mente, también se han utilizado para tratar defectos cartilaginosos y lesiones
traumáticas, pudiendo sustituir a los injertos de condrocitos, con la ventaja de
su mayor capacidad proliferativa y de supervivencia, al no tratarse de células
maduras sino de progenitoras.
También se han utilizado células mesenquimales en el tratamiento de ni-
ños con osteogénesis imperfecta76. En este estudio, los niños recibieron trata-
miento mediante trasplante alogénico, pudiendo demostrarse a los meses del
trasplante un mejoría muy significativa en la calidad y cantidad de tejido óseo
formado y demostrando la capacidad de las células mesenquimales injertadas
de generar osteoblastos y sintetizar nueva matriz ósea.
Terapia celular en enfermedades hepáticas
Un número importante de enfermos hepáticos puede curarse gracias al

trasplante hepático, que restituye un órgano enfermo por un órgano sano. De
igual forma que en otros tipos de trasplantes de órganos, las dificultades técni-
cas junto con la escasez de órganos hacen que el número de pacientes que se
benefician de esta terapéutica sea mucho menor que el número de potenciales
candidatos. La posibilidad de utilizar células madre de distintos orígenes, o in-
cluso hepatocitos maduros modificados genéticamente, aparece como una alter-
nativa de gran interés. Vaya por delante que no existen en la actualidad estu-
dios clínicos de regeneración hepática con células madre y tan sólo se han
realizado algunos estudios clínicos utilizando el trasplante de hepatocitos con
escaso éxito. Sin embargo, existen estudios experimentales que sugieren la po-
sibilidad de regenerar tejido hepático a partir de células madre.
Las células madre embrionarias tienen una indudable capacidad de dife-
79
renciarse en hepatocitos maduros in vitro; sin embargo, existen muy escasos
estudios in vivo que hayan podido demostrar la eficacia de las células embrio-
narias en la regeneración hepática, existiendo además el problema de la genera-
ción de tumores a partir de dichas células embrionarias77.
La posibilidad de regenerar tejido hepático con células madre hematopoyéti-
cas se describió por primera vez por el grupo de Petersen78 en el que observaron
la contribución de células de médula ósea a la regeneración del hígado a través
de la diferenciación hacia células ovales. Utilizando un modelo de ratón transgé-
nico análogo a la tirosinemia humana tipo I, Lagasse demostró la capacidad de
las células madre hematopoyéticas de rescatar animales con dicha enfermedad,
con la consiguiente implicación clínica79. Aunque como ya hemos comentado no
existen estudios clínicos, sí que existen observaciones en pacientes sometidos a
trasplante de médula ósea en los que se ha podido demostrar que células deriva-
das del donante son capaces de adquirir características de células hepáticas, apo-
yando en humanos las observaciones de Lagasse y Petersen. La principal limita-
ción de estos estudios es que datos posteriores, obtenidos por diversos grupos de
investigación, sugieren que la mayor parte de los fenómenos de regeneración he-
pática, observados a partir de células madre hematopoyéticas, se deben realmente
a la capacidad de fusión de las células trasplantadas con los hepatocitos existen-
tes en el animal, y por tanto no a una auténtica transdiferenciación80. Aunque el
mecanismo que contribuye a la regeneración de los hepatocitos es de indudable
interés desde el punto de vista biológico, el hecho de que se trate de fusión celu-
lar o de auténtica transdiferenciación no disminuye su interés desde el punto de
vista clínico. Es decir, incluso en el caso de que las observaciones experimentales
de regeneración hepática se debieran mayoritariamente a fusión celular, sería po-
sible que resultaran clínicamente beneficiosas en pacientes.
La existencia de un compartimento hepático de células madre ya se sugi-
rió hace mas de 40 años81. Las células ovales fueron las primeras candidatas a
células madre hepáticas. Localizadas en los canales de Hering, son células ma-
dre multipotenciales capaces de diferenciarse a hepatocitos así como a epitelio
ductal, y poseen algunos antígenos comunes con células de médula ósea. Sin
duda esta población celular tiene cierta capacidad de regeneración hepática, pe-
ro a día de hoy permanece sin definir si realmente su origen está en el hígado
o, por el contrario, derivan de células de la médula ósea.
Estudios recientemente publicados sugieren que una población de células ma-
80 dre bien caracterizada, como las células madre mesenquimales, pueden contribuir a
la regeneración hepática. Como hemos mencionado anteriormente, la principal fuen-
te de células madre mesenquimales es la médula ósea, si bien es posible derivar di-

chas células a partir de otros tejidos, como la grasa. Son células no hematopoyéticas
de origen mesodérmico en las que, al menos in vitro, se ha podido demostrar su ca-
pacidad de diferenciarse a hepatocitos maduros y funcionales(82). El potencial in vivo
de esta población de células madre no esta definido en la actualidad.
CONCLUSIONES
A lo largo de las paginas anteriores hemos tratado de presentar una pers-

pectiva general, quizá un poco superficial, de lo que la terapia celular y las cé-
lulas madre podrían representar en el futuro. No tenemos ninguna duda de que
las posibilidades son enormes, pero sin embargo es muy importante que sea-
mos conscientes de que estamos todavía muy lejos de alcanzar el objetivo de
utilizar clínicamente esta nueva herramienta. Este es el mensaje más importan-
te que queremos trasmitir: a pesar de las enormes expectativas que existen para
pacientes con enfermedades incurables, es imprescindible eludir el optimismo
exagerado y continuar desarrollando una investigación de calidad científica que
nos permita alcanzar nuestros objetivos.
No sabemos si la terapia celular llegará a curar la diabetes o la enferme-
dad de Parkinson, pero si lo hace seguro que no será en los próximos 5 años,
ni con células madre adultas ni con células madre embrionarias. Los obstáculos
existentes son enormes, y es responsabilidad de los médicos e investigadores
no manipular ni trasmitir esperanzas erróneas e infundadas a los pacientes, que
a la larga se volverán contra nosotros.
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Avances en terapia regenerativa
AVANCES EN TERAPIA REGENERATIVA

María Dolores Herreros Marcos, Isabel Pascual Migueláñez, Jacobo Trébol López,
Damián García Olmo
Cátedra UAM-CELLERIX de Terapia Celular y Medicina Regenerativa
Unidad de Terapia Celular del Hospital Universitario La Paz de Madrid
El término de célula madre se ha hecho tan popular dentro y

fuera del foro científico que, en ocasiones, puede parecer
que pierde credibilidad. Por esto es tan importante respetar
las normas del rigor científico, por un lado, y filtrar la
información que nos llega, por otro, de manera que nuestra
investigación parta de una base completamente revisada.
En este artículo se ha realizado una actualización de la
literatura con dos objetivos: conocer cada uno de los tipos
de células madre existentes y las ventajas e inconvenientes
que presentan; saber cuál es la aplicación clínica en
humanos que tienen este tipo de células, basándonos en la
revisión de los ensayos clínicos en fase I y II publicados en
la literatura.
INTRODUCCIÓN
El término célula madre o célula troncal (stem cell) se utiliza para definir una
célula indiferenciada con capacidad de autorregeneración que, a su vez, puede dar
lugar a diferentes líneas de células especializadas. Es decir, son células con capa-
cidad de división asimétrica (Fig. 1). Se describieron inicialmente en el embrión y
son el origen de todas las líneas celulares somáticas y germinales que conforma-
rán el nuevo organismo (células madre embrionarias totipotenciales); desde el año
2001 se están describiendo células con características semejantes en diferentes te-
jidos del organismo adulto (células madre adultas) (Silvester et al 2004).
Se conoce como terapia celular al método que intenta curar enfermedades 89
con el uso de células vivas. El concepto de Medicina Regenerativa sugiere la
posibilidad de obtener
Autorrenovación en el laboratorio, a
partir de las células
madre, órganos con
todas sus funciones.
Sin embargo, existen
todavía barreras im-
portantes en este cam-
Célula madre
po; algunas de ellas
son puramente técni-
cas o de laboratorio
(desarrollo de mejores
Célula diferenciada procedimientos de se-
lección y cultivo de
Figura 1. Representación
células) y otras son las barreras que podríamos llamar fisiopatoló-
esquemática del concepto
de reproducción
gicas o médicas (como la posibilidad de inmunotolerancia de las
asimétrica que caracteriza células. Salvar este problema de inmunotolerancia supondría poder
a las células madre. realizar trasplantes celulares alogénicos sin necesidad de inmuno-
supresión).
En este artículo se intentará contestar a dos preguntas que resultan funda-
mentales para evaluar en qué momento se encuentra actualmente la terapia re-
generativa:
–¿Qué tipo de células madre son mejores para el uso terapéutico en humanos?
–¿Cuáles son los últimos avances en terapia regenerativa en humanos?
¿QUÉ TIPO DE CÉLULAS MADRE SON MEJORES PARA EL USO

TERAPÉUTICO EN HUMANOS?
Las células madre embrionarias se obtienen a partir de un blastocisto. Una

vez aisladas de la masa celular interna del embrión en este estadio pueden
mantenerse en cultivo de forma indiferenciada porque se dividen indefinida-
mente. Teóricamente podrían constituir una fuente de progenitores de células
de las tres capas embrionarias: endodermo, ectodermo y mesodermo (células
90 pluripotenciales). Sin embargo, no pueden ser usadas en clínica al menos por
cuatro graves problemas: son cancerígenas, generan problemas de histocompa-
tibilidad, requieren un gasto imposible de asumir para las patologías que se

pretenden tratar y plantean problemas éticos de gran complejidad.
Las células madre adultas se encuentran en tejidos órgano-específicos des-
pués del nacimiento. Al principio se pensó que las células progenitoras existen-
tes en los tejidos adultos estaban predeterminadas para generar exclusivamente
un tipo de célula especializada de ese tejido. Por ello se las llamó células mul-
tipotenciales. Así, por ejemplo, las células progenitoras de las criptas intestina-
les solo podrían formar células del epitelio intestinal. Sin embargo, en sucesi-
vos experimentos se ha comprobado que hay células madre en tejidos adultos
con capacidad de transdiferenciación, es decir, que son capaces de dar lugar a
múltiples líneas celulares de las tres capas embrionarias. De esta manera, estas
células podrían ser consideradas verdaderas células pluripotenciales. Un buen
ejemplo de ello es que a partir de células madre de la médula ósea se han obte-
nido líneas celulares como condrocitos, miocitos o neuronas (Conrad et al.
2005).
El uso de células autólogas (del mismo sujeto) o alogénicas (de la misma
especie) obtenidas de sujetos adultos parece suponer un camino más sencillo y
seguro para la terapia celular. Por ello hay que señalar que, hoy por hoy, el uso
de las células madre de origen embrionario está alejado de la clínica humana,
por lo que la única fuente celular en la Medicina Regenerativa actual son los
tejidos del propio ser humano adulto. Actualmente hay cinco fuentes de células
madre de uso clínico: la médula ósea, la sangre periférica, el cordón umbilical,
la biopsia muscular y la grasa (lipoaspirados). La siguiente cuestión es averi-
guar cuál es el mejor tejido donante.
La capacidad de algunas células del estroma de la médula ósea para dife-
renciarse también en otras líneas celulares no hematopoyéticas está hoy bien
documentada. Ha sido demostrado por varios autores (Pittenger et al 1999) que
estas células pueden diferenciarse in vitro evolucionando a osteoblastos, con-
drocitos o adipocitos en función de los factores de crecimiento que se utilicen
para estimularlas. También es interesante la posibilidad de que estas células,
tras entrar en la circulación, puedan migrar a otros lugares del cuerpo donde
pueden diferenciarse y reparar tejido dañado. Puede que, en el futuro, el trata-
miento consista únicamente en usar citocinas para incrementar la salida a la
circulación de las células madre de la médula ósea, tal y como han mostrado
resultados prometedores en modelos murinos (Orlic et al. 2003). Por otro lado,
91
no debe olvidarse que el uso de citocinas como factores estimulantes de colo-
nias se ha visto asociado a efectos secundarios que aún hoy son difíciles de
predecir. El problema es que para obtener poblaciones celulares de la médula
ósea es necesario realizar varias punciones bajo anestesia, que comportan mo-
lestias y riesgos.
Desde 1980 ha sido posible movilizar estas células a la sangre periférica
donde pueden ser recogidas por aféresis, un procedimiento que es más prácti-
co, menos doloroso y asociado a menor riesgo que las punciones (Lewis et al.
2005). Por otro lado, se ha comunicado que las células madre procedentes de
sangre periférica desarrollan el injerto de neutrófilos y plaquetas más rápida-
mente reduciendo el riesgo de infección o hemorragia en el tratamiento de la
enfermedad hemato-oncológica.
El transplante de células de cordón umbilical en adultos presentan las si-
guientes ventajas respecto a las derivadas de médula ósea (Chao et al. 2004): 1.
Fácil disponibilidad (se pueden tener en depósito perfectamente testadas y con
la tipificación de HLA para su uso inmediato); 2. No existe riesgo para madres
y donantes; 3. Posibilidad escasa de transmitir infecciones, particularmente ci-
tomegalovirus; 4. Pocas posibilidades de desarrollar enfermedad de injerto con-
tra huésped; 5. Criterios menos estrictos para el cruce de HLA; 6. El donante
no sufre una agresión. Este tratamiento se ha utilizado sobre todo en enferme-
dades hematológicas como leucemia mieloide crónica, leucemia aguda o sín-
dromes mielodisplásicos. El transplante de células madre del cordón umbilical
expandidas ex vivo está todavía en experimentación.
El crecimiento y la regeneración del músculo tras una agresión del mismo
denotan la existencia de células musculares progenitoras en este órgano (Jan-
kowski et al 2004). Se ha defendido la idea de que la miogénesis es atribuible
a precursores musculares circulantes, habiéndose demostrado en algunos traba-
jos que esta labor la realizan células madre dependientes del músculo y tam-
bién de la médula ósea. Esta vía sistémica todavía se encuentra en investiga-
ción, ya que no se ha logrado evitar las pérdidas celulares para conseguir que
las células cumplan su objetivo. En cualquier caso, la biopsia muscular se ha
mostrado como una buena fuente de células madre (Herreros et al 2003).
El tejido adiposo, como la MO, deriva de la hoja embrionaria mesodérmi-
ca y contiene estroma que puede ser aislado fácilmente. Aquí se han identifica-
do células madre denominadas células madre derivadas de lipoaspirado
92 (CMDL) (Zuk et al. 2001 y 2002). El proceso de aislamiento de esta población
de células madre fue descrito por primera vez por Rodbell en 1964. Más tarde
el procedimiento fue
mejorado por varios
grupos de investiga-
ción y, finalmente, las
células fueron caracte-
rizadas como células
madre por el equipo
de Hedrick del "Labo-
ratorio de Bioingenie-
ría y Reparación Rege-
nerativa" del Servicio
de Cirugía de la Uni-
versidad de California
de Los Ángeles (Zuk
et al. 2001).
Figura 2. Células
Estas células, al igual que las células madre mesenquimales de
mesenquimales
la MO, pueden evolucionar hacia líneas osteogénicas, adipogéni- procedentes de
cas, miogénicas y condrogénicas. Lo más sorprendente es que tam- lipoaspirados en cultivo.
bién pueden diferenciarse en células de características neuronales
(Ashjian et al. 2003). Muestran una caracterización muy similar a
las derivadas de MO (CD29, CD44, CD71, CD90, CD13, CD105, SH-3 y
STRO-1) pero también algunos marcadores específicos (CD49d, CD106,
CD54, CD 34) (De Ugarte et al. 2003). No se han observado diferencias sig-
nificativas entre los dos tipos de células respecto a la adherencia estromal, el
crecimiento, la senescencia celular, la capacidad de diferenciarse en diferen-
tes líneas celulares y la eficiencia en la transducción genética (De Ugarte et
al. 2003). El proceso de obtención se inicia con una liposucción al paciente
que se realiza bajo anestesia local o sedación. El lipoaspirado se somete a un
proceso de laboratorio mediante el cual se aíslan las células adecuadas; éstas
se cultivan a 37º C hasta que el crecimiento alcanza la subconfluencia (Fig.
2). En ese momento pueden emplearse terapéuticamente o ser criopresevadas
para su uso posterior. Este método presenta las siguientes ventajas respecto al
necesario para obtener células de médula ósea: 1. Es seguro; 2. La grasa es
un tejido de fácil acceso; 3. Es menos molesto y agresivo que las punciones
medulares; 4. Puede realizarse bajo anestesia local; 5. Las células pueden 93
criopreservarse (Mizuno et al. 2003).
Por todo esto, desde nuestro punto de vista de clínicos, las células madre
derivadas de lipoaspirado superan incluso a las de médula ósea a la hora de
utilizarlas en terapia humana. Como cirujanos, el método de obtención nos
resulta sencillo y cotidiano, pero puede ser igualmente alcanzable para cual-
quier especialista que cuente con un cirujano plástico o general en su centro
de trabajo.
Al revisar la literatura actual sobre las células madre derivadas de lipoas-
pirado, se observa que la mayoría de los trabajos publicados se centran en su
caracterización en el laboratorio o en ensayos realizados en animales. De he-
cho, sólo se ha comunicado un ensayo clínico realizado en humanos (García
Olmo et al. 2005). Esto significa que, a pesar de su manejabilidad y fácil ob-
tención, el clínico todavía no se ha acostumbrado a este tipo de células, posi-
blemente por desconocimiento o rutina.
Ahora bien, este modelo celular se está analizando ampliamente en mode-
los experimentales. Se han comunicado estudios en animales que utilizan
CMDL como vehículo de determinados genes. Dragoo y cols. (Dragoo et al.
2003, 2005) aislaron células madre derivadas de lipoaspirado de la grasa sub-
cutánea y de la almohadilla infrapatelar y las cultivaron en un medio osteogé-
nico. La mitad de estas células fueron transfectadas con un adenovirus con el
cDNA para la proteína morfogenética básica (BMP-2). Las células, inmersas en
una matriz de colágeno I, fueron inyectadas en una pata trasera de ratones in-
munodeficientes; la otra pata fue inyectada con CMDL no modificadas genéti-
camente. Tras 6 semanas se comprobó que en la pata donde se inyectaron las
células transfectadas, el hueso tenía una mineralización adecuada y comenzaba
a establecer la cavidad medular.
Por otro lado, Martinez-Estrada y cols. (Martinez-Estrada et al. 2005) con-
siguieron diferenciar CMDL en EPC (células progenitoras endoteliales postna-
tales) cultivándolas en un medio hematopoyético. El primer marcador que ex-
presaron fue Flk-1, y progresivamente Ve-caderina y factor de Von Willebrand.
Dado que el bajo número de EPC en la circulación limita su uso en Medicina,
las CMDL pueden ser un gran apoyo.
Además, es muy prometedor el efecto anti-inflamatorio que presentan las
CMDL. Se ha comparado (Puissant y cols. 2005) el efecto de las células madre
derivadas de médula ósea con las CMDL. Las CMDL no provocaron in vitro
94 "alorreactividad" frente a linfocitos incompatibles, es más, lograron suprimir la
reacción linfocitaria mixta (MLR) y la proliferación linfocitaria como respuesta
a mitógenos. Cuando las CMDL y los linfocitos fueron separados por una
membrana permeable estos hallazgos no se repitieron, lo que hace pensar que
es necesario el contacto celular para desencadenar esta reacción. Aquí surge
una nueva idea respecto a la posibilidad de utilizar estas células de manera alo-
génica a partir de un banco de donantes.
En esta línea, otro estudio (Aust et al 2004) investigó el rendimiento celu-
lar por milímetro cúbico de lipoaspirado y los marcadores de superficie que de-
terminan su fenotipo. Se recogió el producto de lipoaspirado de 18 donantes
mujeres, registrando su edad e índice de masa corporal (BMI). El rendimiento
celular medio fue de 404.000±206.000 células por milímetro de lipoaspirado,
de manera inversamente proporcional al BMI pero no a la edad. Las CMDL
eran positivas homogéneamente para CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e,
CD59, CD90 y HLA-ABC; y homogéneamente negativas para CD11b, CD45 y
HLA-DR. La ausencia del marcador panhematopoyético CD45 indica que las
células no derivaban de células madre circulantes. El hecho de obtener una po-
blación tan homogénea procedente de múltiples donantes refuerza también la
idea del empleo alogénico en un futuro.
Por último, Morizono y cols. (Morizono et al. 2003) examinaron la infec-
ción de las CMDL con vectores como adenovirus, oncoretrovirus y lentivirus,
demostrando la posibilidad de transfectarlas con lentivirus. Las células mantie-
nen la expresión transgénica tras diferenciarse en líneas adipogénicas y osteo-
génicas. Así, las CMDL y un vector como el lentivirus pueden ser una buena
combinación como vehículo de la terapia génica.
Para utilizar las células en humanos se han desarrollando ensayos de biosegu-
ridad. Para llegar a realizar estudios en humanos las células se han sometido a es-
tudios de caracterización por inmunofluorescencia y de crecimiento. Existe un tra-
bajo en la literatura en el cual se ha comunicado que, tras mantenerlas en cultivos
durante mucho tiempo, las CMDL pueden experimentar una transformación neo-
plásica capaz de desarrollar tumores en el ratón (Rubio et al. 2005). La posibili-
dad de transformación neoplásica de CMDL humanas in vitro se vio en cultivos
en los que se permitió el crecimiento más allá de la subconfluencia, manteniéndo-
los incluso más de dos meses después del aislamiento celular. En estas células se
demostró la transformación neoplásica mediante el estudio del cariotipo, que con-
firmó la existencia de cambios en el DNA. Se observó, además, que eran células
de crecimiento anómalo o no controlado, capaces de desarrollar tumores al inocu-
95
larse en ratones inmunodeprimidos. Por otro lado, de manera paralela, se cultiva-
ron CMDL evitando el crecimiento más allá del 85% de confluencia celular. En
estas células también se estudió el cariotipo y se inocularon después en ratones
deficientes, observándose ausencia de alteraciones en el DNA y de desarrollo de
tumores en los animales. Ésta es la razón por la cual nuestro grupo siempre ha uti-
lizado células del pase 3 o menor, antes de que las células lleguen a la subcon-
fluencia. No hemos observado ningún caso de reacciones de rechazo ni transfor-
mación tumoral. Por otro lado, la terapia con células madre derivadas de
lipoaspirado, que nuestro grupo utiliza en el tratamiento de fístulas en humanos,
se ha demostrado tan segura que ha sido aprobada por la Agencia Europea del
Medicamento (EMEA) para que este "producto" sea considerado un medicamento
huérfano ("orphan drug"). Además, este ensayo clínico está registrado en Clinical-
trials.gov, ID: NCT00115466) para el tratamiento de la fístula perianal compleja.
¿CUÁLES SON LOS ÚLTIMOS AVANCES EN TERAPIA

REGENERATIVA EN HUMANOS?
El uso de células madre como terapia en humanos se está extendiendo rá-

pidamente en distintos campos de la Medicina. Los grupos que investigaban las
enfermedades hematológicas fueron pioneros al iniciar este camino. Actual-
mente, los oncólogos trabajan en íntima colaboración con los hematólogos para
tratar enfermedades proliferativas con stem cells. Se ha comunicado un estudio
en fase I/II sobre el tratamiento del cáncer de ovario (Frickhofen et al. 2006).
Este tipo de tumor es quimiosensible, pero la mayoría de los pacientes mueren
por la progresión del mismo. La quimioterapia cura el 25% de los pacientes,
por ello está justificado el tratamiento con altas dosis. Se incluyeron 48 pacien-
tes con cáncer de ovario intratable realizándose una movilización de células de
sangre periférica con ciclofosfamida y paclitaxel. Posteriormente las pacientes
se sometieron a dos ciclos de altas dosis de quimioterapia con carboplatino/pa-
clitaxel y carboplatino/melfalan/etoposido. A los 8 años la supervivencia libre
de enfermedad fue de 13,3 meses y la supervivencia global de 37 meses.
La imposibilidad de regeneración de los miocardiocitos en la enfermedad
isquémica supone el fallo cardíaco congestivo postinfarto y el deterioro de la
función del ventrículo izquierdo. Tras demostrar que las células madre proce-
96 dentes de la médula ósea y de la sangre periférica son capaces de evolucionar a
miocardiocitos bajo las condiciones adecuadas, se están utilizando como tera-
pia de la cardiopatía isquémica dentro de varios ensayos clínicos (Schachinger

et aml 2006) (Bardoff et al. 2006) (Emanueli et al. 2005) (Thorin-Trescases et
al. 2005). Este tratamiento parece reemplazar a los miocardiocitos, desarrollar
neoangiogénesis y conseguir la remodelación de la cicatriz. También se ha
comparado el efecto de stem cells derivadas de médula ósea frente a las deriva-
das de sangre periférica, asociándose a las primeras una mejoría significativa
de la eyección del ventrículo izquierdo a los tres meses (Assmus et al. 2006).
Las grandes heridas de los quemados se presentan como otro ejemplo de
terapia celular. Gracias a células madre procedentes de la médula ósea se ha
conseguido una recuperación precoz tanto de las áreas quemadas, como de las
zonas donde se extrajeron los autoinjertos libres de piel (Rasulov et al. 2005).
Se ha comunicado el tratamiento satisfactorio de úlceras del limbo ocular
en pacientes diabéticos. Tras realizar una inyección en el limbo ocular de célu-
las madre derivadas de sangre periférica en los pacientes del grupo de trata-
miento se encontró una tasa de cicatrización completa del 77,8% frente a un
38,9% de los pacientes tratados con placebo (Huang et al. 2005).
En casos severos de enfermedades autoinmunes se están utilizando ciclos
de altas dosis de quimioterapia seguidos de transplante de células hematopoyé-
ticas. Los estudios en fase I y II realizados en 473 pacientes mostraron una
mortalidad del 11% debido a una complicación del transplante o a la progre-
sión de la enfermedad. El 71% de los pacientes respondieron a la terapia con
una franca mejoría de la enfermedad (Gratwohl et al. 2005).
Una de las líneas de investigación de nuestro equipo es el tratamiento de
fístulas en humanos con células madre derivadas de lipoaspirado. Hemos desa-
rrollado un estudio en fase I, con el objetivo de demostrar que la terapia es se-
gura y factible, y un estudio en fase II para conocer la eficacia.
Los resultados del estudio en fase I ya han sido comunicados (García-Ol-
mo et al. 2005). Se reclutaron cinco pacientes desde abril del 2002 a noviem-
bre del 2003, tres hombres y dos mujeres. Se realizaron nueve implantes celu-
lares, 4 en fístulas rectovaginales, 4 en fístulas enterocutáneas (tres fístulas en
el mismo paciente) y uno en una fístula perianal supraesfinteriana. El segui-
miento mínimo exigido en el protocolo fue de 8 semanas. Finalmente se inocu-
laron con CMDL pase 3 o menor nueve fístulas de cuatro pacientes. Ocho de
las fístulas fueron consideradas como evaluables y fueron seguidas durante un
mínimo de ocho semanas (Tabla 1). Se logró ausencia de supuración y el cierre 97
del orificio externo con reepitelización a la octava semana en seis fístulas
(75,0%); estos pacien-

tes se consideraron
curados. Las otras dos
fístulas sólo mostra-
ron un cierre parcial
del orificio externo
con disminución del
flujo, según refirieron
los pacientes, pero
con ausencia de reepi-
telización. Estos dos
pacientes fueron con-
siderados no curados
(25,0%).
Actualmente se
han cumplido más de
dos años de segui-
miento en todos estos
pacientes y ninguno
de los considerados
curados ha presentado
una recidiva de la fís-
tula. No existió rela-
ción entre el número
de células inyectadas
y la reepitelización.
No existió relación
entre el sexo y la
edad de los pacientes
y la curación.
Los procedimien-
tos quirúrgicos y de
Figura 3. Procedimiento
para el tratamiento de las
implantación se realizaron de manera habitual y sin dificultades téc-
fístulas en el ensayo nicas añadidas debidas a la inyección celular de las nueve fístulas
98 clínico en fase I. tratadas (Fig. 3). No se observaron efectos adversos en ninguno de
los 9 implantes.
Tabla 1. Resumen de los resultados clínicos el fase I. NE, no evaluable; NI, no implantado
Nº Nº Tipo de Nº Días Nº células
implante paciente fístula pase cultivo (x106) Resultado
1 001 Rectovaginal 1 6 6.1 Curado
2 002 Enterocutanea 1 9 9.0 Curado
3 002 Enterocutanea 1 7 8.0 NA
NI 003 Perineal 1 NE NI NA
4 002 Rectovaginal 2 14 10.0 No curado
6 001 Rectovaginal 1 12 20.0 Curado
7 004 Enterocutanea 2 16 30.0 No Curado
8 005 Perineal 2 31 20.0 Curado
No se han observado efectos adversos a largo plazo ni aparición de tumo-

res u otras enfermedades en los dos años siguientes a la aplicación de las célu-
las (Tabla 1).
Por otro lado, hemos concluido el ensayo clínico en fase II que analiza la
eficacia de la terapia con células madre derivadas de lipoaspirado para el trata-
miento de fístulas perianales complejas, que está pendiente de publicación.
Para concluir, ha quedado claro que el tratamiento con células madre adul-
tas es una de las líneas de investigación más prometedoras actualmente. Lo
más importante es la gran aplicación clínica que posee, que esperamos que siga
desarrollándose a este ritmo casi vertiginoso, aunque siempre dentro de las nor-
mas de buena praxis clínica y siguiendo el máximo rigor científico.
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Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas
NANOBIOTECNOLOGÍA: HERRAMIENTAS
DIAGNÓSTICAS Y TERAPÉUTICAS
Laura M. Lechuga. Grupo de Biosensores. Centro Nacional de Microelectrónica (IMM-CNM). CSIC
La Nanobiotecnología, convergencia entre la Nanotecnología

y la Biotecnología, es la rama de la Nanotecnología que se
perfila como la de mayor impacto en un futuro próximo
debido a sus importantes aplicaciones, especialmente,
diagnósticas y terapéuticas. La detección temprana de
enfermedades, su tratamiento precoz a nivel personalizado
y el posterior seguimiento de su evolución serán posibles en
los próximos años gracias a la aplicación de las herramientas
nanobiotecnológicas que se están actualmente
desarrollando. Los importantes avances en este campo
podrían dar lugar a sistemas de diagnóstico y terapéuticos
de mayor eficacia que los existentes, lo que redundaría en
una mayor calidad de vida para los ciudadanos.
INTRODUCCIÓN: ¿QUE ES LA NANOBIOTECNOLOGÍA?
Desde hace unos años, la Nanotecnología se esta perfilando como un área

