Captulo 1

Vera Lcia da Silva Valente Gaiesky

Ferramentas Metodolgicas

1. Tecnologias de DNA recombinante 2

1.1 Hibridizao in situ 2 1.2 Reao em cadeia da polimerase 4 1.3 Vetores de clonagem e de expresso 4 1.4 Organismos transgnicos 5 1.5 Outros mtodos 9

Embriologia 2

O avano cientfico observado nas ltimas dcadas propiciou que fossem desenvolvidas novas ferramentas (tcnicas e mtodos) para o estudo da biologia do desenvolvimento, o que permitiu explorar processos e molculas envolvidos na complexa rede de interaes responsvel pela regulao gnica do desenvolvimento de embries. Antes de as tcnicas de biologia molecular serem aperfeioadas, o embriologista podia apenas observar e descrever o embrio em seus diferentes momentos. Hoje, as novas tecnologias permitem ao profissional estabelecer similaridades entre os estgios de vida de organismos at ento considerados muito distantes, tendo como base o compartilhamento e a expresso de seus genes. O conhecimento relativo hierarquia gnica e ao circuito de genes que ligam e desligam a atividade de centenas de outros genes de forma extremamente precisa, bem como a caracterizao de seus produtos, a comparao de suas sequncias de bases e a sua regulao so exemplos de como a biologia moderna aproximou definitivamente embriologistas, geneticistas, bioqumicos, paleontlogos e evolucionistas para o estudo da Evo-Devo (do ingls Evolutionary development) que significa desenvolvimento do ponto de vista evolutivo.

bridizao de cidos nucleicos. Essas sequncias, aqui consideradas sondas (probes), puderam ento ser encontradas em quaisquer genomas, bem como foi possvel decifrar a organizao dos genes que as portam (como, p. ex., se eles possuem, ou no, os stios reconhecidos pelas enzimas de restrio em comparao com o genoma dos organismos originais dos quais o DNA foi extrado). O estudo dessas homologias, por hibridizao, pode ser realizado tanto anelando-se a sonda desnaturada (com a dupla hlice aberta) com o DNA-alvo extrado, fragmentado pelas endonucleases de restrio e submetido eletroforese, como com clulas em suspenso, com cortes de tecidos em lminas ou com embries inteiros (whole mount). A visualizao da regio homologada com a sonda em cromossomos, em tecidos e em rgos intactos dos embries mais difcil do que com a amostra de DNA purificado. Isso ocorre porque, nesses casos, h inmeros obstculos hibridizao, representados pelas molculas envolvidas na organizao da cromatina dos tecidos e rgos para o encontro da sonda com a sequncia homloga a ela. Assim, a hibridizao da sonda com o DNA-alvo extrado mais facilmente estudada por meio da tcnica conhecida como Southern blot. Esse mtodo consiste em submeter uma amostra de DNA isolado de um doador, fragmentado com as enzimas de restrio apropriadas para a obteno de fragmentos de diferentes tamanhos, separao por eletroforese em gel de agarose e colorao com brometo de etdio (um composto que se intercala na dupla hlice, emite fluorescncia e visualizado sob luz ultravioleta). O gel fotografado e imerso em uma soluo de hidrxido de sdio, que promover a desnaturao dos fragmentos de DNA, os quais sero transferidos por capilaridade para um pedao de membrana de nilon ou de nitrocelulose. A sonda a ser utilizada ser marcada radiativamente, ou no, e hibridizada com o DNA desnaturado transferido para a membrana. Aps serem fornecidas as condies e o tempo para que a sonda encontre a sequncia de bases complementar a ela no DNA hospedeiro, essa membrana lavada, a fim de eliminar o excesso da sonda que no se ligou ao DNA. O rigor com que essa membrana lavada, para eliminar mais ou menos sequncias com diferentes graus de homologia do DNA-teste com a sonda, chamado estringncia. Se a sonda for marcada radiativamente ou com compostos que emitem luz, o padro de hibridizao na membrana ser revelado por autorradiografia (Figura 1.1). Uma variao dessa tcnica, denominada Northern blot, utiliza como sonda uma sequncia de RNA e propicia o rastreamento da existncia de um transcrito processado, sendo expresso em uma amostra de DNA genmico.

