Dinamica evolutiva de virus RNA

Samuel Ojosnegros Martos

14 de Noviembre, 2008
TESIS DOCTORAL
Universidad Aut onoma de Madrid
Facultad de Ciencias
Departamento de Biologa Molecular
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Memoria presentada por el licenciado en biologa Samuel Ojosnegros Martos para optar al grado
de Doctor por la Universidad Aut onoma de Madrid. Madrid, Noviembre, 2008.
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El trabajo presentado en esta Tesis Doctoral ha sido realizado en el Centro de Biologa Molecular
Severo Ochoa, bajo la direccion del Dr. Esteban Domingo Solans y nanciado por una beca
predoctoral de Formacion de Personal Universitario (FPU) del Ministerio de Educacion y Ciencia.
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A Sergio
A mis padres
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Agradecimientos
Quiero agradecer al Dr. Esteban Domingo que me aceptara en su laboratorio, desde la visita que realice en
2002. Gracias por concederme tu tiempo y tus conesjos en tantos y tantos problemas que han ido surgiendo.
Seguiremos defendiendo las cuasiespecies!
Gracias a la Dra. Crsitina Escarms por por estar dispuesta a ayudarme en cualquier momento, gracias
por entenderlo todo y por las innitas lecciones de biologa molecular. La mitad de esta tesis es tuya.
Susanna Manrubia me ha transmitido su visi on teorica de los procesos biol ogicos. Gracias por ese re-
galo y por todo el tiempo que pacientemente me has dedicado. Tambien tengo que agradecerle la estrecha
colaboracion y dise no de experimentos en el proyecto con los virus defectivos.
El estudio de la poblaci on del virus de la ebre aftosa C-S8cp260 supone la continaci on del trabajo
realizado por el Dr. Juan F. Garca-Arriaza, quien me ense no las peculiaridades de esta poblaci on viral, y
las tecnicas basicas de la virologa y la biologa molecular.
La realizaci om de esta tesis doctoral no hubiera sido posible sin la colaboracion cinetca de una serie
de personas que han accedido a implicarse en los proyectos en los que he trabajado:
El Dr. Carlos Briones del Centro de Astrobiologa (Madrid) ha presatdo sus conocimientos y consejos
para la realizaci on de toda la logenia presente en esta Tesis doctoral.
El Dr. Juan Cristina del Centro de Investigaciones Nucleares (Montevideo, Uruguay), estandariz o la
manera de utilizar el software PAQ y me ense no una larga serie de software bioinformatico para el
analisis de secuencias de acidos nucleicos. El Dr. Cristina ha colaborado en la relizaci on de la logenia
del captulo 5.4 de esta Tesis doctoral.
El Dr. Martin Nowak de la Universidad de Harvard (Cambridge, USA), amablemente me acogi o en el
insituto que dirige, el Program for Evolutionary Dynamics (PED), se ofrecio a sufragar parte de los
gastos de mi estancia y supervis o el modelo matematico que desarrolle en el PED (encontarndo alg un
fallo).
El Dr. Niko Beerenwinkel, del PED, en la Universidad de Harvard (Cambridge, USA) y ETH-Basel,
colabor o en el desarrollo de un modelo matematico que describe la replicacion de virus en cultivos
celulares.
El Dr. Tibor Antal, del PED, en la Universidad de Harvard (Cambridge, USA) reliz o el estudio analtico
del modelo matematico anteriormente citado.
El estudio de la poblaci on C-S8p260 del virus de la ebre aftosa, como candidato a vacuna inactivada,
no hubiera sido posible sin la colaboracion de la Dra. Noem Sevilla en el Centro de Investigacion en
Sanidad Animal y el modelo animal de los ratones C57/BL6, establecido por ella.
El Dr. Albert Cardona, en UCLA (University of California Los Angeles) y en el Institut of Neuro-
informatics of ETH (INI), Z urich, generosa y pacientemente ha resuleto todas mis dudas sobre pro-
gramacion. El codigo fuente del Apendice informatico se redacto en colaboracion con el Dr. Cardona,
durante una visita al INI.
Los analisis electroforeticos de expresi on de protenas virales se han realizado en colaboracion con la
Dra. Celia Perales, compa nera de laboratorio.
Durante estos a nos he compartido trabajo y buenos ratos con multitud de compa neros en Madrid. A
todos ellos les doy las gracias por hacer inolvidable el tiempo que ha durado esta Tesis doctoral. A mis
compa neros del labo: Arman, sin ti la vida en el labo sera mas aburrida, pero viviramos mas tranquilos ;).
A Ruben le debo en esta tesis el haber aprendido a clonar, y una larga serie de cosas igualmente absurdas (ej.
AT-AT=AT-ST). Mercedes y Ana, necesitara una tesis entera para agradecer la ayuda que constantemente
me habeis prestado a lo largo de estos cinco a nos, gracias!! Celia, pin! pin!, que ya he acabado! Vaya gelacos
nos hemos currado! Maca, gracias por ser tan maja, desde el principio. En n, gracias a todos los compa neros
con los que hemos compartido tantas horas y habeis soportado mis seminarios: Vero, Marta, Hector, Walter
Dino, Teresa, Moni, Claudia, Ana Grande, y claro, Juanillo!!! el encumbrao. Gracias a Hector Tejero por
ense narme los secretos de los modelos SIR aplicados a la virologa. No puedo olvidarme a la gente del labo
de Luis Menendez (inclusive), Tanix, y Monik-K, gracias por divertirme tanto, todo lo que se me ocurre
decirte no se puede poner en una tesis (es un cumplido). Glori y Carola, gracias por amenizar los ultimos
a nos de la Tesis. La gente de cultivos, Pepa, Ma

Angeles y al mejor de todo el centro, Alfonso. Mada y Charo

siempre han estado dispuestas a echarme una mano. El departamento de informatica ha sufrido duramente
mis continuos ataques, gracias a Diego y a Santi (al autor de los ratones dibujados en esta Tesis).
En el CISA recib la ayuda de muchsima gente que no puedo enumerar aqu, especialmente de Horacio
en inumerables ocasiones (te debo tantas!!!), gracias tambien al Dr. Javier Salguero y a Miguel

Angel, y
como no, gracias Ester por la ayuda y la compa nia en el CISA y ahora en el CBM.
Gracias a toda la gente del laboratorio de Juan Ortn y de Amelia Nieto (inclusives), el Dr. Thomas Lutz
me salv o la Tesis y la vida con sus conocimientos de L
A
T
E
X. Emilaco! pedazo de bloques que nos hacemos!
No me puedo olvidar de Estela y Alex, mis neoyorkinos favoritos y de Garaigorta, chicos, lo peor de este
trabajo es que nos centrifuga a todos a miles de km.
Quiero agradecer a todos los colegas de Girona y Barcelona que han estudiado conmigo (o no) y han
comprendido y apoyado este proyecto personal. Pau, gracias por ense narme a dar siempre el maximo de uno
mismo. JR, Toni, Nestor, Javi y Marcos: acabe tios! Gracias a la ayuda de la Dra. Pilar Perez. Oscar, gracias
por tu ayuda con la estadstica, por cierto, seg un Lorenz: x = (y x) ; y = rx y xz; z = xy bz,
es decir, el caos es un tipo de orden. No me puedo olvidar de mi nueva familia y nuestros viajes!. Luisillo,
doctorazo, cuando me muera, en herencia te dejare el Samguayoife (ahora lo necesito). Jordi, mi or aculo
cientco, todo lo que sabes del RNA y las real-time te lo he ense nado yo (por eso no te salen), en n, gracias
por todo to.
Nada de lo que hago sera posible, o sera mas difcil, sin la ayuda de mis hermanos y especialmente de
mis padres, que creen en mi y me apoyan siempre, haga lo que haga. Sois geniales, todos!
N uria, hemos cerrado una etapa juntos, a por otra!!!
Gracias a todos.
Las RNAasas no existen, ciencia total!!! ciencia total!!!
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Abreviaturas
ACM: Anticuerpo monoclonal
AZC: 5-Azacitidina (AZC)
BHK-21: Celulas de ri non de hamster (Baby
Hamster Kidney)
cDNA: DNA copia
d: Distancia media
DEAE: Dietil aminoetilo
Df: Degrees of freedom, grados de libertad
DIs: Partculas defectivas interferentes
DMEM: Medio mnimo de Eagle modicado
por Dulbecco
DNA:

Acido desoxirribonucleico
dNTP: 2-desoxinucleosido-5-trifosfato
e.c.p.: Efecto citop atico
EDTA: Etilen diamino tetracetato
FA: Fiebre aftosa
FU: 5-Fluorouracilo
G: Guanidinio
H: Heparina
h.p.e.: Horas post-electroporacion
IRES: Sitio interno de entrada de ribosomas
(Internal Ribosome Entry Site)
Kb, Pb: Kilobases, pares de bases
LCMV: Virus de la coriomeningitis linfocitaria
del rat on
M: Molar
MDI: Multiplicidad de infecci on
MP: M axima parsimonia
MV: M axima verosimilitud
NJ:neighbor-joining
nt: Nucleotido
PAQ: Partition Analysis of Quasispecies
PBS: Solucion salina tamponada con fosfato
PCR: Reacci on en cadena de la polimerasa
PFUs: Unidades formadoras de placa
PoliA: Poliadenilato
PoliC: Poliribocitidilato
PV: Poliovirus
R: Ribavirina
RNA:

Acido ribonucleico
RpRd: RNA polimerasa RNA dependiente
RT: Retrotranscriptasa
RT-PCR: Reacci on de transcripci on inversa
seguida de amplicaci on por reacci on en cadena
de la polimerasa
SARS: Sndrome respiratorio severo agudo
SBF: Suero Bovino Fetal
SDD: Selecci on dependiente de densidad
SPC: Suero policlonal
SIDA: Sndrome de inmunodeciencia adquirida
ST: Genoma estandar
5 UTR y 3 UTR: Regiones no traducidas de
los extremos 5 y 3, respectivamente
VFA: Virus de la ebre aftosa
VHC: Virus de la hepatitis C
VIH-1: Virus de la inmunodeciencia humana
tipo 1
VSV: Virus de la estomatitis vesicular
: Delecion
Codigo de amino acidos
A (Ala) Alanina I (Ile) Isoleucina
R (Arg) Arginina C (Cys) Cistena
K (Lys) Lisina S (Ser) Serina
D (Asp) Asp artico L (Leu) Leucina
T (Thr) Treonina E (Glu) Glut amico
M (Met) Metionina V (Val)Valina
F (Phe) Fenilalanina N (Asn) Asparagina
W (Trp) Tript ofano G (Gly) Glicina
P (Pro) Prolina Y (Tyr) Tirosina
H (His) Histidina Q (Gln) Glutamina
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Indice
1. Summary (resumen en ingles) 14
2. Introducci on 15
2.1. Variabilidad genetica de virus RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.1. Bases moleculares de la variabilidad genetica de virus RNA. . . . . . . . . . . 15
2.1.2. Frecuencias de mutaci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.1.3. Recombinacion y reordenamientos genicos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.1.4. Estructura poblacional - Cuasiespecies . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
2.1.5. La importancia del espectro de mutantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.1.6. Filogenia como herramienta para el estudio de la estructura de cuasiespecies. 19
2.2. Ecacia biol ogica de un virus: tness . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2.1. Procesos de variacion de la ecacia biol ogica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.2.2. Fitness en detalle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.2.3. Evolucion de estrategias de tness virales: selecci on dependiente de densidad 23
2.3. Mutagenesis letal como estrategia antiviral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.3.1. Evidencias experimentales de extinci on de VFA mediante mutagenesis letal . 25
2.4. El virus de la ebre aftosa (VFA) como modelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.4.1. La ebre aftosa (FA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.4.2. Organizaci on genomica y protenas codicadas por el virus de la ebre aftosa 26
2.4.3. Estructura de la partcula de VFA y entrada en la celula . . . . . . . . . . . . 28
2.4.4. Traduccion del genoma viral y procesamiento proteoltico de la poliprotena
viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.4.5. Replicacion del genoma de VFA y de otros picornavirus . . . . . . . . . . . . 30
2.5. Vacunacion frente a la ebre aftosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.5.1. Vacunas inactivadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.5.2. Vacunas basadas en peptidos o protenas expresadas por vectores . . . . . . . 30
2.5.3. Vacunas vivas atenuadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.6. Partculas defectivas interferentes (DIs) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.6.1. Generaci on de las partculas DIs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.6.2. Tipos de partculas DIs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.6.3. Presencia de partculas DIs en los diferentes sistemas virales . . . . . . . . . . 33
2.6.4. Caractersticas biol ogicas de las partculas DIs . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.6.5. Deleciones internas en VFA. Implicacion en la evolucion de la segmentaci on
viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.6.6. Origen de la segmentaci on viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
3. Objetivos 39
4. Materiales y Metodos 40
4.1. Cultivo de celulas eucarioticas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.2. Variantes del VFA empleadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.3. Infecciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.3.1. Infecciones en medio lquido de monocapas celulares . . . . . . . . . . . . . . 41
4.3.2. Plaqueo de virus en medio de agar semisolido en celulas BHK-21 . . . . . . . 42
4.3.3. Correcci on del ttulo en los plaqueos de las poblaciones de defectivos que
infectan por complementaci on de dos tipos de partculas . . . . . . . . . . . . 42
10
4.3.4. Pases placa a placa de clones del VFA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.3.5. Ensayo de centros infecciosos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.4. Curvas de crecimiento viral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.5. Cuanticaci on de celulas BHK-21 y an alisis de viabilidad . . . . . . . . . . . . . . . 43
4.6. Ensayo de virulencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.7. Ensayo de virulencia-interferencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.8. Puricaci on de virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.9. Anticuerpos monoclonales y policlonales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.10. Tecnicas utilizadas en experimentos con ratones C57BL/6 . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.10.1. Infecciones in vivo con ratones C57BL/6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.10.2. Sangrado de animales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.10.3. Extracci on de suero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.10.4. Ensayos de seroneutralizaci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.10.5. Ensayo de ELISA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4.11. Extracci on de RNA vrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.11.1. Extracci on de RNA vrico extracelular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.11.2. Extracci on de RNA vrico intracelular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
4.12. Obtencion de cDNA y amplicaci on por RT-PCR del RNA viral . . . . . . . . . . . 46
4.13. Puricaci on de fragmentos de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.14. Cuanticaci on de RNA vrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.15. Dise no de iniciadores para la amplicaci on especca de mutantes virales . . . . . . . 50
4.16. Cineticas de producci on de RNA vrico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
4.17. Experimentos de competicion y determinacion de la ecacia biol ogica relativa o tness 51
4.18. Tratamiento con RNAasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
4.19. Clonaje Molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.19.1. Clonaje molecular de la regi on no estructural del VFA pase 260 . . . . . . . . 52
4.19.2. Construccion de pl asmidos con la delecion 417 desplazada 3 nucleotidos
hacia el 5 o 3 del RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
4.19.3. Construccion de un pl asmido con la delecion 417 en el contexto de C-S8c1 . 52
4.19.4. Transcripcion de pl asmidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.20. An alisis de la replicaci on en celulas BHK-21 de RNAs transcritos in vivo . . . . . . . 54
4.20.1. Electroporacion de celulas BHK-21 con RNAs transcritos del virus de cDNA
del genoma del virus de la ebre aftosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.20.2. Marcajes metabolicos y obtencion de extractos celulares . . . . . . . . . . . . 56
4.20.3. An alisis de protenas en gel de poliacrilamida y uorografa . . . . . . . . . . 56
4.20.4. Inmunodetecci on de protenas mediante Western-blot . . . . . . . . . . . . . 56
4.21. Secuenciacion de DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
4.22. Disoluciones y tampones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
4.23. Metodos logeneticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
4.23.1. Alineamiento y edicion de secuencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
4.23.2. An alisis logenetico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
4.24. Caracterizacion de los espectros de mutantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
4.25. Metodos Numericos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.26. Programaci on con C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
11
5. Resultados 60
5.1. Evolucion del clon VFA C-S8c1 hacia la segmentaci on viral . . . . . . . . . . . . . . 60
5.1.1. Descripci on de una poblacion muy heterogenea de genomas defectivos: evi-
dencia de un estado de inestabilidad evolutiva . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
5.1.2. Secuencia nucleotdica en torno a los sitios delecionados: evidencia de recom-
binacion promiscua . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
5.1.3. Estabilidad de la delecion 417 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
5.1.4. La capacidad replicativa de los RNA es dependiente del contexto de secuencia 69
5.2. Estudio de la ventaja selectiva de los virus defectivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
5.2.1. Determinaci on de la ecacia biol ogica de C-S8p260 y C-S8p260p3d . . . . . . 71
5.2.2. Cineticas de replicaci on del RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
5.2.3. Cinetica de expresi on de protenas virales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
5.2.4. Determinaci on de la infectividad especca y su relaci on con tness . . . . . . 76
5.2.5. An alisis de la estabilidad de los virus C-S8p260 y C-S8p260p3d . . . . . . . . 80
5.3. Vacunacion de ratones C57BL/6 con virus defectivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
5.3.1. Protecci on por la vacunacion con C-S8p260 y C-S8p260p3d . . . . . . . . . . 84
5.3.2. La vacunacion con virus defectivos conere protecci on esteril . . . . . . . . . 85
5.3.3. Capacidad inmunogena de la vacunacion con C-S8p260 . . . . . . . . . . . . 85
5.3.4. Los ratones vacunados con C-S8p260 generan anticuerpos neutralizantes . . . 85
5.4. Topologa de poblaciones virales sometidas a mutagenesis . . . . . . . . . . . . . . . 88
5.4.1. Evaluacion logenetica de la diversicacion genetica inducida por la mu-
tagenesis en las poblaciones de VFA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
5.4.2. Partition analysis of quasispecies (PAQ) aplicado al an alisis clonal de pobla-
ciones de VFA mutagenizadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.4.3. An alisis mutacional y tasas de jacion de nucleotidos . . . . . . . . . . . . . . 96
5.4.4. Evidencia de selecci on puricadora durante la mutagenesis incrementada . . . 97
5.4.5. Extincion viral sin un exceso aparente de mutaciones . . . . . . . . . . . . . 99
5.5. Diversicacion de un clon de VFA en dos poblaciones con diferentes estrategias evo-
lutivas: colonizadores y competidores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
5.5.1. Deteccion de clones recombinantes en la poblacion C-S8p200 . . . . . . . . . 102
5.5.2. Origen de la subpoblacion MARLS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102
5.5.3. Las poblaciones tipo-MARLS estan suprimidas por la cuasiespecie . . . . . . 104
5.5.4. Selecci on dependiente de densidad en las poblaciones tipo-MARLS y tipo-p200106
5.5.5. Las poblaciones tipo-MARLS son m as virulentas que las poblaciones tipo-p200106
5.5.6. Posible compromiso entre la producci on de progenie y la virulencia . . . . . . 106
5.5.7. Las poblaciones tipo-p200 intereren con las poblaciones tipo-MARLS, mo-
dulando la virulencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 109
5.5.8. Modelo matem atico de replicaci on y competicion de virus en celulas en cultivo109
6. Discusi on 112
6.1. Origen y evolucion de la segmentaci on genomica: el VFA como modelo . . . . . . . . 112
6.1.1. Descripci on de una cuasiespecie de virus defectivos en el transcurso de la
evolucion hacia un virus segmentado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
6.1.2. Recombinacion exuberante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112
6.1.3. El modelo de la delecion maestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
6.1.4. An alisis de la estabilidad de la delecion 417 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113
6.1.5. Importancia del contexto de secuencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114
6.2. Ventaja selectiva del sistema segmentado de VFA C-S8p260 . . . . . . . . . . . . . . 114
12
6.2.1. La presencia de deleciones es un determinante de tness. . . . . . . . . . . . . 114
6.2.2. Las tasas de replicaci on del RNA y de expresi on de protenas son constantes
en el virus ST y en el defectivo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
6.2.3. El virus segmentado posee mayor infectividad especca que el virus ST. . . . 115
6.2.4. El virus defectivo es m as estable que el virus ST . . . . . . . . . . . . . . . . 116
6.2.5. Origen poliletico de la segmentaci on viral: conclusiones a partir de la evo-
luci on de las DIs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
6.3. Desarrollo de una vacuna atenuada basada en la poblaci on C-S8p260 . . . . . . . . . 117
6.3.1. La vacunacion con la poblacion viral C-S8p260 proporciona una protecci on
esteril al desafo de ratones C57BL/6 con el clon de VFA C-S8c1 . . . . . . . 117
6.3.2. La vacunacion con la poblacion viral C-S8p260 proporciona niveles altos de
anticuerpos neutralizantes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
6.4. El estudio de la topologa logenetica y de particion de cuasiespecies revelan los
patrones evolutivos de poblaciones virales sometidas a mutagenesis incrementada . . 118
6.4.1. An alisis PAQ y logenetico revelan cambios drasticos y rapidos en la estruc-
tura poblacional . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
6.4.2. Las poblaciones mutagenizadas estan sometidas a selecci on puricadora . . . 120
6.5. Estrategias de tness virales: la hip otesis de los dos nichos ecologicos . . . . . . . . . 121
6.5.1. Colonizadores y competidores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121
6.5.2. Diversicacion genetica con un origen clonal com un . . . . . . . . . . . . . . 121
6.5.3. Selecci on dependiente de densidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122
6.5.4. Evolucion de la virulencia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
7. Conclusiones 125
8. Apendice logenetico 126
9. Apendice matematico: modelo basico de dinamica viral en cultivos celulares 128
9.1. Competicion de dos virus en cultivos celulares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
9.2. Din amica in silico frente din amica in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
9.2.1. Condiciones iniciales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
9.2.2. Determinaci on de la cantidad de virus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131
9.2.3. Predicciones del modelo y resultados experimentales . . . . . . . . . . . . . . 132
9.3. Par ametros del modelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132
9.4. An alisis matem atico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
9.4.1. Ley de conservaci on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
9.4.2. Espacio de par ametros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135
10.Apendice informatico 136
10.1. Codigo fuente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
11.Bibliografa 163
12.Artculos publicados 179
13
1. Summary (resumen en ingles)
Quasispecies dynamics is involved in several aspects of RNA virus pathogenesis. It derives from
high error rates during RNA virus replication, large viral population sizes and short replicative
cycles. These features lead necessarily to highly polymorphic populations in which the time needed
to x a specic mutation is longer than the time that it takes to generate new variants.
A clonal population of foot-and-mouth disease virus (FMDV) evolved towards dominance of
genomes with internal deletions, that were infectious by complementation in the absence of standard
virus. In this thesis, the genome composition of intermediate passages in the course of evolution of
the segmented version of FMDV has been analyzed. Multiple minority genomes harboring internal
deletions have been characterized. The results provide evidence of a transient state with genetic
instability. Increased thermal stability of the viral particles containing genomic RNA with internal
deletions, relative to the stability of the standard FMDV, has been associated with the selective
advantage of the segmented version relative to standard FMDV. No signicant dierences have
been noted in virus entry into cells, levels of intracellular RNA, viral protein synthesis or virus exit
from the cell.
The segmented form of FMDV induced anti-FMDV neutralizing antibodies, and protected
B57/BL6 mice against challenge with a lethal dose of the standard virus. Thus, the segmented
FMDV version constitutes a live-attenuated vaccine candidate.
In the present thesis, populations of FMDV subjected to lethal mutagenesis by base and nucleo-
side analogues have been analyzed by PAQ (Partition Analysis of Quasispecies), and by standard
phylogenetic methods. The results have documented expansions and compressions of mutant spec-
trum complexity, as well as the operation of negative selection in the course of mutagenesis. Ex-
tinction can occur with modest increases of mutant spectrum complexity. The results suggest that
PAQ can be very useful to unveil changes in the internal composition of mutant spectra subjected
to mutagenesis or other perturbations.
The diversication of a clonal population of FMDV into two distinct subpopulations has been
characterized. Recombinant forms between components of the two subpopulations have been identi-
ed by nucleotide sequence comparisons and phylogenetic analysis. The two subpopulations diered
in virulence (cell killing ability), replication rate, and interference exerted on other FMDV popu-
lations. The results t an ecological model in which the virus dierentiated into colonizers and
competitors for limited and patched resources, in this case the host cells.
The three main aspects of viral dynamics examined in the present thesis have characterized ma-
jor evolutionary transitions into new genotypic and phenotypic traits. Some transitions (towards
segmentation, dierentiation into resource-coping strategies) have occurred in the course of unper-
turbed evolution, while others (internal changes of mutant spectrum composition) were triggered
by enhanced mutagenesis.
14
2. Introduccion
2.1. Variabilidad genetica de virus RNA
2.1.1. Bases moleculares de la variabilidad genetica de virus RNA.
Los virus son agentes biol ogicos que carecen de un metabolismo propio y dependen necesaria-
mente de la celula para su replicaci on. Son capaces de reconocer a la celula (Baranowski y col. 2001),
entrar en ella (Hogle 2002), utilizar los sistemas de transporte intracelular (Henry y col. 2006), de
traduccion y modicaci on de protenas (Kash y col. 2006) y as generar su progenie. Todos, por
tanto, son par asitos y, con distinto grado de virulencia, son capaces de persistir (Domingo y col.
1998) o matar a la celula hospedadora (Buenz y Howe 2006). La diversidad viral es extensa, la
clasicacion actual incluye 3 ordenes, 73 familias, 9 subfamilias, 287 generos y 1938 especies y aun
existe un gran n umero de virus sin clasicar (Fauquet y col. 2005; Fauquet y Fargette 2005). Los
virus que poseen RNA como material genetico son los m as abundantes en la biosfera, constituyendo
m as del 70 % de los virus patogenos que infectan organismos superiores. Son por tanto los agentes
causantes de un gran n umero de enfermedades en el hombre como gripe, sarampi on, varias formas
de hepatitis, poliomielitis, SIDA y enfermedades de gran importancia veterinaria como la ebre
aftosa (FA) o la lengua azul, y otras denominadas emergentes como las ebres hemorr agicas aso-
ciadas a hantavirus, arenavirus o lovirus (Duarte y col. 1994; Morse 1994; Murphy 1994; Murphy
y Nathanson 1994; Weaver 1998).
La estructura de un virus RNA es generalmente simple. La partcula se compone de un reducido
grupo de protenas que protegen el genoma que incluye la informaci on para la transcripcion y
replicaci on del RNA y para la expresi on de protenas vricas (Flint y col. 2004). El mensaje genetico
se copia con delidad limitada durante la replicaci on viral, dando lugar a la alta variabilidad genetica
de los virus RNA (Figura 1) (Domingo 2006; Domingo y col. 1978).
2.1.2. Frecuencias de mutaci on
Los valores de tasa de mutaci on en la replicaci on de virus RNA se han estimado en 10
3
a 10
5
errores por nucleotido copiado (Drake 1993; Drake y Holland 1999; Holland y col. 1982; Domingo y
col. 2001a). Es un valor muy superior a los 10
8
a 10
11
errores por nucleotido copiado estimados
para los procesos normales de replicaci on de DNA celular (Drake 1991; Drake 1993; Goodman y
Fygenson 1998; Kunkel y Alexander 1986; Kunkel y col. 1986). Dado que los genomas de virus RNA
tienen un tama no de entre 3kb y 32kb, de media se espera que ocurran entre 0,1 y 1 mutaciones
por genoma y ronda de replicaci on (Drake y Holland 1999). Esta velocidad de mutacion es tan alta
que la mayora de la progenie viral puede ser no viable (Con 1995).
Existen al menos dos factores moleculares que contribuyen a la mayor tasa de error de los virus
RNA:
1. Mayor indelidad de las RNA replicasas en comparacion con las DNA polimerasas replicativas.
Ausencia de actividad correctora de errores de las replicasas de RNA (actividad exonucleasa
35), documentada tanto por metodos bioqumicos (Con y col. 1997; Steinhauer y col.
1992) como por comparacion de dominios estructurales de replicasas de RNA y polimerasas
de DNA celulares (Bressanelli y col. 1999; Ferrer-Orta y col. 2006b; Hansen y col. 1997;
Kohlstaedt y col. 1992).
2. Ausencia de mecanismos celulares conocidos de reparacion postreplicativa que puedan actuar
sobre hbridos RNA-DNA o de intermediarios replicativos de RNA bicatenarios (Modrich y
15
Secuencia
consenso
Secuencia
consenso
Eficacia biolgica
relativa
_
+
Figura 1: Esquema de la estructura en cuasiespecies de los virus RNA. En
el esquema central se representa una distribucion heterogenea de genomas, tpica de
los virus ARN. Las lneas representan genomas virales y los smbolos sobre las lneas
representan mutaciones. Debajo del espectro de mutantes se indica la secuencia consenso
o promedio de la distribucion. La cuasiespecie inicial, en el centro, puede evolucionar
hacia aumentos de ecacia biol ogica (echa ancha) al ser sometida a pases con grandes
tama nos poblacionales, o hacia disminuciones de ecacia biol ogica (echas peque nas)
al ser sometida a cuellos de botella poblacionales sucesivos o pases placa a placa. Los
pases con grandes tama nos poblacionales favorecen la competicion entre las variantes y
conlleva un aumento de la ecacia biol ogica relativa del virus. Los pases placa a placa
dan lugar a una acumulacion estocastica de mutaciones deletereas y a una bajada de la
ecacia biol ogica relativa del virus.
16
Lahue 1996). Adem as, las RNA polimerasas son propensas al deslizamiento (slippage) al copiar
tramos homopolmericos, originando delecciones e inserciones (Bebenek y Kunkel 1993).
Existen tambien unas familias de protenas celulares, las citosin y adenosin desaminasas (APO-
BEC y ADAR), capaces de editar genomas o transcritos virales como en Hepatitis , virus de la
inmunodeciencia humana (VIH) (Harris y col. 2003; Mangeat y col. 2003; Zhang y col. 2003),
hepatitis B (Suspene y col. 2005) o incluso en virus DNA como el papilomavirus (Vartanian y
col. 2008). Estas actividades pueden ser tambien una fuente de variacion genetica en algunos virus
RNA.
2.1.3. Recombinaci on y reordenamientos genicos.
La recombinacion es la formacion de nuevas combinaciones de fragmentos de material genetico,
covalentemente unidos, procedentes de diferentes genomas parentales o diferentes zonas de un mismo
genoma (revisi on en Domingo 2007). La recombinacion es una importante fuente de variabilidad
genetica, especialmente en virus RNA de polaridad positiva (Simmonds y Welch 2006). Su valor
evolutivo se asocia a dos propiedades: (i) provee a los virus RNA de un mecanismo para contrarrestar
la desventaja asociada a las altas tasas de mutaci on (Mikkelsen y Pedersen 2000) y (ii) permite
explorar nuevas combinaciones geneticas procedentes de virus parentales de origen distinto (Hahn
y col. 1988).
Se han descrito distintos tipos de recombinacion: (i) hom ologa frente a no homologa, en funcion
de la identidad de secuencia en los puntos de cruce de las cadenas y (ii) replicativa frente a no repli-
cativa, en funcion de si se requiere o no la replicaci on del genoma viral (Domingo 2007; Chetverin
y col. 2005; Kirkegaard y Baltimore 1986b; Urbanowicz y col. 2005; Gmyl y col. 1999; Chetverina
y col. 1999; Gmyl y col. 2003).
La frecuencia de recombinacion vara tanto para virus DNA como para virus RNA. Bujarski
y colaboradores han propuesto que la recombinacion puede ser un hecho habitual en el genetica
del RNA (Urbanowicz y col. 2005). En el VIH se estima que la frecuencia de recombinacion es
mayor que la de mutaci on puntual (Jetzt y col. 2000; Wain-Hobson y col. 2003). En el virus de la
ebre aftosa (VFA), el modelo viral utilizado en esta Tesis Doctoral, se ha estimado que entre el
10 % y 20 % de los genomas progenie en coinfecciones en cultivos celulares son recombinantes (King
1988; Carrillo y col. 2005; Knowles y Samuel 2003; Sobrino y Domingo 2004).Se han detectado
variantes del VFA con cambios de bloques genomicos, algunos con efectos fenotpicos importantes,
como por ejemplo deleciones en la protena 3A, que alteran el rango de hospedador y la virulencia
(Beard y Mason 2000; Giraudo y col. 1990), y existe evidencia creciente de circulaci on de VFAs
recombinantes (Jackson y col. 2007).
Los reordenamientos genicos constituyen una importante fuente de variacion en virus con geno-
ma segmentado (Webster 1999a). El reordenamiento de segmentos procedentes de cepas humanas
y aviares del virus de la gripe tipo A se ha asociado a epidemias como la causante de la gripe
espa nola de 1918, y las epidemias de 1957 y 1968 (Vana y Westover 2008).
2.1.4. Estructura poblacional - Cuasiespecies
Las altas tasas de error de los virus RNA, sus tiempos cortos de replicaic on genomica y los altos
tama nos poblacionales, junto con la accion de la selecci on natural, conguran un sistema darviniano
extremo, en el que la velocidad con la que se generan nuevas variantes supera la velocidad a la que
estas se jan (Manrubia y col. 2005). Esta din amica de mutaci on-seleccion rapida en virus RNA
conlleva necesariamente a la coexistencia de m ultiples variantes en una poblacion, que constituye
un conjunto de individuos muy relacionados entre si, pero no identicos (Figura 1). A esta estructura
17
poblacional se la conoce como cuasiespecies virales (Domingo 2006; Domingo y col. 2006; Domingo
y col. 1978; Eigen 1993; Manrubia y col. 2005; Nowak 1992; Domingo 2007; Holland y col. 1982).
La existencia de una estructura poblacional en forma de cuasiespecies supuso la conrmaci on
experimental de la teora previamente desarrollada por Manfred Eigen y Peter Schuster, sobre el
origen de la vida y evolucion molecular de replicones primitivos (Biebricher y Eigen 2005; Eigen
1971; Eigen y col. 1988; Eigen y Schuster 1979). Las primeras demostraciones de la organizacion
en cuasiespecies de virus RNA fueron la del fago Q, la del VFA (Domingo y col. 1980; Domingo y
col. 1978) y la del virus de la estomatitis vesicular (VSV) (Holland y col. 1982). Hasta el momen-
to, los virus RNA examinados a nivel poblacional muestran un complejo espectro de mutantes y
evolucionan tal como predice la din amica de cuasiespecies (Domingo y col. 2001a; Domingo y col.
1999b; Figlerowicz y col. 2003). Se han descrito casos de virus DNA que parecen tambien tener un
comportamiento de cuasiespecies al igual que los virus RNA (L opez-Bueno y col. 2006).
En una escala temporal superior, los virus evolucionan en la naturaleza con distinta velocidad,
medida como sustituciones por nucleotido y a no, no necesariamente relacionada con su tasa de
error (Domingo 2007; Holmes 2008). Virus dentro de una misma especie pueden presentar serotipos
con homologas de nucleotidos menor del 50 % o 75 % (Grenfell y col. 2004; Knowles y Palmenberg
1998).
2.1.5. La importancia del espectro de mutantes
Las cuasiespecies vricas son un importante reservorio genetico de variantes virales estructu-
rado por la accion de la mutaci on, la selecci on, tanto positiva como negativa, y en determinadas
circunstancias de la deriva genetica y otros procesos estocasticos (Domingo y col. 1988; Domingo
y col. 1985; Wimmer y col. 1993; Novella y col. 1995; Quer y col. 2001). La replicaci on con errores
constituye, por tanto, un mecanismo evolutivo que proporciona a los virus la capacidad de subsistir
en un medio continuamente cambiante.