emergente en ciencia y tecnología y todo indica que esta disciplina nos conducirá
a una nueva revolución industrial. La Nanotecnología hace referencia a las técni-
cas que permiten manipular la materia a escala atómica y molecular. Nano- signi-
fica la milmillonésima parte de un metro. Lo mas interesante de la Nanotecnolo-
gía no es la posibilidad de trabajar con materiales de reducidas dimensiones, sino
el cambio a menudo radical que sufren las propiedades físicas y químicas de la
materia cuando se trabaja a escala nanométrica: la conductividad eléctrica, el co-
lor, la resistencia, o la elasticidad, entre otras propiedades, se comportan de ma-
nera diferente a como lo hace el material volumétrico (ver Figura 1).
La Nanotecnología tiene gran aplicación en diferentes campos, entre los 103
que destacan los materiales, la electrónica, la Medicina y la energía. Así, ya se
está avanzando en
conseguir materia-
les de mayor dure-
za y resistencia,
ordenadores más
veloces y con ma-
yor capacidad gra-
cias a los micro-
procesadores con
componentes nano-
tecnológicos, diag-
nósticos médicos
más eficaces o
energía abundante
a bajo coste y res-
Figura 1. Comparativa de petuosa con el me-
tamaños entre el mundo dio ambiente. Actualmente ya existen productos “nanotecnológicos”
natural y el mundo artificial en el mercado como cosméticos más eficaces y protectores, raquetas
desarrollado mediante
de tenis más flexibles y resistentes o gafas que no se rayan, por citar
Micro y Nanotecnología.
algunos ejemplos.
La irrupción de la Nanotecnología en la Biotecnología y en la Medicina ha
dado lugar a una nueva disciplina que se denomina Nanobiotecnología y que sin
duda constituirá uno de los pilares básicos de esta nueva revolución industrial.
La Nanobiotecnología se define como la aplicación de herramientas, com-
ponentes y procesos de la Nanotecnología al campo de la salud, lo que fre-
cuentemente se denomina también como Nanomedicina, permitiendo el desa-
rrollo de herramientas para diagnosticar, prevenir y tratar enfermedades cuando
están todavía en estados poco avanzados o en el inicio de su desarrollo. La Na-
nomedicina estudia interacciones a la nanoescala (1 a 100 nm) y para ello utili-
za dispositivos, sistemas y tecnologías que incluyen nanoestructuras capaces de
interactuar a escala molecular y que se interconectan a nivel micro para inte-
raccionar a nivel celular. Uno de los grandes retos en este proceso reside en el
desarrollo de “nanoterapias”, dirigidas específicamente a los tejidos y órganos
enfermos, evitándose dañar a las células sanas circundantes.
104 En nuestro mundo industrializado se está observando un progresivo aumento
de graves enfermedades como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, la
diabetes o las enfermedades neurodegenerativas (Alzheimer y Parkinson), para

las que no existen tratamientos definitivos. Por otra parte, debido a la mayor cali-
dad de vida y al aumento de la esperanza de vida, hay un progresivo envejeci-
miento de la sociedad y una mayor incidencia de enfermedades crónicas, lo que
está significando un considerable aumento del gasto de la sanidad pública.
Es evidente que necesitamos nuevos métodos diagnósticos y terapéuticos
que sean más rápidos, eficaces y específicos que los actuales y que, además,
reduzcan al máximo los costes de los análisis y los servicios. La Nanomedicina
promete resolver algunos de estos grandes retos mediante la capacidad de de-
tectar de forma precoz la presencia de enfermedades (como el cáncer) o la ca-
pacidad de regenerar los órganos y tejidos que estén dañados dentro del orga-
nismo, proporcionado un diagnóstico precoz, una terapia adecuada y un
seguimiento posterior efectivo de la evolución del paciente. En un futuro próxi-
mo se podrá incluso disponer de tratamientos individualizados a distancia en el
propio hogar o lugar de trabajo del paciente.
NANOMEDICINA
La Nanomedicina agrupa tres áreas principales: el nanodiagnóstico, la libera-

ción controlada de fármacos y la medicina regenerativa, tal como se detalla en la
Figura 2. El nanodiagnóstico desarrolla sistemas de análisis y de imagen para de-
tectar una enfermedad o un mal funcionamiento celular en los estadios más tem-
pranos posibles tanto in vivo como in vitro. Los nanosistemas de liberación de fár-
macos transportan los medicamentos sólo a las células o zonas afectadas para
conseguir un tratamiento más efectivo y con menos efectos secundarios
y, además, protegiendo al fármaco de la degradación antes de llegar a Figura 2. Áreas de
su destino. La medicina regenerativa pretende reparar o reemplazar te- investigación en
Nanomedicina.
jidos y órganos dañados aplicando
herramientas nanobiotecnológicas.
A continuación se detalla el
nivel de desarrollo que se ha con-
seguido hasta la fecha principal-
mente en el área de nanodiagnósti-
co, así como las principales lineas
105
de investigación futuras.
Nanodiagnóstico
El objetivo del nanodiagnóstico es identificar la aparición de una enferme-

dad en sus primeros estadios a nivel celular o molecular e idealmente al nivel
de una sola célula, mediante la utilización de nanodispositivos (nanobiosenso-
res, biochips de ADN, laboratorios-en-un-chip, nanopinzas, nanosondas...). De
esta forma se conseguiría una capacidad de respuesta más rápida para comenzar
el tratamiento adecuado de cada enfermedad o bien de reparar o recrecer los te-
jidos y órganos dañados, lo que ofrecería mayores posibilidades de curación.
Los nanosistemas de diagnóstico se pueden aplicar in vitro o in vivo. En
aplicaciones de diagnóstico in vitro, los nanodispositivos son capaces de detec-
tar con gran rapidez, precisión y sensibilidad la presencia de patógenos o de-
fectos en el ADN a partir de volúmenes muy reducidos de muestras de fluidos
corporales o de tejidos. En aplicaciones de diagnóstico in vivo, se pueden desa-
rrollar dispositivos biocompatibles que, por ejemplo, puedan penetrar en el
cuerpo humano para identificar estadios iniciales de una enfermedad, identifi-
car y cuantificar la presencia de un determinado patógeno o de células cancerí-
genas, etc.
La principal área del nanodiagnóstico son los nanobiosensores, dispositi-
vos capaces de detectar en tiempo real y con una alta sensibilidad y selectivi-
dad agentes químicos y biológicos.
Biosensores
Desde que en el año 1962 surgió el primer concepto de biosensor (biosen-

sor de glucosa, Clark, 1962), el campo de investigación sobre biosensores ha
ido creciendo de forma exponencial hasta convertirse en un área fundamental
de trabajo. La masiva introducción en el mercado de los biosensores de gluco-
sa, que son utilizados diariamente por miles de personas en todo el mundo, su-
puso la prueba más concluyente de la utilidad de la tecnología biosensora, al
ayudar a miles de enfermos diabéticos a mantener una mejor calidad de vida.
Un biosensor se puede definir como un dispositivo compuesto por dos
elementos fundamentales: un receptor biológico (por ejemplo proteínas, ADN,
106 células,...) preparado para detectar específicamente una sustancia basado en la
gran especificidad de las interacciones biomoleculares y un transductor o sen-
sor, capaz de interpre-

tar la reacción de reco-
nocimiento biológico
que produce el receptor
y “traducirla” en una
señal cuantificable. En
la Fig. 3 se muestra el
esquema básico de fun-
cionamiento de un bio-
sensor. Figura 3. Esquema del
Los dos constituyentes del biosensor están integrados conjunta- funcionamiento de un
mente y es precisamente esta íntima unión de dos mundos opuestos biosensor.
(el “vivo” y el “inerte”) la que le confiere a los dispositivos biosen-
sores sus especiales características de sensibilidad y selectividad. Es frecuente
confundir el termino “biosensor” con un dispositivo que mide moléculas bioló-
gicas, cuando en realidad el nombre “biosensor” hace referencia a la parte re-
ceptora biológica que lleva incorporada en su interior.
Además de la sensibilidad y selectividad, una de las características funda-
mentales que hace atractivos a los biosensores es la posibilidad de realizar el
análisis de la sustancia a determinar en tiempo real y de forma directa (sin nece-
sidad de marcador) a diferencia de cualquier análisis biológico o clínico que re-
quiere siempre un marcador (ya sea fluorescente o radioactivo). Estas dos carac-
terísticas le confieren a los biosensores la posibilidad de realizar no sólo un
análisis cualitativo (si/no) y cuantitativo, sino también la posibilidad de evaluar
la cinética de la interacción (constante de afinidad, asociación, disociación,...) y,
por tanto, elucidar los mecanismos fundamentales de dicha interacción. Las téc-
nicas de análisis de laboratorio más habituales, ya sea de sustancias químicas o
biológicas, suelen ser laboriosas, consumen mucho tiempo y en la mayoría de la
ocasiones requieren personal especializado para su manejo. Frente a ellas los
biosensores ofrecen la posibilidad de hacer medidas directas, continuas, de for-
ma rápida y con alta sensibilidad. Además, muchos biosensores ofrecen también
las ventajas del pequeño tamaño y la portabilidad, lo que posibilita su utiliza-
ción en cualquier lugar, como el hogar o la consulta del médico. Ello implica
también la necesidad de una cantidad de muestra para hacer el análisis relativa-
mente baja (de micro a nanolitros), lo que es muy importante si se trata de aná- 107
lisis de sangre o de ADN o si la muestra es cara o difícil de conseguir.
Son muchos los dispo-

sitivos biosensores que se
han desarrollado y muy va-
riados los mecanismos físi-
co-químicos de transduc-
ción que se han empleado
para traducir la interacción
biológica de la parte “bio”
en una señal cuantificable y
útil para el usuario. La cla-
Figura 4. Algunos ejemplos
sificación de los biosenso-
de nanobiosensores que se res viene impuesta tanto por la naturaleza de la biocapa receptora ele-
pueden emplear para el gida como por el tipo del transductor empleado. Para construir un
diagnóstico precoz de biosensor se pueden usar diferentes componentes. Como elementos
enfermedades de una biológicos receptores se pueden emplear enzimas, anticuerpos, recepto-
forma selectiva y con un
res proteicos, secuencias de oligonucleótidos, fragmentos subcelulares
alto nivel de sensibilidad.
como mitocondrias, secciones de tejidos animales y vegetales, células
completas, etc. y como transductor dispositivos ópticos, electroquímicos y meca-
no-acústicos, principalmente. La combinación de las diversas capas receptoras con
los diferentes transductores ha dado lugar a una gran variedad de biosensores.
El término “nanobiosensor” designa a aquellos biosensores cuyas propie-
dades vienen moduladas por la escala nanotecnológica con la que están fabrica-
dos. Es de esperar que los nanobiosensores tengan una sensibilidad mucho más
alta que la de los dispositivos biosensores convencionales y además emplean
un menor cantidad de muestra. Por otra parte, podrían ser fácilmente introduci-
dos en el interior del cuerpo humano, por lo que proporcionarían datos mucho
más fiables del estado de salud de un paciente. Dentro de los incipientes desa-
rrollos de nanobiosensores son de destacar los nanobiosensores fotónicos, los
basados en nanopartículas de oro o magnéticas, los nanobiosensores basados en
nanotubos de carbono o los biosensores nanomecánicos, que han surgido como
reemplazo de los biochips de ADN, entre los más importantes (ver Fig. 4).
Biosensores basados en nanopartículas
108 Existen ya numerosos trabajos científicos que han demostrado la posibili-

dad de detectar la aparición de las primeras células cancerosas utilizando dife-
rentes tipos de nanopartículas.

Una de las más utilizadas son
las llamadas puntos cuánticos
(“Quantum Dots”), así denomi-
nadas porque su tamaño nano-
métrico provoca un efecto de
confinamiento cuántico en su
estructura (ver Figura 5). Los
puntos cuánticos están fabrica-
dos de material semiconductor
y contienen sólo unos cientos
de átomos. Cuando son excita-
dos emiten luz en diferentes
longitudes de onda dependiendo de su tamaño, por lo que son extre- Figura 5. Nanopartículas
madamente útiles como marcadores biológicos. Los puntos cuánticos con diferentes propiedades
de emisión según su
más empleados son los de CdSe, ya que son fáciles de fabricar con el
tamaño utilizadas en
tamaño deseado mediante procesos químicos, se pueden producir en
nanodiagnóstico. Puede
gran variedad de colores, tienen una emisión excelente (mejor que los observarse el detalle de
marcadores fluorescentes habitualmente usados en biología), y no se una nanopartícula obtenido
desestabilizan ya que son fotoestables. La emisión de fluorescencia mediante microscopia
de estos puntos cuánticos es tan brillante que incluso es posible ob- electrónica (Foto cortesia
del Prof. L.Liz-Marzán,
servar una célula que contenga una única de estas nanopartículas.
Univ. Vigo).
Hoy en día los puntos cuánticos son comerciales y se ha demostra-
do ampliamente su utilidad para la localización de tumores en los pri-
meros estadios, lo cual significa que se podría proceder a su extirpación inmediata.
Pero los puntos cuánticos no funcionan por sí mismos, es preciso indicar-
les cómo localizar el tumor y para ello hay que recubrir la superficie del punto
cuántico con moléculas biológicas (biorreceptores) con afinidad hacia un com-
puesto específico de la célula cancerosa. Por ejemplo, hay ciertas proteínas o
moléculas que se encuentran en mayor proporción en la superficie de las célu-
las cancerosas (como los receptores de ácido fólico o la hormona luteinizante)
y ésto va asociado con cada tipo de cáncer en particular. Cuando los puntos
cuánticos recubiertos con el biorreceptor se acercan a una muestra que contiene
dicha proteína, ambos se unen. Ahora se puede detectar la interacción ilumi-
nando los nanocristales con luz ultravioleta y observando su emisión caracterís- 109
tica. Hay ya numerosos ejemplos de como los puntos cuánticos localizan célu-
las tumorales, como en el caso

del cáncer de mama y de gan-
glios linfáticos cancerosos. Has-
ta ahora, los experimentos se
han realizado con animales, pe-
ro se preve que una vez autori-
zado por las agencias de salud
correspondientes, estos ensayos
puedan realizarse en seres hu-
manos. La Figura 6 muestra un
ejemplo de tal localización.
Al igual que los puntos
cuánticos, muchos otros tipos de
nanopartículas pueden usarse pa-
ra la localización de tumores, por
ejemplo nanopartículas metálicas
o magnéticas. El paso primordial
es disponer del biorreceptor ade-
cuado a la enfermedad que se
pretende detectar y, sobre todo,
Figura 6. Funcionalización
ser capaces de recubrir adecuadamente estas nanopartículas con dicho
de puntos cuánticos de
receptor que permita la localización de las células tumorales.
CdSe con biomarcadores
específicos a tumor de
Además de para realizar un diagnóstico, las nanopartículas tam-
próstata e inyección bién pueden usarse como método terapéutico. Así, una vez que las
de los mismos para nanopartículas se unen a las células cancerosas, se puede inducir un
la localización precoz calentamiento de las mismas mediante un campo magnético de baja
de las primeras células intensidad. El calentamiento provoca la destrucción de las células tu-
cancerosas (comparación
morales pero sin causar ningún daño a las células o tejidos sanos
entre un ratón enfermo
circundantes. Esta tecnología para el tratamiento del cáncer evitaría
y sano).
los graves problemas de efectos secundarios de los actuales trata-
mientos de quimio o radioterapia.
Biosensores plasmónicos
110 El biosensor óptico más conocido es el Biosensor de Resonancia de Plas-

món Superficial (SPR), basado en la variación de reflectividad de una capa me-
tálica en contacto con un

medio biológico. El bio-
sensor SPR ha sido am-
pliamente desarrollado,
cientos de publicaciones
aparecen cada año en la
literatura especializada y
numerosas compañias lo
comercializan en diferen-
tes versiones. Este sensor permite detectar de forma directa concen- Figura 7. (Izda.) Esquema
traciones en el rango nanomolar (o cambios de 10-5 en el índice de de funcionamiento de un

2 biosensor de Resonancia
refracción, o lo que es lo mismo 1pg/mm depositado en la superfi-
de Plasmón Superficial.
cie del sensor).
(Dcha.) Biosensor de SPR
En el sensor de resonancia de plasmón se deposita una capa comercial (SENSIA, S.L.).
metálica delgada (generalmente una capa de oro de 50 nm de espe-
sor) sobre una cristal. Excitando esta superficie en condiciones de reflexión in-
terna total se obtiene una resonancia para un cierto ángulo de incidencia de la
luz, resonancia que se manifiesta en una absorción de la luz y, por tanto, un
mínimo agudo en la intensidad de la luz reflejada. La característica más intere-
sante de este efecto es que el ángulo de resonancia es muy sensible a cualquier
variación que tenga lugar en la superficie metálica, como puede ser una inmu-
norreación o cualquier otro tipo de interacción biomolecular. La interacción
biomolecular se detecta entonces como una variación del ángulo de resonancia.
En la Fig. 7 se muestra el esquema de un sensor de SPR y su mecanismo de
funcionamiento.
Especial mención merece el biosensor de SPR comercializado por Biacore
bajo diferentes modelos, que domina desde hace años el mercado de los bio-
sensores ópticos. Su única desventaja es su elevado precio y su sofisticada ins-
trumentación.
Biosensores nanofotónicos
Los biosensores nanofotónicos han demostrado un nivel de sensibilidad

extremo para la detección directa de proteínas y ADN. En estos sensores (tam-
bién llamados de onda evanescente) se hace uso de la forma particular en que 111
se transmite la luz en el interior de los circuitos ópticos: esta transmisión tiene
lugar a lo largo de la guia óptica mediante multiples reflexiones internas. A ca-

da reflexión, una componente de la luz, denominada onda evanescente, se pro-
paga en el medio que envuelve a la guía. La longitud de penetración de la onda
evanescente es de unos cientos de nanometros y ofrece una oportunidad única
e ideal para medir cualquier interacción biomolecular que tenga lugar en su in-
terior. Con estos sensores es posible evaluar concentraciones de proteínas a ni-
vel picomolar o variaciones de una única base en el ADN en tan sólo unos mi-
nutos, necesitando volúmenes de muestra del orden de los microlitros y, en
algunas ocasiones, las muestras a analizar (orina, suero) no necesitan ni tan si-
quiera ser pretratadas.
Los nanosensores fotónicos también permiten la medida en el interior de
una única célula de su estado metabolico. Para este fin existen nanosensores
que consisten en una fibra óptica muy afilada (su extremo final tiene solo 30-
50 nm) lo que le permite penetrar a través de la membrana celular sin causar
ningún daño y sin alterar el funcionamiento normal de la célula. La fibra óptica
se biofuncionaliza con receptores específicos antes de su introducción. Una vez
dentro, la nanosonda puede detectar especies químicas y señalizar procesos
moleculares en localizaciones especificas del interior de la célula. La detección
se realiza a través de la interacción del campo evanescente de la luz que circu-
la por la fibra óptica con la interacción biomolecular, debida al biorreceptor es-
pecífico anclado en la superficie del extremo final de la fibra. Con esta técnica
se abre la posibilidad de identificar cambios patológicos dentro de una célula
individual e incrementar nuestro conocimiento sobre las funciones celulares in
vivo como la división celular, la apoptosis, funcionamiento de las nanomáqui-
nas biológicas, etc....
Biosensores nanomecánicos
Otro tipo de nanobiosensor con grandes perspectivas en nanodiagnóstico

son los biosensores nanomecánicos, que emplean como sistema de transduc-
ción la deflexión nanométrica de una micropalanca o el desplazamiento de su
frecuencia de resonancia al interaccionar con el sistema biológico. El cambio
en la posición y movimiento de la micropalanca inducido por el reconoci-
miento molecular ocurre a escala de unos pocos nanometros y de aquí deriva
112 el nombre de biosensores “nanomecánicos”. La Figura 8 muestra las imáge-
nes de algunos de estos sensores. Las micropalancas tienen un área sensora
muy pequeña (del or-

den de 1000 µm 2 ) lo
cual permite el análi-
sis de cantidades de
sustancia inferiores al
femtomol. Además, se
fabrican con tecnolo-
gía microelectrónica
estándar, lo que pro-
porciona producción
en masa a bajo coste y
permite la fabricación Figura 8. Biosensores
de miles de micropalancas en un mismo proceso, que podrían ser nanomecánicos empleados
empleadas para la detección simultanea de miles de analitos de la en nanodiagnóstico. Las
misma muestra. micropalancas se doblan
unos pocos nanómetros
cuando tiene lugar una
Sistemas “laboratorio-en-un-chip”
reacción de
reconocimiento molecular
Desarrollos como los nanosensores fotónicos o los nanomecáni- en su superficie. El
cos, fabricados a miles gracias a la tecnología microelectrónica, nanobiosensor de matrices
abren un camino para la fabricación de nanobiochips genómicos y de micropalancas puede
proteómicos, que a diferencia de los actuales biochips, llevan incor- emplearse como biochip
de ADN o proteómico
porado un sistema de transducción de la interacción (no se necesita-
según la
rían marcadores fluorescentes) con los que sería posible conseguir
biofuncionalizacion (Foto
en muy poco tiempo una inmensa cantidad de información genética cortesia de los Drs. K.
y proteómica, lo que permitirá elaborar vacunas, identificar mutacio- Zinoviev, J.A. Plaza, C.
nes indicativas de enfermedades, identificar nuevos fármacos, identi- Domínguez y L.M. Lechuga
ficar patógenos, etc...de forma mucho más rápida que utilizando las del Centro Nacional de
tecnologías convencionales. Microelectrónica, CSIC).
Pero, a pesar de estos incipientes desarrollos, todavía queda

mucho camino por recorrer y, cara al futuro, sería deseable contar con nano-
biosensores que cumplieran la mayoría de los siguientes requisitos: robusto,
barato, posibilidad de multianalito, detección a niveles de pico/femtomolar o
incluso a nivel de una sola molécula, rápidos y directos, portátiles, de fácil
manejo por parte de personal no especializado, de multiuso o suficientemente 113
barato para ser de un único uso. El trabajo futuro se encamina tanto al desa-
rrollo de nuevas estrategias de inmovilización y de protección, para permitir

biosensores completamente reversibles y regenerables y que puedan funcio-
nar in situ en muestras complejas (como es la sangre) y que sean biocompati-
bles para ser implantados in vivo. La inclusión de los nanodispositivos en el
interior del cuerpo humano preservando su funcionalidad será un logro para-
digmático en nanodiagnóstico. Los nanobiosensores implantados podrían fun-
cionar como “centinelas” dentro del cuerpo humano y emitir una señal de
alarma ante la aparición de las primeras células enfermas. Ya se han obtenido
pequenos avances como pildoras con cámaras de imagen que pueden tragar-
se, sensores que pueden realizar medidas in vivo durante operaciones, etc.
Ésta será sin duda una de las grandes áreas de trabajo de la Nanomedicina en
los anos venideros (ver Figura 9).
La integración en sistemas “lab-on-a-chip” será otras de las áreas funda-
mentales de trabajo, que permitirá la descentralización de las medidas. El tér-
mino “lab-on-a-chip” (o “laboratorio en un chip”) describe el desarrollo de
plataformas integradas y miniaturizadas donde tienen lugar com-
Figura 9. Futuro de la plejas reacciones químicas y bioquímicas. Estas plataformas se es-
utilización de
tán constituyendo como una tecnología revolucionaria en el sector
nanobiosensores como
clínico. Las micro y nanotecnologías han proporcionado las herra-
sistemas de
nanodiagnóstico mientas necesarias para llevar a cabo esta innovación en el diag-
(Adaptado de General nóstico molecular, al permitir la fabricación e integración de mi-
Electric). cro/nanobiosensores, microcanales, microactuadores, etc. en un
mismo chip micro-
electrónico. El uso
de estos dispositi-
vos aporta las ven-
tajas de rapidez en
el análisis, reduci-
dos volúmenes de
muestra, alto grado
de automatización
y su carácter portá-
til y desechable.
Un simple mi-
114 crosistema con na-
nosensores incor-
porados podría ofrecer un diagnóstico completo a partir de una gota de san-

gre mediante la identificación (de otra manera imperceptible) de cambios
moleculares. Esto implica que los análisis podrían hacerse a domicilio. Cuan-
do se empiecen a reemplazar los caros y lentos análisis de laboratorio por es-
tos análisis de microchips más baratos, rápidos y cómodos, el impacto en or-
ganizaciones sanitarias y sus pacientes será tremendo. De momento, todavía
no se cuenta con ningún desarrollo de microsistema biosensor que haya lle-
gado al mercado, pero numerosos laboratorios a nivel internacional trabajan
en esta dirección.
Liberación controlada de fármacos
La segunda gran área de actuación de la Nanomedicina es el desarrollo de

sistemas de liberación controlada de fármacos. Estos sistemas tienen como mi-
sión transportar el fármaco hasta el lugar donde debe ser liberado. Además, los
fármacos necesitan ser protegidos durante su tránsito por el cuerpo hasta llegar
al lugar afectado, tanto para mantener intactas sus propiedades físico-químicas
como para proteger a las otras partes del cuerpo por las que viaja de
sus efectos adversos. Una vez que el fármaco llega a su destino, ne- Figura 10. Diferentes tipos
cesita liberarse a una velocidad apropiada para que sea efectivo. Este de nanosistemas que
proceso no siempre es óptimo con las medicinas actuales, por lo que pueden emplearse en la
la Nanomedicina está ofreciendo métodos para mejorar tanto las ca- dosificación de fármacos.
racterísticas de difusión del fárma-
co como las de degradación del
material encapsulante, permitiendo
que el fármaco se transporte de for-
ma mucho más eficaz y que su li-
beración sea igualmente más con-
trolada. Para la administración de
fármacos pueden emplearse diver-
sos tipos de nanoestructuras. Entre
ellas cabe destacar la utilización de
nanopartículas, nanocápsulas, den-
drímeros, liposomas, micelas, nano-
tubos, conjugados poliméricos, etc. 115
(ver Figura 10).
Nanomedicina regenerativa
La Nanomedicina regenerativa es la tercera gran área de la Nanomedicina

y es una de las áreas más emergentes. La Medicina regenerativa intenta la re-
paración o reemplazamiento de tejidos y órganos enfermos o dañados mediante
la aplicación de métodos procedentes de terapia génica, terapia celular, dosifi-
cación de sustancias biorregenerativas e ingeniería tisular, estimulando los pro-
pios mecanismos reparadores del cuerpo humano.
La ingeniera tisular intenta generar tejidos in vivo o in vitro, para lo cual ne-
cesita materiales biocompatibles que mimetizen respuestas celulares específicas a
nivel molecular. Gracias al desarrollo de las nanotecnologías, los materiales tie-
nen el potencial de interaccionar con componentes celulares, dirigir la prolifera-
ción y diferenciación celular y la producción y organización de la matriz extrace-
lular. Entre los materiales que se están utilizando cabe destacar los nanotubos de
carbono, nanopartículas como nanohidroxiapatita o nanozirconía, nanofibras de
polímeros biodegradables, nanocomposites, etc. También se pueden utilizar su-
perficies con nanoestructuración nanométrica que actúen como incubadoras de lí-
neas celulares y que favorecen el proceso de diferenciación celular.
Gracias a la Nanomedicina, las células madre pluripotenciales y los facto-
res de señalización serán componentes esenciales de implantes inteligentes y
multifuncionales que podrán reaccionar en función del microambiente que le
rodee y facilitar entonces la regeneración del tejido dañado de forma especifica
y en el mismo lugar.
Es de prever también que se puedan desarrollar nanoestructuras artificiales
que puedan detectar y reparar daños en el organismo, de la misma forma que
las nanoestructuras naturales lo hacen (por ejemplo los linfocitos de la sangre).
Así, se ha propuesto de forma teórica la fabricación de unas nanoestructuras
para sustituir la hemoglobina, denominadas “respirocitos”. Los respirocitos son
células rojas nanofabricadas con una enorme capacidad para transportar oxíge-
no y que pueden permitir pasar varias horas bajo el agua sin respirar. Según los
cálculos de su creador, con una inyección de respirocitos podríamos vivir con
el corazón parado durante 4 horas o bucear durante 2,5 horas. Otros interesan-
tes desarrollos incluyen motores biomoleculares, interruptores moleculares o
116 nanoagujas que penetren en el nucleo de células vivas con un alto grado de
precisión para realizar cirugia celular.
CONCLUSIONES
La Nanobiotecnología es un área multidisciplinar que puede conllevar

grandes avances diagnósticos y terapéuticos proporcionando nuevos métodos
de diagnóstico más efectivos, mejores sistemas para la administración de fár-
macos y nanoherramientas para la monitorización in situ de parámetros bioló-
gicos y reparación celular. Las nanoterapias, bien mediante la destrucción se-
lectiva de células dañadas o infectadas o bien mediante la liberación controlada
de fármacos en el lugar indicado, se perfilan como uno de los grandes avances
a lograr para mejorar la calidad de vida de nuestra sociedad.
El futuro nos deparara microchips implantables que administrarán los fár-
macos en dosis preprogramadas, fármacos que habrán sido elegidos “a la carta”
según el perfil genético de cada individuo gracias al uso de micro/nanochips de
ADN y que trasmitirán sus datos al hospital para tener controlado al paciente
mientras éste hace su vida normal. Ya existen chips subcutáneos para medir de
forma continua parámetros cruciales como el pulso, la temperatura y la gluco-
sa, microsensores ópticos que se implantan en los tejidos subdérmicos para me-
dir la circulación en los tejidos después de una operación o sensores MEMS
que miden la presión, aceleración, velocidad y parámetros relacionados en pul-
mones paralizados y que ayudan en el diseño de pulmones artificiales. Ya se
están fabricando dispositivos “laboratorio-en-un-chip” y se están realizando en-
sayos clínicos para liberación de fármacos con productos nanotecnológicos. Sin
embargo, los largos procesos de aprobación en los sectores médicos y farma-
céuticos pueden significar que los beneficios para la salud solo podrán apre-
ciarse dentro de muchos años. Aunque quedan muchos problemas por superar,
no hay duda de que la Nanobiotecnología nos deparará grandes avances que re-
dundarán en una mejora de la calidad de vida de nuestra envejecida sociedad y
que ayudará a vencer a las principales enfermedades (cáncer, desórdenes neu-
rodegenerativos y enfermedades cardiovasculares) de nuestro entorno.
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118
Vectores de transferencia en terapia génica
VECTORES DE TRANSFERENCIA
EN TERAPIA GÉNICA
Jesús M. Fominaya. Centro Nacional de Investigaciones Oncólogicas
INTRODUCCIÓN
El concepto de terapia génica, definida como la introducción de material

genético en una célula con el propósito de aliviar o eliminar un proceso patoló-
gico, surgió a nivel ideológico a mediados de los años 60, incluso antes del de-
sarrollo de la tecnología del DNA recombinante. Su apoyo experimental co-
menzó en los 80 con la aparición de los vectores retrovirales. Las primeras
demostraciones in vitro de la potencialidad de esta nueva tecnología generaron
un optimismo desmesurado en la comunidad científica que ha provocado, a lo
largo de poco más de una década, el establecimiento de más de un millar de
ensayos clínicos. Sin embargo, la euforia inicial se ha traducido en prudencia e,
incluso en cierto escepticismo en algunos sectores, al no cumplirse las expecta-
tivas temporales de evolución y consecución de resultados. El fallecimiento de
un joven paciente implicado en uno de estos programas, junto con la aparición
inesperada de varios casos de leucemia inducida tras la integración del trans-
gen, ha provocado una dura crítica al desarrollo que se está produciendo en es-
te campo. En contraposición, comienzan a obtenerse las primeras evidencias de
éxito terapeútico, además de acumularse datos experimentales prometedores.
119
Por otra parte, la baja toxicidad de los tratamientos y las grandes posibilidades
aún por desarrollar, siguen justificando, e incitando, un continuo avance en este

apasionante campo de la investigación biotecnológica.
El cuello de botella del desarrollo de la terapia génica se encuentra en la
obtención de sistemas eficaces de transferencia génica. Hasta el momento,
existe una gran variedad de vectores que presentan diversas ventajas e inconve-
nientes, pero ninguno de ellos alcanza el nivel de calidad requerido para que la
terapia génica obtenga la madurez que le permita ser una alternativa real y
competitiva frente a las terapias tradicionales. La potencialidad sigue siendo
desmesurada. El conocimiento de la totalidad de nuestro material genético, co-
mo resultado de la finalización del proyecto Genoma Humano, abre unas ex-
pectativas ilimitadas. Por ello, necesitamos que los vehículos de transporte del
material genético se desarrollen suficientemente, de modo que permitan la uti-
lización de los genes como nuevos agentes farmacológicos y se posibilite su
explotación terapeútica.
El objetivo de este trabajo es dar una idea general del estado en el que se
encuentra actualmente el campo del diseño y desarrollo de vectores de transfe-
rencia génica con aplicación terapeútica. Antes de comenzar conviene recordar
que estamos tratando con un concepto terapeútico global, ya que cualquier cé-
lula puede ser el objetivo del tratamiento. Además, la aplicación terapeútica de
material genético es potencialmente ilimitada, puesto que va más allá de la re-
paración, sustitución o compensación de una alteración genética, permitiendo
su utilización como agente farmacológico per se, incorporando nuevas activi-
dades en el organismo que permitirían tanto tratamientos de patologías sin da-
ño genético (enfermedades infecciosas, por ejemplo) como tratamientos pre-
ventivos (vacunas de DNA). Por lo tanto, la diversidad de situaciones en las
que se podría aplicar, justifica el desarrollo de una amplia diversidad de vecto-
res (el tratamiento de cada patología puede requerir el diseño de un vector es-
pecífico). La obtención de un vector universal con aplicación generalizada es
una quimera, ya que diferentes enfermedades pueden tener requerimientos
opuestos. Sin embargo, sí se pueden definir las características de un "vector
ideal" y adaptarlas posteriormente a situaciones concretas:
1. Que sea reproducible.
2. Que sea estable.
3. Que permita la inserción de material genético sin restricción de tamaño.
120 4. Que alcance concentraciones elevadas (>108 partículas/ml).
5. Que permita la transducción de células tanto en división como quiescentes.
6. Que posibilite la integración específica del gen terapeútico.