1. Tecnologias de DNA recombinante

O estabelecimento de tecnologias de DNA recombinante, ocorrido a partir de 1980, proporcionou acesso direto s informaes gnicas, constituindo-se em um avano sem precedentes na rea, uma vez que teve aplicao imediata para o estudo de problemas da biologia do desenvolvimento. Entre as principais ferramentas desenvolvidas para o estudo desses problemas, destacam-se a obteno, a caracterizao e a comercializao de enzimas de restrio (ou endonucleases de restrio), que tm a capacidade de cortar molculas de DNA em pedaos correspondentes a certas sequncias de bases especficas. Cerca de duas centenas de enzimas de restrio j so conhecidas e comercializadas, de modo que junto com o conhecimento adquirido por meio do estudo da estrutura, da funo e da especificidade das DNA-polimerases e das DNA-ligases foi possvel a manipulao das sequncias codificadoras e regulatrias dos genes de interesse para o desenvolvimento embrionrio. O avano terico e o aperfeioamento tcnico e instrumental que facilitaram o estudo da complementaridade entre as bases dos cidos nucleicos (DNA e RNA), por sua vez, propiciaram a utilizao em larga escala do pareamento de pedaos de genes (ou genes completos) de um organismo a fim de sondar a sua homologia com partes do genoma inteiro do mesmo ou de diferentes organismos, mais ou menos relacionados, em ensaios de hi-

1.1 Hibridizao in situ

O desenvolvimento das tcnicas de hibridizao de cidos nucleicos isolados teve como consequncia o aperfeioa-

3 Ferramentas Metodolgicas

Fragmentos de DNA clivados com enzimas de restrio

nodo

Gel Separao dos fragmentos por tamanho por meio de eletroforese em gel de agarose

Maior Menor

Ctodo

Tratamento do gel para desnaturar o DNA e transferncia para uma membrana de nilon ou de nitrocelulose

Sonda marcada

Membrana de nilon

Os fragmentos desnaturados so reanelados com uma fita de DNA marcado, e a membrana exposta a um filme de raios X

Cada banda revelada no filme corresponde a um fragmento de DNA que possui uma sequncia complementar da sonda Filme de raios X

Figura 1.1
Esquema dos passos seguidos para anlise de molculas de DNA de duas amostras pela tcnica de Southern blot.
Fonte: Modificada de Berg e Singer.1

mento das tcnicas de hibridizao in situ, que so as ferramentas mais teis para se rastrear os locais (clulas e campos presuntivos) de expresso gnica nos embries. Por meio da hibridizao in situ, possvel entender como a atividade gnica est guiando o desenvolvimento embrionrio, uma vez que permite observar os padres de atividade de genes de interesse no tempo (ao longo do desenvolvimento embrionrio) e no espao (clulas, tecidos e regies mais amplas do embrio). A hibridizao in situ pode detectar o local onde molculas de RNAm esto sendo transcritas de genes em ati-

vidade. Por meio dessa tcnica, uma sonda complementar ao RNA (DNAc) que est sendo transcrito, hibridizar (isto , se parear fortemente) com ele. Assim, a sonda servir para indicar o local de ao do RNAm complementar na fatia do tecido ou no embrio completo. No caso de a sonda ser marcada radiativamente, sua deteco ser feita por autorradiografia. Quando se utilizam mtodos no radiativos (p. ex., corantes), o local de expresso dos genes de interesse detectado como uma rea, clula ou tecido de colorao diferente da colorao de fundo, ao passo que sondas marcadas enzimaticamen-

Embriologia 4

te ou por meio de anticorpos compostos so reveladas atravs de uma mistura com o seu substrato, isto , histoquimicamente (Figura 1.2).