Esta capacidad adaptativa se ha demostrado, entre otros,
en los siguientes casos:
1. Evasion de la respuesta inmune. Se han descrito mutaciones de escape tanto a celulas T como
a la neutralizaci on por anticuerpos (Borrego y col. 1993; Carman y col. 1993; Martnez y col.
1997; Borrego y col. 1993; Carman y col. 1993; Martnez y col. 1997), incluso en individuos
vacunados (Webster 1999b).
2. Evasion a agentes antivirales (Domingo y Holland 1992; Domingo y col. 2001c; Domingo y
col. 1997; Hirsch y col. 2003; Hirsch y col. 2000).
3. Alteraciones del tropismo celular. Se han descrito cambios puntuales en protenas involucradas
en la interacci on con anticuerpos que coneren al virus la capacidad de reconocer receptores
alternativos, lo que en ocasiones conlleva a una expansion del tropismo celular (Baranowski
y col. 2001; Baranowski y col. 2003; Regoes y col. 2005).
4. Alteracion de la virulencia. Durante la replicaci on de los virus RNA emergen variantes con
un incremento en la virulencia. Los determinantes moleculares del aumento de virulencia en
VFA se han asignado a diferentes protenas , tanto estructurales como de replicaci on o zonas
no codicantes de protenas (Herrera y col. 2007; Martinez-Salas y col. 1993; Escarmis y col.
1998; Baranowski y col. 1998; Herrera y col. 2007; Bae y Yoon 1993; Tu y col. 1995; Kim y
col. 2005; N u nez y col. 2001; Mason y col. 2003).
5. Posible implicacion en aparicion de enfermedades emergentes o reemergentes (Drosten y col.
2003; L azaro y Escarms 2002; Mahy 2005).
18
La importancia del espectro de mutantes se ha resaltado recientemete con dos estudios parale-
los, realizados con un mutante del virus de la poliomelitis (PV)(Pfeier y Kirkegaard 2003; Arnold
y col. 2005) que mostro un incremento en la delidad sin comprometer su capacidad replicativa.
Este mutante generaba una cuasiespecie con menor diversidad que el virus salvaje. En ratones sus-
ceptibles infectados, la reduccion de la diversidad viral condujo a la perdida del neurotropismo y
por tanto a un fenotipo atenuado (Pfeier y Kirkegaard 2005; Vignuzzi y col. 2006). La expansion
de la diversidad de la cuasiespecie mediante mutagenesis qumica restauro el neurotropismo y la pa-
togenesis. Estos resultados establecen una relaci on directa entre la tasa de mutacion, la complejidad
del espectro de mutantes y la patogenia viral in vivo.
2.1.6. Filogenia como herramienta para el estudio de la estructura de cuasiespecies.
La logenia es una herramienta util para describir y clasicar la variabilidad de los virus RNA
(Domingo 2007; Flint y col. 2004; Grano y Webster 1999; Salemi y Vandamme 2004; Holmes 2004),
puesto que estos se diversican en la naturaleza en cualquiera de las escalas (tanto temporales
como espaciales) estudiadas (Duy y col. 2008). En muchos virus, como en el caso del VFA, existen
grandes subtipos localizados geogr acamente por todo el mundo (Knowles y Samuel 2003). Se han
descrito tambien, variantes antigenicas dentro de un serotipo viral (Mateu y col. 1988). Asimismo
se han descrito variantes geneticos y antigenicos dentro de un animal infectado (Domingo y col.
1980; Gebauer y col. 1988), incluso en cultivos celulares el VFA se diversica rapidamente (Sobrino
y col. 1983; Fares y col. 2001).
El estudio de la topologa de un arbol logenetico construido con muestras tomadas durante
una serie temporal o geogr aca se denomina lodin amica (Grenfell y col. 2004), y reeja el patron
evolutivo que puede seguir una especie viral (Figura 2). La mayora de los estudios logeneticos
se han realizado con secuencias consenso de las poblaciones virales, que representan una media
ponderada de las m ultiples secuencias presentes en cada tiempo y muestra de virus (Domingo 2007).
Sin embargo, el an alisis clonal de las poblaciones virales puede revelar una compleja estructura,
que no se puede deducir de la secuencia consenso (Figura 2-D).
Se ha descrito un metodo no jer arquico, el An alisis de Particion de Cuasiespecies (PAQ) (Baccam
y col. 2001) para el estudio de secuencias dentro de un espectro de mutantes.

Este metodo agrupa
secuencias que minimizan la distancia genetica (de Hamming) entre ellas. De este modo m ultiples
grupos, solapados o no solapados, se pueden representar en una serie temporal, que reeja la
din amica que siguen los individuos de una misma cuasiespecie (Figura 2-E). El PAQ se ha empleado
con exito para analizar subpoblaciones de la anemia equina infecciosa (Baccam y col. 2003), el
retrotranspos on Ty1-copia (Galindo y col. 2004), en secuencias regulatorias del virus de la diarrea
bovina (Jones y col. 2002), o aislados secuenciales del virus de la hepatitis A (Costa-Mattioli y col.
2006).
En nuestro laboratorio se han descrito y secuenciado una serie de espectros de mutantes proce-
dentes de poblaciones que han replicado en cultivos celulares en presencia de mutagenos (Sierra y
col. 2007; Sierra y col. 2000; Gonzalez-Lopez y col. 2005; Gonzalez-Lopez y col. 2004; ver secci on
2.3). La adaptaci on del VFA a la replicaci on en condiciones de mutagenesis incrementada im-
plic o cambios drasticos de todo el espectro de mutantes que se han comparado mediante metodos
logeneticos y PAQ, como parte de esta Tesis Doctoral.
2.2. Ecacia biologica de un virus: tness
La ecacia biol ogica o tness de una variante viral es la contribuci on esperada de esa variante a
la descendencia de la siguiente generacion en un ambiente determinado (Maynard Smith 1998). Dos
19
A B C
D E
tiempo
Figura 2: Estudio de la evoluci on de virus a traves de la topologa de arboles
logeneticos. A)

Arbol representativo de la evolucion (a nivel epidemiologico) del virus
de la gripe o de clones virales en cultivos celulares. Representa una selecci on constante
y lineal de nuevas variantes virales partir de las previas. En este arbol y en el resto,
las secuencias virales se representan con un crculo que signica que dicha secuencia es
el promedio de una constelacion de mutantes. B)