7. Que reconozca y actúe sobre células específicas.
8. Que la expresión del gen terapeútico pueda ser regulada.
9. Que carezca de elementos que induzcan una respuesta inmune.
10. Que pueda ser caracterizado completamente.
11. Que sea inocuo y minimice sus posibles efectos secundarios.
12. Que sea fácil de producir y almacenar y a un coste razonable.
Los vectores son sólo una parte, aunque fundamental, del sistema terapéu-
tico. El sistema en sí consta de dos componentes, el "vector" (vehículo de
transporte) y el "cargo" (material transportado). Éste, a su vez, se puede subdi-
vidir en otros dos componentes: el "efector" (gen a introducir) y el "soporte"
(los elementos que condicionan su expresión).
El cargo suele ser una estructura de tipo plasmídico (ADN bicatenario y
circular) aunque puede ser de diversa naturaleza y complejidad, desde un sim-
ple oligonucleótido hasta un cromosoma artificial, que permite incorporar una
cantidad elevada de material genético con capacidad de perpetuación en el
tiempo.
El efector que se utilice dependerá del efecto que se persiga. Si se preten-
de compensar, sustituir o reparar un gen dañado, el efector ha de ser una copia
del gen intacto o un elemento que posibilite su reparación. Si se pretende indu-
cir un efecto biológico concreto (eliminar específicamente un tipo de células,
bloquear la expresión de un virus, inducir una respuesta inmune...), se pueden
introducir genes naturales que potencien dicho efecto o genes que originen
nuevas actividades que den lugar al efecto perseguido. Es el caso, por ejemplo,
de los genes suicida, que expresan enzimas procesadoras de pro-drogas, capa-
ces de convertir un sustrato inocuo (pro-droga) en una potente droga citotóxica.
El sistema más utilizado es el del gen de la timidina quinasa del virus Herpes
Simplex (HSV), que transforma el glanciclovir en su derivado tóxico, glanci-
clovir trifosfato. El producto tóxico es capaz de afectar, además, a las células
adyacentes no transducidas, aumentando su eficacia por el denominado efecto
"bystander".
El soporte es la base para el control de la expresión del transgén e incluye
distintos tipos de elementos reguladores. El primero y fundamental es el pro-
motor, la zona de ADN anterior al gen donde se recluta la maquinaria de trans-
cripción. La naturaleza del promotor condiciona el tipo de regulación de la ex-
121
presión génica. Así, se pueden utilizar promotores constitutivamente activos o
Figura 1. Puntos clave

par regular la eficacia
de un vector promotores específicos, que sólo son activos en un tipo celular concre-
de transferencia génica. to. De la misma manera, se pueden emplear promotores inducibles, que
requieren la presencia de un elemento concreto para ejercer su función.
Éste puede ser un agente de adicción exógena (control externo) o un agente de-
terminado por características fisiológicas especiales (por ejemplo, los promoto-
res sensibles a situaciones de hipoxia). Existen otros elementos del soporte de
diversa importancia, dependiendo de la funcionalidad perseguida. Entre ellos se
encuentran potenciadores y represores de los promotores, secuencias de aisla-
miento ("insulators") que impiden las influencias de secuencias reguladoras
próximas, secuencias de integración (para permitir la inclusión del material
exógeno dentro del genoma de la célula hospedadora), secuencias de recombi-
nación homóloga (para permitir el intercambio de material genético con el ge-
noma hospedador en una región específica), secuencias de empaquetamiento
(para introducir el material genético en el interior de un vector viral), o secuen-
cias inmunoestimulantes (secuencias bacterianas del tipo islas CpG no metila-
das, que sirven como coadjuvantes en las vacunas de ADN).
Los vectores son los encargados de asegurar la estabilidad del material ge-
nético transportado y de vencer todas las barreras biológicas hasta alcanzar su
122 destino final, el núcleo de la célula diana, donde tiene lugar la regulación géni-
ca. También de ellos va a depender la vía de administración a utilizar. En la Fi-
Figura 2. Tipo de vectores

y proceso esquematizado
gura 1 se esquematizan las barreras más importantes que el vector ha de obtención.
de solventar en su camino hacia su destino funcional. Entre ellas se in-
cluyen la estabilidad en el medio extracelular (para evitar su eliminación y de-
gradación), el reconocimiento de la célula diana (generalmente mediante un re-
ceptor específico), su unión a la membrana, su internalización en la célula
(normalmente utilizando un sistema de transporte vesicular como la endocito-
sis), el escape de los sistemas de degradación intracelular (lisosomas) y su en-
trada final al núcleo, donde debe desmantelarse para permitir que el material
genético que transporta gane acceso a su ubicación final y a la maquinaria de
transcripción.
Existen dos grandes grupos de vectores: virales y no-virales (Figura 2).
Los primeros incluyen todos aquellos que se han obtenido a partir de un virus,
tratando de eliminar sus características patológicas y de adaptarlos a su nueva
función como transportadores de material genético heterólogo. Pretenden apro-
vechar la ventaja que aportan los virus como vectores naturales, que han sufri-
do procesos de evolución complejos a lo largo de millones de años para opti-
mizar su función de introductores de material genético en las células que 123
invaden. Los vectores no-virales siguen una estrategia opuesta, de síntesis en
lugar de modificación. Parten de estructuras sencillas, conocidas, e intentan re-

construir desde la base un sistema completamente artificial que posibilite el
transporte efectivo de genes en el interior de una célula. Como resulta obvio,
las opciones son muy diversas, aunque todas ellas tienen en consideración pun-
tos equivalentes, que han de resolver, en el intento de incorporar todos los ele-
mentos necesarios para la construcción de un sistema de transferencia efectivo.
Ambas estrategias tienen ventajas y desventajas que analizaremos a continua-
ción. Existen también algunos casos de vectores biológicos no virales (bacte-
rianos) como portadores de genes terapéuticos, alguno de ellos incluso en ensa-
yos clínicos (para más información, visitar la base de datos de ensayos clínicos
en terapia génica que facilita el portal de la revista Journal of Gene Medicine:
http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/), pero no van a ser analizados en este
documento.
VECTORES VIRALES
Los vectores de tipo viral son actualmente los más efectivos, fueron los
primeros en utilizarse en ensayos clínicos a comienzos de 1990 y continúan
siendo los más utilizados en dichos ensayos. Los virus son, de hecho, sistemas
naturales de transferencia genética. Para modificar un virus y transformarlo en
un vector con potencialidad terapéutica, el primer paso es bloquear su capaci-
dad de propagación eliminando los genes responsables de su replicación. Nor-
malmente, se suelen establecer líneas celulares que incorporan parte del geno-
ma vírico y que permiten completar el ciclo reproductivo del virus, cuando son
transfectadas con plásmidos que introducen el material genómico complemen-
tario. Estas líneas celulares se denominan "empaquetadoras" y son las herra-
mientas de producción de los vectores virales. El segundo paso en el proceso
de obtención de un vector viral es la eliminación de parte del genoma viral pa-
ra crear espacio donde introducir el material terapeútico (gen o genes, más los
elementos de control). Se han de eliminar genes que no sean esenciales y, espe-
cialmente, aquellos que puedan resultar tóxicos o perjudiciales para la célula a
tratar.
En general, los vectores virales presentan como ventaja su gran eficacia de
124 transferencia y la posibilidad, en algunos casos, de integrar el transgén en el
genoma de la célula huésped. Sin embargo, arrastran importantes limitaciones
que incluyen su falta de especificidad celular en la mayoría de los casos, la li-

mitación del tamaño en el material genético a incorporar, debido a que han de
empaquetarlo en la cápsida, su elevada inmunogenicidad y, sobre todo, el ries-
go biológico que conllevan (reconstitución de partículas replicativas por re-
combinación genética y oncogenicidad inducida por integración inespecífica).
De hecho, esto es lo que ha ocurrido en un reciente ensayo clínico, por otra
parte exitoso, de terapia compensatoria en una inmunodeficiencia congénita
tratada con vectores retrovirales portadores de una copia "sana" del gen daña-
do. En este ensayo, la inserción del transgén en el genoma del paciente generó,
en un par de casos, el desarrollo de una leucemia producida por su integración
cerca del oncogén LMO2, provocando su activación.
La lista de vectores virales es cada día más amplia. Aquí solo se muestran
algunos de los más representativos, y que están siendo utilizados en ensayos
clínicos.
Vectores retrovirales
Los retrovirus son virus RNA con envuelta y fueron elegidos inicialmente
como prometedores vehículos de transferencia génica debido a su elevada efi-
cacia de transducción en un gran número de tipos celulares, a que son capaces
de integrarse de forma estable en el genoma de la célula que infectan, sin ex-
presar ninguna proteína viral inmunogénica, y a que son relativamente poco
patogénicos, con populares excepciones como el virus del SIDA (HIV, Human
Immunodeficiency Virus). La mayoría de ellos derivan del virus de la leucemia
murina (MuLV). El virus parental posee tres genes, gag, pol y env, que codifi-
can proteínas responsables de la replicación, encapsidación, transcripción re-
versa e infección. Estos tres genes pueden ser utilizados en trans (facilitados
por las células empaquetadoras), permitiendo la generación de vectores que li-
mitan el genoma retroviral a la señal de empaquetamiento y las secuencias ter-
minales necesarias para la integración (LTRs, Long Terminal Repeats). De esta
forma se minimiza el componente genómico viral y se maximiza la capacidad
de incorporación de material genético heterólogo, aunque el límite sigue siendo
discreto, unas 7-8 kilobases (kb).
Su mayor limitación reside en el hecho de que sólo son capaces de trans-
ducir eficazmente células en división, ya que el acceso al núcleo del complejo
125
de preintegración requiere la ruptura de la membrana nuclear. Ésto inicialmente
ha sido utilizado como una ventaja para el tratamiento de patologías oncológi-

cas, generando un cierto grado de especificidad debido al elevado nivel de pro-
liferación de las células transformadas. Sin embargo, limita grandemente su
utilización en sistemas tan atractivos como las células progenitoras, normal-
mente en estado quiescente. La utilización de vectores derivados de otro tipo
de retrovirus, los lentivirus (HIV, SIV...), que sí son capaces de infectar e inte-
grarse en células quiescentes, abre nuevas posibilidades a estos vectores, aun-
que los riesgos inherentes al uso de los mismos han retrasado su utilización en
ensayos clínicos, habiéndose iniciado recientemente.
Un segundo tipo de inconvenientes reside en la poca estabilidad de las
partículas y su baja tasa relativa de producción. Esto ha sido parcialmente re-
suelto mediante la sustitución de la proteína de la envuelta por la glicoproteína
G del virus de la estomatitis vesicular que posibilita la obtención de títulos de
hasta 109 p.i./ml y estabiliza las partículas. Además, la utilización de células
empaquetadoras de origen humano produce vectores resistentes a la inactiva-
ción por complemento.
Finalmente, la carencia de especificidad celular inherente a estos virus
(poseen un rango de infectividad muy amplio) está tratando de resolverse me-
diante la utilización de vectores que poseen proteínas quiméricas en la envuel-
ta. Estas incorporan ligandos heterólogos o anticuerpos monocatenarios que ge-
neran nuevas especificidades y permiten transducir selectivamente una
población celular.
Vectores adenovirales
Los adenovirus son virus DNA sin envuelta con un genoma bicatenario de
hasta 36 kb. Se han seleccionado los serotipos 2 y 5 para la obtención de vec-
tores por no estar asociados con ninguna enfermedad severa ni originar tumo-
res en animales. Pueden transducir un número bastante amplio de tipos celula-
res distintos, tanto células en división como post-mitóticas, con una eficacia
muy elevada. Sin embargo el genoma viral se mantiene episómico, lo que per-
mite solo una expresión genética transitoria.
La primera generación de vectores adenovirales se obtuvo mediante delec-
ción de la región E1, que bloqueaba su capacidad replicativa y la E3, aparente-
126 mente no esencial. Sin embargo, posteriormente se demostró que la presencia
de E3 incrementaba significativamente la expresión del transgen y disminuía la
respuesta inmune, por lo que volvió a introducirse en la segunda generación de

vectores a expensas de otras regiones como la E4 o la E2A. En ambos casos, la
capacidad del vector para acomodar genes terapéuticos no sobrepasaba los 7-8
kb, muy por debajo de la capacidad teórica de las partículas originales. Recien-
temente, se ha conseguido eliminar la mayoría del genoma viral manteniendo
sólo las señales de empaquetamiento y las secuencias terminales (ITRs, Inver-
ted Terminal Repeats), rindiendo vectores con gran capacidad incorporadora
(hasta 35 kb) que se han denominado "vectores sin tripas" (gutless).
La eliminación de material genómico viral no sólo aumenta la capacidad
del vector, sino que disminuye también el riesgo de inducción de respuesta in-
mune. De hecho, éste es uno de los problemas más graves de estos vectores, y
ha sido la causa del fallecimiento accidental mencionado anteriormente. La
mayoría de la población humana ha sido infectada en algún momento con ade-
novirus y presenta una respuesta inmunitaria inicial. Existen estrategias inmu-
nosupresoras transitorias y se están tratando de desarrollar vectores adenovira-
les de origen animal (canino, bovino u ovino). Sin embargo, el problema se
mantiene sin resolver de una forma satisfactoria y el uso de vectores adenovi-
rales se reduce a aplicaciones unitarias.
Una de las mayores ventajas de estos vectores radica en su alta productivi-
dad, con títulos de hasta 1010 p.i./ml, y su gran estabilidad, que les permiten
ser concentrados adicionalmente para alcanzar valores de 1012 p.i./ml. Esto,
junto con la posibilidad de transducir células quiescentes, les ha hecho muy
atractivos para la comunidad científica y son el segundo tipo de vectores en
frecuencia de utilización en ensayos clínicos.
Su falta de especificidad celular también ha sido compensada por el desa-
rrollo de estrategias de redireccionalidad: quimeras que introducen ligandos es-
pecíficos en proteínas de la cápsida y moléculas biespecíficas que reconocen
tanto la cápsida viral como el receptor seleccionado, para conferir un nuevo
tropismo celular.
Vectores basados en virus adenoasociados
Los virus adenoasociados son parvovirus humanos no patológicos. Son pe-

queños virus sin envuelta con un genoma de DNA monocatenario, capaces de
infectar un gran número de células de origen diverso, tanto en división como 127
en su estado quiescente. A diferencia de los adenovirus, pueden integrarse en la
célula huésped en una ubicación específica (el brazo q del cromosoma 19) eli-
minando la posibilidad de mutagénesis insercional. Otra ventaja adicional es la
carencia de respuesta inmune observada in vivo.
Sus mayores limitaciones se centran en su reducida capacidad de transpor-
te (unos 4.5 kb) y en su tediosa producción, que requiere la presencia de virus
de apoyo (adenovirus o herpesvirus), dificiles de eliminar completamente. Una
complicación adicional surgió al comprobar que la eliminación de parte del ge-
noma viral para permitir la introducción del transgén se tradujo en la pérdida
de la capacidad de integración específica. Reciéntemente se ha descubierto que
la proteina Rep78, en presencia de los ITRs, es capaz de potenciar la integra-
ción específica en el genoma celular y podría ser la clave que solucionara este
problema.
Finalmente, como hemos visto en los vectores anteriores, la falta de espe-
cificidad celular ha sido también tratada empleando la estrategia de moléculas
biespecíficas.
Tabla 1.
V. Retrovirales V. Adenovirales V. Adenoasociados
Características
Soporte génico RNA lineal DNA lineal DNA lineal

bicatenario bicatenario monocatenario
Capacidad transportadora 7-8 kb Hasta 35 kb 4.5 kb
(gutless)
Inmunogenicidad Baja Elevada Baja
Eficacia de transfección Elevada Elevada Elevada
Dependencia del estado Sí No No
de división celular (excepto lentivirus)
Integración del transgén Sí, aleatoria No Sí, específica
Estabilidad Baja Elevada Elevada
Especificidad Baja Baja Baja
Otras Riesgo biológico Limitado Elaboración
128 (infect., mutag. a aplicaciones tediosa
insercional) reducidas
Vectores virales quiméricos
Una opción interesante, que cada día se está explotando con mas fre-
cuencia, es la combinación de varios vectores para compensar las limitacio-
nes que presentan cada uno por separado, a la vez que se aprovechan las ven-
tajas más destacables que aportan individualmente. Existen diversas
estrategias experimentales de estas quimeras, pero sólo voy a mencionar, a tí-
tulo de ejemplo, la quimera adenovirus-retrovirus. Consiste en la utilización
simultánea de dos tipos de vectores adenovirales: uno que incorpora la ma-
quinaria de empaquetamiento retroviral (gag, pol y env) y otro que introduce
el material genético equivalente a un vector retroviral (LTRs, señal de empa-
quetamiento y material terapéutico). Se aprovecha la elevada eficacia de
transducción de los vectores adenovirales para cotransfectar con ambos vec-
tores, transformando las células dianas en células productoras de vectores re-
trovirales. Los vectores así generados son capaces de infectar las células ve-
cinas e integrarse en su genoma.
VECTORES NO-VIRALES
El concepto general aplicado al desarrollo de este tipo de vectores se ase-

meja más al de los productos farmacéuticos tradicionales. Se pretende mimeti-
zar el proceso natural de introducción de material genético en una célula hués-
ped, utilizando material sintético y, por lo tanto, conocido y controlable. La
eficacia de estas nuevas "medicinas génicas" depende de dos niveles de actua-
ción, el sistema de introducción de los genes (el vector propiamente dicho) y el
sistema de regulación de su expresión (el soporte). Ambos son fundamentales y
complementarios, pero aquí sólo vamos a tratar el primero de ellos.
Los vectores no-virales presentan, en general, una eficacia inferior a la de
sus oponentes (no es fácil competir con sistemas desarrollados por la naturale-
za). Algunas características virales, como la capacidad de integración en el ge-
noma huésped, están en proceso de desarrollo. Actualmente se está trabajando
en el empleo de transposones como "Sleepy Beauty", capaz de insertar transge-
nes en cromosomas de mamíferos. La explotación de estrategias alternativas,
que no requieren la integración del transgén, para asegurar un efecto terapeúti-
129
co estable, también favorece el desarrollo de estos vectores. Es el caso de los
métodos de inducción de reparación de DNA in situ, como la "quimeraplastia",

aunque su eficacia no está claramente establecida.
En cuanto a sus ventajas, destacan su facilidad de manipulación, mayor
estabilidad, bioseguridad, gran capacidad transportadora, menor inmunogenici-
dad y especificidad celular, en algunos casos. Los tipos de vectores son muy
variados, pero pueden agruparse en categorías, que veremos a continuación.
Métodos físicos
Se basan en la introducción de DNA en la célula mediante la aplicación de

un sistema mecánico o eléctrico. Alguno de ellos está siendo utilizado en ensayos
clínicos, aunque presentan claras limitaciones, principalmente por su aplicación
local y el número reducido de células que afectan. En esta categoría se encuen-
tran la microinyección (introducción de DNA en el núcleo celular mediante el
uso de una microaguja), bombardeo de partículas, popularmente conocido como
la "pistola génica" (proyección de micropartículas metálicas recubiertas de DNA
mediante un sistema balístico impulsado por gas), electroporación de bajo voltaje
(permeabilización transitoria de la membrana celular por aplicación de pulsos
eléctricos de alta frecuencia y bajo voltaje) e inyección intersticial de DNA des-
nudo. Este último método ha resultado especialmente efectivo en músculo.
Liposomas catiónicos (Lipoplexes)
Buscando la similitud con otras formulaciones farmacéuticas, y tratando de

aprovechar la experiencia acumulada en sistemas particulados de encapsulación de
pequeños fármacos en vesículas lipídicas, se trató de aplicar la tecnología de los lipo-
somas al transporte de ácidos nucleicos. Aunque inicialmente se intentó encapsular el
DNA en el interior de liposomas, el rendimiento fue pobre y la eficacia se incremen-
tó considerablemente al cambiar los liposomas tradicionales por otros basados en lí-
pidos catiónicos. A diferencia de aquéllos, el DNA interacciona con los grupos catió-
nicos de la superficie lamelar y no se incluyen en el interior vesicular. El éxito de
este tipo de estrategias ha sido claro desde el principio y actualmente da cuenta del
mayor número de protocolos en ensayo clínico dentro de los vectores no virales.
Existe un número bastante elevado de estos lípidos tanto en explotación co-
130 mo agentes de transfección como en desarrollo para su utilización como vectores
de transferencia en terapia génica. Entre los más populares se encuentran DOT-
MA (Lipofectin), DOTAP, DMRIE, DOGS (Transfectam), DOSPA (LipofectAMI-

NA) y DC-Colesterol. Presentan niveles de eficacia aceptablemente altos, una in-
munogenicidad casi nula, una capacidad de transporte de DNA sin restricción de
tamaño, gran estabilidad de almacenaje y sencillez de uso. Sin embargo, son difí-
ciles de caracterizar estructuralmente y no presentan especificidad celular, aunque
ambos puntos están en desarrollo.
Los lípidos catiónicos utilizados están formados por estructuras anfifílicas,
compuestas de un dominio hidrofóbico y una cabeza polar. La naturaleza de es-
ta última es la que marca la diferencia entre ellos. Los grupos catiónicos más
frecuentes son aminas cuaternarias y poliaminas (espermina, espermidina, polili-
sina...). Su eficacia de transfección depende, en la mayoría de los casos, de la
presencia de un lípido neutro adicional, DOPE, que actúa como "lípido de apo-
yo", posibilitando la fusogenicidad del liposoma y la entrada del DNA en el ci-
tosol. La compactación del DNA con policationes, especialmente protamina, an-
Tabla 2.
M. Físicos Lipoplexes Poliplexes Peptiplexes
Características
Soporte génico Cualquiera Cualquiera Cualquiera Cualquiera

Capacidad transportadora Ilimitada Ilimitada Ilimitada Ilimitada
Inmunogenicidad Muy baja Muy baja Baja (en Baja (en
algunos casos) algunos casos)
Eficacia de transfección Elevada, pero Media Media Media
muy localizada
Dependencia del estado Relativa Relativa Relativa Relativa
de división celular
Integración del transgén No No No No
Estabilidad Elevada Elevada Elevada Elevada
Especificidad Elevada Baja (con Elevada, en Elevada, en
(aplicación local) excepciones) algunos casos algunos casos
Otras Aplicación Experiencia Económicos, Versátiles, 131
bastante limitada farmacológica rel. controlables biodegradables
tes de la adicción del liposoma ha supuesto un incremento importante en la

efectividad del sistema. Otras modificaciones interesantes incluyen la utilización
adicional de lípidos aniónicos, que activan su capacidad fusogénica en el micro-
ambiente ácido del endosoma, la inclusión de ligandos o de anticuerpos para ge-
nerar especificidad celular y la optimización de formulaciones que eviten su op-
sonización, una de las principales limitaciones de su utilización in vivo.
Quimeras HVJ-liposomas (Virosomas)
Un concepto muy interesante, desarrollado por un grupo japonés, es la ob-

tención de liposomas quiméricos por fusión con el virus hemaglutinante del Ja-
pón (HVJ), también llamado virus Sendai. La estrategia consiste en la encapsu-
lación de complejos DNA-HMG1 en liposomas clásicos (fosfolípidos,
colesterol) y su fusión posterior con HVJ inactivado con luz ultravioleta. De
esta forma se combinan las ventajas del vector no viral con la capacidad de
unión celular y la fusogenicidad aportadas por las proteínas de la envuelta víri-
ca. A diferencia de los vectores virales, esta nueva quimera resulta muy poco
inmunogénica y permite administraciones repetidas.
Conjugados moleculares (Poliplexes)
Estos vectores se basan en moléculas bifuncionales obtenidas por unión co-

valente entre un policatión, (polilisina), que posibilita la unión y condensación
del DNA, y un ligando o anticuerpo monoclonal, que confiere especificidad celu-
lar. Estas moléculas forman complejos con DNA de estructura definida (toroidal)
que permite su fácil captura por la célula, siguiendo una ruta endocítica mediada
por receptor. La ventaja más clara del sistema es su especificidad. Sin embargo,
la mayor parte de los complejos que entran en los endosomas finalizan en los li-
sosomas, donde son degradados. Esta importante limitación ha tratado de solu-
cionarse mediante la adicción de reactivos que bloqueen la acidificación del en-
dosoma (cloroquina, monensina, bafilomicina A1...) o la incorporación de
actividades fusogénicas que se activen con la disminución del pH que tiene lugar
en el endosoma. Entre estos últimos se incluyen adenovirus inactivados con pso-
ralen y luz UV (generan eficacias de transfección muy altas) y péptidos fusogéni-
132 cos. Para su utilización in vivo se necesita la incorporaración de esta nueva acti-
vidad en los complejos, en lugar de su utilización in trans.
Policationes (Poliplexes)
De nuevo, el carácter catiónico es la directriz para el desarrollo de un vector

no viral. Este carácter permite, no sólo la interacción con el DNA (polianión), sino
también su condensación y la interacción de los complejos resultantes con las
membranas celulares, que poseen cargas negativas en su superficie. Para ello se
requiere que los complejos policatión-DNA sean electropositivos, lo que se consi-
gue con un exceso del policatión. Por tanto, la determinación de la estequiometría
óptima es fundamental para obtener un buen rendimiento de transferencia génica.
Los policationes más desarrollados y de mayor eficacia en la actualidad
son los basados en polímeros ramificados. Entre ellos destacan los dendrímeros
de poliamidoaminas (PAMAM) y la polietilénimina (PEI). Los primeros son
estructuras esféricas con una arquitectura muy definida y controlable. La pre-
sencia de grupos protonables con diferentes pKs le confiere un carácter tampo-
nador que bloquea la acidificación del endosoma, incrementando la eficacia de
escape al citosol. El fraccionamiento parcial del dendrímero, mediante la elimi-
nación de alguna de sus ramificaciones, ha permitido una mejora sustancial del
vector. El dendrímero fracturado actúa como una "esponja" en el interior del
endosoma, posibilitando una liberación más efectiva del DNA.
PEI es también una alternativa muy interesante. Comparte la funcionalidad
tamponadora de los dendrímeros y su coste de producción es muy bajo. Sin
embargo, es de naturaleza polidispersa y más difícil de caracterizar. Actual-
mente se ha conseguido introducir con éxito diversos tipos de ligandos, que le
confieren selectividad celular.
Vectores de naturaleza peptídica (Peptiplexes)
Existe un grupo heterogéneo de vectores que se basan en estructuras de

naturaleza peptídica. De ellos sólo voy a mencionar dos tipos. El primero utili-
za proteínas multidominio, basadas en el carácter modular de las toxinas bacte-
rianas. El concepto general es similar al de los conjugados moleculares, pero
con la ventaja de la utilización de técnicas de ingeniería genética. El sistema
incorpora, en una sola cadena peptídica, diferentes dominios estructurales, que
confieren actividades específicas necesarias para la eficiente introducción de 133
DNA en las células dianas. Las proteínas quiméricas obtenidas poseen un do-
minio de reconocimiento y unión celular (ligando o anticuerpo monocatenario),

un dominio que posibilita el escape del endosoma (el dominio de translocación
de la toxina) y un dominio de unión a DNA (específico o inespecífico). Una de
las ventajas de este sistema es su versatilidad, que le permite la adaptación a
requerimientos específicos mediante la simple sustitución de un dominio. Sin
embargo, presenta limitaciones en cuanto a la expresión a gran escala de prote-
ínas tan complejas, así como su posible inmunogenicidad.
El segundo tipo está basado en la utilización de una estrategia similar me-
diante el uso de péptidos modulares: la aplicación de péptidos con funcionalida-
des específicas (unión a DNA, reconocimiento celular, fusogénesis, tropismo nu-
clear...) como sillares estructurales. De esta forma, se permite el establecimiento
de complejos de tamaño controlado (el mínimo posible) y de reducida inmunoge-
nicidad, que han permitido mejorar la eficacia de la transferencia génica.
Para finalizar, sólo quiero recordar que éste es un campo en continuo de-
sarrollo y evolución, y que aún quedan estrategias por explotar. Probablemente,
la solución no se encuentre en ninguno de los vectores como se conocen en la
actualidad. La combinación de varios de ellos se está empleando con éxito en
algunos sistemas. En cualquier caso, cuantas más alternativas se exploren, mas
cerca estaremos de la obtención de un buen vector de transferencia.
En paralelo al desarrollo de vectores, los avances en el diseño del soporte
(promotores inducibles y específicos de tejido, secuencias reguladoras, aislan-
tes génicos, sistemas de integración, replicación episómica en el huésped...)
compensan y complementan a aquéllos, permitiendo una evolución integral del
sistema que posibilitará una mayor eficacia y una disminución de sus limitacio-
nes. Mientras tanto, vamos conociendo con mayor detalle los mecanismos bio-
lógicos que permiten la introducción de material genético heterólogo en una
célula y eso repercutirá positivamente en el diseño de las nuevas generaciones
de vectores.
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135
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
TERAPIA GÉNICA EN ENFERMEDADES

MONOGÉNICAS Y CÁNCER
Juan A. Bueren1 y Antonio Bernad2
1División
de Hematopoyesis y Terapia Génica. CIEMAT
2Departamento de Inmunología y Oncología
Centro Nacional de Biotecnología. CSIC
INTRODUCCIÓN
Los avances en el campo de la genética molecular están teniendo una im-

portante repercusión en nuestra capacidad para comprender, diagnosticar, y tra-
tar una variedad
de enfermedades
congénitas y ad-
quiridas. Así, la
posibilidad de in-
troducir genes en
células eucario-
tas ha permitido
dar comienzo a nuevos protocolos de marcado y de terapia génica Figura 1. Modalidades
humana (TG), que no resultaban abordables hace unos pocos básicas en las que se
fundamentan los protocolos
años, y que en esencia se fundamentan en dos estrategias que se 137
de transferencia y terapia
recogen en la Figura 1.
génica.
En términos teóricos existen dos posibilidades técnicas para realizar TG.