GenBank, e sintetizados ou nos prprios laboratrios de biologia molecular, ou sob encomenda, por empresas especializadas em biotecnologia (Figura 1.3). Variaes desse mtodo, como o PCR em tempo real (real time PCR), permitiram avaliar diferenas quantitativas na expresso de certos genes em amostras coletadas em diferentes momentos do desenvolvimento, ou em diferentes tecidos e rgos nos mesmos estgios.

1.2 Reao em cadeia da polimerase

Aps uma sequncia de DNA ser isolada, clonada e sequenciada, o processo inverso ao utilizado pelos mtodos de hibridizao tambm pode ser aplicado. Assim, segmentos selecionados de DNA do genoma de um organismo-teste podem ser seletivamente amplificados pelo mtodo conhecido como reao em cadeia da polimerase (PCR, de polimerase chain reaction). O PCR foi desenvolvido no incio dos anos 1990 e se tornou possvel por meio da descoberta do potencial de uso da DNA polimerase da bactria Thermus aquaticus uma enzima Taq-DNA-polimerase termoestvel capaz de promover ciclos de replicao de DNA sob condies desnaturantes, ou seja, sob altas temperaturas. A tcnica de PCR propicia a obteno in vitro, em um curto perodo de tempo (horas), de milhares de cpias de uma sequncia de bases presente em um DNA genmico. Resumidamente, a tcnica requer uma amostra de DNA genmico, primers (sequncias iniciadoras da replicao), das regies conservadas do gene que se quer identificar e amplificar no genoma de interesse, para funcionarem como molde. Um aparelho denominado termociclador programvel para induo de ciclos de replicao alternados de tempo e de temperatura aos quais ser submetida a amostra, bem como da enzima Taq-DNA-polimerase vai promover a amplificao daquela frao do DNA que possui homologia com o molde. Esses primers, iniciadores ou moldes, so desenhados a partir de sequncias conservadas de genes j descritos e disponveis em bancos de dados pblicos, como o

1.3 Vetores de clonagem e de expresso

Para que se obtenham vrias cpias de uma sequncia isolada, s vezes necessrio realizar uma clonagem molecular. Esse processo envolve a ligao enzimtica de pedaos do DNA isolado do organismo de interesse com o DNA dos vetores de clonagem (plasmdeos, vrus e bacterifagos) dotados de sequncias capazes de promover a sua replicao autnoma dentro das clulas hospedeiras nas quais so introduzidos (em geral, cepas modificadas da bactria Escherichia coli por meio de um processo chamado transformao). Os plasmdeos, alm de se replicarem autonomamente no genoma das bactrias, esto associados resistncia a antibiticos. Dessa forma, o isolamento das bactrias transformadas das que no so transformadas, em placas de cultura, feito com o uso de antibiticos. As bactrias que no contm o plasmdeo (no transformadas) so sensveis ao antibitico e sero eliminadas, restando e crescendo em cultura apenas aquelas bactrias resistentes, que foram transformadas. Quando, alm de se clonar o gene, tambm se quer analisar o seu produto, necessrio utilizar os vetores de expresso (pr e eucariotos, dependendo da natureza e da complexidade da sequncia que foi clonada). Por

Figura 1.2
Embries de Tribolium em trs estgios de desenvolvimento. As clulas esto expressando o gene engrailed (hachurado) como uma faixa em cada segmento do corpo medida que eles vo se formando. A No estgio inicial, s partes da cabea so visveis, como os segmentos gnatais (G1). B No estgio intermedirio, j se formaram os segmentos gnatais, (G1), torcicos (T1) e abdominais (A1). C No estgio tardio, todos os segmentos j esto formados. br, ant, int correspondem, respectivamente, a crebro, antenas e segmentos intercalares.
Fonte: Modificada de Sulston e Anderson.2

br G1 G1 T1 ant int

T1

A1

G1

A1

5 Ferramentas Metodolgicas

Segmento a ser amplificado 5 3 3 5 3 5 5 3

DNA desenrolado 5 iniciadores 5 3 DNA-polimerase 5 3 DNA desenrolado iniciadores DNA-polimerase 3 5 Ciclo 2 5 3 5 Ciclo 1