Arbol logenetico representativo de
virus que realizan infecciones cronicas tipo VIH o virus de la hepatitis C. Se caracteriza
por ramas largas divergentes entre las distintas variantes virales. C) Evolucion con
mucha divergencia inter-subtipo y muy relacionados intra-subtipo (tpica de Dengue).
D) Diversicacion de HIV en un paciente infectado, documentado por secuenciacion de
clones moleculares. E) An alisis por particion de cuasiespecies (PAQ). Los crculos (o
esferas) representan subpoblaciones virales de una misma muestra analizada durante
una serie temporal. El tama no de cada esfera puede representar el tama no de cada
subpoblacion (n umero de individuos) o la diversidad de cada subpoblacion. N otese la
variacion uctuante a lo largo de la serie de la composicion de cada poblacion. Esquemas
basados en (Grenfell y col. 2004) y (Domingo 2007).
20
virus con diferente capacidad replicativa pueden contribuir de manera muy similar a la siguiente
generacion, cuando estos replican de manera independiente. Por este motivo, en virologa, se ha
adoptado la cuanticaci on de la capacidad replicativa en competicion y obtener as un valor de
ecacia biol ogica relativa. El valor de tness de un virus reeja su grado de adaptaci on al entorno
(Domingo y col. 1999a; Domingo y Holland 1997).
Para estimar la tness relativa de un virus se realizan experimentos de competici on en cultivos
celulares o en un organismo hospedador. En cultivos celulares, los dos virus se mezclan con unas
proporciones dadas, y se realiza una infecci on con ellos. A diferentes tiempos durante la infecci on
o tras observar efecto citopatico completo, se realizan determinaciones de la proporci on de cada
tipo viral (Qui nones-Mateu y Arts 2006). Cuando se obtiene una serie temporal (varios tiempos
dentro de una misma infecci on, o varias infecciones seriadas), cl asicamente se ha tomado como
valor de tness el incremento respecto al tiempo de la frecuencia de cada virus (Figura 3), o m as
precisamente, la pendiente de la relaci on logartmica de las frecuencias de los genotipos durante la
serie temporal (Holland y col. 1991). Esta pendiente representa el incremento medio por pase (o
por unidad temporal) de la frecuencia de la variante viral estudiada. Para poder diferenciar los dos
virus se utilizan marcadores geneticos que sean distinguibles mediante (i) PCR a tiempo real con
iniciadores especcos (Arias y col. 2004), (ii) secuenciacion de mutaciones especcas de un tipo
viral (Garca-Arriaza y col. 2006), (iii) uorometra si uno lleva insertada una protena uorescente
(Qui nones-Mateu y Arts 2006), (iv) titulacion de los virus en presencia de anticuerpo cuando uno
de los dos es resistente al anticuerpo (Holland y col. 1991; Novella y col. 2004).
2.2.1. Procesos de variaci on de la ecacia biol ogica
El teorema fundamental de la selecci on natural de Fisher dice: El ritmo de aumento en tness
de una poblacion en cualquier momento es igual a su variaci on genetica en tness en ese momento
(Edwards 1994; Fisher 1930; Maynard Smith 1998; Fisher 1941). Por tanto cuanto mayor sea la
variabilidad dentro de una poblacion, mayor sera la probabilidad de que existan y se seleccionen
individuos mejor adaptados. Las poblaciones de virus RNA, dada su naturaleza de replicaci on en
forma de cuasiespecies, poseen una elevada variabilidad genetica. Cuando al virus se le permite repli-
car con elevados tama nos poblacionales, se establece una competicion entre las diferentes variantes
geneticas. En estas circunstancias, la selecci on positiva act ua seleccionando aquellas variantes de
mayor ecacia biol ogica (Figura 1) (Escarmis y col. 1999; Novella y col. 1995). La din amica de
las cuasiespecies vricas en relaci on con los cambios de ecacia biol ogica se ha documentado con
numerosos estudios empleando virus bacterianos, virus animales y virus de plantas (Domingo 2000;
Domingo 2006; Domingo y col. 2001a). Los cuellos de botella poblacionales constituyen el otro
extremo en el regimen de pases de un virus. Si durante un nuevo proceso de infecci on, el tama no
poblacional efectivo se ve reducido drasticamente (cuello de botella poblacional), se puede producir
la amplicaci on de subpoblaciones de genomas, independientemente de su adaptaci on o ventaja
selectiva en el entorno. Ello puede dar lugar a la jacion de genomas con mutaciones no necesa-
riamente adaptativas, en la secuencia consenso de la poblacion viral. Este proceso se conoce como
trinquete de Muller (Muller 1964) y establece que en organismos asexuales se produciran perdidas
en la ecacia biol ogica, como resultado de la acumulacion de mutaciones deletereas, cuando los
mecanismos compensatorios, como el sexo o la recombinacion, esten impedidos. Este proceso ha
sido ampliamente demostrado con diversos virus RNA , y el propio VFA (Chao 1990; Escarmis y
col. 1996; Escarms y col. 2008; de la Iglesia y Elena 2007; Novella 2004; Yuste y col. 1999). Este
proceso es habitual en la macroevolucion de los virus, ya que la transmision huesped a huesped
puede implicar un cuello de botella poblacional (Chao 1997).
21
0 1 2 3 4
V
i
r
u
s
1
/
V
i
r
u
s
2
10
-2
y = 0,318e
0,917x
R
2
= 0,9218
10
-1
10
0
10
1
10
2
0 1 2 3 4
10
-2
y = 0,318e
0,917x
R
2
= 0,9218
10
-1
10
0
10
1
10
2
Nmero de pase
Figura 3: Esquema tpico de una competici on viral para determinar tness re-
lativa. La gr aca representa la proporci on de dos variantes virales en un in oculo inicial
(pase 0) y al nal de una infecci on citoltica (a lo largo de 4 pases). Cada punto repre-
senta el resultado de una infecci on realizada a partir del preparado viral de la infecci on
previa. La pendiente de la gr aca representa la variacion temporal en la proporci on de
cada genotipo. Dado que el incremento en x (n umero de pases) es 1 en cada punto, la
pendiente en este caso es e
0,917
= 2, 6 =valor de tness relativa.
2.2.2. Fitness en detalle
Se ha criticado que el valor obtenido de la variacion temporal de la proporci on de cada virus, en
un ensayo de competicion, es realmente la diferencia absoluta en tness entre dos virus, en lugar de
ser la autentica tness relativa (Maree y col. 2000). Para calcular el cl asico coeciente de selecci on,
en principio m as generalizable, se han propuesto tres modelos matem aticos, cada uno actualizando y
corrigiendo el previo (Bonhoeer y col. 2002; Maree y col. 2000; Wu y col. 2006). Sorprendentemente
ninguno de estos modelos contempla la posibilidad de que una misma celula sea coinfectada por dos
variantes virales distintas. Cuando las mediciones de tness en cultivo celular se realizan con una
multiplicidad de infecci on (MDI) algo menor que uno, durante las primeras rondas de infecci on los
virus replican en celulas sin coinfectar, pero a medida que la infecci on progresa, cuando la carga viral
sobrepasa un umbral, las distintas variantes virales coinfectan celulas. En ausencia de coinfecci on,
el virus con la mayor tasa de replicaic on es aquel que tiene mayor tness, (Aguirre y Manrubia
2007; Aguirre y Manrubia 2008; Nowak y May 2000). En los modelos matem aticos que describen
los experimentos de competicion, al no introducir ecuaciones que contemplen explcitamente la
posibilidad de que las celulas sean coinfectadas por distintas variantes, se esta realizando la anterior
suposicion, es decir, el virus que replica a mayor velocidad es el de mayor tness. La velocidad de
replicaci on relativa de un virus y su tness relativa no son procesos necesariamente an alogos,
una suposicion erronea realizada por diversos autores (Bull y col. 2000; Maree y col. 2000). Si
fueran procesos an alogos, el resultado de medir los niveles de replicaci on de dos virus en cultivos
separados sera identico que al hacerlo en competicion. Sin embargo, la posibilidad de que las
celulas sean coinfectadas por distintas variantes existe en los experimentos en cultivos (Domingo
2007) y es habitual en infecciones in vivo (Jung y col. 2002). Dado que se han descrito interacciones
22
importantes, que pueden alterar el resultado de una competicion, en celulas que estan coinfectadas
por diferentes variantes virales (Baulcombe 1996; Bull y Molineux 1992; Chao 1997; Chao y Tran
1997; Gonzalez-Lopez y col. 2004; Grande-Perez y col. 2005b; Holland 1990; Novella y col. 2004;
Russel 1992; Sachs y Bull 2005; Turner y Chao 1998; Turner y Chao 1999; Wilke y col. 2004b; Perales
y col. 2007; Valcarcel y Ortin 1989; Holland y col. 1989), los ensayos de tness pueden concluir
resultados muy diferentes en funcion del grado de coinfecci on que se permita en el experimento.
2.2.3. Evoluci on de estrategias de tness virales: selecci on dependiente de densidad
Un conjunto de celulas, ya sea un organo, un tejido o una monocapa de celulas en cultivo, es
para el virus un recurso parcheado (discreto) cuya unidad funcional es la celula. La distribucion
parcheada de los recursos favorece la aparicion de diferentes adaptaciones, en funcion del modo en
el que se aprovecha el recurso. Existen modelos de ecologa te orica que predicen la especializacion
de individuos en dos estrategias basicas: colonizadores y competidores (Tilman 2007). Los coloniza-
dores son aquellos individuos con mayor capacidad de ocupar y agotar el recurso. Los competidores
son capaces de desplazar a otros individuos cuando compiten por un mismo recurso (May y Nowak
1994; May y Nowak 1995; Nowak y May 1994).
Aunque no se ha llegado a describir en detalle estas estrategias evolutivas en virus RNA, existen
evidencias de que los virus puedan adoptar diferentes tipos de adaptaci on en funcion de la densidad
de individuos (Turner y Chao 1999). La MDI en virologa corresponde al concepto ecologico de
densidad, en este caso del n umero de virus infecciosos por celula. Modulando la MDI en una
infecci on se puede modular el grado de coinfecci on de las celulas, y por tanto el grado de interacci on
o replicaci on individual de los virus dentro de una celula (Wilke y Novella 2003). En infecciones con
baja MDI (<1) los virus replican principalmente solos en las celulas. La probabilidad de coinfecci on
de una celula por dos o m as partculas aumenta con la MDI y, por tanto, la competencia intracelular
entre distintas variantes. Se han descrito experimentos con virus RNA que demuestran que al variar
la MDI, los virus evolucionan de manera diferente:
La primera observaci on se realiz o con el VFA (Sevilla y col. 1998b). Se infectaron cultivos
celulares con varias poblaciones a alta o baja MDI durante pases seriados. Posteriormente
estas poblaciones fueron competidas entre ellas. Se observ o que las poblaciones evolucionadas
en regmenes de alta MDI ganaban en competicion s olo cuando esta suceda a alta MDI,
mientras que las poblaciones evolucionadas a baja MDI, ganaban en competicion cuando
esta se realizaba con infecciones a baja MDI. Dado que con la MDI se modula el grado
de coinfecci on en un cultivo celular, es de suponer por un lado que las poblaciones virales
optimizaron la capacidad replicativa cuando replicaron aisladamente, y que por otro lado
optimizaron la competencia intracelular. Por tanto el experimento de Sevilla y colaboradores
fue la primera demostraci on de selecci on dependiente de densidad (SDD) en virus RNA.
Otras observaciones de SDD se realizaron con el rabdovirus VSV. Un experimento demostr o que
un virus de alto tness unicamente se seleccionaba durante infecciones realizadas a baja MDI.
En condiciones de alta MDI el virus permaneca en una proporci on baja en la poblacion, hecho
que se atribuyo a un efecto de supresi on de la poblacion (de la Torre y Holland 1990).
Otra serie de experimentos con VSV demostr o que la SDD tambien actuaba en unos clones
aislados en cultivos celulares (Novella y col. 2004). En este caso la SDD se atribuyo a que uno
de los virus presentaba un defecto en alg un producto genico, que era complementado por las
protenas aportadas en trans por el virus competidor, cuando coinfectaban la misma celula
(Wilke y col. 2004a; Wilke y col. 2006).
23
Experimentos con el bacteriofago 6 produjeron los mismos resultados que los citados para
VFA. Dos variantes virales que replicaron a alta o baja MDI, produjeron progenie que era
m as ecaz en las condiciones de densidad en las que haban replicado (Turner y Chao 1998).
La ventaja de los virus adaptados a replicar a alta MDI se atribuyo a que podan ser m as
ecaces explotando las protenas del virus competidor, adaptado a replicar a baja MDI, en
la que apenas se produce competicion intracelular. Por este motivo estos virus se estudiaron
desde el punto de vista del dilema del prisionero de la teora de juegos (Maynard Smith
1998). A los virus adaptados a alta MDI se les llamo desertores (que es una traduccion
erronea de defectors, mantenida historicamente), ya que aprovechan las protenas que el otro
virus comparte en el citoplasma como un cooperador (Nowak y Sigmund 1999; Nowak 2006).
Existen ciertos estudios te oricos que describen la evolucion de virus adaptados a la replicaci on
en coinfecci on o individualmente, que predice un estado de equilibrio entre las dos estrategias
replicativas (Bull y col. 2006).Otro estudio predijo que la replicaci on en presencia de coin-
feccion en el VIH, puede seleccionar virus con menor capacidad replicativa (Wodarz y Levy
2007).
La observaci on de casi identicos resultados en virus tan dispares, y con el mismo virus en
dos experimentos diferentes (de la Torre y Holland 1990; Novella y col. 2004), reeja el caracter
general del resultado que puede tener la adaptaci on de los virus RNA a replicar en un ambiente
parcheado. Aunque se hayan apuntado ideas (no demostradas) que expliquen el comportamiento
de los virus que replican a alta MDI, no existe ning un experimento ni propuesta de lo que sucede
con los virus que replican a baja MDI. En esta Tesis Doctoral propondremos la hip otesis de los
dos nichos ecologicos, que predice que en un ambiente parcheado, como lo es un grupo de celulas,
durante la replicaci on de virus RNA, estos adoptar an dos estrategias, aquella adaptada a competir
por el conjunto de las celulas (virus colonizadores) y aquella adaptada a competir por una celula
(virus competidores). Propondremos el caracter general de esta hip otesis, su posible relevancia in
vivo y la dependencia sensible de la densidad en la evolucion de estas estrategias, bas andonos en
experimentos y en un modelo matem atico.
2.3. Mutagenesis letal como estrategia antiviral
Los virus RNA, dada la elevada tasa de mutaci on durante su ciclo de replicaci on, viven en el
lmite entre la adaptaci on y la extinci on por la constante proximidad a la perdida de su informaci on
genetica (Domingo 2000; Biebricher y Eigen 2005; Eigen 1971; Swetina y Schuster 1982). La cercana
de estos virus al colapso genetico se quiso comprobar incrementando articialmente su tasa de
mutaci on con mutagenos qumicos (Holland y col. 1990) en un proceso que se ha denominado
mutagenesis letal (Loeb y col. 1999) (para revisiones lease Anderson y col. 2004; Domingo 2005;
Graci y Cameron 2004). El uso de mutagenesis incrementada se ha empleado ecientemente en
cultivos celulares para disminuir la carga viral o extinguir virus RNA de diversas familias como es
el caso del lentivirus VIH (Loeb y col. 1999; Tapia y col. 2005), con picornavirus como PV (Crotty y
col. 2000; Crotty y col. 2001), el VFA (Sierra y col. 2000; Pariente y col. 2003; Pariente y col. 2005;
Gonzalez-Lopez y col. 2004), con el arenavirus de la coriomeningitis linfocitaria de rat on (LCMV)
(Grande-Perez y col. 2002; Grande-Perez y col. 2005b), o Hantavirus (Severson y col. 2003; Jonsson
y col. 2005; Chung y col. 2007), entre otros.
Ciertos mutagenos pueden actuar in vivo reduciendo efectivamente la infectividad de virus, como
se demostr o para LCMV en infecciones en rat on (Ruiz-Jarabo y col. 2003). El an alogo de nucleosido
ribavirina (1--D ribofuranosil-1, 2, 3- triazol- 3 carboxamida) (R), se emplea habitualmente en el
tratamiento de la infecci on por el virus de la hepatitis C (HCV). Existen evidencias que sugieren
24
que la R pueda actuar como mutageno de HCV in vivo (Asahina y col. 2005), aunque tambien
existen estudios que sugieren otros mecanismos de actuacion (Chevaliez y col. 2007).
2.3.1. Evidencias experimentales de extinci on de VFA mediante mutagenesis letal
En nuestro laboratorio hemos empleado el VFA como sistema modelo para la mutagenesis letal,
sometiendo clones y poblaciones virales a tratamiento con 5-uorouracilo (FU), R, o 5-azacitidina
(AZC) (Domingo 2003; Pariente y col. 2005; Domingo 2005). Los agentes mutagenicos FU, AZC y
R, pueden producir la extinci on del virus durante infecciones citolticas o persistentes en cultivos
celulares (Sierra y col. 2000; Pariente y col. 2001; Pariente y col. 2003; Airaksinen y col. 2003).
Las principales conclusiones de la mutagenesis letal con virus RNA (incluyendo VFA, LCMV y
HIV) son las siguientes:
1. Una baja capacidad replicativa y bajas cargas virales favorecen la extinci on viral en presencia
del mutageno (Sierra y col. 2000; Pariente y col. 2001).
2. La combinacion de agentes mutagenicos con inhibidores de la replicaci on viral (FU, cloruro
de guanidinio, (G) y heparina, (H), en el caso de VFA, y 5-hidroxidesoxicitidina con AZT
en el caso de HIV-1) fue m as efectiva en provocar la extinci on del virus que los agentes
mutagenicos o inhibidores administrados aisladamente (Pariente y col. 2003; Tapia y col.
2005). En el proceso de extinci on viral la infectividad especca desciende entre 10
2
a 10
3
veces sin modicaci on de la secuencia consenso de la poblacion (Gonzalez-Lopez y col. 2005;
Grande-Perez y col. 2005a). En cambio, se producen aumentos en la complejidad del espectro
de mutantes, medida por comparacion de frecuencias de mutacion y entropa de Shannon
(Pariente y col. 2005).
3. El RNA preextincion (extrado de la ultima poblacion viral que presenta infectividad) inter-
ere con la infectividad del RNA infeccioso presente en la misma poblacion (Gonzalez-Lopez
y col. 2004).
4. Datos experimentales con LCMV, apoyados por un modelo matem atico, sugieren que el in-
cremento de mutagenesis favorece la aparicion de dominantes negativos (genomas defectivos
denominados defectores) que intereren con la replicaci on de virus competentes, acelerando
la extinci on. A este proceso se le ha llamado defecci on letal (Grande-Perez y col. 2005b).
En los experimentos con LCMV y VFA la accion de mutagenos elimin o la infectividad antes que la
capacidad de replicar (Grande-Perez y col. 2005b). Por tanto un mutante resistente a un mutageno
no necesariamente puede manifestar una ventaja replicativa sobre sus competidores no infecciosos.
Ello podra dicultar la selecci on de virus con mutaciones de resistencia a un mutageno, para las que
hay pocas descripciones (Young y col. 2003; Pfeier y Kirkegaard 2003). Un estudio reciente con
VFA ha detectado una serie de poblaciones capaces de resistir a la presi on mutagenica ejercida por
la R. Estas poblaciones presentaban una mutaci on de resistencia a R en la polimerasa (3D) del virus
(M296I), que se impone en la secuencia consenso (Sierra y col. 2007). En la presente Tesis Doctoral,
la serie evolutiva que dio lugar a poblaciones resistentes a R se analizar a bioinformaticamente, y se
investigar a la participacion del espectro de mutantes en el proceso de mutagenesis letal.
2.4. El virus de la ebre aftosa (VFA) como modelo
2.4.1. La ebre aftosa (FA)
La enfermedad de la FA fue descrita por primera vez en la India en 1025, y posteriormente
en el siglo XVI por el humanista italiano Girolamo Fracastorius (1546). En 1897 Loeer y Forsch
25
describieron, por primera vez que la etiologa de una enfermedad animal estaba causada por un
virus, o elemento ltrable, el VFA (Loeer y Frosch 1897). FA es una enfermedad infecciosa, de
diseminaci on y contagio muy rapido, que afecta a artiodactilos (animales de pezu na hendida),
fundamentalmente a ganado bovino y porcino. Es la enfermedad animal que causa m as perdidas
econ omicas en la ganadera. Como ejemplos, el brote de 2001 en el Reino Unido costo unos 6 billones
de libras y una falsa alarma de aftosa en EEUU que duro menos de 24h costo 50 millones de dolares.
El virus se transmite principalmente por la va fecal-oral, aunque existen m ultiples vas de
transmision, incluidas el contacto directo, transporte mecanico, aerosoles, ingestion, etc. El virus
penetra en el organismo a traves de los epitelios causando una infecci on aguda caracterizada por
ebre y ampollas o aftas, principalmente en lengua, boca y pezu nas. A pesar de que la enfermedad
cursa con una alta morbilidad, en animales adultos la mortalidad no suele superar el 5 %, mientras
que en animales jovenes afectados de miocarditis asociada al VFA, la tasa de mortalidad se aproxima
al 50 % (Sutmoller y col. 2003) (revisiones en Sobrino y col. 2001; Sobrino y Domingo 2004). Tras la
fase aguda de la enfermedad se puede establecer una infecci on persistente en rumiantes en la que el
virus persiste de forma asintom atica en el esofago y garganta por periodos prolongados de tiempo.
Estos animales portadores asintom aticos constituyen una reserva natural de virus muy extendida en
todo el mundo y se sospecha que pueden originar nuevos brotes de la enfermedad aguda en animales
sanos, dicultando a un m as el control de la enfermedad (van Bekkum y col. 1959; Pereira 1981;
Gebauer y col. 1988; Salt 1993; Salt 2004). Las estrategias de control de la enfermedad utilizadas
tradicionalmente se basan en la vacunacion sistematica de animales susceptibles. Sin embargo,
la continua aparicion de brotes del VFA en numerosas regiones del mundo, incluyendo aquellos
pases que fueron declarados libres de la enfermedad (por ejemplo en Taiwan, Jap on, Grecia, Reino
Unido)(Samuel y Knowles 2001) han resaltado la necesidad de adquirir un mejor entendimiento del
virus y su interacci on con el huesped, as como del desarrollo de vacunas m as ecaces.
2.4.2. Organizaci on gen omica y protenas codicadas por el virus de la ebre aftosa
El VFA pertenece al genero aftovirus de la familia Picornaviridae y orden Picornavirales, posee
un genoma RNA de cadena simple y de polaridad positiva de alrededor de 8 Kb de longitud,
envuelto en una capsida icosaedrica desnuda (sin envuelta lipdica) (Figura 4). El peptido viral
VPg (codicado por 3B), act ua como cebador en la iniciaci on de la replicaci on de los picornavirus
(Paul y col. 1998; Ferrer-Orta y col. 2006a; Paul y col., 1998; Paul, 2002; Nayak y col., 2005). La
replicaci on del RNA esta catalizada por una RNA polimerasa RNA-dependiente (RpRd, abreviada
como 3D) codicada por la regi on 3D del genoma. La baja delidad de copia de esta protena es el
origen de la variabilidad genetica del VFA (Ferrer-Orta y col. 2006b). Se han descrito siete serotipos
distintos del VFA (A, O, C, Asia1, SAT1, SAT2 y SAT3), m as de 65 subtipos y numerosos variantes
antigenicos (Knowles y Samuel 2003; Pereira 1977; Mateu y col. 1988; Carrillo y col. 2005). La
elevada variabilidad natural del VFA constituye uno de los principales obst aculos para el control de
la enfermedad por vacunacion (Barteling 1987; Domingo y col. 1980; Domingo y col. 1990; Domingo
y Holland 1992; Sobrino y Domingo 2004; Domingo y Holland 1992).
El virus de referencia empleado en nuestro laboratorio es el C-S8c1. Es un clon biol ogico puri-
cado de aftas de un cerdo enfermo (Sta. Pau, Girona,1970) tras dos clonajes sucesivos en cultivos
celulares (Sobrino y col. 1983). Pertenece al subtipo europeo C1 dentro del serotipo C. El genoma
del VFA C-S8c1 tiene 8115 nucleotidos de longitud, sin contar los tramos homopolimericos de po-
lirribocitidilato (poliC) y poliadenilato (poliA), que son heterogeneos en longitud (Escarms y col.
1992; Escarmis y col. 1996; Toja y col. 1999)(Figura 5)
26
Bucle GH
VP2
VP1
VP3
Figura 4: Organizaci on gen omica y estructura de la partcula del virus de la
ebre aftosa (VFA). El genoma de VFA se organiza en una regi on codicante de
una unica poliprotena viral anqueada por dos regiones no codicantes 5 UTR en el
extremo 5 y 3 UTR en el extremo 3 del genoma con un poli A terminal (AA..A).
La regi on 5 UTR presenta un sitio interno de uni on al ribosoma (IRES), encargado de
reclutar el ribosoma celular. Tras el procesamiento de la poliprotena viral se generan las
protenas estructurales (P1) y no estructurales (P2 y P3). Tambien se libera la proteasa
lder (L). El peptido VPg (3B) esta unido covalentemente al extremo 5 del genoma. B)
Esquema de la capsida de VFA. La partcula viral presenta una capsida icosaedrica y se
constituye por el ensamblaje de 12 pentameros alrededor del genoma. Cada pentamero
esta formado por 5 protomeros biol ogicos producidos tras la sntesis y procesamiento
de la poliprotena viral. Cada protomero contiene una unidad de las protenas de la
capsida: VP1, VP2, VP3 y VP4 que esta en la cara interna y no se representa. C)
Representaci on de la estructura tridimensional de un protomero biol ogico de FMDV
con el bucle GH expuesto.
27
2.4.3. Estructura de la partcula de VFA y entrada en la celula
La partcula del VFA esta formada por cuatro protenas (VP1, VP2, VP3, VP4) que forman
los monomeros basicos de la capsida viral (Figura 4) (Acharya y col. 1989; Lea y col. 1994).
Las protenas VP2, VP3 y VP1 (tambien denominadas 1B, 1C y 1D, respectivamente) forman la
supercie externa de la estructura. La protena VP4 (1A), que se encuentra miristilada, forma la
supercie interna de la capsida y esta en contacto con el genoma viral, que esta muy compactado
en el interior de la partcula (Acharya y col. 1989; Belsham y Martnez-Salas 2004).
El VFA reconoce a las celulas diana a traves del triplete de amino acidos RGD en el bucle GH de
la protena VP1 de la capsida. Este triplete se une a una serie de integrinas que act uan de receptores
celulares (v1, v3, v6, v8)(Burman y col. 2006; Jackson y col. 2004; Baranowski y col.
2003; Baxt y Rieder 2004). Este bucle de uni on al receptor coincide con el sitio antigenico principal
de VFA (sitio A) (Mateu y col. 1996; Mateu y Verdaguer 2004; Verdaguer y col. 1994; Verdaguer
y col. 1995) (Figura 4). En poblaciones de VFA adaptadas a replicar en cultivos celulares tras
pases seriados, se han descrito el uso de receptores alternativos al estandar (Jackson y col. 1996;
Baranowski y col. 2000). La estructura cristalina de la partcula viral revelo que el bucle GH
esta desordenado, muy expuesto y es exible (Acharya y col. 1989; Verdaguer y col. 1999) (Figura
4), con el motivo RGD conservado rodeado de amino acidos altamente variables.(Carrillo y col. 2005;
Domingo y col. 2004).
2.4.4. Traducci on del genoma viral y procesamiento proteoltico de la poliprotena
viral
El genoma de VFA se traduce de manera independiente de cap a partir de un sitio interno de
entrada del ribosoma (IRES) que presenta una compleja estructura secundaria, y es capaz de unirse
al ribosoma (Martinez-Salas 2008; Martinez-Salas y col. 2008). La sntesis de la poliprotena viral
se produce a partir de 2 codones de iniciaci on diferentes (en la misma fase de lectura) y generan
dos proteasas lider (L) de distinto tama no, Lab y Lb, que se separan del resto de la poliprotena
por su autoprocesamiento en cis. La proteasa L procesa un factor celular de inicio de la traduccion
(eIF4G) (Martnez-Salas y col. 2001; Belsham y Martnez-Salas 2004) de manera que el ribosoma
no puede reconocer la estructura cap de los RNA celulares, impidiendo, por tanto, la traduccion
de mensajeros celulares.
Toda la regi on codicadora se traduce de manera seguida generando una poliprotena que se
procesa principalmente por la accion de la proteasa 3C, liberandose las distintas protenas virales
maduras (Figura 5). La proteasa 3C participa adem as en el procesamiento del factor de la traduccion
eIF4G ayudando a la sntesis independiente de cap (Belsham y col. 2000). Hay 10 cortes proteolticos
en la poliprotena viral producidos por 3C y otros 3 cortes que no son producidos por 3C (Figura
5). El primero es el autoprocesamiento de la proteasa L. El segundo, entre 2A y 2B, no es un corte
proteoltico, sino que 2A impide la formacion del enlace peptdico que une 2A con 2B (Ryan y col.
2004; Donnelly y col. 2001). Tras el procesamiento por L y 2A se genera el precursor P1-2A. El
procesamiento proteoltico de la proteasa 3C libera el peptido 2A y corta P1 en VP0 (VP4-VP2),
VP3 y VP1. Los pentameros se ensamblan alrededor del genoma y ello produce el tercer corte en la
poliprotena independiente de 3C, el procesamiento de VP0 en VP4 y VP2. Este corte resulta en la
maduracion de la capsida (Rowlands 2003; Sobrino y Domingo 2004). El resto de cortes proteolticos
en la poliprotena viral se producen por la accion de 3C (Figura 5).
28
2
A
3
B
L 1B 1C 1D 2B 2C 3A 3C 3D
VPg A(n)
IRES
1
A
A
L P1-2A 2BC P3
B
P1-2A 2BC P3
3CD 3AB
1
3A
VPg
1 2 3
3D
pro
pol
3C
pro
2C 2B
C
1
2
3
VP0 VP3 VP1
PSEUDO-
NUDOS
CRE
Figura 5: Representaci on esquematica del procesamiento de la poliprotena
viral. A) Esquema del genoma de VFA. B) Se representan los 3 precursores intermedios
que se generan tras la sntesis de la poliprotena viral. Se producen tres procesamientos
en cis a medida que se sintetiza la poliprotena. La separaci on entre L y P1-2A se produce
por el corte de L sobre si misma. El corte entre P1-2A y 2BC se produce por un salto
de la sntesis mediado por 2A. El corte entre 2BC y P3 se produce por 3C. C) Los
3 polipeptidos obtenidos tras la sntesis de la poliprotena viral (1) se procesan dando
lugar a los diferentes peptidos y protenas maduras (3). Algunos productos intermedios
del procesamiento, como 3AB1 y 3CD son de gran relevancia en el ciclo de infecci on
del virus. El procesamiento en trans se produce por la proteasa 3C madura, aunque
tambien pueden mostrar actividad proteasa algunos de sus precursores.
29
2.4.5. Replicaci on del genoma de VFA y de otros picornavirus
El RNA de todos los picornavirus se copia por la accion de la RNA polimerasa RNA-dependiente
(RpRd), codicada en la regi on 3D del genoma (Cameron y col. 2002; Ferrer-Orta y col. 2006b;
Ferrer-Orta y col. 2004). En el VFA, la regi on 3B codica para 3 VPg diferentes que act uan como
cebador en el inicio de la replicaci on (Paul y col. 1998; Ferrer-Orta y col. 2006a). Durante el inicio de
la sntesis de la cadena positiva se requiere la actuacion de la regi on genomica cre u ori I (elemento
de replicaci on en cis) como molde del proceso de uridilaci on de VPg. La molecula 3CD estimula
esta reacci on (Paul y col. 2000; Paul y col. 2003; Yin y col. 2003). Sin embargo, no se requiere la
presencia de cre en la iniciaci on de la sntesis de la cadena negativa (Murray y Barton 2003). El
elemento cre se encuentra en la regi on no codicante del extremo 5 del genoma, justo antes del
dominio conservado 1 del IRES. (Figura 5; Belsham y Martnez-Salas 2004).
Hay evidencia de que la replicaci on del genoma en picornavirus esta asociada a la cara cito-
plasm atica de la membrana del retculo endopl asmico, con 3D reclutada en la membrana por el
polipeptido 3AB (Lyle y col. 2002b; Paul 2002). Se ha propuesto un modelo en el que un tapiz
de polimerasas estara recubriendo la membrana externa del retculo endoplasmatico de celulas
infectadas formando una malla cataltica (Lyle y col. 2002a).
2.5. Vacunacion frente a la ebre aftosa
Poco despues desde la descripci on de Loeer y Frosch de la etiologa viral de la FA, se abord o la
preparacion de una vacuna que conriera protecci on frente a la enfermedad. Intentos de aislar una
cepa atenuada o de atenuar el virus mediante pases en cultivos celulares fracasaron ya que el virus
continuaba siendo virulento, o cambiaba sus propiedades antigenicas (Barteling 2004). Por este
motivo, y hasta el da de hoy, las vacunas m as efectivas contra la FA han sido las vacunas fabri-
cadas con virus vivo e inactivado qumicamente. Se han realizado adem as diversas aproximaciones
experimentales, como vacunas vivas atenuadas o basadas en peptidos.
2.5.1. Vacunas inactivadas
La vacuna contra VFA se prepara por infecci on de celulas BHK-21 a nivel industrial (Stoker
y Macpherson 1964). Para cada serotipo se elige una muestra viral diferente, a ser posible inmu-
nodominante (Rweyemamu 1978). El virus se inactiva con etilenimina binaria (BEI), m as efectiva
que el formaldehdo (Bahnemann 1990). Conjuntamente se suministra un adyuvante, actualmente
se utiliza la saponina o el adyuvante incompleto de Freund (Freund y Thomson 1945).
La protecci on de la vacuna inactivada generalmente no alcanza el 100 %. Adem as, la duraci on de
la inmunidad es muy limitada (Doel 2003), por lo que se suministran varias dosis de recuerdo de la
vacuna. Tpicamente se vacuna dos veces al animal, con un espacio de un mes de separaci on, y luego
se puede vacunar durante cada a no. Las vacunas vivas atenuadas contra otros picornavirus, como
el PV, producen inmunidad duradera y han permitido la erradicaci on de la poliomelitis en varias
zonas del mundo (Murdin y col. 1996). La vacuna inactivada de la FA s olo protege, generalmente,
contra el serotipo contra el que esta preparada.
2.5.2. Vacunas basadas en peptidos o protenas expresadas por vectores
Las vacunas basadas en peptidos consisten en suministrar al animal peptidos que incluyen de-
terminantes antigenicos del VFA (Rowlands 2004). El VFA posee un sitio antigenico mayoritario
(Acharya y col. 1989; Strohmaier y col. 1982; Rowlands y col. 1983), el denominado bucle GH, alta-
mente expuesto en la supercie del virion, implicado en la neutralizaci on del virus por anticuerpos
30
(Figura 4) (Verdaguer y col. 1997; Verdaguer y col. 1995). Se han probado vacunas experimen-
tales que incluan ese y otros peptidos aislados o conjugados a diferentes protenas (DiMarchi y
col. 1986; Ruppert y col. 1994), peptidos expresados por vectores (Moraes y col. 2002; Qian y col.
2004; Grubman 2005; Ren y col. 2008), o capsidas vacas de VFA (Clarke y col. 1987). El principal
problema de las vacunas basadas en peptidos es la falta de estimulacion de una respuesta inmune
potente y duradera y la facilidad de escape del virus a este tipo de vacunas (Taboga y col. 1997).
2.5.3. Vacunas vivas atenuadas
Las vacunas vivas tpicamente coneren una inmunidad muy eciente, ya que los antgenos
del virus mantienen su conformaci on nativa, y la replicaci on intracelular estimula la respuesta
inmune celular. Esta ultima tiene mayor relevancia de lo que inicialmente se supuso en el control
de la FA (McCullough y Sobrino 2004). Recientemente, basado en el clon infeccioso del VFA, se
ha dise nado por genetica reversa un virus con la proteasa L completamente delecionada capaz de
replicar (Piccone y col. 1995). La inoculaci on de este virus en ganado vacuno no desencaden o la
enfermedad y conri o una protecci on similar que la inoculaci on del mismo virus inactivado con
BEI (Mason y col. 1997). Cerdos vacunados con este virus tambien presentaron una protecci on
parcial (Chinsangaram y col. 1998). En otra aproximacion, se inocularon cerdos con un pl asmido
recombinante que codicaba el genoma del VFA sin el dominio de uni on a la celula. De este modo,
la expresi on del pl asmido produca progenie viral, pero esta no era capaz de realizar una segunda
ronda de infecci on. Sin embargo, la protecci on conferida por la vacuna fue limitada. No existe hasta
la fecha, por tanto, ninguna aproximacion vacunal realmente satisfactoria en cuanto protecci on y
seguridad de virus vivos atenuados del VFA. Parte del trabajo de esta Tesis Doctoral consistio en
explorar el empelo del VFA segmentado (poblacion C-S8p260 descrita en 2.6.5) como nueva vacuna
frente a la FA. Para ello se emplearon ratones adultos C57/BL6 susceptibles a la infecci on por el
VFA (Salguero y col. 2005).
2.6. Partculas defectivas interferentes (DIs)
En 1970 Huang y Baltimore propusieron por primera vez el termino partcula defectiva interfe-
rente (DI), reriendose a aquellas partculas virales que carecen de parte del genoma viral (DNA o
RNA), que son empaquetadas dentro de las protenas estructurales del virus, pero que necesitan la
presencia de un virus estandar (ST) que act ue de donador de protenas (helper) para su replicaci on
y encapsidacion. (Huang y Baltimore 1970). Las primeras evidencias de la presencia de partculas
DIs fueron descritas para el virus de la gripe (von Magnus 1954) y para VSV (Bellet y Cooper
1959).
2.6.1. Generaci on de las partculas DIs
Las partculas DIs de virus RNA animales se originan por recombinaciones del genoma viral
como resultado del salto de la replicasa viral de un molde RNA viral a otro, o de una regi on de un
molde a otra de la misma molecula, mecanismo denominado cambio de molde (o salto de hebra,
copy-choice; Figura 6) (Huang y Baltimore 1977; Leppert y col. 1977; Lazzarini y col. 1981; Perrault
1981b; Kirkegaard y Baltimore 1986a). Otros mecanismos, como eventos de splicing aberrantes,
podran a veces estar implicados (Holland 1992). Las DIs se seleccionan durante pases seriados de
virus en cultivos a alta MDI, dado que as se favorecen las coinfecciones. Por el contrario, pases de
virus a baja MDI eliminan las DIs presentes en una preparaci on viral (Stampfer y col. 1971; Holland
y col. 1976; Garcia-Arriaza y col. 2004). Las DIs generalmente son indistinguibles del virus estandar
infeccioso en tama no y apariencia, sin embargo, en alg un sistema viral como VSV, el tama no suele
31
GenomaST
DI tipodelecininterna
3' 5'
5'
ATC TAG
DI tipoSTEM
3'
5'
3'
5'
3'
3'
5'
5'
DI
3' 5'
5'
5'
5' 3'
A
B
C
D
Figura 6: Representaci on esquematica de la generaci on de partculas DIs me-
diante el mecanismo de cambio de molde (copy-choice). Se representa mediante
lneas negras el molde de RNA de polaridad positiva y mediante lneas grises el RNA
de polaridad negativa. La replicasa se esquematiza en amarillo. La replicasa inicia la
sntesis de la cadena negativa sobre un molde de polaridad positiva (A). Posteriormen-
te, la replicasa se cae del molde (B) llevando consigo la hebra naciente de RNA, para
reiniciar la sntesis de la cadena negativa en alg un lugar de un molde diferente donde
puede existir cierta homologa de secuencia (zonas rojas); (C) de este modo se genera
un genoma RNA defectivo con una delecion interna (D). Si la polimerasa salta hacia
atr as genera repeticiones (no representado en la gura). Si copia sobre la hebra naciente
(D) genera DIs del tipo stem o snapback. Cuando la polimerasa realiza m ultiples saltos
se generan partculas DIs tipo mosaico. Basado en (Holland 1990; Lazzarini y col. 1981;
Perrault 1981b).
ser entre el 10 % y el 60 % del tama no estandar. En virus de simetra icosaedrica el tama no de los
genomas defectivos viene restringido por los requerimientos de empaquetamiento por capsidas de
tama no estandar, de modo que s olo un rango limitado de tama no de moleculas de RNA defectivas
puede encapsidarse (Cole 1975; Lundquist y col. 1979; McClure y col. 1980).
2.6.2. Tipos de partculas DIs
Las partculas DIs se han clasicado en 4 tipos diferentes en funcion de su estructura: (i)
partculas DIs con el extremo 5 conservado tipo stem y tipo snapback o hairpin, por ejemplo en
VSV (Lazzarini y col. 1975); (ii) partculas DIs con el extremo 3 conservado (por ejemplo virus
Sindbis (Weiss y col. 1974); (iii) partculas DIs con delecion interna, iv) partculas DIs tipo mosaico,
que muestran complejos reordenamientos internos debidos a m ultiples recombinaciones (Perrault y
Holland 1972).
32
2.6.3. Presencia de partculas DIs en los diferentes sistemas virales
Se ha descrito DIs tanto en virus RNA como en virus DNA (revisiones en Barrett y Dimmock
1986; Holland 1990; Schlesinger 1988). En virus RNA de cadena positiva, se han descrito DI mosaico
en alfavirus, DI por delecion interna en coronavirus y reovirus. Se han descrito DI en picornavirus
como PV (Cole y Baltimore 1973c; Cole y col. 1971), virus Mengo (McClure y col. 1980), virus de
la encefalomiocarditis murina (Radlo y Young 1983) y virus de la hepatitis A (Nuesch y col. 1988)
entre otros. Deleciones en la zona 5 del genoma del virus de Coxakie aumentaron su virulencia
(Kim y col. 2005). Las DI de PV son mutantes de delecion interna y siempre se localiza en la
zona que codica las protenas de la capsida (Lundquist y col. 1979; Nomoto y col. 1979). Se ha
observado que no todas las deleciones son igualmente viables, a pesar de mantener la pauta de
lectura (Lundquist y col. 1979).
2.6.4. Caractersticas biol ogicas de las partculas DIs
Cole y Baltimore distinguieron los procesos de interferencia y enriquecimiento para explicar la
imposicion de las DI sobre el virus ST(Cole y Baltimore 1973b; Cole y Baltimore 1973c). Esta
distincion de dos procesos moleculares no es posible separarla completamente, pues los mecanismos
que dan lugar al enriquecimiento de las DI son, en ciertos virus, parte de la razon de la interferencia.
Intereferencia. Los virus defectivos intereren con el virus ST homologo, al aprovechar las pro-
tenas que codica, principalmente estructurales. Es necesario que las deleciones esten en fase y que
el virus defectivo codique sus protenas propias de replicaci on para que se produzca una interfe-
rencia (Hagino-Yamagishi y Nomoto 1989). No hay evidencias moleculares s olidas que demuestren
que las DIs sean m as ecientes aprovechando las protenas suplementadas en trans, por el contrario
la producci on viral es muy similar en las DI y en el virus ST de RNA de cadena positiva (Cole y
Baltimore 1973b; Cole y Baltimore 1973c; Logan y col. 1993).
Enriquecimiento. Una vez aparecen las DI en una poblacion viral, estas se amplican y pueden
desplazar progresivamente al virus ST. No existe un mecanismo general por el cual las DI se
enriquecen en una poblacion viral, de hecho ese mecanismo contin ua hoy siendo desconocido en
la mayora de sistemas virales. En el caso de VSV bastan dos pases a alta MDI para generar
un exceso de partculas DIs que disminuyen la producci on de virus estandar un 99,9 % (Huang y
Baltimore 1970). En PV y otros picornavirus el enriquecimiento en DIs es unicamente del orden
del 10 % en cada pase (Cole y Baltimore 1973a; McClure y col. 1980). Adem as, el proceso de
enriquecimiento parece ser especco del tipo de sistema viral. Virus de cadena negativa tienen
delecionadas secuencias en las zonas del genoma responsables de la iniciaci on de la transcripcion.
Estas DIs replican sin realizar el proceso de transcripci on, utilizando las protenas expresadas por
la transcripci on y traduccion del genoma ST. De este modo, en celulas coinfectadas por virus
defectivo y ST se produce un enriquecimiento preferencial en genomas DI. Los DI de papovavirus
como el SV40 tienen duplicaciones en el sitio de origen de replicaci on del DNA. Se cree que esta
caracterstica hace que se copien preferencialmente y posteriormente puedan ser encapsidados por
las protenas del virus ST.
En virus con deleciones internas, que son las DI mayoritarias, como las que presentan los virus
de RNA de cadena positiva, no tienen afectadas las zonas implicadas en la replicaci on que expliquen
su mecanismo de interferencia. Experimentos con PV demostraron que tanto la sntesis de RNA
como la de protenas seguan una cinetica paralela a la del virus ST (Cole y Baltimore 1973c; Cole
33
y Baltimore 1973b; Lundquist y col. 1979). No se ha podido demostrar tampoco que las DI sean
m as efectivas encapsidandose o aprovechando las protenas del virus ST (Barclay y col. 1998b).
Evoluci on y fen omenos cclicos. En las cuasiespecies a menudo aparecen virus mutantes que
muestran m as resistencia que el virus inicial a la interferencia producida por los genomas DIs
(Jacobson y Pfau 1980; Horodyski y Holland 1980; Weiss y col. 1983; Cave y col. 1985; Huang
1988; Bangham y Kirkwood 1993). Se produce por tanto una coevolucion entre DI y ST de modo
que ocurren ciclos de aparicion de DI, seguido de la selecci on de virus ST resitentes a la interferencia
de las DI, nueva selecci on de DI interferentes, y as continuadamente (Horodyski y col. 1983;
DePolo y col. 1987; Palma y Huang 1974; Kirkwood y Bangham 1994b). Esta din amica evolutiva
constituyo una de las primeras evidencias de la importancia biol ogica de la variacion genetica,
competicion y selecic on (Holland y col. 1982).
Modulaci on de los procesos de enfermedad viral y persistencia vrica. Las partculas
DIs pueden modular y proteger de los efectos de la infecci on por virus ST, tanto en animales como
en plantas (revisiones en Holland 1987; Holland 1990; Huang 1988; Roux y col. 1991a; Bean y col.,
1985), aunque se desconoce si es debido a su accion interferente o por estimulacion del sistema
inmune (Barrett y Dimmock 1985; Johnston 1981; Marcus y Gaccione 1989).
Las partculas DIs pueden facilitar el establecimiento de infecciones persistentes de celulas en
cultivo o in vivo, disminuyendo la muerte celular inducida por virus (Huang y Baltimore 1977;
Perrault 1981b; Schlesinger 1988), reduciendo los rendimientos virales, incluso facilitando en algunos
casos la completa eliminacion del virus por parte del sistema inmune (Spandidos y Graham 1976;
Cave y col. 1985).
2.6.5. Deleciones internas en VFA. Implicaci on en la evoluci on de la segmentaci on
viral
En esta Tesis Doctoral, aunque estrictamente no corresponden a la denicion clasica de DIs,
se aborda el estudio de formas variantes del VFA caracterizadas por la presencia de deleciones
internas.
Durante pases seriados a alta MDI del clon de VFA C-S8c1 en cultivos de celulas BHK-21, se
acumularon en el pase 143 genomas con deleciones internas localizadas en la zona que codica la
proteasa L (417 y 402; Figura 7) (Charpentier y col. 1996b). En pases sucesivos se detectaron
nuevos virus con genomas con deleciones internas en fase (999 y 1017) que mapeaban en la
zona de la capsida. Los genomas 999 y 1017 se detectaron siempre junto con el genoma 417.
En el pase 260 no se pudo detectar el genoma ST mediante RT-PCR. La poblacion C-S8p260, por
tanto, esta compuesta mayoritariamente por dos tipos partculas con RNAs con deleciones internas
en fase, en la zona que codica para la proteasa L y para la capsida. Estos dos tipos de RNA, al
coinfectar una misma celula, resultaron ser infecciosos mediante complementaci on en ausencia de
virus ST, como lo indica: (i) la cinetica de doble impacto de muerte celular (Figuras 7-C y 8);
(ii) la presencia de genomas defectivos y cantidades indetectables de genoma ST en placas de lisis
individuales formadas en infecciones de monocapas celulares; (iii) la observaci on de muerte celular
y rescate de virus con deleciones internas (sin virus ST) tras co-electroporacion de los genomas
999 y 417 sintetizados in vitro (Garcia-Arriaza y col. 2004).
An alisis mediante microscopa electronica demostraron que los genomas defectivos de C-S8p260
se encapsidan en partculas virales individuales indistinguibles de las del virus ST (Figura 9). Tras
tres pases seriados a baja MDI disminuye la probabilidad de coinfecci on con los dos tipos de genomas
y se selecciona el virus ST C-S8p260p3d, que procede de la recombinacion de los genomas 417
34