En primer lugar, podríamos plantear una "terapia de sustitución" en la que el
gen afectado (mutado) fuese sustituido por una versión correcta. Esta aproxi-
mación sería perfecta, puesto que el gen introducido se encontraría en su entor-
no natural y bajo los sistemas de control/regulación de la expresión fisiológica.
Sin embargo, debido fundamentalmente al bajo índice de recombinación homó-
loga demostrada en las células eucarióticas (incluidas las de mamífero), ésta
aproximación no se plantea en términos prácticos, aunque muchos grupos de
investigación trabajan activamente en el desarrollo de procedimientos para au-
mentar dicho fenómeno (Li J. y Baker M.D., 2000), y se han comunicado algu-
nos intentos con éxito (Hatada et al. 2000). En segundo lugar nos encontramos
con la denominada "terapia de adición", que pretende introducir una construc-
ción de diseño que permita aportar la función génica afectada, generar un cir-
cuito secundario que incida sobre las vías afectadas o promueva una respuesta
fisiológica que elimine las células malignas o defectivas. La mayoría de los
protocolos en desarrollo actualmente utilizan esta alternativa, combinando un
sinfín de posibilidades técnicas que vienen principalmente determinadas por el
tipo de afección con la que se enfrenta el equipo de investigación. El resumen
de la experiencia acumulada hasta el momento indica que no existe una fórmu-
la universal de TG. Cada patología, y por ende cada tipo celular afectado e in-
cluso cada paciente, tiene más posibilidades de éxito con un determinado pro-
cedimiento que con otro, y esto es necesario probarlo en la arena clínica.
En esencia, el proceso de TG se puede realizarse tanto in vivo (inoculando el
vector de transferencia en el paciente), como in vitro. En este caso, la transferencia
génica se realiza sobre células extraídas del paciente, las cuales, una vez modifica-
das genéticamente, serán reinoculadas en él mismo. En general, los vectores de
transferencia actuales presentan una eficacia de transducción notablemente superior
cuando éstos se utilizan in vitro sobre las células diana a transducir, frente a cuando
éstos se inoculan in vivo. Por ello, una gran parte de los protocolos actuales de TG
tienen su fundamento en la obtención, transducción y reinfusión de las células
transducidas. A pesar de ello, los vectores adenovirales, y en menor medida los re-
trovirales, se han comenzado a utilizar in vivo en protocolos de terapia génica anti-
tumoral, mediante inoculaciones directas en la masa tumoral del paciente.
138 La revista Journal of Gene Medicine ha reportado que a finales del año
2005 estaban en marcha un total de 678 ensayos clínicos de terapia génica
en fase I; 219 en fases I/II, 147 en fase II y tan sólo 32 en fases II/II ó III.
Los vectores retrovirales y los adenovirales son los vectores de uso más fre-
cuente en estos ensayos, pues cada uno de estos vectores se está utilizando
en un 25% de los protocolos. Le siguen los ensayos en los que se utiliza
DNA desnudo (16%), lipofección (8%), y el resto está muy repartido entre
ensayos que utilizan vectores adenoasociados, virus vaccinia, y hasta 20 ti-
pos diferentes de vectores.
TERAPIA GÉNICA DE ENFERMEDADES MONOGÉNICAS
Criterios para definir el vector de transferencia a utilizar
El éxito terapéutico de los tratamientos de TG depende fundamentalmente

de dos variables. En primer lugar, resulta necesario insertar eficazmente el trans-
gén en las células diana deseadas. Por otra parte, es también necesario que el
gen se exprese adecuadamente, produciendo niveles suficientes de la proteína
terapéutica. En el caso de enfermedades metabólicas asociadas a defectos gené-
ticos hereditarios, resulta evidente que la curación de la enfermedad sólo se ob-
tendrá cuando a las células de los tejidos afectados les llegue de manera estable
en el tiempo niveles umbrales de la proteína deficitaria. Una de las aproxima-
ciones más directas para lograr este objetivo es la de transducir la población ce-
lular afectada y/o sus células progenitoras con vectores que permitan la integra-
ción estable del transgén en el genoma celular. En los protocolos clínicos
diseñados al efecto, se han utilizado fundamentalmente vectores retrovirales, en
particular los derivados del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV).
En un grupo significativo de aplicaciones clínicas -por ejemplo las relacionadas
con la terapia de la hemofilia- se ha comenzado a hacer uso de vectores adenoa-
sociados (AAV). Tal como ocurre con los vectores retrovirales, estos vectores
permiten la inserción estable del transgén, si bien en este caso suelen ser varias
las copias integradas, con lo que parece que se consiguen mayores niveles de
expresión del transgén en las células diana. Los vectores lentivirales constituyen
también una herramienta ya considerada para su uso en protocolos clínicos de
TG humana, ya que mediante estos vectores se facilita la integración del trans-
gén en células poco o nada proliferativas, con lo que se confía poder transducir
139
de manera muy eficaz las células madre de los diferentes tejidos.
El esquema básico seguido

en estos ensayos clínicos es el
que se muestra en la Figura 2.
Las células de la médula ósea
del paciente se extraen de la
médula ósea, se purifican y se
translucen con los vectores te-
rapéuticos. Finalmente, la po-
blación conteniendo células
madre corregidas genéticamen-
te son infundidas en el pacien-
te, el cual en ocasiones puede
hacer recibido un tratamiento
submieloablativo para facilitar
el prendimiento del inóculo.
Figura 2. Correción genética
de células madre
hematopoyéticas de Principales enfermedades monogénicas que son
pacientes con objeto de terapia genética
enfermedades hereditarias.
Hasta que los laboratorios de genética molecular ofrezcan al-
ternativas eficaces para el tratamiento de mutaciones dominantes,
el tratamiento genético de las enfermedades metabólicas se está centrando en la
terapia de mutaciones monogénicas recesivas, en las cuales la expresión de una
copia funcional del correspondiente transgén pueda ser suficiente para la cura-
ción de la enfermedad.
En aquellas patologías metabólicas en las que no resulta posible o no es
del todo eficaz la administración exógena de la proteína deficitaria, se han
planteado alternativas de terapia celular o génica sobre estos pacientes. En rela-
ción a los protocolos clínicos de terapia celular, del orden de treinta enferme-
dades metabólicas pueden ser tratadas mediante trasplante de progenitores he-
matopoyéticos procedentes de donantes histocompatibles sanos. No obstante,
debido a las limitaciones de donantes histocompatibles y a los riesgos asocia-
dos al trasplante alogénico, una larga serie de enfermedades metabólicas mono-
génicas han sido consideradas para su tratamiento mediante la transferencia del
gen deficitario en las células que manifiestan la patología.
140 De todos los protocolos de TG de enfermedades asociadas a defectos mo-
nogénicos, a continuación se muestra el fundamento de algunos de los han sido
más relevantes, bien por su relevancia histórica, por su eficacia terapéutica o

por las expectativas generadas.
Inmunodeficiencias genéticas
Entre las inmunodeficiencias consideradas para su tratamiento genético
son de destacar las inmunodeficiencias severas combinadas asociadas a muta-
ciones en los genes de la Adenosina Deaminasa (ADA) y la inmunodeficiencia
SCID-X1.
La ausencia de la ADA implica una acumulación del sustrato desoxiadeno-
sina trifosfato en las células, resultando particularmente tóxico para los linfoci-
tos T (Figura 3). Ésta fue una de las primeras patologías en ser tratadas me-
diante protocolos de TG con vectores retrovirales, primero en el NIH de
Estados Unidos (Blaese et al., 1995; Khon et al., 1998), y luego en el Hospital
S. Raffaelle de Milán (Bordignon et al., 1993; 1995; Ferrari et al., 1992; Aiuti
et al 2002). Las dos alternativas que se han considerado para el tratamiento ge-
nético de esta enfermedad estuvie-
ron basadas en la transferencia del
gen ADA en las células T de pa-
cientes y también en células madre
hematopoyéticas (CMH). En todos
los casos se comprobó la presencia
de células transducidas en los pa-
cientes y evidencias de mejora en
su inmunocompetencia. Muy re-
cientemente se ha comunicado que
pacientes con deficiencia de ADA,
Figura 3.
que fueron acondicionados con protocolos poco agresivos y trasplan-
Inmunodeficiencia
tados con células de médula ósea corregida genéticamente, han podi- severa combinada ADA.
do hacerse independientes de la administración exógena del ADA
bovino y recuperado su función inmune (Aiuti et al 2002).
La inmunodeficiencia SCID-X1 representa aproximadamente la mitad de

todas las inmunodeficiencias severas y está asociada a un defecto en la cadena
γc, una proteína que forma parte de numerosos receptores de interleuquinas (Fi-
gura 4). La TG de estos pacientes se ha realizado mediante la transferencia de
141
la versión funcional del transgén a CMH, utilizando para ello técnicas optimi-
zadas de transferencia retroviral. Las

CMH se han trasplantado a once pa-
cientes no acondicionados, habiéndo-
se observado en diez de ellos la apa-
rición de células del sistema inmune
conteniendo el transgén y una eviden-
te mejoría clínica de los pacientes,
que les permitió abandonar las unida-
des de aislamiento a las pocas sema-
nas del tratamiento (Cavazzana-Calvo
et al., 2000).
Figura 4. Señalización por

receptores de citoquinas
Se considera que este protocolo, desarrollado en Francia por
en la inmunodeficiencia el grupo de A. Fischer, es el primer protocolo de TG de una enfer-
X1-SCID. medad metabólica que ha demostrado una eficacia terapéutica in-
cuestionable. Desgraciadamente, dos de los once pacientes actual-
mente tratados han desarrollado una leucemia linfocítica como
consecuencia de la activación del oncogén LMO2 en las células que habían in-
corporado el gen terapéutico. Esta observación supone, por tanto, también el
primer efecto patogénico asociado a una inserción retroviral en un paciente, y
pone de manifiesto la necesidad de evaluar el delicado equilibrio
beneficio/riesgo asociado a la práctica de la TG insercional (Hacein-Bey-Abina
et al 2003) en cada indicación clínica.
La granulomatosis crónica constituye otra inmunodeficiencia que ha
recibido atención particular para su tratamiento genético. Esta enfermedad
se caracteriza por un fallo por parte de las células fagocíticas para generar
el anión superóxido, por lo que se manifiesta mediante un síndrome recu-
rrente de infecciones y formación de granulomas (Figura 5). Estudios expe-
rimentales sugieren que la corrección genética de aproximadamente un 5%
de los granulocitos circulantes será suficiente para reportar un beneficio te-
rapéutico (Malech et al., 1999). Los estudios clínicos basados en el tras-
plante de células CD34+ transducidas sobre pacientes no acondicionados
no han mostrado beneficio terapéutico. No obstante, un ensayo clínico co-
menzado en Alemania con pacientes sometidos a un modelo de acondicio-
142 namiento modesto con busulfán ha evidenciado mejoría clínica en los dos
pacientes tratados.
Como conclusión
a los estudios realiza-
dos para tratar genéti-
camente pacientes con
enfermedades mono-
génicas, la Figura 6
muestra el número de
pacientes con inmu-
nodeficiencias seve-
ras, así como los que
han mostrado eviden-
cias de mejoría clíni-
ca. De estos estudios
se pone de manifiesto
que existe un número
de enfermedades mo-
nogénicas, para las Figura 5. Granulomatosis
cuales la terapia génica co- crónica.
mienza a ser una realidad

terapéutica. En este mo-
mento, son las cuestiones
de seguridad las que limi-
tan el mayor desarrollo de
estos ensayos en la clínica
(Ver apartado 4).
Enfermedades
de acumulación
de sustratos tóxicos
Un número relativa-
mente elevado de genes se
han asociado a este tipo de
Figura 6. Beneficio clínico
enfermedades. De entre todas ellas, la enfermedad de Gaucher es la
de pacientes con
más frecuente, por lo que ésta es la enfermedad de acumulación li- inmunodeficiencias
sosomal que ha sido objeto de más estudios de TG. La enfermedad tratados mediante
143
de Gaucher está asociada a una deficiencia en glucocerebrosidasa terapia génica.
(GC), por lo que se presentan importantes acumulaciones de glucocerebrósido

en macrófagos y en células derivadas de los mismos, produciéndose patologías
de la médula ósea, hígado, bazo y cerebro. Para que la TG de esta patología sea
eficaz se requerirá, por tanto, que las células corregidas alcancen órganos hema-
topoyéticos y no hematopoyéticos. En particular, para el tratamiento de la pato-
logía que afecta a la microglía del sistema nervioso central será necesario que
las células modificadas genéticamente migren al SNC y confieran allí el efecto
necesario sobre la manifestación neurológica. Hasta el momento se han realiza-
do pocos estudios piloto, aunque los mismos se encuentran todavía en fases
tempranas de estudio clínico. Otras enfermedades de acumulación de sustratos,
tales como la mucopolisacaridosis de tipo II (síndrome de Hunter) han recibido
atención para su tratamiento genético, aunque su desarrollo no se encuentra tan
avanzado como en el caso de la enfermedad de Gaucher.
Hemofilia
Tanto la hemofilia A, producida como consecuencia de un defecto en la pro-
ducción del factor VIII de coagulación, como la hemofília B, asociada al defecto
en el factor IX, han sido consideradas para su tratamiento por TG. Un estudio clí-
nico reciente (Kay et al., 2000) ha mostrado las primeras evidencias de eficacia clí-
nica asociada al tratamiento con vectores AAV que codifican el factor IX. En este
estudio, los vectores AAV se inocularon en el músculo de pacientes de hemofilia
B, obteniéndose resultados que sugieren que la hemofilia B podría transformarse
en una enfermedad más leve mediante la aproximación genética propuesta.
Enfermedades asociadas a defectos en la hemoglobina

La talasemia-β y la anemia falciforme constituyen las dos patologías de
este grupo más estudiadas para su tratamiento mediante TG. Constituyen las
dos enfermedades monogénicas más frecuentes, y su patología molecular ha si-
do ampliamente investigada. El remplazamiento de la globina-β, defectiva o
ausente en pacientes con talasemia β puede ser curativa. Los altos niveles de
expresión del gen que codifica la globina-γ normal en las células eritroides de
pacientes con anemia falciforme, se confía que sean beneficiosos, debido al en-
samblaje preferente de los tetrámeros α y γ, y la relativa inestabilidad de las
144 cadenas βs. La TG de esta enfermedad requerirá, sin embargo, muy altos nive-
les de expresión del transgén, lo cual supone una taréa todavía pendiente.
Anemia de Fanconi
La anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad autosómica recesiva poco
frecuente entre la población, pero de muy mal pronóstico. Los pacientes suelen
desarrollar anomalías congénitas múltiples (en un 65% de los casos), fallo de
médula ósea y predisposición a cáncer. En promedio, la manifestación de la
aplasia se observa alrededor de los 8 años de edad, siendo la supervivencia me-
dia de estos pacientes de 16 años. Una de las características de esta enferme-
dad que la hacen particularmente apropiada para su tratamiento por TG radica
en la ventaja selectiva que parecen tener las células corregidas, respecto a las
células defectivas en los genes de Fanconi. La AF es consecuencia de mutacio-
nes o deleciones en cualquiera de los ocho genes que en la actualidad se sabe
están implicados en una función celular relacionada con la estabilidad del ge-
noma de estas células. Los resultados publicados sobre los ensayos realizados
en fase I no manifiestan beneficios terapéuticos evidentes (Liu et al., 1999). No
obstante, nuevos ensayos con protocolos optimizados de transducción están ac-
tualmente en marcha.
Fibrosis quística
El gen de la fibrosis quística (FQ) está localizado en el cromosoma 7 y
posee un tamaño de 6,7 kB. En un 75% de los pacientes enfermos de FQ la
enfermedad se produce por un defecto en la posición 508. Como conse-
cuencia de las deficiencias de este gen se produce una alteración física y
química de las secreciones de las vías respiratorias y de las enzimas pan-
creáticas. Como consecuencia del defecto en el transporte del cloro entre
las células, las mucosidades se hacen muy densas, dificultando la expulsión
del moco bronquial y facilitando su infección con patógenos difíciles de
eliminar. La TG prioritaria de esta enfermedad radica en la inserción del
gen de la FQ en las células respiratorias. Hasta la actualidad se han desa-
rrollado diversos ensayos clínicos en fase I utilizando vectores adenovira-
les, adenoasociados y liposomas (Alton et al., 1998). Los protocolos con
vectores adenovirales han mostrado ventajas respecto a su eficacia de trans-
ducción de las células diana; sin embargo, también han puesto de manifies-
to su inmunogenicidad, al haberse generado anticuerpos que neutralizaron
la eficacia de los vectores adenovirales. Es de esperar que los protocolos
actuales, con vectores menos inmunogénicos y más eficaces, faciliten la 145
mejoría clínica de estos pacientes.
TERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER (TGC)
En los años 60 y 70 se sucedieron las primeras propuestas teóricas para el

tratamiento de enfemedades humanas mediante la introducción de material ge-
nético en los órganos o células afectados. En 1968 se reportó el primer experi-
mento en el que se utilizó un virus oncogénico modificado como transportador
de material genético potencialmente terapeútico (Rogers S. y Pfuderer P. 1968).
Hubo que esperar al año 1979 hasta que apareciera el primer modelo animal
(Andreson W.F. y Fletcher J.C. 1979), lo que catapultó la investigación general
en el área. Sin embargo, la aplicación al campo de la terapia en cáncer se retra-
só hasta el año 1987, cuando se abordó el tratamiento de leucemias (Howell et
al. 1987; Merz, B. 1987; Bank et al. 1987).
Biología molecular del cáncer

El principal problema al que se en-
frenta la TGC es que, en sus formas
más habituales, no se trata de una en-
fermedad monogénica y las células can-
cerígenas presentan un gran número de
anomalías genéticas y cromosómicas.
Por tanto, las filosofías y formas de tra-
bajo habituales en el campo, más cen-
tradas en conseguir una mayor eficien-
cia de transducción en los órganos
diana, son sólo una parte del problema
en la TGC.
En base a esta premisa general, ha
sido necesario avanzar en el conoci-
miento molecular y fisiológico del
enemigo a batir, antes de contar con
Figura 7. Bases
herramientas suficientemente eficaces para afrontar el reto que
moleculares del cáncer
supone conceptualmente. Actualmente, y contando con que en ca-
(Adaptada de Hanahan
2000). da tipo de tumor humano los circuitos implicados principales
pueden ser distintos, conocemos varios principios de la fisiología
146 tumoral sobre los que poder incidir con garantías razonables de
éxito. Las principales vías afectadas (en solitario o en combina-
ción) en los tumores humanos (Hanahan, D. y Weinberg, R.A., 2000), y en

las que se conocen genes importantes, son las siguientes (ver Figura 7):
1) Bloqueo de los programas de muerte celular programada.

2) Insensibilidad a señales antiproliferativas.
3) Generación de circuitos de supervivencia alternativos.
4) Proliferación descontrolada.
5) Invasividad y metástasis.
6) Inducción de angiogénesis asociada al desarrollo de tumores sólidos.
Todas estas vías pueden cooperar sin solución de continuidad y dependien-

do del tumor humano concreto, de forma casi aleatoria (al menos poco predeci-
ble), por lo que ha sido necesario acumular esta información antes de poder
realizar un diseño terapéutico racional. Esta situación se resume en varias si-
nergias bien caracterizadas en tumores humanos.
Este desarrollo ha llevado a un cambio conceptual del "tumor", asu-

miéndose actualmente que se trata de un nuevo "tejido", con necesidades fi-
siológicas específicas. Frente a la visión "reduccionista" del tumor, asu-
miendo que es un
conjunto de célu-
las, relacionadas
clonalmente pero
heterogéneas por
su inestabilidad gé-
nica intrínseca, la
nueva visión emer-
gente entiende el
tumor como un
"neotejido" en
constante evolu-
ción, con unas ne-
cesidades cambian-
Figura 8. El tumor como
tes, tanto en términos metabólicos como protectores. El tumor
un tejido complejo.
genera señales y sustancias que "manipulan" su entorno fisioló- 147
Adaptada de Hanahan
gico en su propio beneficio; se está jugando su propia supervi- y Weinberg (2000).
vencia. Los tumores primarios crecen autónomamente hasta que sus necesi-
dades nutricionales les obligan a reclutar más recursos. Este es un momento
crítico (denominado angiogenic switch) en el que el tumor se estructura
atrayendo células de soporte, promueve la neovascularización de su entorno
(angiogénesis) y atrae células inmunes circulantes y las estimula para que
secreten metaloproteasas (p.e.) para favorecer su expansión y extravasación
(Figura 8).
En cada una de las vías anteriormente descritas se conocen algunos de los

mediadores o reguladores moleculares principales (master genes) sobre los que
se plantean las distintas aproximaciones terapéuticas. Dependiendo de cuál sea
la vía principal y cuál el mecanismo molecular afectado, los argumentos y es-
trategias terapéuticas son diferentes. A modo de ejemplo, ya que es imposible
ser exhaustivo en el marco de esta charla, comentaremos las principales estra-
tegias desarrolladas y los protocolos técnicos asociados.
Terapia génica
del cáncer
Lo primero a
tener en cuenta es
que los tratamientos
clínicos contra el
cáncer son tremen-
damente eficaces,
eliminando un altí-
simo porcentaje de
las células maligni-
zadas. Los proble-
mas fundamentales
derivan bien de la
agresividad de los
Figura 9. Definición
tratamientos, de la
de dianas en terapia aparición de quimioresistencias cruzadas, o bien de la existencia de
génica antitumoral. pequeños focos que no se eliminan y que pueden dar lugar a la rea-
148 Adaptada de Hanahan parición de los procesos neoplásicos. En la actualidad, la mayoría
y Weinberg (2000). de los procedimientos desarrollados en base a la utilización de TGC
distan mucho de ser capaces de sustituir a los tratamientos clínicos actuales,

aunque pueden aspirar a combinarse con ellos.
La Figura 9 presenta de forma muy esquemática las principales estrate-
gias, agrupadas de acuerdo con las distintas vías implicadas en la transforma-
ción tumoral.
En términos generales, si el principal proceso afectado es la eliminación de los

mecanismos de control negativo de la proliferación, se intentan introducir versiones
correctas de estos genes (p.e. los genes p53 o p16; Chen y col, 2000; Swisher S.G.
y Roth, J.A., 2000; Cowen et al., 2000; Kawacabe et al., 2000). Si el defecto con-
siste en la resistencia a los mecanismos naturales de inducción de muerte celular
programada, se intentan expresar genes que la pueden promover o hacerla más
efectiva (caspasas, FasL, etc). Un buen ejemplo es el tratamiento de gliomas me-
diante la expresión de caspasa-8 con vectores adenovirales (Shinoura et al., 2000)
Si el tumor es muy dependiente de la inducción de neovascularización o es muy
propenso a metastatizar, se introducen genes que puedan bloquear o disminuir di-
chos procesos (VEGF-R, análogos de angiostatina, moduladores de integrinas o
metaloproteasas, etc; Chen et al., 2000; Carmeliet, 2000; Abruzzese et al., 2000).
Los procedimientos empleados para realizar la transferencia génica son
muy variados y dependen fundamentalmente de la biología y fisiología del tu-
mor, pero esta etapa es crítica para el resultado final del tratamiento. Se emple-
an vectores virales (adenovirus, adeno-asociados, virus herpes, retrovirus, y
vectores derivados de lentivirus), vectores no-virales (liposomas, dendrímeros,
péptidos, bombardeo con micropartículas de oro que transportan las construc-
ciones génicas, etc), y el procedimiento puede ser in vivo o ex vivo.
Como es imposible en esta presentación hacer una revisión exhaustiva de
todo el panorama en desarrollo del área, nos restringiremos a aquellas aproxi-
maciones más específicas del campo o aquellas que más se han desarrollado.
Una rama especialmente desarrollada en la TGC es la introducción de genes
pro-citotóxicos en las células tumorales (fundamentalmente la timidina kinasa del vi-
rus herpes-HSV-TK-, y la proteína citidin-deaminasa -CDA-) lo que las susceptibiliza
a distintos compuestos (el más empleado es el ganciclovir, GCV) de forma diferen-
cial con respecto a las células sanas. La administración de estas sustancias al modelo
animal o al paciente elimina las células tumorales transducidas y aquéllas que se en-
cuentran en sus cercanías por un fenómeno conocido como "bystander", que está me-
149
diado por la transferencia de la droga metabolizada a las células circundantes.
Dos son los modelos tumorales que más atención han recabado de las expec-
tativas de la TGC, y lógicamente, son los tumores que peor pronóstico presentan
con los tratamientos clínicos actuales: glioma maligno y melanoma avanzados. El
tratamiento de gliomas ha sido evaluado por numerosos autores (revisado por
Klatzman et al., 1998), obteniendo resultados variables. Sandmair y col. han com-
parado la eficiencia del tratamiento, bien utilizando vectores retrovirales, bien con
adenovirus (Sandmair y col. 2000). Sus resultados demuestran claramente que los
efectos secundarios del tratamiento son aceptables, y que los pacientes tratados
con vectores adenovirales han mostrado una duplicación del tiempo de supervi-
vencia (MRI), 15.0 meses, en comparación con los pacientes tratados con vectores
retrovirales, 7.4 meses, y el grupo control, 8.3 meses.
De 1998 a febrero de 2000 se han hecho públicos varios estudios clínicos
(Fase I/II) para el tratamiento de pacientes con melanoma cutáneo maligno y me-
tastásico, mediante la administración intra-lesión de vectores adeno expresando
HSV-TK en combinación con dosis escaladas de ganciclovir (Klantzman et al.,
1998; Morris et al. 2000). En estos estudios se pretende determinar la dosis máxi-
ma de GCV que puede ser administrada en combinación con la administración au-
torizada del vector, evaluar la tasa terapéutica objetiva del ensayo y determinar si
existe efecto "bystander" en otras localizaciones lejanas al punto de tratamiento.
Esta estrategia es bastante efectiva, aunque todavía presenta algunos in-
convenientes como los derivados de: 1) aparición de células tumorales resisten-
tes al tratamiento, 2) eficiencia del proceso de transferencia y 3) generación de
inmunogenicidad por la expresión de una proteína de origen bacteriano (TK).
De forma adicional existe una rama casi exclusiva de la TGC que lidia
con mejorar la respuesta inmune del organismo frente a los tumores (inmunote-
rapia bioquímica y/o celular). En esta aproximación se utilizan también distin-
tas aproximaciones que se pueden resumir en las siguientes:
1) Aislamiento, amplificación ex vivo, modificación génica (en algunos
casos) y retrasplante en el paciente de linfocitos autólogos del paciente (TILs,
LAKs, ALTs) que presentan afinidad por el tumor (Weijtens et al., 1998; Bol-
huis R.L. y Gratama J.W., 1998).
2) Inmunización con DNA de oncogenes tumor-específicos (p.e - neu en
el caso de cáncer de mama-; Reilly et al., 2000; Amici et al., 2000).
3) Generación de vacunas autólogas, utilizando células tumorales inacti-
150 vadas, primando células dendríticas (revisado por Kirk C. y Mule J., 2000), o
potenciando la inmunogenicidad de las células tumorales mediante la introduc-
ción de genes que favorecen el proceso (HGFs, ILs, moléculas accesorias, etc).
Ésta es una de las aproximaciones más evaluadas, con distintas filosofías. Mi-
ller y col. han demostrado que la administración intratumoral de células dendrí-
ticas modificadas con adenovirus que expresan IL-7, aumenta la respuesta in-
mune antitumoral (cáncer de pulmón) hasta conseguir su erradicación (Miller
et al., 2000). El tratamiento del melanoma también se ha intentado mediante
técnicas de vacunación. Osanto y col. han publicado el tratamiento con éxito
de 33 pacientes afectados por melanoma metastásico, mediante su vacunación
con una línea celular de melanoma alogénica, manipulada para producir IL-2
(Osanto et al., 2000). Otros autores han tratado cinco pacientes con células tu-
morales autólogas transducidas para que secreten GM-CSF (Chang et al.,
2000), demostrando una remisión total en uno de los pacientes.
Cualquiera de estas aproximaciones presenta la gran ventaja respecto a los
tratamientos más convencionales que, al menos teóricamente, sería capaz de al-
canzar los reservorios residuales del tumor (santuarios) que no son eliminables
por las terapias convencionales (cirugía, quimio y radioterapia), por lo que los
tratamientos más prometedores podrían ser utilizados en combinación con los
que actualmente se utilizan en clínica. Desde mi modesta opinión, estas aproxi-
maciones parecen las más realistas y prometedoras para aumentar el arsenal te-
rapéutico en la lucha contra el cáncer.
Finalmente se han introducidos nuevos vectores virales citotóxicos con una
particularidad esencial: se replican y amplifican preferentemente en las células tu-
morales (conditional replication-competent vectors). Actualmente existen varios
modelos preliminares (Alemany et al., 2000; Rancourt et al., 1999) que necesitarán
una posterior etapa de refinamiento y de bioseguridad, pero que son muy interesan-
tes. En este último estudio se ha desarrollado un modelo para controlar la produc-
ción de partículas infecciosas tras la infección con un vector adenoviral (Ad5dl312)
al que se le había delecionado la función E1A, y sustituido por una función de sín-
tesis activada por IL-6. La generación de partículas infecciosas depende de la pro-
ducción celular de IL-6, por lo que el modelo terapéutico tiene un gran interés en
tumores que poseen un ciclo autocrino de IL-6, como el cáncer de ovario.
Una variante de esta última aproximación, que todavía se encuentra en fa-

se de desarrollo, es la utilización de vectores retrovirales replicativos (RRV).
Solly y col. han publicado recientemente un primer estudio en el que comparan
151
la eficacia de transducción in vivo de los RRV (>85%) en comparación con los
vectores convencionales (<1%), para modificar masas tumorales desarrolladas

en modelos animales inmunocompetentes; los autores proponen el uso de estos
modelos para el tratamiento de tumores cerebrales en los que han demostrado
una eficiencia 1.000 veces mayor que los adenovirus deficientes en replicación
(Solly et al., 2003). Si se consiguen derivar vectores RRV condicionales se ob-
tendrá una nueva y valiosa herramienta para la lucha contra el cáncer mediante
técnicas de manipulación genética.
LA SEGURIDAD EN TERAPIA GÉNICA
Problemas ocurridos en el tratamiento de la deficiencia

de la Ornitín Transcarbamilasa
Esta es una enfermedad en la que los pacientes carecen de una enzima cla-
ve del metabolismo de aminoácidos -la Ornitín Transcarbamilasa (OTC)- lo
que da lugar a una acumulación potencialmente fatal de amoniaco en la sangre.
Puesto que la actividad OTC está normalmente presente en el hígado, se consi-
dera que éste es el tejido diana de vectores que expresen la versión correcta del
gen OTC. En virtud de la eficacia de los adenovirus para infectar células hepá-
ticas, se propuso utilizar tales vectores para transducir las células hepáticas de
estos pacientes con el gen OTC. Estudios in vitro, y también en animales de
experimentación, mostraron la eficacia del protocolo propuesto. El tratamiento
de 17 pacientes con dosis progresivamente crecientes del vector no manifestó
efectos tóxicos severos. No obstante, en uno de los pacientes tratados con la
dosis más alta se manifestó un proceso febril seguido de inflamación hepática
y aumento descontrolado de los niveles de amonio, dando lugar a la entrada en
coma del paciente. Lamentablemente el paciente falleció poco después, estando
todavía en investigación la causa primaria de su muerte. El fallecimiento de es-
te paciente como consecuencia de la inoculación del vector viral disparó las
alarmas de los organismos reguladores, principalmente en lo que se refiere a la
inoculación in vivo de vectores de la familia de los adenovirus. En la actuali-
dad se han generado nuevos vectores adenovirales desprovistos de la mayor
parte del esqueleto viral implicado en la inmunogenicidad de los mismos, por
152 lo que se confía en que su uso prevenga de la generación de respuestas inmu-
nogénicas no previstas.
Incidencia de leucemias en pacientes X1-SCID tratados

mediante terapia génica
Desgraciadamente, tres de los diez pacientes X1-SCID que han sido trata-
dos en el Hospital Necker, mediante terapia génica, han desarrollado leucemias
asociadas a la inserción del gen terapéutico en la proximidad de oncogenes
(Hacein-Bey-Abina et al. 2003). De particular significado ha sido la observa-
ción que en dos de estos pacientes la inserción se ha observado próxima al on-
cogén LMO2, implicado en leucemias linfocíticas. Como se recoge en la Figu-
ra 10, en ninguno de los otros protocolos en marcha, ni tampoco en los
pacientes X1-SCID tratados en Londres, se han observado efectos adversos se-
veros similares.
El conocimiento de las bases moleculares por las cuales se han producido

las leucemias en estos pacientes aún está por resolver. No obstante, estas evi-
dencias sugieren la conveniencia de proseguir los trabajos que tienen por obje-
to mejorar la seguridad de
los vectores dirigidos a
tratar pacientes por esta
nueva aproximación tera-
péutica.
Como también suce-
dió con la quimioterapia o
la radioterapia, los prime-
ros efectos severos adver-
sos asociados a la terapia
génica también han que-
dado ya de manifiesto. En
los próximos años los in-
vestigadores habrán de ser
capaces de demostrar que Figura 10. Incidencia
la relación entre el beneficio clínico y el riesgo asociado a la tera- de efectos adversos
pia génica es positiva para el paciente. Este hecho repercutirá en la severos en pacientes
expansión de una nueva herramienta terapéutica para pacientes que con inmunodeficiencias
tratados con 153
no tienen otra opción terapéutica eficaz.
terapia génica.
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155
Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología
FARMACOCINÉTICA DE LOS MEDICAMENTOS