5 3 3 5

5 3 3
5

5 3 3 DNA desenrolado iniciadores DNA-polimerase 5 3 5 5 3 Ciclo 3

3 5 5 3

3 5 5 3 5 3 3 5

5 3 3 5 3 5 5 3 DNA desenrolado iniciadores DNA-polimerase 5

5 3 3

3 5 5 3 5 3 3 5 Ciclo 4

3 5 5 3

Figura 1.3
Amplificao de segmentos de DNA por meio de PCR.
Fonte: Modificada de Berg e Singer.1

exemplo, para expresso em procariotos, normalmente as bactrias E. coli e Bacillus subtilis so vetores adequados; j para expresso em eucariotos, leveduras como a Saccharomyces cerevisae so utilizadas. A existncia de certas caractersticas moleculares do plasmdeo, como, por exemplo, possuir uma sequncia promotora forte, fundamental para o sucesso da expresso do gene nele inserido (Figura 1.4).

1.4 Organismos transgnicos

A produo de organismos transgnicos permitiu um grande avano no conhecimento dos genes envolvidos no desenvolvimento embrionrio, bem como a sua essencialidade e a sua conservao evolutiva. Animais e plantas geneticamente modificados pela incluso de um gene clonado de outro indivduo (seja da mesma espcie ou no) constituem os chamados

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Origem da replicao

Gene para resistncia a um antibitico Inserto do gene estranho

ser reconhecido e regulado pelas clulas hospedeiras. Se a transformao (insero bem-sucedida do gene estranho no DNA das clulas hospedeiras) ocorrer nas clulas que vo originar a linhagem germinativa do embrio, o transgene passar para as geraes seguintes. Cruzando-se o organismo transgnico com outro organismo de uma linhagem que no porta o transgene, pode-se monitorar o seu efeito no desenvolvimento das geraes subsequentes. Em camundongos, genes que condicionam mutaes no desenvolvimento so comumente introduzidos em um embrio selvagem na fase de blastocisto para que faam parte de clulas-tronco embrionrias. Essas clulas so obtidas por meio de culturas permanentes derivadas de embries mutantes (muitos deles, letais embrionrios) e, quando introduzidas em um embrio selvagem inicial, vo contribuir para formar tanto os seus tecidos somticos, como a sua linhagem germinativa. As clulas-tronco embrionrias em cultura, por sua vez, podem ser geneticamente manipuladas, de forma a se induzir mutaes nos genes de desenvolvimento sob escrutnio, introduzir doses a mais ou a menos desses genes, bem como produzir mutaes que faam com que a sequncia original do gene perca completamente a sua funo. Assim, a expresso de um ou mais transgene no embrio transformado (uma quimera) depender de quantas clulas transformadas sero inseridas corretamente no embrio hospedeiro, promovendo variaes de natureza quantitativa na atividade desse gene (Figura 1.5). Outra maneira de originar camundongos transgnicos consiste em injetar um fragmento de DNA contendo o gene cuja funo se deseja conhecer diretamente no ncleo do ovo recm-fertilizado. A vantagem de se trabalhar com clulas-tronco embrionrias, alm da sua maior viabilidade, a possibilidade de se selecionar, na cultura, aquelas clulas que foram previamente transformadas, aumentar seu nmero e ento introduzi-las no estgio de blastocisto do embrio selvagem. Moscas transgnicas do gnero Drosophila tambm tm contribudo de forma marcante para o progresso da biologia do desenvolvimento, pois so originadas por meio da insero de uma sequncia de DNA conhecida diretamente nos cromossomos do embrio hospedeiro, utilizando-se de um vetor (no caso, uma sequncia gentica mvel) ou transpson. Essas sequncias, aparentadas com os vrus, ocorrem naturalmente no genoma de certas linhagens e tm a capacidade de mudar de lugar ao longo dos cromossomos. Se introduzidas no genoma de linhagens que no as portam, elas sero inseridas ao acaso no genoma hospedeiro. Porm, se forem geneticamente engenheiradas para conter, alm do seu prprio gene de mobilizao (que codifica uma enzima chamada transposase), os genes de interesse que se quer estudar, por meio de um processo conhecido como transformao mediada por elemento P, o embrio produzir uma mosca transgnica (Figura 1.6). Se o elemento P geneticamente modificado for inserido na parte posterior do embrio para onde, muito cedo, migraro as clulas polares que origi-