C-S8c1 C-S8p143
...
st
L P1 P2 P3
st
417
402
C-S8p260
417
1017
999
st
C-S8p260p3d
C-S8p50
C-S8p100
C-S8p143
C-S8p200
C-S8p260p3d
C-S8p260417
C-S8p260999
P1 P2 P3
AUG
L VP4 VP2 VP3 VP1
2A
2B 2C 3A
3B
3C 3D pol
B
A
C
3UTR
C-S8p2601017
Figura 7: Evoluci on del clon de VFA C-S8c1 hacia genomas segmentados que
son infecciosos por complementaci on. A) Esquema de pases citolticos del clon
C-S8c1 en cultivos celulares. El cuadrado negro representa el clon biol ogico inicial C-
S8c1. Los crculos blancos representan poblaciones virales. Las echas grises representan
pases en cultivos celulares sin diluir el virus. Las echas delgadas representan pases con
virus diluido. La p detr as de C-S8 indica el n umero de pases al que fue sometida
la poblacion. Los genomas presentes en cada poblacion se representan encima de cada
poblacion. Las deleciones se marcan en las zonas correspondientes de cada genoma con
cajas de color. B) Esquema del genoma de VFA como en la Figura 4. Debajo del genoma
se representa con lneas la secuencia consenso del genoma de las poblaciones indicadas a
la derecha. Las lneas verticales negras representan una mutaci on jada en la poblacion.
Las lneas rojas representan mutaciones presentes en mezcla en la secuencia consenso.
C-S8p260417, C-S8p260999, C-S8p2601017 son los tres genomas con deleciones
internas integrantes de la poblacion C-S8p260. C-S8p260p3d es un genoma que surge
por recombinacion de los genomas C-S8p260999, C-S8p260417, en la zona que une
los dos genomas con lneas discontinuas. C) Cinetica de doble impacto de la poblacion
C-S8p260. La gr aca representa un ensayo de virulencia, medida como el n umero de
partculas virales necesarias para matar 10
4
celulas BHK-21. Las poblaciones virales se
detallan en Materiales y metodos (apartado 4.2). Las poblaciones ST (C-S8c1, MARLS,
C-S8p260p3d) presentan una cinetica logartmica de muerte celular; la poblacion C-
S8p260 presenta una cinetica potencial o de doble impacto (basado en Garcia-Arriaza
y col. 2004; Manrubia y col. 2006).
35
REGI