OBTENIDOS POR BIOTECNOLOGÍA
Alfonso Domínguez-Gil Hurlé. Servicio de Farmacia. Hospital Universitario de Salamanca
FARMACOCINÉTICA
Toda sustancia con actividad farmacológica queda definida no solamente

por su configuración estructural sino también por sus propiedades físico-quími-
cas y biológicas, entre las que se incluye el perfil farmacocinético que cuantifi-
ca, mediante diversos parámetros, los procesos de absorción, distribución, me-
tabolismo y excreción1.
La farmacocinética se ha consolidado durante los últimos años como una
disciplina de gran interés sanitario. Su aplicación se dirige, principalmente, hacia
el desarrollo de nuevos medicamentos y a la optimización de los tratamientos
farmacológicos2. Otras aplicaciones menos conocidas son la detección diagnósti-
ca de respuestas anómalas, el análisis retrospectivo de errores terapéuticos o tra-
tamientos inadecuados y las actividades educativas encaminadas a asegurar el
uso seguro y eficaz de los medicamentos. Dentro de la investigación farmacoló-
gica, la farmacocinética puede dirigirse también a la resolución de aspectos clíni-
cos concretos como la detección de interacciones, problemas de biodisponibili-
dad o a la definición de parámetros útiles para el diseño de regímenes de
dosificación individualizados. La farmacocinética es hoy de gran utilidad para to-
157
dos aquellos profesionales implicados en el desarrollo, evaluación y uso de los
medicamentos. La far-
macodinamia expresa
la variación del efecto
con la concentración y
asociada a la farmaco-
cinética constituye la
base para la definición
de la respuesta en los
tratamientos farmaco-
lógicos.
Figura 1. Relación de la La actividad intrínseca que presenta un fármaco es condición
farmacocinética y necesaria, pero no suficiente, para asegurar la eficacia terapéutica. El
farmacodinamia
fármaco precisa, necesariamente, alcanzar su lugar de acción, no
con la respuesta
siempre bien definido, en ocasiones difícilmente accesible o cuya ac-
terapéutica.
cesibilidad se modifica con la gravedad de la enfermedad. Para ello
se puede requerir, por ejemplo, una biodisponibilidad elevada, una
amplia distribución tisular o un lento aclaramiento plasmático. Unas propieda-
des farmacocinéticas desfavorables pueden llegar a condicionar el potencial te-
rapéutico de un nuevo fármaco y aconsejar la interrupción de los ensayos clíni-
cos programados en su desarrollo. La Figura 1 muestra esquemáticamente la
contribución de la farmacocinética y la farmacodinamia en la respuesta a un
tratamiento farmacológico3.
Es posible establecer distintos tipos de relaciones entre la farmacocinética
y la farmacodinamia de péptidos y proteínas de interés terapéutico. Así, los va-
lores del área bajo la curva de niveles séricos de algunos agentes trombolíticos
se correlacionan directamente con la permeabilidad en el infarto vascular. Un
modelo PK-PD ha sido utilizado para el diseño de las pautas de dosificación de
reteplasa, un agente trombolítico recombinante.
Con frecuencia no es posible establecer, para péptidos y proteínas, una re-
lación directa concentración-efecto debido a que la variable medida suele ser la
resultante a dos o más procesos cinéticos que ocurren después de la fijación a
receptores. La Figura 2 recoge el modelo PK-PD con respuesta indirecta esta-
blecido para la hormona de crecimiento utilizando diferentes vías de adminis-
tración4. En algunos casos, se requieren modelos PK-PD complejos para poder
158 definir una relación entre las concentraciones séricas y la respuesta, como se ha
demostrado con interleuquina-2, eritropoyetina, etc.
Los resultados
obtenidos en los estu-
dios farmacocinéticos
junto a los procedentes
de los ensayos de efi-
cacia y seguridad con-
figuran el perfil farma-
cológico de un nuevo
medicamento, permi-
tiendo establecer los
principios básicos para
Figura 2. Modelo
su correcta utilización en la práctica clínica.
farmacocinético-
La investigación de nuevos fármacos se orienta, con frecuencia, farmacodinámico
a mejorar algunas características farmacocinéticas, especialmente la establecido para la
absorción gastrointestinal, la distribución tisular y la velocidad de hormona de crecimiento.
eliminación. Ello se consigue mediante cambios en la estructura quí-
mica o en la formulación farmacéutica que puede modificar la cinética de libe-
ración, el acceso a los tejidos e incluso los procesos de metabolismo y excre-
ción5. Estos cambios permiten mejorar la efectividad de los tratamientos bien
por cambios en el perfil de la respuesta o facilitando la administración y mejo-
rando el cumplimiento de la prescripción.
La estructura química que presentan la mayoría de los productos biotecno-
lógicos condiciona algunas propiedades, que pueden dificultar su utilización te-
rapéutica y que se refleja en su perfil farmacocinético. Entre ellas destacan la
baja biodisponibilidad por vía oral, ciertas exigencias en la distribución tisular
y celular y un aclaramiento plasmático elevado.
MEDICAMENTOS BIOTECNOLÓGICOS
Los medicamentos obtenidos por Biotecnología constituyen una clase tera-

péutica emergente en la clínica que presenta unas características diferenciales
no solo por su origen, sino también por su estructura química y algunas propie-
dades farmacocinéticas y farmacológicas.
Aunque la biotecnología moderna nace en 1953 al conocerse la estructura 159
del ácido desoxirribonucleico (ADN), su incorporación a la terapéutica humana
no se produce hasta comienzos de los años 80 con la utilización de la insulina

y de la hormona de crecimiento recombinantes en terapia sustitutiva. Desde en-
tonces se han incorporado al arsenal terapéutico unos 100 medicamentos, aun-
que cerca de 700 moléculas, para el tratamiento de unas 250 enfermedades, se
encuentran en diferentes fases de investigación clínica. Diversos analistas clíni-
cos coinciden en afirmar que los medicamentos biotecnológicos llegarán a re-
presentar, en un futuro, el 20-25% de todos los recursos farmacológicos6.
Los medicamentos biotecnológicos incluyen proteínas obtenidas por inge-
niería genética, anticuerpos monoclonales producidos mediante la tecnología
del hibridoma, vectores para el transporte de material genético, fragmentos de
anticuerpos, oligonucleotidos antisentido, vacunas, etc. Estos productos presen-
tan algunas características que los diferencia de los medicamentos tradiciona-
les. Su estructura química, por ejemplo, es más compleja ya que se trata, con
frecuencia, de proteínas que contienen un número elevado de aminoácidos (fil-
gastrin 174, somatropina 191, alteplasa 527, etc.) con una determinada secuen-
cia, con especificidad en el número y localización de los puentes disulfuro e
incorporación de una o varias moléculas de carbohidratos que son necesarias
para la actividad biológica. La cadena proteica puede presentar, además, héli-
ces en distinto número, tamaño y configuración. Asimismo, algunas proteínas
activas requieren la asociación de varias subunidades proteicas para formar un
gran agregado activo, estructura cuaternaria, como ocurre, por ejemplo con el
interferon-α-1b formado por dos proteínas idénticas de 165 kDa unidas por
uniones no covalentes7.
BIODISPONIBILIDAD ORAL
Los péptidos y proteínas presentan una baja biodisponibilidad por vía oral,
generalmente inferior al 1%, por lo que en principio no son candidatos idóneos
para utilizar esta vía de administración. Ello es debido a su inestabilidad en el
medio fuertemente ácido del estómago, al efecto producido por las peptidasas
intestinales, y especialmente a su escasa permeabilidad como consecuencia del
tamaño molecular, la carga eléctrica y la elevada polaridad. La mayoría de las
proteínas recombinantes se incluyen dentro de la clase III del sistema de clasi-
160 ficación biofarmacéutica; solamente algunas pertenecen a la clase IV y es ex-
cepcional que algunas biomoléculas se incluyan en la clase I. Es decir, los pro-
ductos obtenidos por Biotecnología suelen presentar una solubilidad en agua

alta o moderada y una permeabilidad intrínseca baja o muy baja8.
La capacidad de los fármacos para atravesar las barreras biológicas consti-
tuye un parámetro biofarmacéutico de gran interés del que depende no sólo la
absorción, sino también la distribución, metabolismo y excreción. Aunque las
diferentes membranas biológicas presentan unas características específicas, los
principales constituyentes siempre son: fosfolípidos, colesterol, esfingolípidos y
glicolípidos. Por tanto, para que un fármaco supere las diferentes membranas
biológicas y alcance su lugar de acción debe presentar un balance adecuado en-
tre hidrofilia y lipofilia, que se expresa habitualmente por el coeficiente de re-
parto octanol-agua (P) o más fácilmente por log P. Este parámetro es un buen
predictor de la permeabilidad de muchos fármacos y puede ser correlacionado
con diversos parámetros farmacocinéticos. Ello no es posible cuando se trata
de péptidos y proteínas, debido a que en su estructura están presentes numero-
sas funciones polares que forman puentes hidrógeno con los grupos hidroxilo
de la fase acuosa. Los péptidos presentan, en consecuencia, coeficientes de re-
parto más altos, que no se corresponden con la permeabilidad. No obstante,
pueden obtenerse buenas correlaciones cuando se determina el número de
puentes de hidrógeno potenciales que pueden establecerse con el agua. Los co-
eficientes de reparto heptano-etilenglicol o la diferencia entre los coeficientes
de reparto octanol-agua y ciclohexano-agua (ΔlogP) permiten estimar los puen-
tes hidrógeno o la desolvatación potencial de las moléculas peptídicas que son
buenos predictores de la permeabilidad. De esta forma es posible anticipar el
efecto de las modificaciones estructurales en la absorción oral de péptidos de
interés terapéutico, lo que es de gran utilidad en el desarrollo de nuevas molé-
culas. La desolvatación potencial que presentan diferentes péptidos ha podido
ser relacionada con parámetros farmacocinéticos que describen el proceso de
absorción como Cmax y AUC.
Factores fisiológicos como el tiempo de tránsito gastrointestinal, la dilu-
ción y las interacciones con componentes de los alimentos reducen la fracción
de dosis disponible para la absorción de péptidos y proteínas. Finalmente, el
efecto del "primer-paso" y las "bombas de eflujo" también son responsables de
la escasa biodisponibilidad oral que presentan los productos obtenidos por bio-
tecnología.
La Figura 3 muestra algunos de los factores más importantes que reducen
161
la biodisponibilidad oral de moléculas proteicas.
Pese a esta situa-

ción, sabemos que al-
gunos medicamentos
con estructura peptídi-
ca como antibióticos
β-lactámicos, inhibi-
dores de la ECA o la
ciclosporina presentan
valores de biodisponi-
bilidad que permiten
su administración por
Figura 3. Efecto del vía oral y tienen acreditado su valor terapéutico. Asimismo, peque-
metabolismo y del ños péptidos procedentes de la digestión de las proteínas de la dieta
contratransporte por o incluso algunos antígenos naturales solubles se absorben intactos.
gliclop-P en la
A diferencia de otros fármacos algunas proteínas recombinantes
biodisponibilidad oral de
presentan una actividad intrínseca muy elevada, hasta el punto de po-
proteínas.
der admitir que una biodisponibilidad del 10% podría ser suficiente
para alcanzar los objetivos terapéuticos cuando se administran por vía oral.
La Figura 4 recoge algunas de las alternativas en desarrollo para mejorar
la biodisponibilidad oral de péptidos y proteínas.
Figura 4. Proteínas por vía oral: ¿es posible?

- Modificaciones estructurales:
• Emisphere Technologies y Nobex Corporation (insulina, hormona del
crecimiento y paratohormona).
• Generes Biotechnology Corp: Oral-lyn® (oral insulin spray*).
- Sistemas endógenos de transporte celular:·
• Inhibidores de la P-glicoproteína, G-CSF-transferrina.
- Partículas como sistemas de transporte:
• Liposomas recubiertos con mucoadhesivos, hidrogeles.
- Nanosistemas (<500 nm):
• Nanopartículas vectorizadas (β1 Integrinas, lectinas).·
162 • Vacunas orales.
*primera formulación oral de insulina comercializada
ADMINISTRACIÓN PARENTERAL
Debido a las limitaciones de la vía oral, los péptidos y proteínas se admi-

nistran habitualmente por vía parenteral, preferentemente endovenosa. La ma-
yoría de estas moléculas presentan un rápido aclaramiento, lo que conduce a
valores bajos en la semi-vida de eliminación
Los problemas que surgen con la administración parenteral de macromolé-
culas que presentan un rápido aclaramiento ha estimulado el desarrollo de dife-
rentes actuaciones dirigidas, en principio, a modificar el perfil farmacocinético
y, en consecuencia, facilitar su administración. Ello se ha conseguido mediante
cambios estructurales, por conjugación con diversos polímeros, por hiperglico-
silación de las proteínas y con el desarrollo de formulaciones parenterales de
liberación controlada9-11.
Entre las modificaciones estructurales pueden citarse las derivadas de la
insulina de acción ultralarga como el (Fmoc)2-insulina, un profármaco cuya
transformación en insulina presenta un t1/2 = 12 ± 1 días en ratas. No se han
publicado aún los resultados de los estudios en humanos.
La conjugación de péptidos y proteínas con diversos polímeros constituye
actualmente un área de gran interés especialmente en la terapéutica oncológica
a la que se han incorporado proteínas antitumorales, enzimas, citoquinas, etc.
La conjugación con polímeros produce cambios significativos en el perfil far-
macocinético de las macromoléculas, permitiendo superar algunas de las limi-
taciones que presentaban para su utilización clínica. El principal cambio es un
incremento en la semi-vida de eliminación con un aumento de la captación ce-
lular por endocitosis. Una vez en sangre se produce la liberación del conjugado
a los compartimentos endosómicos y lisosómicos de la célula con descenso del
pH (5,5-6,0). Una vez alcanzado el lisosoma se produce la degradación meta-
bólica por acción de las hidrolasas intracelulares, como se puede observar en la
Figura 5.
La pegilación de proteínas con una o varias cadenas de polietilenglicoles
(PEG) es, posiblemente, el mecanismo de conjugación más desarrollado. Los
PEG son polímeros lineales o ramificados constituidos por unidades de óxido
de etileno (-CH2-O-CH2-) que presentan dos grupos hidroxilo terminales, los
cuales pueden ser activados químicamente 12. La reacción de pegilación más 163
frecuente implica al grupo ε-amino de la lisina o grupos amino terminales de
las proteínas. Las bio-

moléculas conjugadas
presentan propiedades
físico-químicas dife-
rentes de las proteínas
originales, como cam-
bios conformacionales,
impedimento estérico,
capacidad de unión
electrostática, valores
de pK locales de la li-
sina, hidrofobicidad
punto isoeléctrico, etc.
Estos cambios pueden
quedar reflejados, en
principio, por cambios
Figura 5. Captación en la actividad detectada mediante ensayos in vitro y en la eficacia,
celular de un polímero establecida utilizando ensayos in vivo. La fijación a receptores se re-
por endocitosis.
duce progresivamente al aumentar la masa molecular del polímero,
lo que produce un descenso de la actividad cuando se utilizan ensa-
yos in vitro con tiempos de incubación cortos. Sin embargo, la eficacia de la
proteína se incrementa como consecuencia de los siguientes mecanismos:
a) Retraso en el aclaramiento renal de la proteína que produce un incre-
mento en la semi-vida de eliminación y en el valor del área bajo la curva de
niveles séricos. Este último parámetro refleja el "periodo de exposición" y se
relaciona, en ocasiones, con la eficacia en modelos pK-pD.
b) Mayor estabilidad frente a los enzimas responsables de la degradación
de peptidos y proteínas frecuentemente como consecuencia del impedimento
estérico.
c) Menores efectos adversos debido a que el PEG reduce significativa-
mente la inmunogenicidad y antigenicidad de las proteínas.
La pegilación de interferones también produce cambios significativos en el
perfil farmacocinético-farmacodinámico que pueden suponer un progreso en el
tratamiento de la hepatitis C y otras indicaciones. La Figura 6 muestra el efecto
164 provocado en las concentraciones séricas del interferón-α-2a como consecuen-
cia de su conjugación con el PEG. El efecto depende del tamaño del polímero
y se ha considerado
que dos cadenas rami-
ficadas de 20 kDa pro-
porcionaban un perfil
farmacológico idóneo
para el desarrollo clí-
nico13.
Durante los pasa-
dos 20 años han sido
estudiados numerosos
conjugados de proteí-
nas con PEG (citotóxi-
cos, antioxidantes, enzimas, trombolíticos, citoquinas y factores de Figura 6. Farmacocinética
de interferón y dos
crecimiento hematopoyético, etc.) aunque sólo algunos se encuentran
derivados pegilados.
en fase de desarrollo clínico. La conjugación con PEG ha sido apli-
cada también a oligonucleótidos y lípidos para aumentar su solubili-
dad, estabilizar las moléculas, incrementar la permeabilidad o dismi-
nuir el aclaramiento14.
Los glicoconjugados son aquellos compuestos resultantes de la unión co-
valente de una fracción glucídica con otro compuesto que puede ser protídico o
lipídico. La eritropoyetina recombinante es una glicoporteína utilizada desde
hace más de 10 años en el tratamiento de la anemia renal. Su excreción renal
es mínima, pero es ampliamente metabolizada en el hígado vía receptores de la
galactosa. Los residuos de ácido sialico eliminados en el proceso de biotrans-
formación aseguran la estabilidad de la hormona y su actividad biológica. El
metabolito desprovisto de ácido sialico es rápidamente eliminado, siendo la se-
mi-vida de eliminación de la eritropoyetina de 4-8 horas.
Diversos estudios experimentales han demostrado que hay una relación
directa entre el contenido de ácido sialico y la semi-vida de eliminación de
las glicoproteínas, lo que ha sido un estímulo para la búsqueda de nuevas
moléculas.
La darbepoetina alfa es un análogo hiperglicosilado de eritropoyetina que
presenta distintas propiedades físico-químicas y biológicas. La Figura 7 recoge
la estructura de ambas moléculas estimulantes de la eritropoyesis así como la
evolución de los niveles séricos obtenidos tras su administración por vía intra- 165
venosa. La principal consecuencia del cambio producido en el perfil farmacoci-
nético será de modifi-

cación del intervalo
posológico, que pasará
de 3 a 4 días con la
eritropoyetina a 7-14
días con NESP15.
En los últimos
años se han desarrolla-
Figura 7. Estructura y
do numerosas matrices poliméricas biodegradables y biocompatibles
farmacocinética de
eritropoyetina y NESP.
que se han incorporado a microcápsulas, microesferas, nanoesferas e
implantes para conseguir una liberación prolongada de pequeñas mo-
léculas. Actualmente, algunos de estos polímeros se utilizan en el di-
seño de formulaciones parenterales de medicamentos obtenidos por biotecnolo-
gía16. Entre ellos destacan los poli (α-hidroxiácidos) como el ac.poliláctico y el
ac.polihidroxibutírico y co-polímeros, especialmente el ac.láctico-ac.glicólico.
Estos productos no son inmunogénicos y permiten, por sus propiedades físico-
químicas controlar la velocidad de liberación de péptidos y proteínas. El diseño
y fabricación de estas formulaciones difiere de los habitualmente utilizados con
fármacos de bajo peso molecular que presentan, en general, una mayor estabili-
dad durante los procesos de separación de fases, evaporación de disolventes,
emulsión, atomización, etc. Estos procesos exigen temperaturas elevadas, con-
centraciones altas de tensoactivos, mezcla de disolventes, etc. que provocan, en
muchos casos, una degradación acelerada de proteínas. Para evitar la pérdida
de actividad asociada a la degradación química debe recurrirse a la liofilización
de las proteínas, homogeneización de la suspensión proteína-polímero, secado
por atomización en nitrógeno liquido, eliminación del disolvente del polímero
con etanol y filtración y secado bajo vacío17. Estas técnicas han sido utilizadas
en el desarrollo de microesferas de liberación controlada de proteínas recombi-
nantes, como la hormona de crecimiento interferón-α, interleuquina-2, calcito-
nina, hormona liberadora de tirotropina, etc.
La liberación de las proteinas microencapsuladas en el organismo es un
proceso complejo e incluye habitualmente la hidratación de las partículas, diso-
lución del fármaco con difusión a través de los poros de la matriz polimérica y
biodegradación del polímero. La duración del proceso de liberación está condi-
166 cionada por diversos factores como la composición del polímero, la presencia
de modificadores de la liberación, etc.
La posibilidad de modular el proceso de liberación ha permitido el diseño

de vacunas para administración en dosis únicas. Las micropartículas (1-200
mm) del copolímero láctico-glicólico están siendo utilizadas como portadores
de antígenos para la inmunización frente a bacterias, virus y parásitos. Sin em-
bargo, el progreso es lento debido a que no existe un consenso sobre la cinética
óptima de liberación y por las dificultades para mantener la estabilidad física y
química de los antígenos.
La mayor complejidad de estas formulaciones en relación con las de libe-
ración inmediata obliga a adoptar precauciones especiales en la optimización
de su producción industrial. Los principales puntos críticos son la integridad de
la proteína y el valor del Cmax en ratas, utilizado como parámetro farmacociné-
tico que refleja la eficacia del proceso de encapsulación.
DISTRIBUCIÓN TISULAR Y CELULAR
La incorporación de los fármacos a órganos y tejidos corporales es un pro-

ceso cinético complejo con una gran repercusión en la respuesta terapéutica. La
velocidad de distribución puede estar limitada por la perfusión sanguínea o por
la permeabilidad lo que condiciona el acceso y permanencia en su lugar de ac-
ción. La fracción de la dosis de un fármaco que alcanza finalmente los tejidos,
o incluso los espacios intracelulares, depende de numerosos factores, muchos
de ellos dependientes de sus propiedades físico-químicas. Por ello, las peque-
ñas moléculas con un óptimo coeficiente de reparto acceden con facilidad a los
compartimentos periféricos y presentan valores elevados del volumen aparente
de distribución, a diferencia de los péptidos y proteínas que presentan valores
relativamente pequeños. El elevado peso molecular que presentan algunas bio-
moléculas constituye un factor limitante de la distribución tisular. Sin embargo,
en algunos casos es posible alcanzar el lugar de acción en concentración sufi-
ciente para producir una respuesta terapéutica adecuada.
La especificidad en la localización del lugar de acción de muchos fárma-
cos obtenidos por Biotecnología obliga a mayores exigencias en su perfil de
distribución. El desarrollo de los factores de crecimiento y genes recombinates
para promover la angiogénesis en el infarto de miocardio es un buen ejemplo
de la importancia de esta característica farmacocinética18. La administración 167
endovenosa del factor de crecimiento de fibroblastos (FCF) no produce res-
puesta angiogénica en modelos experimentales de isquemia miocárdica. Por

ello ha sido necesario recurrir a la administración directa en el miocardio, en el
saco pericárdico o en el espacio perivascular, para alcanzar la respuesta tera-
péutica deseada. La eficacia de estas alternativas fue confirmada y evaluada
por medida del flujo y función miocárdica, aunque se hace preciso aún aplicar
nuevas técnicas, como la tomografía de emisión de positrones o la resonancia
magnética, para establecer, de forma más precisa, la extensión de la respuesta
angiogénica.
Una situación más problemática se plantea cuando se precisa el acceso in-
tracelular de genes y oligonucleótidos antisentido, cuya diana está localizada en
el compartimento citosol/núcleo19. Se han propuestos diferentes mecanismos pa-
ra explicar la internalización de estas moléculas como la endocitosis en fase
fluida y la endocitosis mediada por receptores, ya que no hay evidencia de paso
por difusión pasiva, ni siquiera recurriendo a biomoléculas neutras. En el mo-
mento actual la escasa capacidad de internalización y la inadecuada comparti-
mentalización intracelular constituyen un problema básico en el progreso de la
terapéutica antisentido. Recientemente se han desarrollado diferentes métodos
físicos (microinyección, permeabilización, electroporización, etc.), que mejoran
la captación celular de los oligonucleótidos en relación a los métodos conven-
cionales de conjugación o aquéllos que recurren a transportadores (liposomas,
lipoplexes, policationes, etc.). También puede recurrirse a la administración de
estos medicamentos en el tejido diana, como el fomivirsen administrado por in-
yección intravítrea directa en el tratamiento de la retinitis por citomegalovirus.
La selectividad en la distribución permite mejorar la relación beneficio-
riesgo de numerosos medicamentos, lo que puede incrementar su potencial te-
rapéutico. Esta última consideración ha vuelto a poner de actualidad el concep-
to de "bala mágica", idealización introducida por Paul Erlich hace casi un siglo
y que gracias a la Biotecnología puede convertirse en una realidad20.
Los sistemas de transporte coloidal como liposomas, nanopartículas, mi-
crosferas, etc. han sido utilizados para prolongar el tiempo de circulación de
numerosas moléculas, protegerlas de la degradación y dirigirlas a tejidos diana.
Estos sistemas tienen dificultades para acceder a los tejidos sanos, debido, en-
tre otros factores, a su tamaño, especialmente si supera 20 nm, considerado el
tamaño crítico para la mayoría de los tejidos.
168 Los liposomas son opsomizados por las proteínas plasmáticas en la circu-
lación sistémica y reconocidos por el sistema reticuloendotelial (SRE) acumu-
lándose preferentemente en el hígado. Los liposomas son vehículos adecuados

para el transporte de péptidos y proteínas inmoduladoras debido a su absorción
linfática y a la captación y metabolismo por los macrófagos. Ello ha impulsado
el desarrollo de liposomas conteniendo interleuquina-2, factores de crecimiento
eritropoyético e interferones. Además, los liposomas, como algunas macromo-
léculas, pueden acumularse también en los tumores debido a la falta de drenaje
linfático normal y a la lenta velocidad de difusión.
Para evitar o reducir la captación por el SRE, se ha optado preferentemen-
te por incrementar la hidrofilidad superficial mediante sialoconjugados sintéti-
cos y más recientemente con PEG. Estos liposomas de lento aclaramiento han
sido utilizados para la vectorización activa y pasiva de medios diagnósticos y
terapéuticos.
Las mayores dificultades se plantean para dirigir los liposomas a aquéllos
tejidos donde normalmente no se acumulan. Ello ha obligado al desarrollo de
diferentes tipos de vectores como oligosacáridos, oligonucleótidos, péptidos,
proteínas, vitaminas, anticuerpos monoclonales y receptores.
En principio sería posible dirigir los liposomas a todo tipo de células,
siempre que los vectores sean adecuados, aunque algunos problemas como el
acceso a los tejidos y el rápido aclaramiento pueden disminuir las posibilidades
terapéuticas.
El desarrollo de los anticuerpos monoclonales representa una de las técnicas
más poderosas para dirigir fármacos, tóxicos, isotopos y enzimas a su lugar de
acción. El gemtuzumab es un anticuerpo recombinante humanizado dirigido fren-
te al antígeno CD33 y unido a la calicheamicina, un potente antibiótico tumoral.
Se trata del primer fármaco vectorizado introducido en quimioterapia y ha sido
aprobado por la FDA a finales del año 2000 en el tratamiento de la leucemia
mieloide aguda en casos de recidivas. Gemtuzumab se une al antígeno CD33, ex-
presado en el 80-90% de los pacientes con leucemia mieloide aguda, penetrando
en la célula y liberando el agente citotóxico que provoca la muerte celular.
El potencial terapéutico de estos agentes se ha incrementado desde la in-
troducción de la tecnología del hibridoma en los años 70 y actualmente se dis-
pone de fármacos inhibidores de la reactividad aloninmune y autoinmune, anti-
tumorales, antiplaquetarios antivirales, etc. En España se han introducido
recientemente transtuzumab, infliximab y rituzimab, aunque otros muchos se
encuentran en diferentes fases de desarrollo, alcanzando casi un 25% de todos
169
los productos obtenidos por Biotecnología21.
A pesar de las ventajas potenciales que presentan al fijarse selectivamente