Gene estranho Captura pela clula hospedeira

Diviso celular

B Promotor da -galactosidase DNAc do gene que se quer expressar RNAm Gene para resistncia ampicilina Origem do plasmdeo

Figura 1.4
Vetores de clonagem e de expresso. A Plasmdeos bacterianos usados como vetores para multiplicao de insertos de DNA estranho. B Caractersticas de um vetor de expresso: a seta grande indica o gene estranho que se quer expressar.
Fonte: Modificada de Berg e Singer.1

organismos transgnicos. A transgenia, por sua vez, de grande utilidade para se testar in vivo a funo de quaisquer sequncias gnicas e a sua conservao funcional entre organismos diferentes, assim como resolver problemas relacionados regulao da expresso de certos genes de interesse para o desenvolvimento. Ela serve tambm para identificar suas sequncias regulatrias e codificadoras, alm de sondar os domnios de expresso de vrios genes. Para o sucesso da transgenia, o gene clonado inserido em um embrio hospedeiro deve se integrar e se replicar nas sucessivas divises celulares, bem como deve passar a

7 Ferramentas Metodolgicas

Ovo fertilizado

DNA do gene de interesse

Pr-ncleo

DNA microinjetado no pr-ncleo

DNA integra-se no genoma e os pr-ncleos so fusionados

Ovos injetados no oviduto da me substituta Ovo injetado

Camundongos transgnicos DNA isolado da cauda da prole digerido com enzimas de restrio, submetido eletroforese e analisado por Southern blot

DNA injetado identificado com uma sonda especfica

transplantes sem sucesso

transplantes bem-sucedidos

Figura 1.5
Produo de camundongos transgnicos.
Fonte: Modificada de Berg e Singer.1

naro as gnadas , as clulas germinativas contero o gene que se deseja estudar, o qual ser passado s geraes subsequentes, permitindo avaliar sua segregao. Frequentemente, as sequncias inseridas portam um gene marcador de uma caracterstica morfolgica + visvel, como, por exemplo, o alelo selvagem white , que condiciona olhos vermelhos. A insero do transgene em um embrio mutante para esse gene (white ), que condiciona olhos brancos em homozigotos, por sua vez, pode ser monitorada pelo surgimento da cor vermelha (que indica que o inserto foi incorporado com

sucesso) ou branca (que indicar a no incorporao do inserto) nos olhos das moscas adultas da gerao seguinte. Por meio dessa metodologia, pode ser avaliado o efeito de doses extras de genes e a sua expresso sob influncia de sequncias regulatrias selvagens ou mutantes, bem como o efeito de novos genes (ou genes cognatos ao que se quer avaliar). Uma variante consiste em utilizar um gene marcador bioqumico acoplado ao elemento P engenheirado que vai gerar a transformao do embrio hospedeiro. Esse marcador, tambm chamado gene reprter, ter sua ex-