ON
a
CS8p260
C-S8
p50
b
C-S8
p100
C-S8
p143
C-S8
p200
417 999 1017
C-S8
p260p3d
aa
change
c
Fragmento S C247U C247U C247U C247U C247U C247U C247U
C338U C338U C338U C338U C338U C338U C338U
Pseudonudos
U467C/U
d
ND
G476A G476A G476A G476A G476A G476A ND G476A
C511U/C ND
ND U518C
IRES U856C U856C U856C U856C U856C U856C ND U856C
ND U1008C
Proteasa L A1043G * N2S
(1039-1641) G1066G/U G1066U G1066U V10L
G1091U R18I
C1105C/U C1105U P23S
A1154A/U 417 K39M
C1158C/A 417 =
C1180C/U 417 C1180U C1180U H48Y
417 =
A1628U A1628U A1628U Q197L
A1640G/A K201R
VP4 A1810G/A A1810G T57A
(1642-1896)
VP2 C2202U 1017 C2202U =
(1897-2550) C2250U 1017 =
G2285A 1017 G130D
VP3 U2622C 1017 =
(2551-3207) C2624U C2624U C2624U C2624U C2624U 1017 C2624U A25V
G2763U 1017 R71S
C2897U/C 999 1017 A116V
C3064G/C C3064G 999 C3064G C3064G H172D
G3067A G3067A G3067A G3067A G3067A 999 G3067A G3067A E173K
999 U3157C S203P
C3202A C3202A C3202A C3202A C3202A 999 C3202A C3202A Q218K
VP1 A3328G A3328G A3328G A3328G 999 A3328G A3328G K41E
(3208-3828) A3344G/A A3344G/A A3344G 999 A3344G A3344G D46G
U3345A * 999 D46E
U3387C/U U3387C 999 U3387C U3387C =
U3433C U3433C 999 U3433C U3433C =
A3668G/A * 999 H154R
U3753C/U 999 ND U3753C =
A3797A/G A3797G A3797G A3797G A3797G A3797G ND A3797G H197R
2B A4036G/A A4036G A4036G ND A4036G T52A
(3883-4344)
2C G4583A G4583A G4583A G4583A ND G4583A S80N
(4345-5298) G4650A * ND =
C4748U/C C4748U/C C4748C/U * ND T135I
C4824U/C C4824U/C ND C4824U =
A5110G A5110G A5110G A5110G ND A5110G T256A
G5133C G5133C G5133C G5133C ND G5133C Q263H
A5191G/A A5191G A5191G ND A5191G M283V
ND C5214U =
G5295A * ND =
3A U5454C/U U5454C/U U5454U/C ND U5454C =
(5299-5757) A5524G * ND I76V
A5606G/A A5606G/A A5606G ND D103G
A5713G * A5713G/A A5713G/A ND A5713G N139D
3C U6372C * ND =
(5971-6609)
3D
U6789U/C
U6789U/C
ND U6789C =
(6610-8022) U6903C * ND =
G7554U G7554U G7554U * ND =
3UTR ND
Tabla 1: Mutaciones respecto al clon CS8c1 de poblaciones de VFA tras pases citolticos
en cultivos celulares. Los residuos genomicos se numeran seg un (Escarms y col. 2006). Las
mutaciones que aparecen en mezcla en las secuencias se indican entre parentesis. En el genoma
CS8p2601017 s olo se secuenciaron los nucleotidos 1 a 367, y 1031 a 3697. ND, no determinado.
a
Zonas reguladoras y protenas codicadas en el genoma de VFA. Se indican las posiciones inicial
y nal de cada regi on en el genoma.
b
Las poblaciones virales se denominan con C-S8 seguido el n umero de pases en cultivos celulares.
c
=, mutaci on sinonima.
d
Mutaci on en mezcla en la poblacion.
indica la reversi on de una mutaci on.
36
C-S8p260p3d C-S8p260999 C-S8p260417 C-S8p260
Figura 8: Esquema de la infectividad de las poblaciones C-S8p260p3d y C-
S8p260. El virus C-S8p260p3d contiene un genoma de tama no estandar y es capaz
de completar independientemente el ciclo de replicaci on. Los virus C-S8p260417 y C-
S8p260999 no pueden completar el ciclo de replicaci on independientemente, pero s lo
hacen por complementaci on en celulas coinfectadas por los dos tipos de virus (basado
en Garcia-Arriaza y col. 2004).
y 999 (Figura 7) (Garcia-Arriaza y col. 2004). Por este motivo el virus C-S8p260p3d comparte
el contexto genetico con la poblacion de virus defectivos (Figura 7, Tabla 1), y sirve como virus
de referencia para investigar las diferencias entre una poblacion ST y otra dominada por RNAs.
Tras los 260 pases en cultivo la poblacion C-S8p260 acumul o un total de 32 mutaciones, repartidas
a lo largo del genoma como muestra la Figura 7 y la Tabla 1. La inuencia de esas mutaciones en
la evolucion hacia la segmentaci on son objeto de estudio en esta Tesis Doctoral.
2.6.6. Origen de la segmentaci on viral
Se han descrito dos tipos de virus RNA con genoma segmentado: los virus multipartitos que
encapsidan cada parte del genoma en una partcula diferente, y los virus segmentados sensu estricto
como el virus de la gripe que encapsidan todos los genomas en un mismo virion (Flint y col. 2004;
Fauquet y Fargette 2005). Los virus multipartitos son tpicos de los virus que infectan plantas,
de las superfamilias virales picorna-like y alpha-like. Durante la infecci on en plantas se producen
elevados ttulos que permiten la complementaci on entre los distintos segmentos.
Mediante tecnicas de recombinacion in vitro se han generado versiones segmentadas de virus
RNA no segmentados. As un replic on del virus Sindbis se encapsido junto con una partcula
defectiva natural del mismo virus dado que los dos genomas mantenan los orgenes de replicaci on
y las se nales de encapsidacion (Geigenm uller-Gnirke y col. 1991). Tambien se construy o un virus
Sindbis con el genoma tripartito, que encapsidaba cada segmento en partculas diferentes (Fayzulin
y col. 2005). Se ha descrito un virus del sarampi on con tres segmentos encapsidados en la misma
partcula, que replicaba ecientemente (Takeda y col. 2006). El virus de DNA SV40 evoluciono en
cultivos celulares espontaneamente hacia dos genomas defectivos que codicaban las zonas 5 y 3
37
100nm
100nm
A B
Figura 9: Imagenes de microscopa electr onica de las poblaciones virales C-
S8p260 y C-S8p260p3d. Las dos electromicrografas muestran las partculas virales
presentes en ambas poblaciones y fueron tomadas a 25.000 aumentos mediante tin-
ci on negativa con acetato de uranilo. El tama no medio de las partculas virales es de
300,1nm. A) C-S8p260. B) C-S8p260p3d. Basado en (Garcia-Arriaza y col. 2004).
del genoma respectivamente, en ausencia de virus ST detectable (ONeill y col. 1982).
La evolucion del clon de VFA C-S8c1 hacia la poblacion C-S8p260, dominada por genomas
defectivos que son infecciosos por complementaci on, se ha considerado como una transicion evolutiva
hacia la segmentaci on viral. Esta transicion evolutiva fue posible gracias a la replicaci on a alta MDI
que permitio la complementaci on entre los distintos RNAs (Garcia-Arriaza y col. 2004; Nee 1987;
Szathmary 1992; Chao 1991). La poblacion segmentada de VFA constituye la primera evidencia de
segmentaci on en virus RNA ocurrida espontaneamente en cultivos celulares. Se han propuesto varios
modelos te oricos que discuten la evolucion de la segmentaci on viral, principalmente en relaci on con
el origen del sexo y al incremento de la resistencia de virus a mutaciones, aumentos de la tasa
de replicaci on, encapsidacion etc. (Nee 1987; Szathmary 1992; Chao 1991). La ventaja selectiva
e implicaciones en el origen de la segmentaci on viral son materia de investigacion en esta Tesis
Doctoral.
38
3. Objetivos
1. Estudiar el origen y evolucion de poblaciones de VFA con genomas defectivos que son infec-
ciosos por complementaci on. Implicaciones para el origen de la segmentaci on viral.
Estudio de la composicion genetica de las poblaciones previas a la imposicion de los genomas
con deleciones internas.
An alisis de los requerimientos de las deleciones internas, tanto de localizacion como de
contexto de secuencia, mediante mutagenesis dirigida.
Estudio de los mecanismos moleculares que coneren ventaja selectiva al sistema de VFA
segmentado
Aplicaci on de las poblaciones defectivas como posible vacuna viva atenuada, con dos
niveles de seguridad, empleando ratones C57/BL6.
2. Estudio genetico de poblaciones de VFA sometidas a mutagenesis incrementada. Implemen-
taci on del software PAQ para describir la evolucion de los espectros de mutantes.
3. Evolucion de las estrategias de tness asociadas a la diversicacion genetica de una pobla-
ci on clonal de VFA, replicando en cultivos celulares. Desarrollo de una simulacion en C de
replicaci on de virus en cultivos celulares.
39
4. Materiales y Metodos
4.1. Cultivo de celulas eucarioticas
Se han empleado las siguientes lneas celulares establecidas:
Celulas BHK-21 (LC), broblastos de ri non de hamster (Stoker y MacPherson 1964), recibidas
de L. Carrasco; estas celulas se utilizaron unicamente para experimentos de electroporacion.
Celulas BHK-21 clon 2, broblastos de ri non de hamster, obtenidas de la ATCC que fueron
clonadas por dilucion lmite (de la Torre y col. 1988).
Las celulas se cultivaron hasta conuencia en medio Eagle modicado por Dulbecco (DMEM)
(Dulbecco y Freeman 1959), suplementado con amino acidos no esenciales (Sigma), 50 g/ml de
gentamicina (Sigma), 0.00002 % de parahidroxibenzoato de butilo (Sigma), y 5 % de suero bovino
fetal (SBF) (Gibco), en una atm osfera con 7 % de CO2, 98 % de humedad y a 37
o
C tal como se
ha descrito previamente (Domingo y col. 1980).
4.2. Variantes del VFA empleadas
Se han empleado los siguientes VFA de serotipo C:
C-S8c1: es un clon biol ogico obtenido a partir del aislado natural C1 Santa Pau Sp/70 (Santa
Pau, Girona, 1970) mediante tres aislamientos sucesivos de placa en celulas BHK-21 (Sobrino y col.
1983).
Poblaciones virales derivadas de C-S8c1 tras infecciones seriadas a alta multiplicidad
de infecci on (MDI): son las poblaciones resultantes de pasar seriadamente el virus C-S8c1 en
celulas BHK-21 a alta MDI, infectando en cada pase 2 x 10
6
celulas con 4-8 x 10
6
PFUs (MDI de
2-4 PFUs por celula) (Garca-Arriaza y col. 2006). Estas poblaciones se identican en esta Tesis
Doctoral mediante C-S8 seguido del n umero de pase, precedido por una p ( C-S8p240 es la poblacion
resultante de pasar C-S8c1 240 veces en las celulas BHK-21).
Clones biol ogicos de las poblaciones derivadas de C-S8c1: a partir de las poblaciones de-
rivadas de C-S8c1 se puricaron clones biol ogicos, recogiendo virus de placas de lisis individuales en
plaqueos con agar semisolido. En las poblaciones virales compuestas por mezcla de virus con geno-
mas defectivos (con deleciones internas), y virus con genomas de tama no estandar (ST), las placas
de lisis tienen tama nos bien diferenciados. El tama no grande de 2,680,86 mm, es el producido ge-
neralmente por C-S8c1 ST, mientras que las placas de tama no peque no, con un di ametro medio de
0,940,53 mm, se asocian a genomas defectivos (Garcia-Arriaza y col. 2004). Los clones biol ogicos
se denominan con el nombre de la poblacion donde se originaron, seguido de G unicamente si la
placa era de tama no grande, y seguido del n umero de clon (p240-G1, p225-G2, p219-G1, etc.). Por
simplicidad, para los clones biol ogicos se omite C-S8c1.
Poblaciones p3d: las poblaciones virales derivadas de C-S8c1 tras pases a alta MDI, p200, p219,
p225 y p240 fueron sometidas a tres pases a baja multiplicidad (diluyendo 1000 veces el virus antes
de cada pase). Estas poblaciones se denominan con el nombre de la poblacion seguido de p3d
(C-S8p240p3d, etc.).
40
MARLS: es un clon mutante de escape al anticuerpo monoclonal (ACM) SD6. SD6 es un ACM
neutralizante que reconoce el sitio antigenico A en el bucle GH de la protena VP1 del VFA de
serotipo C (Mateu y col. 1990). MARLS fue seleccionado a partir de la poblacion C-S8c1p213
(Charpentier y col. 1996a). Presenta el cambio de amino acido L144S en la protena VP1 (Baranowski
y col. 1998; Charpentier y col. 1996a). La ecacia biol ogica relativa de este clon es de 25 veces la
del clon C-S8c1 (Garcia-Arriaza y col. 2005).
C-S8p200p5d, denominado a lo largo de esta Tesis tambien poblaci on tipo-MARLS:
es la poblacion derivada de someter el virus C-S8p200 a 5 pases a baja multiplicidad de infecci on
(diluyendo 1000 veces el virus antes de cada pase).
C
9
22
: es un virus resultante de realizar 22 pases placa a placa a partir de la poblacion C-S8p2
(Escarmis y col. 1996).
Linaje RA: el clon MARLS fue pasado a alta MDI en presencia de concentraciones crecientes de
Ribavirina (1--D ribofuranosil-1, 2, 3- triazol- 3 carboxamida, R), tal como se indica en Resultados
5.4 y en la Figura 32. Estos virus se denominan como RA, seguido de una p y el n umero de pase:
RAp35, RAp44, etc.
RA0p35: es la poblacion RAp30 (MARLS pasado 30 veces a alta MDI en presencia de R) some-
tida a 5 pases adicionales a alta MDI en ausencia de R.
CAp35: es el clon MARLS pasado a alta MDI 35 veces en ausencia de R.
Sin-drogap1, Sin-drogap25: son las poblaciones obtenidas tras pasar el clon C-S8c1, 1 y 25
veces respectivamente, a alta MDI en ausencia de droga.
FUp1, FUp25: son las poblaciones obtenidas tras pasar el clon C-S8c1, 1 y 25 veces respectiva-
mente, a alta MDI en presencia de 200g/ml de 5-orouracilo (FU).
AZCp1, AZCp25: son las poblaciones obtenidas tras pasar el clon C-S8c1, 1 y 25 veces, respec-
tivamente, a alta MDI en presencia de 10g/ml de 5-azacitidina (AZC).
C-S8p3FUG: es la poblacion que se obtiene al pasar el clon C-S8c1 3 veces a alta MDI en
presencia de FU [200g/ml] y de clorhidrato de guanidinio (G) [4mM]. Esta poblacion se considera
una poblacion preextincion, ya que es la ultima poblaci on de la serie de pases de la cual se puede
extraer virus infeccioso y material genetico viral amplicable por RT-PCR.
4.3. Infecciones
4.3.1. Infecciones en medio lquido de monocapas celulares
Los metodos de infecci on de celulas BHK-21 y CHO en medio lquido han sido descritos en
(Baranowski y col. 1998; Domingo y col. 1980). Brevemente, en el protocolo estandar se infectaron
2-4 x 10
6
celulas con 1 x 10
5
a 2 x 10
7
PFUs de virus. Tras una hora de adsorcion a 37
o
C en
una atm osfera con 7 % de CO2 y 98 % de humedad (condiciones de ambiente identicas para el
crecimiento de celulas e infecciones por virus), se retiro el sobrenadante (con el virus no adsorbido)
41
y se a nadio medio DMEM con 1 % de SBF, incubandose en las mismas condiciones hasta observar
efecto citop atico (e.c.p.) completo (despegue de la monocapa) o hasta que hubieran transcurrido
72 horas. Todas las infecciones incluyeron monocapas tratadas en paralelo pero sin virus para
comprobar la ausencia de contaminaci on (control negativo).
4.3.2. Plaqueo de virus en medio de agar semis olido en celulas BHK-21
Se han aplicado los metodos de titulacion viral por plaqueo de virus en medio de agar semisolido
en celulas BHK-21 previamente descritos (Baranowski y col. 1998; Domingo y col. 1980). Se infec-
taron varias monocapas conteniendo 2-4 x 10
6
celulas, con diluciones crecientes de virus procedente
de cultivos celulares o sueros de rat on. Tras una hora de adsorcion a 37
o
C, se retiro el sobrenadante
y se a nadio agar semisolido a una concentraci on del 0,5 % en medio DMEM con 1 % de SBF y 1 %
de dietilaminoetil (DEAE)-dextrano. A continuaci on se incubo a 37
o
C durante 24 horas. Despues
de la incubaci on se jaron las celulas con formaldehdo 2 % y se ti neron las monocapas jadas con
cristal violeta (2 % cristal violeta en formaldehdo 2 %).
4.3.3. Correcci on del ttulo en los plaqueos de las poblaciones de defectivos que in-
fectan por complementaci on de dos tipos de partculas
Los ttulos virales (en PFU/ml) para virus estandar (ST) se calcularon del modo habitual, es
decir mediante la formula: Ttulo = (n
o
placas contadas / dilucion del virus) x volumen de virus
empleado. En el caso de que la producci on de placas dependa de la coinfecci on de una celula por
dos tipos de partculas (como es el caso de los genomas defectivos que se complementan, estudiados
en esta Tesis Doctoral), el calculo del n umero de partculas vricas infectivas individuales a partir
del n umero de PFU requiere la siguiente correci on: Supongamos una poblacion viral compuesta
por n partculas infecciosas. En un virus ST la n correspondera con el ttulo viral o PFUs. Si la
poblacion de n partculas esta compuesta por dos tipos de partculas (tipo A y tipo B), y se necesita
la coinfecci on de una celula con al menos una partcula de cada tipo para producir una infecci on,
entonces las PFUs no se relacionan directamente con la n. La relaci on entre las PFU y n es la
siguiente:
Basandonos en las probabilidades del modelo publicado por (Manrubia y col. 2006), sea
n
0
= n umero de partculas vricas infecciosas.
N = n umero de celulas totales
PFU = n umero de placas contadas en una monocapa (observadas)
y
n
0
2
, n umero de partculas de tipo A
1
N
, probabilidad de que una partcula de tipo A entre en una celula concreta
dada una cantidad inicial de partculas n
0
(mitad de tipo A, mitad de tipo B), se obtienen las
PFUs
_
n
0
2
__
n
0
2
_
N = PFU (1)
simplicando,
n
2
0
4N
= PFU (2)
de ah,
42
n
0
=