a las células diana, su incorporación a la terapéutica presentó mayores dificul-
tades de las inicialmente previstas. Entre ellas figuran la capacidad limitada de
penetración tisular que depende, entre otros factores, de las dimensiones del
anticuerpo. Los anticuerpos convencionales son proteínas de elevado peso mo-
lecular que presentan una baja capacidad de acceso a tejidos, especialmente
aquéllos que tienen escasa vascularización. En terapéutica oncológica con anti-
cuerpos monoclonales, la relación de concentraciones entre el tumor y la circu-
lación sistémica se incrementa lentamente durante varios días debido a la eli-
minación del anticuerpo y, en menor grado, a la captación tumoral22.
METABOLISMO Y EXCRECIÓN
Los péptidos y proteínas se eliminan del organismo por metabolismo y ex-

creción renal. El metabolismo se produce principalmente por proteolisis en di-
ferentes localizaciones del organismo como consecuencia de la amplia disper-
sión que presentan los enzimas proteoliticos. La velocidad y extensión de la
degradación metabólica es muy variada y depende de la estructura química, vía
de administración etc.
El tracto gastrointestinal constituye el ambiente más hostil para las proteí-
nas debido a los numerosos enzimas proteolíticos que se encuentran, a elevadas
concentraciones, a lo largo del tubo digestivo. La encapsulación con materiales
entéricos no es suficiente para proteger su integridad química durante el perio-
do de tiempo que transcurre entre la liberación y la incorporación a la circula-
ción sistémica. En el pasado se trató de superar este inconveniente asociando a
las proteínas inhibidores enzimáticos (p.e. aprotinina), pero actualmente su uso
está desaconsejado. Sin embargo, se han obtenido resultados esperanzadores in-
corporando las proteínas en partículas biodegradables mucoadhesivas, que con-
tienen inhibidores metabólicos unidos de forma covalente con diferentes polí-
meros23.
Una de las principales limitaciones de los agentes antisentido es la degra-
dación enzimática por las nucleasas que se produce en sangre y en el interior
de las células. La semi-vida de degradación de los oligonucleótidos que contie-
170 nen uniones fosfodiester es próxima a 5 minutos lo que impide su utilización
en clínica.
Ello ha impulsado el desarrollo de nuevos oligonucleótidos más estables

frente a las nucleasas y que mantengan su capacidad para fijarse al lugar de ac-
ción. Para mejorar la estabilidad metabólica se han modificado las uniones fos-
fodiester, los azúcares y las bases heterocíclicas. Los derivados mejor conoci-
dos son los fosforotionatos en los que los átomos de oxígeno del fosfato han
sido sustituidos por azufre. Sin embargo, aún estos derivados son metaboliza-
dos en animales experimentales en mayor extensión que las previsiones apoya-
das en los resultados de estudios en cultivos celulares. Por ello, se hace preciso
introducir mejoras en el perfil farmacocinético de los agentes antisentido, in-
crementando su estabilidad metabólica24.
La excreción renal se produce por los mismos mecanismos que afectan a
los fármacos de bajo peso molecular. Las macromoléculas menores de 68
kDa podrían experimentar una filtración glomerular, aunque la capacidad de
filtración depende también de la carga y rigidez de la molécula. La influen-
cia de la carga se pone especialmente de manifiesto con moléculas cuyo ra-
dio es superior a 2 nm. Después de la filtración, los péptidos complejos y las
proteínas son reabsorbidos en los túbulos proximales por endocitosis e hidro-
lizados a fragmentos peptídicos o aminoácidos que retornan a la circulación
sistémica. En consecuencia, sólo cantidades mínimas de las proteínas intac-
tas son detectadas en la orina. Los péptidos y proteínas pueden también ex-
perimentar una secreción tubular desde los capilares postglomerulares, acom-
pañada también de una degradación metabólica. Esta vía de eliminación es
utilizada por diversas hormonas como calcitonina, insulina, vasopresina, an-
giotensina II, etc.
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172
Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica humana
APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA
RECOMBINANTE VEGETAL A LA TERAPÉUTICA
HUMANA
Fernando Ponz. Departamento de Biotecnología. INIA, Madrid
DESARROLLO DE LA BIOTECNOLOGÍA VEGETAL
Aproximadamente, durante las dos últimas décadas se han producido, en

el conjunto de las actividades ligadas a la investigación genética en plantas,
una serie de innovaciones y cambios tecnológicos que se han englobado bajo la
denominación de biotecnología vegetal, y que constituyen una verdadera revo-
lución, ya no sólo de la investigación y el desarrollo agrario, sino de toda una
concepción de la agricultura tradicional y de la utilización económica de las
plantas. Sin duda, la capacidad de generar plantas transgénicas constituye una
de estas nuevas tecnologías sobre las que pivota el cambio global que se está
produciendo. Hoy día, prácticamente ya no hay ninguna especie vegetal culti-
vada importante para la que no se disponga de la capacidad de transgénesis.
Transgénesis vegetal mediante Agrobacterium tumefaciens
La transgénesis vegetal no se realiza en la actualidad de un modo único.

173
Los primeros desarrollos, todavía ampliamente utilizados, se basaron en la ca-
pacidad natural de la bacteria Agrobacterium tumefaciens y relacionados para

integrar de forma estable parte de su material genético en el genoma de sus
plantas huésped. La manipulación subsiguiente del genoma de Agrobacterium
permitió disponer, en breve plazo, de vectores desarmados (exentos de la capa-
cidad de inducir enfermedad que poseen los aislados naturales de la bacteria)
para llevar a cabo integraciones estables de genes foráneos. El clonaje de estos
genes en los vectores de Agrobacterium permite que la bacteria los integre en
el genoma de las futuras plantas transgénicas. En general, el proceso de trans-
formación se complementa con un conjunto de tecnologías de cultivo in vitro
de tejidos vegetales, que permiten regenerar plantas enteras fértiles a partir de
determinados tejidos transformados cultivados. Como queda dicho, esta tecno-
logía de generación de plantas transgénicas se utiliza todavía ampliamente. Sin
embargo, más recientemente se han desarrollado otras formas de transforma-
ción de plantas, lo cual a su vez ha permitido ampliar el abanico de especies
transformables.
Otros métodos de transformación de plantas
De entre todos los desarrollos habidos desde las primeras transformaciones

de discos de hojas de tabaco con Agrobacterium, merecen destacarse dos por la
simplicidad que han añadido al proceso. En primer lugar la biolística, que im-
plica el disparo de microproyectiles de oro, wolframio, etc., recubiertos del
ADN que se desea integrar en el genoma de la planta. Esta técnica permite evi-
tar el uso de la bacteria en el proceso de transformación y es especialmente in-
teresante en los casos de especies vegetales que no son huéspedes naturales de
la bacteria, como es el caso de los cereales (en general de las plantas monoco-
tiledóneas). El otro desarrollo reciente es el que permite en algunas especies,
sobre todo experimentales, llevar a cabo la transformación con la bacteria di-
rectamente sobre las flores, lo que posibilita la obtención directa de semillas de
plantas transgénicas sin necesidad de recurrir al cultivo in vitro.
Genómica y proteómica vegetales
Disponer de plantas transgénicas constituye un hito importante en el de-

174 sarrollo de la Biotecnología Vegetal, pero no es el único. En efecto, la capaci-
dad para el análisis pormenorizado de los genomas vegetales, tanto en su ver-
tiente estructural como funcional, se ha desarrollado en paralelo con la trans-

génesis y está empezando a permitir la racionalización de muchos de los pro-
cesos clásicos de la mejora genética y, también de la propia transgénesis. La
nuevas disciplinas de la genómica y la proteómica, cuyas aplicaciones al estu-
dio del genoma humano están provocando toda una nueva forma de buscar y
diseñar fármacos, están también teniendo un fuerte impacto en la Biotecnolo-
gía Vegetal. La conjunción de ambas tecnologías supone un potencial enorme
de incidencia en procesos de desarrollo controlado de las plantas, así como de
su utilización para otras áreas biotecnológicas, como por ejemplo la farmacia.
Como en tantas otras ocasiones anteriores, el desarrollo tecnológico ha permi-
tido poner de manifiesto conceptos de índole más fundamental, en un proceso
de alimentación mutuo muy característico de todas las actividades de I+D. Así
por ejemplo, fenómenos como la cosupresión y el silenciamiento génico me-
diado por ARN se han descubierto y estudiado por primera vez en plantas,
gracias al propio desarrollo tecnológico de la Biotecnología Vegetal. Tras su
descubrimiento en plantas, se ha demostrado en los últimos 2-3 años la exis-
tencia de fenómenos similares en animales, incluido el hombre, incluyendo to-
do un nuevo sistema de regulación de la expresión génica basado en micro-
ARNs. Las implicaciones de este descubrimiento en las aproximaciones
terapéuticas a enfermedades, tanto genéticas como infecciosas, se están reve-
lando en la actualidad como de una enorme importancia.
GENERACIONES DE PRODUCTOS VEGETALES

BIOTECNOLÓGICOS
Primera generación de plantas y productos vegetales

transgénicos
Las primeras variedades transgénicas de algunas plantas de gran cultivo

mundial como, por ejemplo, el maíz, la soja, la colza o el algodón, ya han lle-
gado al mercado y tanto ellas como sus productos derivados están en estos mo-
mentos en el centro de una fuerte polémica social que se está desarrollando en
varios frentes a diferentes niveles. Los ejemplos citados forman parte de lo que
se ha dado en llamar la primera generación de plantas y productos transgéni-
175
cos. La principal característica de esta primera generación de productos vegeta-
les transgénicos es que las modificaciones genéticas que se les han introducido
van dirigidas a mejorar características de las plantas que son de interés funda-
mentalmente para sus productores, o sea, para los agricultores. Así, plantas que
expresan constitutivamente un gen de una toxina para insectos procedente de
una bacteria, que sobreexpresan una enzima que inactiva la acción de un herbi-
cida o que son resistentes a una virosis gracias a la resistencia conferida por la
producción en planta de fragmentos del propio virus, son plantas de un interés
obvio e inmediato para el productor primario. La OCDE, que ha venido estu-
diando intensamente el fenómeno de la Biotecnología desde muchos ángulos
en los últimos años, ha definido esta primera generación de cultivos transgéni-
cos como que "se ha centrado en características agronómicas para conferir ma-
yores rendimientos en las cosechas mediante la reducción de pérdidas y espa-
ciamientos menores entre hileras, y para reducir costes de insumos mediante la
disminución del uso de plaguicidas y herbicidas". Otras dos características de
los productos de la primera generación son su irrelevancia para el consumidor
final, así como que no suponen un cambio de mercado. Se trata, en definitiva,
de plantas cuyos productos van dirigidos a los mismos mercados que sus pa-
rientes no transgénicas y que no suponen cambios sustanciales para el consu-
midor, excepto quizá su menor precio, consecuencia de unos menores costes de
producción.
Segunda generación de plantas y productos vegetales

transgénicos
Existen ya una segunda y una tercera generación de plantas transgénicas,

cuya llegada al mercado se está produciendo aún con timidez, pero de las que
se espera mucho mayor impacto comercial en los próximos años. De nuevo se-
gún la OCDE, la segunda generación de plantas transgénicas "se centra en una
serie de caracteres relacionados con la calidad, que mejorarán su uso en los sis-
temas de producción de alimentos, así como sus características de uso finales.
Cosechas con modificaciones en las grasas, aceites y almidones para mejorar el
procesamiento y la digestibilidad, tales como sojas de alto contenido en ácido
oleico, colzas de alto estearato o ácido láurico (cultivándose ya en los Estados
Unidos), maíz de bajo fitato o ácido fítico. Desde un punto de vista industrial
176 se pueden esperar, por ejemplo, plantas de algodón coloreado que eviten o dis-
minuyan la necesidad de tintes químicos (algunas ya disponibles)". Se aprecian
en esta segunda generación algunos cambios sustanciales en relación con la

primera. En primer lugar hay un cambio de mercado final. Las modificaciones
genéticas ya no se hacen pensando fundamentalmente en el productor, sino en
el consumidor del producto final al cual se le proporciona un producto de ma-
yor calidad. Por supuesto, es posible combinar características típicas de esta se-
gunda generación con otras de la primera, si se desea o el mercado lo deman-
da. Así por ejemplo, es posible producir patatas con unas características de
almidón más adecuadas para su congelación y fritura directa en freidora, que
además sean resistentes al escarabajo de la patata mediante la expresión de la
toxina bacteriana. La otra característica de algunos de los productos de la se-
gunda generación es que presentan un aspecto de interfase con cuestiones más
clásicamente relacionadas con problemas de salud humana que con considera-
ciones meramente agroalimentarias. Por ejemplo, la producción de aceite de
soja con un mayor contenido en ácido oleico se hará teniendo muy en cuenta
factores de salud relacionados con enfermedades cardiovasculares, además de
otros factores de producción agraria. O algunas de las modificaciones en los
metabolismos de hidratos de carbono de plantas, como la patata o algunos ce-
reales, considerarán el tamaño creciente de mercado que suponen los consumi-
dores diabéticos.
Tercera generación de plantas y productos vegetales

transgénicos
Si la segunda generación de productos biotecnológicos vegetales supone un

grado de sofisticación considerable en relación con los de la primera, será así
más aún con los productos de la tercera generación. La OCDE predice que estas
plantas "producirán más factores de calidad de cara a un producto final tales co-
mo productos de nutricéutica o 'alimentos funcionales', que son cosechas modi-
ficadas para producir medicinas o suplementos alimentarios en la planta. Estas
plantas podrían inducir inmunidad a enfermedades o mejorar características sa-
nitarias de los alimentos tradicionales, por ejemplo colza con β-carotenos o
arroz suplementado con vitamina A. También se prevén plantas que fijen nitró-
geno con mayor eficacia, disminuyendo por tanto la necesidad de abonos o
plantas resistentes a la sequía, las inundaciones y las temperaturas extremas, así
como plantas que se puedan utilizar en procesos de biorremediación de suelos y
177
aguas. También se ha sugerido la posibilidad de producir plantas de algodón in-
combustible o que no se arrugue, o plantas de colza que produzcan plásticos

biodegradables (esto ya se ha conseguido)". Es, en estos productos de tercera
generación, donde se producirá el verdadero cambio que aporta la Biotecnología
a la producción vegetal. Los mercados a los que se dirigen estos productos pue-
den ser tradicionales del producto agrario, pero serán básicamente mercados
nuevos. La interfase entre la producción vegetal e industrias que son en estos
momentos ajenas a la agricultura, o utilizan productos agrarios de manera muy
minoritaria, se verá fuertemente incrementada cuando estos productos alcancen
masivamente el mercado. De entre todas estas industrias es quizá la industria
farmacéutica la que se prevé que se afecte antes en sus estructuras de produc-
ción de determinados productos por el impacto de la Biotecnología Vegetal. Se
prevén dos niveles de impacto entre productos biotecnológicos vegetales y la
producción de medicamentos. El primero es el de utilizar las plantas como bio-
factorías de producción de medicinas o productos de interés farmacéutico. Esta
actividad constituye el factor más importante de lo que se ha venido a llamar
"agricultura molecular" (molecular pharming) y se describe con algo más de de-
talle en el siguiente apartado. La otra constituye una verdadera síntesis entre la
agricultura, la alimentación y la farmacia y es la base de una nueva disciplina
científica emergente, la "nutricéutica", como parte de un concepto más general,
que es el del "alimento funcional". Conferir una funcionalidad sanitaria al hecho
de alimentarse supone profundizar en una tendencia creciente en las sociedades
avanzadas, como es la de la "comida sana", confiriendo al hecho de alimentarse
una vertiente curativa, o más bien, y en mayor medida, preventiva. Quedan
mencionadas anteriormente las posibilidades de plantas con suplementos vitamí-
nicos, pero quizá el paradigma de lo que puede ser esta nueva actividad farma-
céutica lo constituyan las llamadas "vacunas comestibles". Esta idea intenta ex-
plotar la inmunidad mucosal de las personas y los animales (también
aplicaciones veterinarias) mediante la presentación de antígenos con potencial
vacunal a través de alimentos procedentes de plantas transgénicas que expresen
dichos antígenos. Algunas de las primeras pruebas hechas en animales de expe-
rimentación han resultado muy prometedoras y las pruebas clínicas ya han em-
pezado en algún caso. Además de la posible implantación de este tipo de vacuna
alimenticia en las poblaciones infantiles de países desarrollados, lo cual resulta
algo cuestionable desde el punto de vista de la rentabilidad y ventajas económi-
178 cas y de gestión, esta aproximación presenta una vertiente social de indudable
valor, como es el poder alcanzar segmentos de población que en estos momen-
tos no están sometidos a programas de vacunación, fundamentalmente por moti-

vos económicos, especialmente en países no desarrollados. Ello podría incluir
enfermedades infecciosas tropicales de baja incidencia en países desarrollados,
como el cólera, la malaria o la fiebre amarilla, para las que se podrían plantear
vacunaciones fundamentadas en vacunas comestibles basadas en productos de
alto consumo (yucas, bananas, etc.).
PRODUCCIÓN DE FÁRMACOS EN PLANTAS
Producción en plantas transgénicas
La agricultura molecular ha comenzado su andadura fundamentalmente

orientada a la producción de fármacos en plantas y, de entre ellas, los primeros
productos que han despertado el mayor interés entre los biotecnólogos vegeta-
les han sido las proteínas terapéuticas. Existen ya en la literatura científica nu-
merosos ejemplos de plantas transgénicas productoras de proteínas humanas
con valor terapéutico. Los resultados obtenidos hasta el momento permiten ser
muy optimista con respecto a la evolución creciente de esta tecnología, pero al
tiempo ilustran con claridad la complejidad de situaciones que se pueden pro-
ducir al generar las plantas productoras. Algunos de los puntos que se están re-
velando claves para el éxito o el fracaso de esta aproximación global son tan
variados como, por ejemplo, las enormes diferencias de expresión del transgén
que se encuentran en los distintos casos, la problemática de extracción de las
proteínas producidas, el grado de similitud en el procesamiento post-traduccio-
nal de las proteínas, etc. Cada uno de estos puntos va a requerir un esfuerzo de
afinamiento de las condiciones de producción que necesitará soluciones par-
cialmente distintas para cada caso, por lo que es difícil, en estos momentos, ir
mucho más allá en las generalizaciones. En la actualidad no hay todavía ningu-
na proteína terapéutica humana producida en plantas que se encuentre en el
mercado, pero ya hay algunas en las fases de pruebas clínicas. Quizá la más
avanzada sea un anticuerpo producido en tabaco que se pretende utilizar, a tra-
vés de chicles de mascar, en el tratamiento y prevención de las caries y enfer-
medades infecciosas de las encías. Los costes menores de producción de gran-
des volúmenes de un anticuerpo de estas características en plantas de tabaco
179
posiblemente permitan lanzar al mercado ese tipo de producto sin disparar el
precio para el consumidor final. Al margen de los problemas nuevos que se va-
yan poniendo de manifiesto en la producción de fármacos en plantas según se
vayan desarrollando los procesos, esta estrategia de producción presenta algu-
nas ventajas inherentes respecto de los métodos tradicionales de extracción de
tejidos humanos y animales o de procesos de fermentación. Queda ya mencio-
nado el probable menor coste, pero hay más. Por ejemplo, el de la seguridad
sanitaria del fármaco. La reciente crisis de las encefalopatías espongiformes
bovinas, y su probable relación con algunas enfermedades humanas del tejido
nervioso, ha puesto claramente de manifiesto el riesgo de arrastrar, desde teji-
dos animales en los procesos de extracción, patógenos de difícil detección o
eliminación. Este riesgo se elimina totalmente en las plantas, ya que éstas no
permiten la multiplicación de estos patógenos (priones, virus del SIDA, virus
de las diferentes hepatitis, etc.). Además, las plantas pueden constituir el único
sistema capaz de producir eficientemente ciertas proteínas humanas, tales como
reguladores del crecimiento e inhibidores del ciclo celular, que tendrían un im-
pacto negativo en los animales transgénicos o en las células animales cultiva-
das en las que se expresaran. Otra consideración es la de capacidad de produc-
ción del fármaco, la cual puede llegar a ser limitante en algunos casos. Un caso
citado con frecuencia de esta última situación es el del potencial tratamiento
del cáncer mediante inmunoterapia. Cálculos efectuados en los Estados Unidos
predicen que cada paciente puede llegar a necesitar 10-200 mg de anticuerpo
recombinante antitumoral, lo cual, dado el ritmo de diagnóstico de nuevos ca-
sos al año (650.000 de cánceres de mama, pulmón y colon sólo en los Estados
Unidos), puede llegar a crear una demanda de unos 130 kg por año en ese país.
Prácticamente, sólo la producción en plantas puede asegurar ese nivel de pro-
ducción a un precio razonable.
Producción mediada por virus vegetales
El punto de la producción de grandes cantidades del fármaco que se de-

sea producir ha puesto de manifiesto un problema al que se enfrentan las plan-
tas transgénicas como vía de producción. Como se ha mencionado previamen-
te, con la tecnología disponible en la actualidad es prácticamente imposible
predecir los niveles de expresión del gen foráneo que se alcanzarán en una lí-
180 nea transgénica determinada y, de todas formas, parece razonable pensar que
la expresión a partir de un promotor tiene que presentar límites cuantitativos
difíciles de sobrepasar. Por otra parte, establecer un línea transgénica producti-

va y genéticamente estable puede llevar muchos meses, incluso años. Situa-
ciones como la de los anticuerpos antitumorales, mencionada anteriormente,
son claramente incompatibles con estas limitaciones, pues se trata de fármacos
personalizados de los que se necesitan grandes cantidades en períodos breves
de tiempo (semanas a unos pocos meses). Este tipo de consideraciones, junto
con algunas otras de carácter más cercano a la estrategia comercial, han hecho
que bastantes investigadores y empresas de Biotecnología se hayan fijado en
los virus vegetales como vehículos de expresión de los genes foráneos. Los
virus vegetales suelen ser agentes infecciosos muy simples genéticamente, por
lo que su manipulación genética no resulta excesivamente compleja. General-
mente se multiplican hasta alcanzar niveles de acumulación de viriones bas-
tante elevados, lo cual se encuentra también para algunos de sus productos gé-
nicos individuales y, por extrapolación, para proteínas producidas a partir de
genes foráneos introducidos en ellos. Además, desde el punto de vista de la
rapidez de producción, resulta mucho más rápido generar un virus transgénico
que una planta transgénica. Estas características hacen de los virus vehículos
de expresión muy interesantes y que se están desarrollando rápidamente en la
actualidad. Una consideración adicional para algunas aplicaciones es que es
factible combinar ambas estrategias (plantas transgénicas y vectores virales),
lo cual permitiría elegir lo mejor de ambas.
La estructura de la empresa biotecnológica farmacéutica

vegetal
El rápido desarrollo de la Biotecnología Vegetal está contribuyendo tam-

bién, junto con otros desarrollos biotecnológicos, a la profunda transformación
que se está experimentando en la actualidad en la estructura empresarial de va-
rios sectores industriales ligados a las ciencias de la vida. Hay características
muy llamativas de la nueva situación. Por un lado, surgen constantemente (sobre
todo en los Estados Unidos) nuevas pequeñas empresas con un alto contenido
tecnológico que contribuyen de manera muy significativa al rápido desarrollo de
la Biotecnología. Muchas de estas empresas fracasan en su proyecto empresarial
o son finalmente absorbidas por otras empresas mayores. Por otro lado, este
proceso de absorción empresarial se da también entre grandes empresas multina-
181
cionales, lo cual está generando una situación de concentración empresarial sin
precedentes. Otra característica nueva es la de la creación de un sector industrial

completamente nuevo, que se ha venido a denominar de empresas de ciencias
de la vida. Este tipo de empresas se diferencian de las clásicas empresas farma-
céuticas o de productos agrarios o alimentarios en que integran en su seno am-
bos mundos, reflejo de la interfase creciente entre ambas actividades, que se ha
comentado varias veces a lo largo de este artículo. En lo referente al futuro es
razonable pensar que ambas tendencias (nuevas pequeñas empresas tecnológicas
y grandes grupos empresariales) seguirán desarrollándose, creando una estructu-
ra de producción farmacéutica nueva. Sin embargo, el fenómeno es todavía muy
reciente y habrá que estar atento a su evolución.
BIBLIOGRAFÍA
El número de trabajos que abordan de manera pública los temas referidos a la produc-
ción de fármacos en plantas mediante Biotecnología es aún limitado, dada su relativa
novedad. Además, bastantes de estos trabajos se publican en revistas especializadas de
investigación en plantas de menor difusión en los ambientes médicos o farmacéuticos.
Sin embargo, en los últimos años se han publicado un número importante de buenos ar-
tículos de revisión sobre este tema, que proporcionan un visión general y un buen nivel
de información al lector interesado. Se presenta a continuación, como orientación, una
lista de algunas de estas revisiones.
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183
Innovación tecnológica y nuevas terapias
INNOVACIÓN TECNOLÓGICA Y
NUEVAS TERAPIAS. OBTENCIÓN
DE ANTICUERPOS MONOCLONALES
TOTALMENTE HUMANOS:
PANITUMUMAB
José Luis Motellón. Amgen S.A.
La innovación en la producción de anticuerpos ha permitido

la producción de anticuerpos totalmente humanizados. Un
claro ejemplo es el panitumumab. A lo largo de este capítulo
se presentan las aportaciones y diferencias de este tipo de
anticuerpos sobre los tradicionales, y en concreto, las
ventajas clínicas del panitumumab en su uso en Oncología.
INTRODUCCIÓN
Las terapias dirigidas se han convertido en la punta de lanza de la in-

novación en nuevas tratamientos. Dentro de ellas, los anticuerpos son el
ejemplo más claro y quizás más revolucionario. Los anticuerpos monoclo-
nales están cada vez más instaurados en la farmacopea. Hoy en día, esta-
mos asistiendo a un nuevo paradigma en la producción y utilización clíni-
ca de estas terapias, con el desarrollo de los anticuerpos monoclonales
totalmente humanos. Esta tecnología presenta claras ventajas en su utiliza-
ción clínica sobre los anticuerpos monoclonales no totalmente humanos.
Entre ellos, el panitumumab representa el mejor ejemplo dentro del área 185
de la Oncología.
DESARROLLO DE ANTICUERPOS MONOCLONALES TOTALMENTE