Embriologia 8

Figura 1.6
Produo de moscas transgnicas pela modificao da linhagem germinativa de embries pela insero de um elemento P, portando um gene que se quer estudar. O gene carregado pelo elemento P funcional, e o do genoma hospedeiro uma forma mutante, no funcional. O aparecimento da forma selvagem do gene na prole das moscas transformadas indica que o processo foi bem sucedido.
Fonte: Modificada de Wolpert e colaboradores.3

Gene clonado com o elemento P

Elemento P Microinjeo no embrio da mosca

Cromossomos da mosca

Transferncia do elemento P portando o gene clonado

Cromossomo

Embrio da mosca portando o gene em seu genoma

presso revelada por colorao histoqumica, indicando que o inserto ao qual ele est acoplado foi inserido com sucesso no genoma hospedeiro, sinalizando, pela colorao revelada, a regio, o tecido ou as clulas embrionrias em que o gene de interesse est se expressando (Figura 1.7). Os genes reprteres tm sido amplamente utilizados em embries de camundongos e de outros animais, sendo o lacZ (que codifica a enzima bacteriana -galactosidase) um dos mais frequentemente empregados na criao de animais transgnicos. A revelao da atividade enzimtica desse gene marcador colore de azul as clulas, os tecidos e os rgos do embrio que expressam o transgene. Tem sido comumente utilizada em Drosophila a sequncia promotora de genes de resposta a estresses fsicos e qumicos (heat shock), chamados promotores fortes, uma vez que induzem a expresso dos genes a eles adjacentes sem a ajuda de sequncias enhancers (ou aumentadoras), comuns em genes de eucariotos. O uso de transgenes acoplados a um promotor de heat shock (descobertos em genes que condicionam proteo contra os efeitos de modificaes bruscas da temperatura do ambiente) permite que se induza a expresso dos genes a ele adjacentes simplesmente aumentando a temperatura da cmara de cultivo do organismo.

O sucesso dos sistemas de transferncia de genes em mamferos e em leveduras contribuiu para o desenvolvimento de tecnologias para produo de plantas transgnicas, cuja aplicabilidade ao rendimento das plantas de lavoura foi imediato. As plantas transgnicas, pela sua maior plasticidade de desenvolvimento, oferecem muitas facilidades para a obteno de embries transgnicos. Vrios mtodos so atualmente disponveis para a transformao de plantas. A maneira mais natural possvel de se obter plantas transgnicas consiste na transfeco de clulas vegetais em cultura com a bactria Agrobacterium tumefasciens, que capaz de formar tumores em forma de galhas bem conhecidas nas plantas. Esse processo, que tambm ocorre na natureza, foi utilizado pelos melhoristas para a produo controlada de plantas transgnicas, uma vez que essa bactria contm um plasmdeo Ti, que possui os genes necessrios para a proliferao das clulas responsveis pela formao do calo (callus). Se genes de interesse agronmico, como, por exemplo, um gene importante para o desenvolvimento precoce da florao de uma planta, for inserido no Ti e a bactria que o contm for induzida a infectar uma cultura de clulas vegetais, ele funcionar como um vetor de transformao muito eficiente. Uma vez que clulas diferenciadas

9 Ferramentas Metodolgicas

Figura 1.7
Embrio de camundongo transgnico de 12 dias. A parte hachurada corresponde expresso do gene myoD, por meio do gene reprter bacteriano -galactosidase sob controle da sequncia enhancer nos mioblastos.
Fonte: Modificada de Goldhamer e colaboradores.4