4N PFU (3)
Una vez obtenida la cantidad real de partculas vricas infecciosas (n
0
), se puede calcular el
ttulo como en el caso de un virus estandar; es decir:
ttulo (partculas infecciosas/ml) =
n
0
volumen
diluci on
(4)
(ejemplo, volumen es 5 si se aplican 200l a la monocapa, ya que en 1ml hay 5 veces 200l).
4.3.4. Pases placa a placa de clones del VFA
Los pases placa a placa de VFA se han descrito por (Escarmis y col. 1996). Tras el plaqueo del
virus en celulas BHK-21 en medio de agar semisolido, el virus contenido en una placa aislada se
resuspendio en 500l de DMEM. La suspensi on viral se volvio a plaquear y se repiti o el proceso el
n umero de veces deseado.
4.3.5. Ensayo de centros infecciosos
Se infectaron monocapas de celulas BHK-21 conuentes a alta MDI (1-50) con diferentes po-
blaciones o clones virales. Tras 1h de adsorcion las celulas se lavaron con tamp on fosfato pH=6.0
(para eliminar virus extracelular) y 2 veces con DMEM, se despegaron por tratamiento con tripsi-
na (Difco) y se recogieron en un tubo. Una alcuota se separ o para contar celulas en la camara de
Neubauer. Las celulas restantes se resuspendendieron en el volumen deseado de DMEM con 1 % de
suero. A partir de este punto se procedio a utilizar las celulas como si fueran poblaciones virales,
aplicandolas a monocapas de celulas BHK-21 tal y como se indica en 4.3.2.
4.4. Curvas de crecimiento viral
Las curvas de crecimiento viral se determinaron como se describe en (Baranowski y col. 1998),
con ligeras modicaciones. Se infectaron monocapas celulares conuentes de BHK-21 (1 x 10
6
celulas) con el mismo n umero de PFUs de los virus cuyo crecimiento se quiso comparar (1 x 10
4
PFUs). Despues de una hora de adsorcion las monocapas se lavaron con tamp on fosfato 0.1M de pH
6.0 y con DMEM y se a nadio 1ml de DMEM con 1 % de SBF. A diferentes tiempos postinfeccion se
recogieron alcuotas del medio de cultivo para la determinacion del ttulo viral mediante un ensayo
de plaqueo en medio de agar semisolido en celulas BHK-21 (secci on 4.3.2). La curva de crecimiento
representa el ttulo viral (PFUs/ml) a los distintos tiempos postinfeccion.
4.5. Cuanticacion de celulas BHK-21 y analisis de viabilidad
Un volumen de celulas resuspendidas en DMEM se mezclo con un volumen igual de azul tripano
(previamente calentado a 37
o
C); 10l de la mezcla se a nadieron a la camara de Neubauer para
contaje de las celulas al microscopio optico. Las celulas muertas se observan al microscopio con el
citoplasma te nido de color azul. Tras contar cuatro cuadrculas grandes de la camara y calcular un
promedio, el n umero de celulas se obtiene de:
N
o
celulas/ml = celulas contadas x 2 (dilucion en azul tripano) x 10
4
43
4.6. Ensayo de virulencia
La virulencia para BHK-21 se dene en la presente Tesis Doctoral como el mnimo n umero
de PFUs necesarias para lisar 10
4
celulas BHK-21 en un tiempo determinado. Se determino la
virulencia de varias poblaciones virales y clones biol ogicos a distintos tiempos postinfeccion. Para
ello se infectaron pocillos de placas de 96 pocillos (10
4
celulas por pocillo) con diluciones seriadas de
los virus, a distintos tiempos postinfeccion se jaron las celulas con formaldehdo 2 % y se ti neron
las monocapas jadas con cristal violeta (2 % cristal violeta en formaldehdo 2 %). El procedimiento
es el descrito anteriormente (Garcia-Arriaza y col. 2004; Herrera y col. 2007)
4.7. Ensayo de virulencia-interferencia
Este ensayo es equivalente a un ensayo de virulencia centrado s olo en un tiempo (12 o 24h) y
realizando infecciones a partir de diluciones seriadas de celulas obtenidas en un ensayo de centros
infecciosos. Tras repartir en placas de 96 pocillos diluciones de celulas previamente infectadas
(centros infecciosos), se dejaron reposar las celulas en los pocillos durante 30 min., posteriormente
se a nadio medio, tal como se ha descrito en la secci on 4.3.2 para plaqueos con medio de agar
semisolido.
4.8. Puricacion de virus
Las partculas virales de C-S8c1 fueron puricadas tal como se describe en (Diez y col. 1990). Los
viriones provenientes de una infecci on se puricaron parcialmente por ultracentrifugacion a traves
de un colchon de sacarosa al 20 % en TNE (Mateu y col. 1987) (la composicion de los tampones se
decribe en 4.22).
4.9. Anticuerpos monoclonales y policlonales
SD6: ACM producido en rat on (Mateu y col. 1990; Mateu y col. 1987). Reconoce sitio antigenico
A situado en el bucle GH de la protena VP1 de la capsida del VFA. El eptopo reconocido es
lineal. No presenta reactividad cruzada con anticuerpos de reconocimiento del sitio conformacional
D (Lea y col. 1994). En los ensayos de inmunouorescencia, 5C4 se utilizo a una dilucion 1:500 del
sobrenadante de un cultivo de hibridoma conuyente.
5C4: ACM producido en rat on (Lea y col. 1994). Reconoce el sitio antigenico D y dene un
eptopo conformacional localizado en subunidades pentamericas que forman la capsida. Reconoce
pentameros de la capsida o estructuras de orden superior (c apsida, poliprotena plegada) (Lea y col.
1994; Saiz y col. 1994). No presenta reactividad cruzada con los anticuerpos de los que disponemos
que reconocen el sitio A. En los ensayos de inmunouorescencia, 5C4 se utilizo a una dilucion 1:2000
del sobrenadante de un cultivo de hibridoma conuente.
Anticuerpos policlonales (APC) -3D, -2C, -L: APCs producidos en conejo, y que reconocen,
respectivamente, a las protenas 3D, 2C y L del VFA. Fueron utilizados a una dilucion 1:500 en
inmunouorescencias dobles, junto con los ACMs SD6 y 5C4.
Anticuerpos secundarios:
Cabra anti-conejo: rojo Alexa 555
Cabra anti-conejo: verde Alexa 488
Cabra anti-raton: rojo Alexa 555
Cabra anti-raton: verde Alexa 488
44
Cabra anti-raton: rojo lejano Alexa 647
Fueron adquiridos de Invitrogen y se utilizo una dilucion 1:500 de todos los anticuerpos secun-
darios.
4.10. Tecnicas utilizadas en experimentos con ratones C57BL/6
Los ratones C57BL/6 se compraron en Harlan Interfauna Iberica, S.L. Los ratones se mantu-
vieron en condiciones libres de patogenos y se les permiti o aclimatarse al nivel 3 de bioseguridad
(NBS3) en el animalario del Centro de Investigacion en Sanidad Animal, INIA, Madrid, durante 1
semana antes de ser utilizados en los experimentos. Se emplearon hembras de 8-10 semanas. Todos
los experimentos con animales vivos se realizaron siguiendo la normativa de la Comunidad Europea
(86/609) y fueron aprobados por el comite etico del Centro.
4.10.1. Infecciones in vivo con ratones C57BL/6
Los ratones fueron inoculados en la almohadilla plantar de la pata trasera izquierda, mediante
inyecci on subcut anea, con 10
7
PFU de los virus C-S8p3d y C-S8c1, y 10
7
o 10
3
PFU del virus C-
S8p260. Varios animales fueron inoculados con PBS como control negativo. En todos los casos los
animales fueron inoculados con un volumen total de 50l. Los animales se examinaron diariamente
buscando sntomas clnicos.
4.10.2. Sangrado de animales
Los animales fueron sangrados por la cola practicandoles una incision en la vena con un bis-
tur esteril, y cambiando de bistur con cada animal para evitar contaminaciones cruzadas. En cada
sangra se extrajo un m aximo de 300l de sangre por animal.
4.10.3. Extracci on de suero
El suero se separo de la fraccion celular mediante centrifugacion, 3 min. a 5.000 revoluciones
por minuto (r.p.m.). Se retiro el sobrenadante descartando el sedimento celular.
4.10.4. Ensayos de seroneutralizaci on
Se obtuvo un preparado del clon de VFA C-S8c1 a una concentraci on tal que al plaquearlo en
en medio con agar semisolido en una placa p60, se obtuvieran aproximadamente 100 placas de lisis.
Dicho preparado se mezclo con concentraciones decrecientes de sueros de ratones, en una relaci on
de volumen 1:1. El PRN70 se calcula como el recproco del logaritmo de la concentraci on en la
que se obtiene un 70 % de reduccion del n umero de placas. Como control positivo de neutralizaci on
se utilizaron varias diluciones de sobrenadante de hibridoma del anticuerpo SD6, y como control
negativo diluciones de un suero irrelevante.
4.10.5. Ensayo de ELISA
Se detectaron anticuerpos anti VFA en suero de ratones mediante ELISA tal como se describe en
(Novella y col. 1993). Se tapizaron placas de 96 pocillos de cloruro de polivinilo (Flow Laboratories)
a 4
o
C durante la noche, con C-S8c1 puricado por ultracentrifugacion a traves de un colchon de
sacarosa (Mateu y col. 1987; cantidad de antgeno equivalente a 100 ng de VP1). Los sueros de
rat on se diluyeron en PBS/3 % ovoalbumina y se analizo la presencia de anticuerpos IgG, usando
45
anticuerpos de cabra anti IgG de rat on unidos a peroxidasa de rabano (BioRad). Como substrato
de la peroxidasa se utilizo o-fenilendiamina-H2O2 (OPD) y se determino la absorbancia a 490 nm.
Los ttulos se dan como el recproco de la dilucion m as alta que dio una lectura de absorbancia
mayor de 200. Los controles sin infectar fueron negativos en la dilucion m as baja ensayada (1:10).
4.11. Extraccion de RNA vrico
4.11.1. Extracci on de RNA vrico extracelular
El RNA fue extrado a partir de 150 l del sobrenadante de infecci on de monocapas celulares
utilizando Trizol (Gibco). El sobrenadante se mezclo con 400 l Trizol y se incubo 5 minutos a
temperatura ambiente; se a nadio cloroformo (100 l por cada 150 l de sobrenadante), se agito y
se incubo 10 minutos a temperatura ambiente. Tras centrifugacion de 15 minutos a 12.000 r.p.m.
(14.819 x g), se separaron las dos fases y los acidos nucleicos se recuperaron de la fase acuosa por
precipitaci on con isopropanol.
4.11.2. Extracci on de RNA vrico intracelular
Para la extraccion del RNA intracelular, las monocapas se lavaron previamente con tamp on
fosfato pH 6.0 y medio de cultivo con el n de eliminar virus no adsorbido. Posteriormente se
a nadieron 400l de Trizol directamente sobre la monocapa, y se extrajo el RNA tal y como se
indica en el apartado anterior.
4.12. Obtencion de cDNA y amplicacion por RT-PCR del RNA viral
Para la reacci on de transcripci on inversa del RNA viral (obtenci on del cDNA a partir del RNA
del VFA) se empleo la retrotranscriptasa del virus de la mieloblastosis aviar AMV-RT (Promega).
Las reacciones de amplicaci on por PCR del cDNA se llevaron a cabo utilizando Ampli-Taq poli-
merasa (Perkin Elmer). En ambos casos se siguieron las instrucciones facilitadas por el fabricante,
realizando el proceso de amplicaci on por RT-PCR en un s olo paso en el tamp on y concentraci on
de Mg
2+
optimos para la Ampli-Taq. Este tipo de amplicaci on se utilizo cuando exista riesgo de
falsos positivos debido a recombinacion en la PCR.
Para algunas amplicaciones se empleo la DNA polimerasa termoestable EHF (Expand High
Fidelity, Roche), que es una polimerasa de alta delidad de copia, con actividad correctora de errores
35 exonucleasa. Tambien en este caso se realiz o el proceso de RT-PCR en un s olo paso con el
tamp on y concentraci on de Mg
2+
recomendados por el fabricante. Para aumentar la eciencia en la
amplicaci on, en algunos casos se utilizo la retrotranscriptasa Transcriptor (Roche) para obtener
cDNA en una reacci on independiente. Posteriormente el cDNA se utilizo como sustrato para una
PCR con Ampli-Taq polimerasa.
Regi on
a
Oligonucleotido
b
Secuencia (53