HUMANOS
Los anticuerpos son biomoléculas de naturaleza proteica que se caracteri-

zan por poseer la capacidad de reconocer y unirse específicamente a un antíge-
no. En el año 1975, Kholer y Milstein describieron que si se fusionaban células
plasmáticas productoras de anticuerpos con una célula de un tumor llamado
mieloma, se conseguían células, las llamadas hibridomas, que tenían las pro-
piedades de los dos tipos celulares iniciales, esto es: eran células productoras
de anticuerpos, como las células plasmáticas y que podían mantenerse de ma-
nera indefinida en cultivo (como las células mielomatosas). La posterior selec-
ción de la mejor de dichas células y su expansión, dando lugar a un clon, per-
mitía producir anticuerpos procedentes de un único clon y, por lo tanto,
homogéneos (anticuerpo monoclonales, AcM) en cantidades ilimitadas1. Ini-
cialmente, la inmunización con el antígeno para obtener las células plasmáticas
se hacía sobre roedores (habitualmente ratones), por lo que los AcM obtenidos
eran de ratón. Esto limitaba su utilización en la clínica, ya que su inyección en
humanos generaba una respuesta inmunológica frente al propio AcM, la deno-
minada HAMA (siglas en inglés de Human anti-murine antibody) que neutrali-
zaba la posterior utilización del anticuerpo y limitaba su uso, en muchos casos,
a una única administración2,3. Por consiguiente, la investigación en la utiliza-
ción terapéutica de los AcM ha ido, en buena medida, dirigida a disminuir di-
cha capacidad inmunogénica (3)
El primer intento ha consistido en producir AcM quiméricos en los que la
región variable del anticuerpo, que es la que se une al antígeno (aproximada-
mente un 34% de la proteína), sigue siendo de origen murino, mientras que el
resto del anticuerpo es de origen humano4-6. Entre los AcM quiméricos aproba-
dos para ser utilizados en la clínica están, por ejemplo, rituximab (Rituxan®),
cetuximab (Exbitux®) e infliximab (Remicade®). Si bien la utilización de es-
tos AcM quiméricos ha reducido significativamente la inmunigenicidad de los
AcM, el desarrollo de anticuerpos humanos frente a la quimera (o respuesta
HACA, human anti-chimeric antibody) sigue siendo un problema potencial-
mente importante, que requiere monitorización de los pacientes a los que se les
186 administra, así como, en algunos casos, el tratamiento concomitante con corti-
costeroides3.
Otro avance en la minimización de la inmunogenicidad producida por

los AcM lo constituye la producción de AcM 'humanizados', proceso inicial-
mente llamado reshaping con los que se consigue que los AcM contengan só-
lo un 5 a 10% de proteína murina4. Esta técnica consiste en utilizar tecnolo-
gía de DNA recombinante para insertar las regiones determinantes de la
complementariedad (CDRs- complementary determining regions) de origen
murino en un anticuerpo humano7. Con ello se esperaba poder eliminar prác-
ticamente la inmunogenicidad, aunque en realidad todavía se sigue observan-
do respuesta inmunogénica frente a dichos AcM humanizados, la llamada
HAHA (human anti-human antibody)3. Por otra parte, el proceso de humani-
zación no es simple, ya que en ocasiones se compromete la afinidad por el
antígeno3,7. Bevacizumab (Avastin®) y trastuzumab (Herceptin®) son anti-
cuerpos humanizados.
La generación de AcM totalmente humanos es un paso adelante en la con-
secución de AcM todavía más seguros y eficaces3. Entre las técnicas que se
han utilizado para producir AcM totalmente humanos, está la creación de rato-
nes transgénicos (XenoMouse®)4,8,9. La Figura 1 ilustra los pasos implicados
en la creación del XenoMouse®. En primer lugar, se toman células embriona-
rias de ratón, y mediante técnicas de deleción de genes diana, se
inactivan los loci de los genes que codifican para la inmunoglobuli-
nas (Ig) endógenas de ratón. La descendencia consiste en ratones ho-
mocigóticos incapaces de producir inmunoglobulinas murinas. A
continuación se toman grandes fragmentos de DNA correspondientes Fig. 1. Tecnología de la
producción de
a la cadena pesada y la cadena ligera de las Ig humanas se clonan y
XenoMouse®
se introducen también en
células embrionarias de
ratón. Finalmente, estas
dos cepas de ratones
(una incapaz de producir
Ig y otra que produce
tanto Ig humanas como
de ratón) se cruzan entre
sí, para producir el Xe-
noMouse®, que es capaz
de expresar Ig totalmen- 187
te humanas e incapaz de
producir las Ig murinas. Estas cepas de ratón se pueden utilizar para producir
hibridomas, con la diferencia de que los AcM producidos serán humanos y no
murinos (4).
PANITUMUMAB
Panitumumab es el primero de estos AcM totalmente humanos producidos

por tecnología XenoMouse®10 en incorporarse al arsenal terapéutico, puesto
que el pasado 27 de septiembre de 2006, Amgen anunció la aprobación por
parte de la FDA de panitumumab (con el nombre comercial de Vectibix™) pa-
ra el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal metastásico11. Por lo que
respecta a Europa, el pasado 28 de abril de 2006 fue presentada la solicitud de
autorización de comercialización de panitumumab en la EMEA.
Panitumumab es un anticuerpo monoclonal IgG2 totalmente humano que se
une con alta afinidad al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFr),
que se encuentra sobreexpresado en el 25-77% de los cánceres colorrectales12,13.
El bloqueo de la vía de señalización del EGFr en las células cancerosas por pani-
tumumab determina no sólo la inhibición de la tirosina quinasa del receptor y la
proliferación celular, sino también otros efectos que son críticos para la supervi-
vencia tumoral, crecimiento y metástasis10. A continuación se resumen los datos
de los ensayos clínicos de panitumumab en cáncer colorrectal.
Farmacocinética de panitumumab, bases para la dosificación
Un estudio de fase 1 llevado a cabo por Weiner et al. en pacientes con

cáncer colorrectal, de pulmón no microcítico, renal, de próstata, páncreas o
esófago, evaluó los datos farmacocinéticos de panitumumab administrado a do-
sis de 0,01 mg/kg a 5 mg/kg una vez por semana, 6 m/kg/cada dos semanas y
9mg/kg/cada tres semanas. La dosis de 2,5 mg/kg/semana fue escogida como
dosis óptima sobre la base de la incidencia de exantema, saturación del aclara-
miento no linear de panitumumab y consecución de los niveles séricos asocia-
dos con la regresión tumoral en modelos. El modelado farmacocinético utiliza-
do en este estudio predijo que la dosis de 6 mg/kg/cada dos semanas y 9
188 mg/kg/cada tres semanas conseguirían concentraciones mínimas similares a 2,5
mg/kg/semana (aproximadamente 50 mcg/mL). Los resultados farmacocinéti-
cos de los pacientes de este estudio confirmaron esto, y en consecuencia la do-

sis de 6 mg/kg/cada dos semanas se escogió para los ensayos de fase 314.
Eficacia terapéutica en cáncer colorrectal (CCRm)
Estudio pivotal de fase 3
Peeters et al. llevaron a cabo un estudio multicéntrico, abierto, aleatorizado y

controlado de panitumumab administrado a dosis de 6 mg/kg/cada dos semanas
junto con el mejor tratamiento de soporte frente al mejor tratamiento de soporte
solo en pacientes con CCRm con progresión documentada radiológicamente (du-
rante o en los seis meses tras la quimioterapia más reciente consistente en fluoro-
pirimidinas, irinotecan y oxaliplatino), los pacientes tenían un estado funcional
ECOG de 0-2 y al menos un 1% de la membrana de las células tumorales presen-
taban tinción de EGFr por técnica de inmunohistoquímica (evaluada centralmen-
te). A los pacientes en el brazo del tratamiento de soporte que progresaban se les
permitía que se cruzasen a recibir panitumumab en un protocolo aparte. Las res-
puestas tumorales por RECIST modificado se analizaron mediante un proceso cie-
go de valoración y revisión centralizada en las semanas 8, 12, 16, 24, 32, 40, 48,
y cada 12 semanas a partir de entonces hasta progresión. La valoración principal
del estudio era determinar si panitumumab mejoraba la supervivencia libre de pro-
gresión frente al tratamiento de soporte. Otros objetivos eran seguridad, supervi-
vencia global, tasa de respuesta objetiva y duración de la respuesta. Un total de
463 pacientes fueron aleatorizados (231 en el brazo de panitumumab más trata-
miento de soporte y 232 en el brazo de tratamiento de soporte solo) con caracte-
rísticas basales bien equilibradas entre los dos grupos. Considerando todos los pa-
cientes, 67 (14%) tenían una puntuación ECOG de 2, 172 (37%) habían recibido
al menos 3 líneas previas de quimioterapia (el 100% había recibido al menos 2 lí-
neas), y la mediana de edad era de 63 años15.
Se observó una mejora significativa de la supervivencia libre de progre-
sión en el brazo panitumumab (p<0,0001) con una disminución en la tasa de
progresión relativa del 46% en los pacientes que recibieron panitumumab fren-
te a los que recibieron tratamiento de soporte (HR= 0,54, IC 95%: 0,44, 0,66).
Ya en la primera valoración programada para la semana 8, un mayor porcentaje
de pacientes estaban vivos sin progresión en el grupo panitumumab que en el
189
grupo control (49% vs 30%, respectivamente); con una diferencia que conti-
Tabla 1. Mejor respuesta objetiva de panitumumab más mejor tratamiento de

soporte frente a tratamiento de soporte solo15
Panitumumab más
Análisis primario, tratamiento de soporte Tratamiento de soporte
Revisión centralizadaa (n= 231) solo (n= 232)
Respuesta parcial
- n (%) 19 (8) 0 (0)
Enfermedad estable -
n (%) 64 (28) 24 (10)
Control de la enfermedad
(RP más EE) - n (%) 83 (36) 24 (10)
Tiempo hasta respuesta-
semanas
Mediana (min, máx) 8 (97, 15) n/a
Duración de la respuesta-
semanas
Mediana (min, máx) 17 (4, 40) n/a
a PorRECIST modificado, las tasas de respuesta se confirmaron al menos 4 semanas tras la
consecución del primer criterio de respuesta.
nuaba hasta las semana 40 (Figura 2). Un análisis de subgrupos demostró un

efecto coherente de panitumumab en función del estatus del ECOG, regímenes
de quimioterapia previa, estatus del EGFr o la edad. Debido probablemente al
diseño cruzado, un análisis interino de la supervivencia global mostró que no
Figura 2. Estimado
de Kaplan-Meiera
de supervivencia
libre de progresión
de panitumumab
más tratamiento de
soporte frente a
190
a Análisis
tratamiento de
primario, conjunto de todos los análisis aleatorizados, radiología
central. soporte solo15.
Tabla 2. La mejor respuesta objetiva de panitumumab más tratamiento de

soporte en el Estudio Cruzado15
Revisión local Pacientes
Pacientes que recibieron
panitumumab 174
Respuesta completa - n (%) 1 (1)
Respuesta parcial- n (%) 16 (9)
Enfermedad estable - n (%) 55 (32)
Control de la enfermedad
(RP más EE) - n (%) 72 (42)
había diferencias entre los dos grupos con un hazard ratio de 0,93 (IC 95%:
0,73, 1,19). Las mejores respuestas objetivas vistas en este estudio y en el estu-
dio cruzado se resumen en las Tablas 1 y 215.
Más pacientes en el grupo de panitumumab con tratamiento de soporte
frente al tratamiento de soporte sólo presentaron toxicidades cutáneas (91% vs
15% con exantema grado 3 /4 en el 14% y 0% respectivamente). También se
observaron: fatiga (24% vs 15%), dolor abdominal (23% vs 17%), náusea
(22% vs 15%), y diarrea (21% vs 11%) respectivamente. Doce pacientes (5%)
presentaron potenciales reacciones a la infusión (ninguna fue de grado 3 /4); 1
paciente interrumpió panitumumab debido a una reacción de hipersensibilidad
de grado 215.
Estudio de fase 2
Este estudio llevado a cabo por Malik et al. era multicéntrico, abierto, de
un único brazo para evaluar la seguridad y la eficacia de panitumumab en mo-
noterapia en pacientes con CCRm que habían fracasado al tratamiento con 5-
Fu con o sin leucovorin e irinotecán u oxaliplatino o ambos. La cohorte A in-
cluyó pacientes con tinción de EGFr por inmunohistoquímica de 2+ ó 3+ en al
menos el 10% de las células tumorales y la cohorte B incluyó pacientes con
suma de las tinciones de EGFr de 1+, 2+ y 3+ en al menos el 10% de las célu-
las tumorales, pero con suma de 2+ y 3+ en menos del 10% de las células tu-
morales. Panitumumab se administró como infusión IV a 2,5 mg/kg/semana
durante 8 ciclos hasta progresión de la enfermedad, toxicidad inaceptable o
191
muerte. Un total de 148 pacientes recibieron al menos una dosis de panitumu-
Tabla 3. Resultados de Eficacia para el estudio de fase 2 en monoterapia de

panitumumab en CCRm16
Parámetro de Cohorte A Cohorte B Total
eficacia (n= 105) (n= 43) (N= 148)
Respuesta global,
n (%) 7 (7%) 6 (14%) 13 (9%)
Enfermedad estable,
n (%) 36 (34%) 7 (16%) 43 (29%)
Enfermedad
progresiva, n (%) 35 (33%) 24 (56%) 59 (40%)
Medianaa (IC 95%)
Duración de la
enfermedad estable
(Revisión
centralizada) 18,3 (16,7, 26,4) 26,1 (16,3, 35,9) 24,7 (17,0, 26,4)
Medianaa (IC 95%)
Supervivencia sin
progresión, semanas 16,0 (9,6, 16,4) 8,3 (8,0, 16,3) 13,6 (8,3, 16,1)
Medianaa (IC 95%)
Supervivencia
global, semanas 39,9 (23,3, 44,7) 37,5 (24,1, 47,7) 37,6 (25,6, 42,4)
aMediana de Kaplan-Meier
mab con una media de edad de 59 años (21-88 años), 111 (75%) con un estado
funcional ECOG de 1, y 65 (44%) habían recibido 3 agentes quimioterápicos
previos. Se observó control de la enfermedad en 43 (41%) de los pacientes en
la cohorte A y 13 (30%) de los pacientes en la cohorte B. La duración mediana
de la enfermedad estable fue 18,3 semanas (IC 95% 16,7-26,4) para los pacien-
tes en la cohorte A y 26,1 semanas (IC 95% 16,3 - 35,9) para los pacientes en
la cohorte B. Los resultados de eficacia se muestran en la Tabla 316.
Los cuatro acontecimientos adversos grado 3/ 4 relacionados con el trata-
miento notificados con mayor frecuencia fueron exantema 5 (3%), fatiga 4
(3%), vómitos 2 (1%) y náusea 1 (1%). Acontecimientos adversos relacionados
con toxicidad cutánea fueron notificados por 141 pacientes (95%) y 5% eran
grado 3 y ninguno grado 4. Una reacción relacionada con la infusión se obser-
192 vó en un paciente que no requirió modificaciones de la dosis. No se observaron
anticuerpos anti-humanos en ninguno de los 145 pacientes testados16.
Estudios clínicos en primera línea en CCRm
En un estudio de fase 2, de dos partes, brazo único, llevado a cabo

en pacientes con CCRm, los pacientes fueron tratados con panitumumab
2,5 mg/kg/una vez por semana y IFL (parte 1) o FOLFIRI (parte 2; en-
mienda al protocolo debido a la toxicidad del esquema IFL). Los criterios
clave de eligibilidad incluyeron estatus ECOG de 0 ó 1, no tratamiento
previo con quimioterapia, expresión de EGFr en al menos el 10% de las
células tumorales. La valoración principal fue la incidencia de diarrea
grado 3 /4. Diecinueve pacientes se incluyeron en la parte 1 y 24 pa-
cientes en la parte 2, 14 (73%) y 19 (79%), respectivamente, de los pa-
cientes presentaron control de la enfermedad (incluye respuestas comple-
tas, respuestas parciales y enfermedad estable). La mediana de
supervivencia sin progresión fue de 5,6 meses y 10,9 meses, y la supervi-
vencia mediana global fue de 16,8 meses y no estimable (23 de los 24
pacientes seguían vivos en el momento del análisis). La incidencia de
diarrea grado 3 /4 fue 11 (58%) y 6 (25%) para la parte 1 y la parte 2,
respectivamente. Todos los pacientes (de ambas partes) presentaron toxi-
cidad cutánea, de los cuales 3 (16%) y 4 (17%) eran de grado 3 /4 para
la parte 1 y parte 2, respectivamente. No se observaron reacciones a la
infusión graves o formación de anticuerpos anti-humanos inducidos por
panitumumab 17.
CONCLUSIÓN
La innovación tecnológica en el desarrollo de AcM ha ido en la línea de

disminuir cada vez más el componente exógeno, generalmente murino, de los
mismos para minimizar su inmunogenicidad, lo que se espera que se asocie
con una mejora en su perfil de eficacia y seguridad. Panitumumab es el primer
AcM totalmente humano aprobado para ser utilizado en la clínica. En concreto,
la FDA lo ha aprobado para el tratamiento de pacientes con cáncer colorrectal
metastásico con sobreexpresión de EGFr en progresión durante o después del
tratamiento con esquemas de quimioterapia que contengan fluoropirimidinas,
irinotecan y oxaliplatino18. Actualmente, panitumumab está en fase de registro 193
por la EMEA.
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http://www.aacr.org/page5911.aspx# (Fecha de acceso: 3 de abril de 2006).
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col. 2005;Abstract 3520 y Póster.
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wwwext.amgen.com/medpro/vectibix_pi.html. (Fecha de acceso, 28 de Noviembre
de 2006).
195
Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la EMEA
EVALUACIÓN DE MEDICAMENTOS
BIOTECNOLÓGICOS EN LA AGENCIA EUROPEA
DE MEDICAMENTOS (EMEA)
BWP (GRUPO DE BIOLÓGICOS) Y CHMP
(COMITÉ DE MEDICAMENTOS DE USO HUMANO)
Sol Ruiz y Gonzalo Calvo
Agencia Española de Medicamentos y Productos Sanitarios
ABREVIATURAS
BWP Biologics Working Party (previamente Biotechnology Working

Party)
CHMP Committee for Human Medicinal products (previamente CPMP)
COMP Committee for Orphan Medicinal Products
CPMP Committee for Proprietary Medicinal Products (actualmente
CHMP)
CVMP Committee for Veterinary Medicinal Products
EM Estado(s) Miembro(s)
EMEA European Medicines Agency 197
HMCP Committee for Herbal Medicinal Products
ICH International Conference for Harmonization of Technical Requi-

rements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use
OMS Organización Mundial de la Salud
PhEur Farmacopea Europea
RMS Reference Member State
UE Unión Europea
INTRODUCCIÓN
Durante la década de los 80, los avances en ingeniería genética y en el

establecimiento y cultivo de líneas celulares han permitido la obtención de
multitud de proteínas terapéuticas (ej. eritropoyetina, hormona de crecimien-
to, interferón) que nunca hubiese sido posible obtener en cantidad suficiente
de sus fuentes naturales. Además, el desarrollo de las técnicas de ingeniería
de proteínas ha permitido disponer de proteínas modificadas respecto a sus
equivalentes naturales que presentan una mejor eficacia clínica, un mejor
perfil de seguridad o una nueva aplicación terapéutica. Así, se encuentran
disponibles análogos de insulina o eritropoyetina, (ej. insulina lispro, darbe-
poetin alfa), proteínas de fusión que combinan características de dos proteí-
nas diferentes (ej. etanercept), proteínas conjugadas a polietilénglicol (ej.
peginterferon, pegfilgrastim) o anticuerpos monoclonales "humanizados" (ej.
alemtuzumab).
Desde la creación de la agencia europea de medicamentos (EMEA) en
1995, la evaluación de estos medicamentos obtenidos mediante tecnología
del ADN recombinante se realiza, por requerimiento legal, mediante un pro-
cedimiento de tipo centralizado, es decir, efectuado en todos los países de la
Unión Europea a la vez y coordinado por la EMEA. Hasta la fecha se han
autorizado más de 70 productos biotecnológicos y se espera que este número
siga aumentando durante los próximos años. Además, la investigación en
nuevos sistemas de expresión permitirán obtener medicamentos biotecnológi-
cos de fuentes "menos convencionales" como por ej. animales transgénicos o
plantas. Así, la EMEA autorizó en junio de 2006 el primer medicamento bio-
tecnológico (antitrombina III humama recombinante) producido en la leche
198 de cabras transgénicas. Otros productos obtenidos en conejos transgénicos,
tales como C1 inhibidor, lactoferrina y fibrinógeno humanos, se encuentran
en fase de desarrollo clínico o preclínico. Otros medicamentos considerados

de alta tecnología incluyen las denominadas "terapias avanzadas" que inclu-
yen terapia génica, terapia celular somática e ingeniería de tejidos. Las solici-
tudes de comercialización para estos productos se evalúan también mediante
el procedimiento centralizado (solamente la autorización de ensayos clínicos
es responsabilidad nacional).
La legislación comunitaria actual permite la autorización de medica-
mentos biosimilares, es decir, medicamentos biotecnológicos equivalentes a
otros ya autorizados y cuya patente ha expirado. Su autorización es también
mediante el procedimiento centralizado coordinado por la EMEA. Hasta
ahora se han autorizado dos medicamentos (ambos son preparaciones de
hormona de crecimiento humana recombinante) siguiendo esta nueva vía de
autorización.
Marco legal y bases para la creación de una agencia europea de

evaluación de medicamentos
Los fundamentos de la Unión Europea (UE) se recogen en el Tratado de

Roma, ratificado inicialmente por seis países en 1957. Aunque el tratado com-
prometía a sus signatarios a establecer un amplio rango de medidas de armoni-
zación, dejaba la organización de la sanidad y los sistemas de seguridad social
a la decisión de cada país. Cada estado miembro (EM), por tanto, desarrolló su
propia regulación farmacéutica.
Desde 1965 (fecha de adopción de la primera directiva de la UE), la legis-
lación farmacéutica comunitaria ha buscado dos objetivos fundamentales: la
protección de la salud pública y la creación de un mercado común que permita
la libre circulación de medicamentos.
La Comisión Europea (en adelante referida como Comisión) comenzó
en 1965 a promulgar Directivas (del inglés, Directives), es decir, leyes o
disposiciones comunitarias de carácter obligatorio, relacionadas con la re-
gulación farmacéutica. La Directiva 65/65/EEC del Consejo de 26 de ene-
ro de 1965 estableció el principio de concesión de autorizaciones de comer-
cialización de especialidades farmacéuticas en todos los EM sobre criterios
científicos de calidad, seguridad y eficacia, sin tener en cuenta considera-
ciones de tipo socioeconómico. Diez años más tarde, los EM consolidaron
199
la experiencia adquirida y se pusieron de acuerdo sobre principios comunes
para la autorización y control de medicamentos de uso humano (Directivas

75/318/CEE y 75/319/CEE del Consejo de 20 de mayo de 1975). No obs-
tante, cada EM mantenía la responsabilidad de conceder o denegar la auto-
rización para comercializar cada medicamento en particular. Actualmente,
tanto las directivas citadas anteriormente como otras relacionadas con me-
dicamentos humanos han sido derogadas y sustituidas por la Directiva
2001/83/EC del 6 de noviembre, posteriormente modificada y ampliada por
la Directiva 2003/63/EC del 25 junio. Estas dos directivas constituyen ac-
tualmente la legislación básica que regula los medicamentos para uso hu-
mano. Otra directiva posterior, 2004/27/EC, y la Regulación (EC) No.
726/2004 modifican y delimitan también el ámbito de aplicación de la di-
rectiva 2001/83/EC.
En 1977, el denominado Comité de Especialidades Farmacéuticas o
CPMP (Committee for Proprietary Medicinal Products), formado por repre-
sentantes de todos los EM y de la Comisión, a solicitud de un EM o de la Co-
misión, podía emitir un dictamen consultivo sobre temas relacionados con la
autorización de medicamentos y sobre el control de reacciones adversas de los
mismos (farmacovigilancia).
En 1981, se adoptaron provisiones similares para medicamentos de uso
veterinario (Directivas 81/51/CEE y 81/52/CEE del Consejo de 28 de septiem-
bre de 1981), incluyendo la creación del Comité de Medicamentos Veterina-
rios o CVMP (Committee for Veterinary Medicinal Products). Al igual que pa-
ra medicamentos humanos, estas directivas han sido sustituidas por otra más
reciente, la Directiva 2001/82/EC.
La creación de estos comités supuso también el inicio de un procedimien-
to coordinado de evaluación, con dictamen no vinculante, que marcó un paso
importante en la cooperación entre EM. Aparte de los procedimientos de regis-
tro nacionales, las compañías farmacéuticas podían utilizar dos tipos de proce-
dimiento de registro comunitario: el "procedimiento multi-estado" (amplia-
ción de la autorización existente en un EM a dos o más de los restantes EM) o
el "procedimiento de concertación" (evaluación coordinada de la solicitud de
autorización en todos los EM; ningún EM podía tomar una decisión individual
sobre una autorización de comercialización antes de su discusión previa y dic-
tamen por el CPMP). Este último procedimiento estaba reservado a los medica-
200 mentos obtenidos por procesos biotecnológicos y para otros medicamentos de
alta tecnología.
Con el objeto de colaborar con el CPMP en determinados aspectos de la

evaluación de medicamentos, se crearon grupos de trabajo sobre calidad, se-
guridad y eficacia con objeto de aproximar la forma en que cada EM ponía en
práctica las obligaciones derivadas de las directivas comunitarias. Estos gru-
pos de trabajo han tenido su continuación en grupos equivalentes en el seno
de la EMEA.
Primeros pasos en la creación del Grupo de Biotecnología
En 1985 se creó el denominado Ad Hoc Working Group on Biotechno-

logy/Pharmacy (precedente del grupo de Biotecnología de la EMEA) con dos
objetivos fundamentales: asesorar al CPMP sobre solicitudes de autorización de
productos biotecnológicos y establecer recomendaciones específicas sobre la
producción y control de calidad y seguridad de estos productos.
Esta segunda finalidad se llevó a cabo mediante la elaboración de di-
rectrices o "guidelines" (i.e. disposiciones de carácter no obligatorio basa-
das en los conocimientos científicos del momento sobre un aspecto concre-
to). Se ha preferido la utilización de directrices, que no obligan
jurídicamente, en vez de un instrumento jurídico formal, como una directiva,
con el fin de mantener la flexibilidad y no poner obstáculos legales al pro-
greso científico. Se admite que en algunos casos, como resultado de los
avances científicos, pueda ser adecuado otro enfoque. Sin embargo, cuando
un solicitante decida no seguir una determinada directriz debe explicar y
justificar dicha decisión en los informes que presente la compañía en apoyo
de su solicitud.
El Ad Hoc Working Group on Biotechnology/Pharmacy estaba formado
por expertos (alrededor de 20) procedentes de diferentes áreas relacionadas
con la Biomedicina, desde autoridades reguladoras, laboratorios nacionales
de control o investigadores, y un representante (observador) de la Farmaco-
pea Europea (PhEur). En esta etapa inicial se completaron y/o iniciaron va-
rias directrices sobre citoquinas, anticuerpos monoclonales y reducción del
riesgo de transmisión de encefalopatías espongiformes a través de medica-
mentos. Este grupo ha tenido continuación como el Biotechnology Working
Party (BWP) dentro de la estructura de la EMEA. Recientemente este grupo
ha pasado a denominarse Biologics Working Party (BWP), aunque sus funcio-
201
nes no han variado.
LA AGENCIA EUROPEA DE MEDICAMENTOS. PROCEDIMIENTOS

DE AUTORIZACIÓN
A finales de 1990 se publicaron varias propuestas relacionadas con la cre-

ación de la agencia y el nuevo sistema comunitario para autorización de medi-
camentos. En 1993 se decidió fijar la sede de la EMEA en Londres y comenzó
a funcionar como tal en febrero de 1995. La función principal de la EMEA es
coordinar y organizar el sistema de autorización de medicamentos en Europa.
Este sistema evalúa cualquier solicitud de comercialización bien mediante el
denominado "procedimiento centralizado" (autorización de comercialización
en todos los países de la UE a la vez; decisión unánime o por mayoría) o "des-
centralizado" (también conocido como "reconocimiento mutuo", equivalente
al anterior procedimiento "multi-estado" (extensión de la autorización existente
en un EM a otros). El procedimiento centralizado de autorización está regla-
mentado por la Regulación (EC) No. 726/2004. Este procedimiento es obliga-
torio para los medicamentos que se describen a continuación:
• medicamentos obtenidos a partir de tecnología del ADN recombinante, o
de la expresión controlada de genes que codifican proteínas biológica-
mente activas en procariotas o eucariotas, incluyendo las células de ma-
mífero transformadas, u obtenidos a partir de hibridomas o que emplean
anticuerpos monoclonales durante su producción
• medicamentos veterinarios empleados como potenciadores para aumen-
tar el crecimiento o rendimiento de los animales tratados
• medicamentos humanos para el tratamiento del síndrome de inmunodefi-
ciencia adquirida, cáncer, diabetes y enfermedades neurodegenerativas.
A partir de 2008 también será aplicable a enfermedades autoinmunes u
otras alteraciones inmunitarias y para enfermedades virales.
• Medicamentos huérfanos (según la Regulación (EC) No 141/2000).
Existen actualmente cuatro comités científicos dentro de la EMEA:
CHMP (comité de medicamentos humanos; previamente CPMP), CVMP (co-
mité de medicamentos veterinarios), COMP (Committee for Orphan Medicinal
Products; encargado de la concesión este tipo de clasificación a un medica-
mento) y HMPC (Committee for Herbal Medicinal Products; encargado de
202 plantas medicinales). Cada uno de estos comités está formado por un represen-
tante de cada uno de los EM. La EMEA actúa como el eje central del sistema
europeo, organizando y coordinando el trabajo de evaluación que es llevado a

cabo por expertos nacionales de cada una de las agencias reguladoras.
EVALUACIÓN DE MEDICAMENTOS DE USO HUMANO Y

VETERINARIO: EL CHMP Y CVMP
Desde la creación de la EMEA, ambos comités de medicamentos humanos y

veterinarios, CHMP y CVMP, respectivamente, continúan su labor mediante reu-
niones mensuales de varios días de duración. Una gran parte de la agenda consiste
en la discusión y emisión de dictámenes respecto a nuevas solicitudes de comer-
cialización, bien por el procedimiento centralizado o por el descentralizado. En el
procedimiento centralizado, dos miembros del comité (representantes de países
distintos) son designados como ponentes (rapporteur y co-rapporteur) para coor-
dinar la evaluación de cada solicitud. Tras la evaluación en el ámbito nacional, los
informes de cada uno de los ponentes son discutidos en las reuniones del comité
científico correspondiente (CHMP o CVMP), y se emite un informe final vincu-
lante sobre dicho producto. La decisión final se transmite a la Comisión, que con-
vertirá dicha opinión en una única autorización de comercialización para toda la
UE. Solamente quedan a decisión nacional los aspectos relacionados con el precio
del medicamento y su posible financiación por el sistema nacional de salud.
El procedimiento descentralizado está basado en el principio de reconoci-
miento mutuo de autorizaciones nacionales. Permite la extensión de una autori-
zación de comercialización dada por un EM (denominado EM de referencia o
RMS) a otro(s) EM identificados por el solicitante. Cuando no sea posible lle-
gar a un acuerdo porque algún EM no acepte la autorización nacional original
concedida por el RMS, los puntos de desacuerdo serán discutidos en el recien-
temente creado Grupo de Coordinación. Si el desacuerdo permanece, la deci-
sión del comité correspondiente (CHMP o CVMP) es siempre vinculante.
Independientemente del procedimiento seguido, la decisión final es toma-
da por la Comisión Europea o, en caso de desacuerdo importante entre EM,
por el Consejo de la UE.
Aquellos productos que vayan a comercializarse únicamente en un EM
pueden continuar utilizando la vía de autorización nacional (como se ha descri-
to anteriormente, los productos biotecnológicos nunca podrían utilizar esta vía
203
de autorización).
Grupos de trabajo del CHMP
Con objeto de emitir una opinión sobre cualquier cuestión planteada a la