em culturas de tecidos vegetais podem dar origem a uma planta adulta completa, devido conservao da sua totipotncia, as clulas geneticamente modificadas podem originar plantas transgnicas, com suas clulas transformadas pela infeco com o Agrobacterium, inclusive na sua linhagem germinativa, permitindo a obteno de cultivares transgnicos estveis. Outra abordagem possvel, entre vrias outras disponveis para produzir plantas e tambm animais transgnicos, o recurso da biobalstica, que consiste no bombardeamento de clulas em cultura com partculas recobertas com sequncias do DNA que se quer inserir e estudar no organismo receptor. Essas partculas, que consistem em pequenas esferas de tungstnio ou ouro, so carregadas com DNA vetor (a construo) e espalhadas na superfcie de uma placa mvel ou de uma bala plstica (macroprojtil). Submetido ao impacto de uma bomba de vcuo, o macroprojtil disparado contra uma placa de reteno, permitindo que seja desacelerado, e que os microprojteis (as esferas com o DNA vetor) sejam arremessados contra a superfcie das clulas a serem transformadas, penetrando no seu interior. O sucesso da transformao de plantas e de animais deve ser monitorado por meio do uso de marcadores genticos, detectados pela sua expresso diferencial em clulas transformadas ou no, ou por meio de genes reprteres. Sequncias de lcus enzimticos (como o da lacZ bacteriana e outros) cuja deteco pode ser colorimtrica ou histoqumica podem ser utilizadas para construir e detectar transgenes. bastante frequente tambm o uso de um lcus enzimtico bacteriano, capaz de promover a expresso de luciferase, detectvel com ensaios de bioluminescncia. As plantas e os animais transformados,

nos quais os transgenes so acoplados ao lcus da luciferase bacteriana, simplesmente brilham no escuro, da mesma forma que o fazem as bactrias de cujo genoma esse gene proveniente, revelando o sucesso da transformao. A protena conhecida como GFP (green fluorescent protein) codificada por um gene isolado do cnidrio Aequorea victoria, tambm bastante usada como gene reprter, quando fusionada com os genes de interesse, para revelar onde eles esto se expressando, uma vez que emite uma luminosidade verde, facilmente detectvel.

1.5 Outros mtodos

A cada dia, novos mtodos analticos so desenvolvidos, kits de reagentes so industrializados e programas de bioinformtica so comercializados, tornando cada vez mais promissor o estudo da biologia do desenvolvimento e da diferenciao. Alm dos mtodos j tradicionalmente utilizados, nos ltimos anos foram aperfeioadas novas metodologias com base no sequenciamento dos genomas e na bioinformtica (chips de DNA e microarranjos de DNA), o que tem propiciado o acesso ao elenco de genes especificamente expressos em cada momento do desenvolvimento, mesmo que ainda desconhecidos. Por exemplo, por meio de microarranjos (microarrays) de DNA, os RNAms so isolados por fragmentos 3 poly-A copiados em DNA complementar. Os DNAcs, que correspondem aos pedaos processados dos genes individuais, podem ser clonados em plasmdeos e replicados vrias vezes, propiciando a construo de bancos de sequncias. Por meio de sequenciamento automatizado, possvel esco-

Embriologia 10

Molculas de DNA do gene de interesse

Amplificao por PCR Impresso sobre lmina de microscopia

lher os clones de DNAc dos plasmdeos do banco que contm os menores fragmentos de um gene (ESTs, ou expressed sequence tags), que sero amplificados por PCR, e decifrar a sua funo no tecido ou no estgio do desenvolvimento de interesse. Por meio dessa estratgia, stios contendo DNAc, ESTs ou oligonucleotdeos presentes em uma amostra podem ser monitorados por hibridizao com a sequncia complementar previamente imobilizada em uma placa. A anlise feita base por base, e a sua identificao possvel porque o DNA da amostra foi previamente marcado com substncias fluorescentes. Mtodos como os microarranjos possibilitaram fazer a triagem dos genes que esto sendo expressos em um determinado tecido ou grupo de clulas de um embrio, em um dado momento. Esse mtodo consiste na ligao de fragmentos de DNA do genoma que se quer estudar a uma superfcie, como uma lmina de microscopia ou uma membrana de nilon com carga positiva (Figura 1.8). Esses microarranjos so capazes de detectar e de quantificar RNAms ou DNAcs das amostras a serem testadas (p. ex., um tecido embrionrio) quando colocadas para hibridizar com as sequncias de DNA dispostas na lmina. As amostras so marcadas, isto , conjugadas a compostos qumicos fluorescentes (fluorocromos). Quando um gene est sendo transcrito, ele lido por um scanner como uma cor, dependendo da combinao de fluorocromos que for utilizada. O conjunto de genes expressos tambm tem sido chamado transcriptoma, e seu conhecimento crucial para decifrar as extensas redes regulatrias do desenvolvimento, desencadeadas por fatores de transcrio que dirigem a morfognese. Outro avano para o estudo do desenvolvimento foi o emprego de morfolinos (morpholinos). So molculas pequenas (oligmeros) de cidos nucleicos usadas como ferramenta para se fazer gentica reversa, isto , fazendo um nocaute ou (knock out) do gene original cuja funo se quer determinar. Essas molculas antissenso so sintetizadas para se ligarem ao gene que deveria se expressar em um determinado momento e em um determinado tecido, revelando sua essencialidade. Essa interferncia com a expresso do gene ocorre tanto pelo impedimento da sntese proteica como pela modificao dos padres de processamento do pr-RNAm.

mRNA1 fluorocromo vermelho ()

mRNA2 fluorocromo verde ()

Hibridao

Lavagem

Deteco de sinais vermelhos (), verdes () e combinao de ambos por scanner

Figura 1.8
O mtodo de microarranjos para anlise de transcriptomas.
Fonte: Modificada de Wolpert e colaboradores.
3

Veja a figura em cores na orelha do livro.

11 Ferramentas Metodolgicas

Morfolinos podem ser usados at para sondar o efeito de cada xon para a funcionalidade da protena-alvo e para eletroporar embries de eucariotos, como de Xenopus e de galinhas, por meio de um mtodo similar ao que utilizado em biobalstica. importente mencionar a extrema rapidez com que novos mtodos esto sendo estabelecidos e que permi-

tem, junto com o desenvolvimento da bioinformtica, o surgimento da genmica comparada. Atualmente, mais de uma centena de organismos j tiveram seus genomas sequenciados, e as comparaes entre a organizao de seus genes e de seus padres de expresso no processo de desenvolvimento embrionrio encontram-se em um momento crucial na histria da biologia.

Resumo
O refinamento de mtodos bioqumicos analticos, oriundos da biologia molecular, a comercializao de insumos, o avano da bioinformtica e o sequenciamento dos genomas propiciaram enormes avanos no estudo dos processos de desenvolvimento embrionrio dos eucariotos, levando a uma nova rea de estudo, a Evo-Devo que significa evoluo dos processos de desenvolvimento. Essa uma das reas da biologia que mais tem crescido, e novas ferramentas metodolgicas para o estudo dos embries e das complexas redes regulatrias dos genes envolvidos na sua morfognese so veiculadas a cada semana.

Questo dissertativa
1. Faa uma relao dos principais mtodos analticos atualmente disponveis para o estudo da biologia do desenvolvimento embrionrio.

Referncias
1. Berg P, Singer M. Dealing with genes: the language of heredity. Mill Valley: Blackwell Scientific; 1992. 2. Sulston IA, Anderson KV. Embryonic patterns mutants in Tribolium castaneum. Development. 1996;122(3):805-14. 3. Wolpert L, Jessel T, Lawrence P, Meyersowitz E, Robertson E, Smith J. Princpios de biologia do desenvolvimento. 3. ed. Porto Alegre: Artmed; 2008. 4. Goldhamer DJ, Brunk BP, Faerman A, King A, Shani M, Emerson CP Jr. Embryonic activation of the myoD gene is regulated by a highly conserved distal control element. Development. 1995;121(3):637-49.

Leituras sugeridas
Carroll SB. Evo-devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 2008;134(11):25-36. Griffin HG, Griffin AM. DNA sequencing. Methods Mol Biol. 1993;23:1-8.