EMEA relacionada con medicamentos, el CHMP cuenta con el apoyo de gru-
pos de trabajo que le asesoran en aspectos específicos relacionados con la cali-
dad, eficacia y seguridad de medicamentos y que participan en las actividades
de armonización internacionales (ICH).
Actualmente existen diferentes grupos de trabajo del CHMP y uno conjun-
to del CHMP/CVMP:
• Grupo de Biológicos (Biologics Working Party o BWP - previamente
Biotechnology Working Party): asesora al CHMP y COMP sobre aspec-
tos relacionados con la producción y control de productos biológicos y
biotecnológicos.
• Grupo de Eficacia (Efficacy Working Party o EWP), responsable de
elaborar recomendaciones metodológicas en áreas terapéuticas estableci-
das y documentos de opinión sobre aspectos de eficacia de medicamen-
tos en áreas en desarrollo clínico.
• Grupo de Seguridad (Safety Working Party, SWP), discusión y reco-
mendaciones sobre aspectos de seguridad preclínicos.
• Grupo de Farmacovigilancia (Pharmacovigilance Working Party,
PhWP), grupo de discusión y evaluación de aspectos relacionados con la
seguridad o cambios en la relación riesgo/beneficio de medicamentos
autorizados.
• Grupo de Hemoderivados (Blood Products Working Group, BPWG),
encargado de aspectos de seguridad y evaluación clínica de productos
derivados de sangre o plasma humanos.
• Grupo de Vacunas (Vaccine Working Party, VWP), evaluación y discusión
de aspectos relacionados con la calidad, eficacia y seguridad de vacunas;
• Grupo de Terapia Génica (Gene Therapy Working Party, GTWP), gru-
po asesor en temas de terapia génica.
• Grupo de Terapia Celular e Ingeniería de Tejidos (Working Party on
Cell-based Products, CTWP); grupo asesor en temas de terapia celular e
ingeniería de tejidos.
204 • Grupo de Biosimilares (Similar Biological (Biosimilar) Medicinal Pro-
ducts, BMWP), grupo encargado de aspectos de seguridad y evaluación
clínica de medicamentos biológicos o biotecnológicos que se presentan

como equivalentes a otro ya autorizado.
• Grupo de Farmacogenética (Pharmacogenetics Working Party, PgWP),
grupo asesor del CHMP en materias relacionadas con farmacogenética.
• Grupo de Calidad (Quality Working Party, QWP), grupo conjunto del
CHMP y CVMP para armonizar y asesorar sobre aspectos de calidad de
medicamentos humanos y veterinarios.
El grupo de Biológicos (BWP)
Desde 1995 hasta ahora el BWP viene celebrando unas 10-12 reuniones
anuales, de varios días de duración, en la sede de la EMEA. Este grupo está
formado por un representante de cada uno de los EM de la UE, un representan-
te de la Comisión, un representante de la Farmacopea Europea, personal técni-
co de la EMEA y, desde febrero de 2000, un representante de Noruega y otro
de Islandia se han incorporado como miembros de pleno derecho (presentes
desde 1999 en calidad de observadores).
El BWP es responsable de proporcionar asistencia técnica al CHMP sobre
aspectos relacionados con la fabricación y control de medicamentos biotecno-
lógicos y de origen biológico, incluyendo aquellos derivados de sangre o plas-
ma y productos inmunológicos. El BWP es también el grupo asesor del COMP
para productos de origen biológico o biotecnológico y de la OMS en aquellos
casos en que este organismo lo solicite.
Las actividades principales del BWP se describen a continuación:
• Elaboración de informes sobre los procesos de producción y control de
las solicitudes de comercialización de medicamentos humanos de origen
biológico y biotecnológico. Los aspectos relacionados con la calidad de
este grupo de medicamentos se discuten en la reunión correspondiente
del BWP y se emite un informe para su consideración por el CHMP
que, tras la discusión de los aspectos toxicológicos y clínicos del medi-
camento en cuestión, emitirá un dictamen final sobre la aprobación o re-
chazo de la solicitud correspondiente.
• Elaboración de directrices o recomendaciones europeas e internacio-
nales sobre temas específicos relacionados con productos biológicos
y biotecnológicos. Al igual que el resto de grupos de trabajo, una de 205
las tareas fundamentales del BWP es la elaboración de directrices o
recomendaciones, que serán después aprobadas por el CHMP, sobre

temas específicos relacionados con productos biológicos y biotecno-
lógicos. Con este fin, se suelen crear subgrupos dentro del BWP que
elaboran un documento inicial sobre un tema especifico que es discu-
tido posteriormente en las sesiones plenarias del BWP. En general,
las directrices elaboradas por el BWP son objeto de evaluación conti-
nua a medida que se producen avances científicos en temas específi-
cos. Expertos del BWP participan también en grupos de trabajo inter-
nacionales para armonizar criterios y recomendaciones entre la UE,
Norteamérica y Japón (actividades ICH) sobre este grupo particular
de medicamentos.
El BWP también proporciona asesoramiento al CHMP en forma de docu-
mentos de opinión o recomendaciones puntuales (Points to Consider) sobre as-
pectos concretos relacionados con un grupo particular de medicamentos (p. ej.
aspectos relacionados con la evaluación de posibles vacunas de gripe atenua-
das), introducción de nuevos requerimientos de control (p. ej. test de PCR para
la detección del virus de la hepatitis C en volúmenes de plasma para la obten-
ción de hemoderivados), etc.
• Asesoramiento científico. Las compañías farmacéuticas tienen la posibi-
lidad de solicitar asesoramiento científico en cualquier momento durante
el desarrollo de un medicamento previo a la presentación de una solici-
tud de autorización de comercialización o antes de introducir determina-
dos cambios en la fabricación de un medicamento ya autorizado. El ase-
soramiento en aspectos de producción y control de medicamentos
biotecnológicos lo realiza el BWP.
• Organización de "workshops" y reuniones sobre temas relacionados con
medicamentos biológicos y biotecnológicos. El BWP organiza reuniones
con expertos europeos e internacionales con objeto de discutir los últi-
mos avances científicos en determinadas áreas que permitan la elabora-
ción de recomendaciones especificas, p. ej. productos de terapia génica,
ensayos para la detección de marcadores de encefalopatías espongifor-
mes y su posible aplicación a medicamentos, etc. El BWP también lleva
a cabo reuniones con representantes de la industria farmacéutica impli-
cados en temas concretos con objeto de evaluar las implicaciones o con-
206 secuencias de la introducción de determinadas medidas de control o de
discutir la aplicación de las mismas de forma coordinada, p. ej. con re-
presentantes de fabricantes de gelatinas y derivados de grasas animales

empleados en la fabricación de medicamentos.
• Reuniones con otros grupos de trabajo de la EMEA y de la PhEur.
Miembros del BWP participan también en reuniones conjuntas con
miembros de otros grupos de trabajo con objeto de coordinar y facilitar
la adopción de recomendaciones concretas, p. ej. la discusión sobre as-
pectos de seguridad del tiomersal (empleado en la fabricación de deter-
minadas vacunas) se llevó a cabo junto con los Grupos de Seguridad
(SWP) y el de Farmacovigilancia (PhWP). Miembros del BWP también
forman parte de grupos de trabajo de la PhEur para coordinar activida-
des y recomendaciones en temas relacionados con el control de calidad
de productos biológicos y biotecnológicos en general.
WEBLIOGRAFÍA
www.emea.europa.eu Información adicional sobre el BWP y actividades de la EMEA
en general (incluyendo los documentos elaborados por los gru-
pos de trabajo)
pharmacos.eudra.org Regulación relacionada con la autorización de medicamentos
en la Unión Europea
207
Impact of pharmacogenetics on drug use
IMPACT OF PHARMACOGENETICS ON DRUG USE IN

INDIVIDUALLY OPTIMISED PHARMACOTHERAPY
Arnold G. Vulto PharmD PhD and Monique J. Bijl MPharm. Department of Hospital Pharmacy.
Erasmus University Medical Centre Rotterdam. The Netherlands
Traditional pharmacotherapy is rather inefficient; on

average only 40% of patients will benefit from a particular
drug as compared with placebo. Interindividual variability in
drug disposition and effect can be partly explained by
genetic variants. In the science of pharmacogenetics the
influences of genetic differences on patients' drug response
are studied. The major causes of inefficient drug treatment
(like lack of effectiveness or the occurrence of side effects
or toxicity) are heterogeneity of the disease, variations in
drug disposition (pharmacokinetics) and drug response
(pharmacodynamics).
Genetic variants can be detected by amplification of DNA
using the Polymerase Chain Reaction (PCR) followed by
sequence analysis. Other techniques, like micro-arrays,
enable us to screen the whole genome.
The influence of pharmacogenetics becomes more and more
important in clinical practice and on drug development. In
this review we will discuss the principles of
pharmacogenetics and the practical implications, illustrated
with examples taken from clinical practice.
Pharmacogenetics is a new cornerstone in medicine!
INTRODUCTION
When looking at the demographic evolution one can observe that there
has been an impressive increase in life expectancy of the population in the 209
developed world during the last century. Currently, it is not expected that, on
average, we can add many more years to the general population. The formi-
dable increase in life expectancy was caused by a general increase in stan-
dard of living, including better hygiene standards such as the availability of
clean (and thus safe) drinking water and a reliable sewage system in crowded
areas. Although difficult to quantify, improved medical care may have contri-
buted as well. With a traditional medical approach, we are able to cure infec-
tious diseases and postpone deleterious effects of systemic diseases like dia-
betes, hypertension, COPD, etc. However, we may have reached a plateau
with this rather crude and population-based approach. When treating risk fac-
tors (e.g. hypertension) medically, we are grossly overtreating the general po-
pulation; only a minority will actually benefit from these treatments. A good
measure to evaluate treatment effect is the Numbers Needed to Treat (NNT):
the total number of people that are exposed to treatment to prevent one inci-
dent. For example >1000 patients younger than 60 years with hypertension
should be treated to prevent one death. From this perspective, traditional
drug treatment is rather inefficient and causes a serious morbidity problem
(due to inherent side effects).
The reason for this inefficiency is that we cannot point out beforehand
which patients will benefit from the treatment. For many drugs, the exact dose-
response relationship is uncertain. So, on top of inefficiency, there is also a cer-
tain degree of inaccuracy. Patients do not only show a considerable variation in
disease-development but also in drug disposition (pharmacokinetics) and drug
effects (pharmacodynamics) (Evans et al; 2003). As a result, some experts state
that only some 40% or less of all used drugs benefit individual patients (i.e.
60% or more of all drugs do not clearly benefit our patients).
The mapping of the human genome is slowly changing this scene. Based
on genetic analysis drugs can be produced tailor-made for specific patients,
based on their genetic constitution. Many applications can be envisaged. Ge-
netic predisposition can be spelled out: which patients carry a serious disease
risk and should be treated with priority? Which patients will benefit most
from certain types of drugs? It may become possible to repair genetically de-
termined risk factors, or to repair genetic defects (gene therapy). Gene therapy
can also be employed to change the biochemical repertoire of a cell in such a
way that the body is producing its own drugs. But also in the use of traditio-
210 nal drugs, the scene will change. Factors like absorption and metabolism are
genetically determined by the structure of so-called P-glycoprotein pumps in
the cell membrane and polymorphism of the cytochrome P450 family of drug
metabolising enzymes in the liver. In addition, it may become feasible to as-
sess the sensitivity of target-tissues or even become possible to change it in a
desirable fashion.
GENETIC VARIATION
The whole DNA sequence is called the human genome. The arsenal of
proteins is the proteome. 99.9% of the genome of two unrelated persons is
identical, but still there is genetic variability in 0,1% of 3.3 billion base pairs
(on average one variant per 1000 bases).
The most common type of variant is a single nucleotide polymorphism
(SNP), a single-base difference in the DNA sequence that can be observed be-
tween individuals in the population. A polymorphism has been defined as the
minor allele occurring in more than 1% of the population, whereas mutations
are rare. Many mutations have been discovered in coding sequences of genes
causing rare inherited diseases.
The specific set of alleles observed on a single chromosome is called a ha-
plotype. Haplotypes are formed by recombination when the paternal and mater-
nal chromosomes exchange corresponding segments of DNA. The coinheritan-
ce of SNPs on these haplotypes leads to associations between these alleles
(linkage disequilibrium). Not a single SNP but the haplotype is associated with
the disease. This advantage leads to optimal genotyping: carefully chosen SNPs
in a specific region will provide enough information to predict much of the in-
formation about the remaining SNPs in that region. These SNPs are called
'tagSNPs' and are used to screen the whole genome (Burton et al; 2005).
The human genome is diploid (one paternal and one maternal allele). A
SNP can be present on 0, 1 or 2 alleles. If an individual has no polymorphism
on both alleles, this individual is called homozygous wildtype. One speaks of
homozygous mutant if both alleles are affected. An individual with one wildtype
and one variant allele is heterozygous. A SNP could lead to no functional enzy-
me activity or decreased enzyme activity. To simplify different combinations
the term semiquantitative gene dose (SGD) is introduced. Functional alleles ha-
ve a SGD of 1, completely dysfunctional alleles 0 (e.g. CYP2D6*4) and 0,5 211
for variant alleles with decreased enzyme activity (Steimer et al; 2004).
SOURCES OF VARIATION
The major causes of ineffi-

cient drug treatment are heteroge-
neity in disease, variations in drug
disposition (pharmacokinetics)
and drug response (pharmacody-
namics). The figure shows the re-
lationships in relation with the
drugs response / therapy outcome
and the targets we can use to opti-
mise pharmacotherapy. In the fo-
llowing sections we will present
some illustrative examples of ge-
netic variability with practical
consequences for the quality of
Figure 1. Variability in
drug response scheme. pharmacotherapy.
Heterogeneity in disease
One of the interesting examples of diseases showing the importance of ge-

netic heterogeneity is Alzheimer-disease. Currently, we know that at least 3 ge-
ne-mutations are involved. In addition, there are polymorphisms in susceptibi-
lity genes. Such genes may not cause the disease themselves but may make an
individual more sensitive to acquire the disease if conditions make this permi-
ssive.
The E4 variant of APOE (apolipoprotein E) is associated with an increa-
sed risk of Alzheimer disease. Homozygosity of the E4 allele increases the risk
of Alzheimer by a factor 33 in Japaneses, 15 in Caucausians and 6 in African
Americans. Although this increased risk is known for 12 years, its identifica-
tion did not help to develop effective medicines or prevention strategies.
Alzheimer is also an illustrative example to show heterogeneity in drug
response. When the cholinesterase-inhibiting drug tacrine was investigated in
clinical trials, the overall efficacy was disappointing: only about 1/3 of the pa-
212 tients benefited from the drug, in 1/3 there was no apparent effect and the drug
had to be discontinued in another 1/3 due to side effects. Only later (when the
drug was already dead) is was found that patients with a ApoE 2/3 genotype
showed a 80% response while the ApoE 4 genotype predisposed for no effect /
worsening of the disease and suffering from side effects. This example shows
the potential promise of genome technology. Some drugs are very efficacious
in some patients, but not in others. But how can we learn this beforehand? That
means that we have to study the origins of variability in drug response in more
detail, and these may have to do with disease state, pharmacokinetics and phar-
macodynamics.
On the other hand success stories are also know. The drug trastuzumab has
a high affinity for the HER2 transmembrane protein. HER2 (human epidermal
growth factor) is a member of the epidermal growth factor receptor (EGFR) fa-
mily of tyrosine kinases and is involved in regulation of cell proliferation. In pa-
tients with overexpression of HER2 or an amplification of the gene, breastcan-
cer is more aggressive: enhanced growth and proliferation, increased invasive
and metastatic capability and stimulation of angiogenesis. In these patients treat-
ment with trastuzumab leads to a response rate of 34%. In combination with cy-
totoxic agents the response rate is further increased (Hortobagyi et al; 2005).
Heterogeneity in Pharmacokinetics
Absorption / P-glycoprotein and Multi-Drug Resistance (MDR) Genes
The P-glycoprotein efflux pump, which is encoded for by the MDR1 gene,
plays an important role in the export of substances from the inside of cells and
from membranes to the outside. PGP (P-glycoprotein) protects cells from toxic
substances and many drugs by permitting or inhibiting transportation through
the intestine and other epithelial barriers. To date at least 105 variants of the
MDR1 gene have been discovered. Not all these SNPs lead to an effect on
PGP; most of them are intronic or non-coding. Of the 15 most common variants
the C3435T mutation at exon 26 is well known. This silent mutation leads to an
alteration in the effect of PGP. The TT genotype (homozygous variant allele) is
associated with a twofold lower MDR-1 expression level in the duodenum
compared with the CC genotype (wildtype) and resulted for instance in a hig-
her digoxine plasma concentration (Kerb; 2006).
HIV-protease inhibitors are known substrates of PGP resulting in a low
213
bioavailability and a limited penetration in targets. Patients who were ho-
mozygous for the 3435TT genotype had low plasma concentrations of nelfi-
navir and efavirenz, but for not fully understood reasons, they had a better
antiviral response and CD4+ immune recovery than patients with the CC- or
CT genotype (Fellay et al; 2002). This can be explained by low PGP levels
in the membrane of (infected) cells and therefore enhanced concentration
build-up of anti-retroviral drugs in these cells. The frequency of the TT ge-
notype is very low in Africans comparing to Caucasians (25%), which ex-
plains the difference in response between Caucasians and black Africans to
these drugs.
Metabolism / polymorphism in drug metabolising enzymes
Many drugs are metabolised by the oxidative cytochrome P450-enzyme

complex. One member of this family, CYP2D6, is extremely polymorphic,
with more than 75 allelic variants. CYP2D6*4 is the most common variant
(21% allele frequency in Caucasians), which leads to a non-functional allele.
Subjects homozygous for a non-functional variant allele lack enzyme activity
and are defined as 'poor metabolisers' (PMs). The CYP2D6 PM phe-
Figure 2. Schematic notype results in an increased plasma concentration of drugs predo-
presentation of the minantly metabolised by CYP2D6 e.g. tricyclic antidepressants, co-
relationship between the
deine, tramadol. In case of a narrow therapeutic window this will
debrisoquine metabolic
lead to toxicity.
ratio and CYP2D6 genotype
in caucasians (Dahl et al;
CYP2D6 gene duplication/multiplication occurs relatively infrequent
2002). among northern Europeans (1-2% of the Swedish population), but increa-
ses in southern direction: 7-
10% of Spaniards and Sout-
hern Italians, and as high as
29% of Ethiopians. Such
subjects can have an inade-
quate response to standard
doses of drugs metabolised
by CYP2D6 and are called
'ultrarapid metabolisers'
(UMs) (Dahl et al; 2002).
214 These polymorphisms
are illustrated in Figure 2.
The following case is a nice example showing the influence of CYP2D6

polymorphisms in daily practice (Gasch et al; 2004).
A 62-year-old man with a history of chronic lymphocytic leukaemia had com-
plaints of fever, fatigue, dyspnea and a cough. Therapy with ceftriaxone, clari-
thromycine and voriconazol was initiated for pneumonia infected by yeast. The
patient received a modest dose of codeine (25 mg 3 times daily) to relieve the
cough. After 4 days, the patient's level of consciousness deteriorated. His neurolo-
gical status (a score of 6 on the Glasgow Coma Scale) was poor. After the admi-
nistration of naloxone, the patient recovered rapidly. Extremly high plasma levels
of codeine and morphine were found despite of the modest dose of codeine. After
analysis of the patients CYP2D6 genotype, the patient seemed to be an ultrarapid
metaboliser. Along with the CYP2D6 gene duplication, a drug interaction may ha-
ve contributed to the observed toxic effects. Voriconazole and clarithromycine both
inhibit CYP3A4, thereby decreasing the amount of the metabolite norcodeine (and
increasing codeine concentration). At last due to renal failure the excretion of the
morphine metabolites was reduced, leading to the observed respiratory problems.
A similar example demonstrating the impact of the CYP2D6 genotype on
codeine toxicity was published in the Lancet (Koren et al; 2006). A full term
baby boy died due to an increased morphine concentration (70 mg/ml instead
of 0-2,2 ng/ml). The mother, who was breast-feeding her child, was prescribed
codeine in a standard dose. After genotyping for CYP2D6, the mother seemed
to be an ultrarapid metaboliser (gene duplication). This genotype leads to in-
creased formation of morphine from codeine, which she passed on to her boy.
Genetic variations do not only determine drug response and toxicity but
also side effects. A polymorphism (C677T) in 5,10-methylenetetrahydrofolate
(MTHFR) polymorphism for example, can determine MTX toxicity. MTHFR
is a folate-metabolizing enzyme that is inhibited by MTX metabolites. The ac-
tivity of the enzyme is reduced in the TT and CT genotypes to 30% and 60%
respectively. Patients with these genotypes often experience MTX toxicity as a
result of low folate levels. As the prevalence of MTHFR variant allele is very
high, (TT 10-12% and CT 40%) genotyping with subsequent adaptation in the-
rapy will reduce the risk of MTX toxicity (Ulrich et al; 2001).
Unless proven evidence that genotyping contributes to better drug respon-
se, genotyping is hardly performed in clinical practice to predict drug response.
It is mostly carried out afterwards to explain clinical symptoms as seen in the
215
cases mentioned above.
Thiopurine S-methyltransferase (TPMT) genotyping comprises an excep-

tion: it is clinically used to prevent life-threatening myelosuppression in pa-
tients with acute lymphoblastic leukemia, treated with mercaptopurine (Puri-
Nethol®) or azathioprine (Imuran®).
The immunosuppressant thiopurine drugs mercaptopurine and azathioprine
are metabolised by thiopurine S-methyltransferase (TMPT) and xanthine oxidase
(XO). Variation in TPMT is of much greater impact than XO. Three important
SNPs are found in the TPMT gene: TPMT*3A, *3B and *3C. The presence of
one of these mutations leads to reduced enzyme activity. Subjects homozygous
for the variant allele TPMT*3A (0,3% of the Caucasians) are of increased risk of
myelosuppression, a known side effect of thiopurine drugs. *3C is the most co-
mmon variant allele in Asian subjects, while *3B is very rare (Wang et al; 2006).
Phenotypic assays for TPMT, performed on red blood cells, have also
been developed. However, the phenotypic assay is labor-intensive, requires
qualified knowledge and expensive instruments.
Some authors have doubts about the benefit of genotyping, since TPMT
polymorphism fails to explain all cases of myelosuppression. However, cer-
tainty is rare in clinical medicine. TPMT genotyping predicts myelosuppression
and is proven to be cost-effective (van den Akker et al; 2006).
Heterogeneity in Pharmacodynamics
Pharmacodynamics of a drug is regulated by the whole genome. We know

for example that drug response depends on the presence of sufficient numbers and
sensitivity of receptors. Receptors are proteins that are encoded for by genes. This
means that the gene expression level determines the amount of receptors and is
thus closely associated with drug response. Gene expression itself however, is de-
termined by several transcriptional, translational and post-translational regulatory
effects of other genes. In this way the whole genome is involved in drug response.
Small genetic variations, such as variability in receptors, can have a large
impact on the pharmacodynamics of a drug. It is no surprise that the list of
drugs that are subject to such an effect is increasing almost daily.
In some cases a SNP or a point mutation can modify drug response. Gene-
tic variability in receptors is either inherited or acquired. Resistence to imatinib
216 is for example associated with mutations in the kinase domain of BCR-ABL
that interfere with drug binding. Acquired mutation in a theronine residue of
the ABL kinase is the cause of resistance to imatinib in about 67% of the cases
(Gorre et al;2001). Increased expression of BCR-ABL from genomic amplifi-
cation could also be a mechanism for resistance.
One of the first well documented examples that in literature relates to the
efficacy of cholesterolsynthesis-inhibitors of the statin-type. Carriers of so ca-
lled B1-alleles on the receptor benefit more from statin-therapy than indivi-
duals that have just one allele (Kuivenhoven et al;1998).
Another example relates to the tachyphylaxis of beta-2-agonists, a well
known effect from drugs like salbutamol. The 2-receptor has three main poly-
morphisms and two of them (Arg16Gly and Gln27Glu) are found in the gene-
ral population. The two SNPs are in strong linkage disequillibrium and can be
considered together in haplotypes. It is demonstrated that homozygous carriers
of Gly16/Gly16 desensitise faster than Arg16/Arg16 carriers. Arg16Gly and
Gln27Glu are associated with a decreased effect of 2-agonists.
Patients with variant alleles of the promoter gene of ALOX5 (5-lipoxyge-
nase) have a diminished gene transcription, and therefore a decreased receptor
activity, which leads to a decreased response to treatment with leukotriene an-
tagonists (like montelukast) (Drazen et al;1999).
DETECTING GENETIC VARIATION
One of the most frequently used techniques in identifying genetic variability

is the Polymerase Chain Reaction (PCR). PCR is a simple method by which a
part of DNA or a transcript (RT-PCR) is amplified. Subsequent sequence analysis
on the PCR product will reveal the presence of mutations or polymorphism. PCR
is not only used to detect sequential variability but also variability in gene ex-
pression. By applying real-time PCR, we are able to measure gene expression
precisely. In this way single nucleotide polymorphism can be detected in genes
encoding drug metabolising enzymes, transporters and receptors.
Micro-arrays have been developed to detect many SNPs in a short time
period. The Amplichip CYP450 GeneChip® is an oligonucleotide microarray
hybridization method for genotyping CYP2D6 and CYP2C19. This test distin-
guishes 29 polymorphisms in the CYP2D6 gene including gene deletion (*5)
and gene duplication. In this way the phenotype of a patient (PM, IM, EM or 217
UM) can be predicted. For CYP2C19 the test discriminates between PM and
EM by determining 2 common polymorphisms in CYP2C19 (*2 and *3). The

main disadvantage of the test is its price (600 euro per patient). It is expected
that these costs will decrease due to a higher demand and mass production.
For detecting disease related genes 'whole genome screening' can be used.
Commercially available kits based on hybridisation technology (Illumina®, Affy-
metrix®) contain more than 550 000 tagSNP's evenly distributed across the geno-
me (1 tagSNP every 5.5 Kb). None of these arrays covers all variation in the hu-
man genome, but come close by using haplotype tagging SNP's.
A different technique to detect chromosomal aberrations is spectral karyoty-
ping (SKY). SKY is based on the hybridisation of certain molecules (probe) to
chromosomes, creating colour in exposure to light. As a result, each chromosome
has a specific and distinguished colour. Parts of chromosome can be translocated,
or swapped between one chromosome and another. Other chromosomes can be
deleted or duplicated either in whole or in part.
SKY is routinely used to identify birth defects and genetic abnormalities behind
certain cancers, like leukaemia. Based on chromosomal aberrations in leukaemia di-
fferent therapeutic approaches are undertaken. For example, patients with a transloca-
tion between chromosome 15 and 17 t(15;17), are successfully treated with all-trans
retinoic acid (ATRA). Targeted therapy in these patients leads to an enhanced event-
free survival (80-90% at 3 years). Without such targeted therapy the overall survival
is relatively poor, ranging from 6-20%. Recently, many clinical studies are going on
with Imatinib, a signal transduction inhibitor with effect against tyrosine kinase acti-
vity. Imatinib is developed especially for leukemic patients with a translocation be-
tween chromosome 9 and 22. The so-called t(9;22) or Philadelphia positive leukae-
mia generates high amounts of an abnormal tyrosine kinase protein and is associated
with a very poor prognosis. It seems however that Imatinib is changing the prospects
of Philadelphia positive leukemic patients. Ongoing trials indicate that after some
time resistance occurs frequently (see before). Research is aimed at new kinase
inhibitors or combination of compounds to overcome this resistance (Tallman; 2002).
INFLUENCE ON DRUG DISCOVERY
Pharmacogenomics can enhance drug discovery in two ways:

218 • Identification of new drug targets.
• Subpopulation-specific drug development.
Pharmaceutical companies are interested in carrying out smaller, less ex-

pensive trials using pharmacogenetics. Identification of a genetic variant asso-
ciated with drug response can lead to smaller phase III studies involving only
those individuals who are more likely to respond that lead to improved effi-
cacy, decreased toxicity and less side effects.
Many genetic variants vary in frequency among ethnic populations. If a
marker for drug response has a low prevalence in a certain population, that po-
pulation might be excluded from research or treatment.
An example is the drug BiDil, a combination of isosorbide dinitrate and
hydralazine. This drug was not sufficiently effective in treating heart failure in
two large ethnically mixed clinical trials. But in a subpopulation of African
Americans BiDil decreased the risk of death by 43%. The FDA approved this
drug for a single racial group (Service; 2005).
CONCLUSION
Pharmacogenetics constitutes a rapidly evolving research field. Thousands

of studies are published annually with great promise. However, incorporation
of these discoveries in medical practice has been slower than expected.
Promising prospects are complicated by several factors. Diagnostics have
to be changed in such a way that genotyping of relevant PK/PD systems is in-
cluded. Who will translate this kind of sophisticated information to a prescri-
bing physician? By now, proper dosing and avoiding drug interactions is alrea-
dy a formidable task. The number of disease-targets will become almost
incomprehensible for the average physician. That means that an incredible in-
formation dissemination barrier has to be solved. As a result, a new speciality
will develop: genetic information specialist. Not aimed at diagnosing inherited
diseases but at inherited risk factors and drug-treatment success-factors. And
last but not least: the costs of these developments -both for diagnosis and for
more individualised drug preparations- will be impressive. There will be no
way to deny patients the results of these new developments because they may
prove highly efficacious and possibly also cost-effective (although very costly
on an individual basis).
Hospital pharmacists and other healthcare professionals should be aware 219
of the upcoming developments and should prepare both for a proper informa-
tion structure and sufficient expertise to advise doctors in the rapidly approa-
ching era of genetically based medicine (pharmacogenetics). And of course of
the formidable resources needed to pay for this.
Pharmacogenetics is a new cornerstone in medicine!
ACKNOWLEDGEMENT
We wish to thank Dr. A. Vermes, hospital pharmacist, for critically reading

the manuscript.
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221
Notas
NOTAS
222
Notas
223
Notas
224
CURSO DE
BIOTECNOLOGÍA
APLICADA
7ª Edición
DIRECCIÓN DEL CURSO

DR. JUAN BUEREN Y DR. JOSÉ LUIS MOTELLÓN
7º Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA

Fundación
Centro Nacional de
Investigaciones
Cardiovasculares
Carlos III
Este curso es posible gracias a una aportación educacional de
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7º Curso de BIOTECNOLOGÍA APLICADA

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Reservados todo los derechos. Ninguna parte de esta

Sanidad y Ediciones, S.L.

Técnicas de análisis masivo de la expresión de genes ......................... 5

Inmunoterapia humoral .......................................................... 31

Introducción a la inmunoterapia celular .......................................... 41

Células embrionarias pluripotentes ............................................. 57

Trasplante celular y terapia regenerativa con células madre .................. 65

Avances en terapia regenerativa ................................................. 89

Nanobiotecnología: herramientas diagnósticas y terapéuticas ................ 103

Vectores de transferencia en terapia génica .................................... 119 1

Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer ...................... 137

Farmacocinética de los medicamentos obtenidos por Biotecnología . . . . . . . . . 157

Aplicaciones de la Biotecnología Recombinante Vegetal a la terapéutica

Innovación tecnológica y nuevas terapias: obtención de anticuerpos

Evaluación de medicamentos biotecnológicos en la Agencia Europea

Impact of pharmacogenetics on drug use in individually optimised

José Luis Motellón

TÉCNICAS DE ANÁLISIS MASIVO

Los conocimientos sobre el genoma humano hacen posible

SISTEMAS DE ANÁLISIS MOLECULAR MASIVO

Matrices tisulares (tissue arrays)

Permiten utilizar en bloques parafinados sistemas de análisis masivo. Para

complementario a microarrays de cDNA. Indicaciones típicas de esta técnica

Variaciones naturales de la secuencia entre dos copias del genoma debi-

Hay diferentes opciones para arrays de CGH, esencialmente BACs u

ello se realiza hibridación comparativa entre DNA de un paciente/DNA suje-

Matrices de cDNA (Oncochip) u oligonucleótidos

Un microarray de DNA es un sistema miniaturizado en el que fragmentos

nes biológicas, lo que convierte a esta técnica en una herramienta de alto

ANÁLISIS DE RESULTADOS DE MICROARRAYS

Los datos generados en estos experimentos precisan de análisis bioinfor-

LIMITACIONES DE LOS MICROARRAYS DE DNA

Como otras técnicas usadas en investigación, los microarrays tienen limi-

diente de fenómenos azarosos, u oscilaciones cíclicas, no relacionadas con el

Aunque sobre un número menor de genes, existen actualmente plataformas

DETECCIÓN DE PROTEÍNAS COMO MARCADORES SÉRICOS

Múltiples grupos de investigación coinciden en el objetivo de identificar

DETECCIÓN DE FOSFOPROTEÍNAS EN CÉLULAS INDIVIDUALES

Recientes datos experimentales coinciden en que tanto el mecanismo de

Las matrices de cDNA permiten también establecer el llamado perfil genó-

fármaco. Estos genes muestran variabilidad en función de la droga, estirpe ce-

FUTURO EN LA APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE GENÓMICA

El alto potencial aplicado a investigación y diagnóstico de estas técni-

La medicina molecular se está desplazando muy rápidamente

Una de las consecuencias más beneficiosas derivadas del conocimiento del

de la Proteómica. La descripción del genoma de los organismos (Genómica)

proteína de manera permanente o transitoria. Tales modificaciones afectan a su

avances en las estrategias diagnosticas convencionales (técnicas de imagen,

a) El amplísimo rango dinámico de la concentración de proteínas en teji-

mRNA editing, modificaciones co- y post traduccionales). anticuerpos específicos

tas de señalización, metabólicas, etc. El conocimiento de las interaccio-

A pesar de la complejidad antes citada, el rápido y notable desarrollo de

clínica. Para que la proteómica clínica impacte de manera real en la mejora de

OBJETIVOS DE LA PROTEÓMICA CLÍNICA

La finalidad de la Proteómica Clínica está, actualmente, centrada en al

La búsqueda e identificación de biomarcadores individuales se lleva a

cando diversos métodos de proteómica

Obtención de perfiles proteicos

Consiste en el estudio sistemático, a gran escala, de las proteínas de una