)
c
Orientaci on
d
Posici on
e
FRAGMEN-
TO S
SR3 TTGAAAGGGGGCGCTAGGGTC S 1
SD3 CAGCGCTAACAACCAAGTAG A 236
SD4 TGAAAGGCGGGTTCGGGTG A 367
PSEUDO-
NUDOS
CS8NR2 CCCTAAGTTTTACCGTCTGTCCCG S 368
contin ua en la pagina siguiente
46
IRES ND2new TGTTACCAAGGAGGAGTTCC A 759
ND1 AAACCGAGCGCTTTTATAG A 973
LR1L CGGAGGTCGGCACCTTTCCTTTAC S 1002
ND5 CCGAGCTCAGGGTCATTAATTG A 1038
Proteasa
L
LR1 GCTGTGGTAAACGCCATCA S 1063
[417+3 back GGAACAAATACCTTTTTCTCGCCG A 1143
[417+3 ida
CACGACGGCGAGAAAAAGG-
TATTTGTTCCA
S 1138
[417-3 back
GGAACAAATACCAGGATCT-
CGCCGTCG
A 1140
[417-3 ida
TACACGACGGCGAGATCCT-
GGTATTTGTTCCATACG
S 1136
Del 417 ida
ACGACGGCGAGAAAATGGT-
ATTTGTTCCATACG
S 1139
Del 417 back
CGTATGGAACAAATACCAT-
TTTCTCGCCGTCGTGTAGC
A 1134
LD4 TCTCGGGCGAATTGTAGACCCAG A 1267
LR2new
CACAGGGTTGGAGTTGCGC-
GAGGGTG
S 1305
LD2 CAGCAAGACACATGTCCGT A 1444
LR2 GGACAGGAACACGCTGTCT S 1471
LU1 CTACCCATGGACGCCAGACCCG S 1539
LD1L GCCTTCCACCCTTCATTGAGTGGC A 1619
VP4 4R1 CACTGGCAGCATAATTAAC S 1692
1810st-new GTGTTGGTTGTGTGTGCAG A 1808
4D1new TTGTTCTGGGTGTTGGTTGTGTG A 1835
4D1 AACCAGTCGTTGGTCTGG A 1844
VP2 2R1new CTGGTCTAGAGACGCGCGTTCATC S 2042
MA4 CAACCTTGTGCATGTGTCC A 2140
2R3 CAAGTGCCCAACAGATC S 2471
2R3new CAGGTGCCCAACAGATCAAAG S 2471
VP3 EDVP3new AGTTGTCACCATGTTGCCGTAAC A 2601
EDVP3 CAGTTGTCACCATGTTGCC A 2602
3R1EcoRInew
CACGAATTCACGGGCAAAGG-
CTACTGG
S 2744
3R1EcoRI CTGGCCGAATTCGACGTGTCGCTG S 2767
3D1 GTAGTACTGGGCCAAGCCGGCC A 2841
JD5 CGTACGCCACCATGTACCG A 2923
JD5new GCAGGTACGCCACCATGTACCGAG A 2926
3D2 CTGCGTGTATGCAGTGGGCAGCC A 2983
3R2new CTTTGAGCTCCGGCTACCTGTG S 3171
3R2newbis GAGCTCCGGCTACCTGTGGA S 3175
3R2 CCTGTGGACGCTAGACA S 3187
VP1 NK26 GACCTTCACAAACCGG A 3333
MARLS-Vp1 CACGTACTATTTTTCTGATTTG S 3414
200-Like CACGTACTACTTTTCTGATCTG S 3414
contin ua en la pagina siguiente
47
AV1new GGATTGGTTGTGTTGTTAAGTGC A 3518
1R1L ACACCGTGTGTTGGCTACGGCG S 3573
ED3 CTGCACCAAAGTTGAACGAT A 3697
JH1 GCACGCTTCATGCGCAC A 3743
VP1/2B pUL GAGAAGAAGAAGGGCCCAGGGTTG A 3896
2B 2BR1 TTGGTGTCTGCTTTTGAGGAAC S 3988
2BD1 CAAACGTGCTGTCCAGAATCTC A 4189
2C 2CD1 CTCTTCTGAGGCGATCCATGC A 4504
2CR1 AGAGCGGGAACGTCCATATTG S 4580
2CD2new GGGCAGTACCAAACAGAATCG A 4769
2CR2 GGCAAACCCTTCAGCAGTAAG S 4924
3A 3AR1 AAAGGCCAACACGAGGCAGC S 5344
5531wt ACATTGTCATCATGATCCGCGA S 5510
5531wtnew GTCATCATGATCCGCGAGA S 5515
5531C
9
22
new GTCATCATGATCCGCGCGA S 5515
3AD2 GCCTTCTGACCTGGAAGAGTTC A 5699
3C 53C ATGAGTGGTGCCCCACCGACCGAC S 5971
3CD1 CATGACCATCTTTTGCAGGTCAG A 6009
3CR1 CCCCCGTCGTTGGCGTGATTAAC S 6308
33C CTCGTGGTGCGGTTCAGGGTC A 6609
3D 53D GGGTTGATCGTTGATACCAGAGA S 6610
3DR3 CAAAGATGTCTGCGGAGGACAA S 6800
B2new CACTGCAGCGATGCCATGAACATC S 7351
AV3 TTCATGGCATCGCTGCAGTGG A 7370
AV2new TGTGGAAGTGTCTTTTGAGGAAAG A 7783
3DR2 GGACTCGCCGTCCACTCCGGAC S 7894
3 UTR R-end
TTTGGATTAAGGAAGCGGGA-
AAAGCCC
A 8115
Tabla 2: Oligonucle otidos sinteticos empleados para la
amplicaci on, secuenciaci on y cuanticaci on de las
diferentes poblaciones virales y plasmidos.
a
Region genomica correspondiente al clon VFA C-S8c1 don-
de se localiza el oligonucleotido, seg un el mapa de la Figura
5. en la introducci on.
b
Identicaci on del oligonucleotido con el nombre empleado
en el texto.
c
Secuencia del oligonucleotido en sentido 5

. En negrita
se muestran los cambios de nucleotido respecto a la secuencia
de C-S8c1. Los oligonucleotidos que amplican especcamen-
te virus mutantes tienen marcadas en rojo las posiciones que
coneren especicidad (ver Tabla 3).
d
S, sentido; A, antisentido.
Cuando se parti o de escasa cantidad de molde, la amplicaci on se realiz o mediante PCR anidada
(dos PCRs sucesivas) con la enzima polimerasa Ampli-Taq (Perkin Elmer), siguiendo las instruc-
48
ciones del fabricante y protocolos estandar (Sambrook Russell, 2001). Los productos amplicados
se analizaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y tinci on con bromuro de etidio o Sybr
Safe (Invitrogen). En la Tabla 2 se describen los oligonucleotidos empleados en la amplicaci on del
RNA de poblaciones virales y de los pl asmidos que contienen genomas con deleciones (descritos en
la secci on 4.19).
4.13. Puricacion de fragmentos de PCR
Los productos de amplicaci on por PCR se separaron mediante electroforesis en geles de agarosa
Sea-Plaque, de bajo punto de fusi on (Cambrex), en tamp on TAE. El DNA de la banda deseada
se purico mediante cromatografa de anidad usando el kit Wizard PCR Preps DNA Purication
System (Promega) o el kit GeneClean (Bio 101), siguiendo las instrucciones del fabricante. El DNA
se cuantico por tinci on con bromuro de etidio o Sybr Safe en geles de agarosa y comparacion
de la intensidad de la banda con marcadores de concentraci on conocida. Cuando fue necesario
eliminar s olo los oligonucleotidos y dNTPs no incorporados, los fragmentos de DNA sintetizados
por RT-PCR se ltraron a traves de membranas de Microcon (Millipore).
4.14. Cuanticacion de RNA vrico
La cuanticaci on de RNA vrico se realiz o mediante el metodo de RT-PCR cuantitativa a tiempo
real con el Light-Cycler (Roche). La reacci on de amplicaci on que se utiliza lleva un uor oforo que
se une de manera especca al DNA de doble banda. En cada ciclo de amplicaci on se mide la
uorescencia emitida. El ciclo de la reacci on en el que la amplicaci on pasa a ser exponencial es
inversamente proporcional a la cantidad de molde inicial. La cuanticaci on de RNA de las muestras
se determino por extrapolacion de los valores obtenidos en una curva patron realizada en paralelo,
con RNA transcrito del pl asmido pMT-28 que contiene el genoma de C-S8c1, cuya concentraci on
fue determinada mediante densidad optica a 260nm. La curva de fusi on del producto obtenido en la
PCR cuantitativa permite discriminar entre productos artefactuales de diferente peso molecular y
el producto especco. Los oligonucleotidos empleados para la cuanticaci on de los RNAs tambien
se incluyen en la Tabla 2.
Se utilizaron los kits LightCycler RNA Master SYBR Green I y LightCycler RNA Amplica-
tion kit SYBR Green I (Roche), para la amplicaci on y cuanticacion de fragmentos peque nos
(<500 pb) y grandes (>500 pb), respectivamente. En el caso del kit RNA Master se siguieron las
instrucciones facilitadas por el fabricante, optimizando la concentraci on de Mn
2+
. La mezcla de
reacci on se preparo en un volumen nal de 10 l que incluyo tamp on de reacci on, dNTPs, 25 ng
de cada iniciador, 3mM Mn[OAc]
2
, la sonda SYBR Green I y la polimerasa Tth. La polimerasa
Tth es una enzima termoestable que posee actividad retrotranscriptasa y polimerasa, permitiendo
la combinacion de retrotranscripci on y PCR en la misma mezcla de reacci on. La polimerasa Tth
esta unida a aptameros, que son oligonucleotidos que se unen al centro activo de la polimerasa y
evitan la uni on de los acidos nucleicos a temperaturas debajo de la temperatura optima de la Tth.
A altas temperaturas la enzima se libera de los aptameros y se inicia el proceso de retrotranscrip-
ci on. Las condiciones de amplicaci on incluyen un primer ciclo de retrotranscripcion (61
o
C durante
20 min.); un ciclo de desnaturalizacion (95
o
C, 2 min.); 45 ciclos de amplicaci on (95
o
C, 5 seg.;
temperatura de hibridacion del iniciador, 5 seg. y 72
o
C durante un n umero de segundos obtenidos
de la divisi on de la longitud del fragmento amplicado por 25). En el caso del kit RNA Amplica-
tion Kit se siguieron las instrucciones facilitadas por el fabricante, optimizando algunas condiciones
(cantidad de MgCl
2
y de Resolution Solution, una disoluci on que mejora el rendimiento en moldes
con elevadas estructuras secundarias). La mezcla de reacci on se preparo en un volumen nal de
49
Virus
a
Oligont.
b
Oligont.
c
Temperatura
d
Especicidad
e
sentido antisentido hibridaci on
C-S8p260p3d Lu1 1810st-new 70
o
C-5 Mutaci on puntual
72
o
C-10 1810st-new
C-S8p260999 3R1-EcoRI PUL 50
o
C-5 Tama no
72
o
C-5 del fragmento
tipo-MARLS MARLS-Vp1 ED3new 60
o
C-5 2 mutaciones
70
o
C-11 puntuales
MARLS-Vp1
tipo-p200 200-like ED3new 66
o
C-5 2 mutaciones
70
o
C-11 puntuales
200-like
C
9
22
5531-C9.22 new 3CD1 68
o
C-5 Mutaci on puntual
72
o
C-13 5531-C9.22new
Tabla 3: Parejas de oligonucle otidos iniciadores empleados en las amplicaciones
especcas de virus mutantes.
a
Poblaciones virales discriminadas positivamente mediante las amplicaciones especcas indicadas.
b
Oligonucleotido que hibrida con la cadena positiva del RNA deVFA.
c
Oligonucleotido que hibrida con la cadena negativa del RNA deVFA.
d
El primer y segundo valor de cada la hacen referencia a la temperatura y tiempo (en segundos),
respectivamente, empleados en el ciclo de hibridacion de los oligonucleotidos durante la PCR. El
tercer y cuarto valor hacen referencia a la temperatura y tiempo de elongacion, respectivamente.
e
La especicidad de los iniciadores se basa en las diferencias geneticas indicadas. La secuencia y
mutaciones de los oligonucleotidos basados en mutaciones puntuales se detalla en la Tabla 2.
20 l que incluyo tamp on de reacci on, dNTPs, 25 ng de cada iniciador, 6mM de MgCl2, 4 l de
Resolution Solution, la sonda SYBR Green I y las polimerasas AMV-RT y Taq. Las condiciones
de amplicaci on fueron similares a las descritas para el RNA Master, salvo que el primer ciclo de
retrotranscripci on se realiz o a 55
o
C durante 30 min.
4.15. Dise no de iniciadores para la amplicacion especca de mutantes virales
La amplicaci on de RNA con secuencias especcas que diferan en 1 o 2 nucleotidos respecto al
RNA estandar se realiz o con iniciadores especcos de cada secuencia (Tabla 3). Los iniciadores se
dise naron con el nucleotido discrepante (y especco de cada secuencia), situado en la antepen ulti-
ma posicion (contada en sentido 53). Los iniciadores fueron ensayados a diferentes temperaturas
hasta conseguir especicidad de amplicaci on con un exceso de entre 10
2
o 10
3
veces de secuencias
contaminantes. Para la amplicaci on especca de la poblacion C-S8p260 se dise naron unos inicia-
dores anqueantes a la delecion de 999nt, de tal modo que en la secuencia especca se generara
un amplic on de 140 nt y en la secuencia contaminante uno de 1139nt (Tabla 3). Dada la baja
procesividad de la polimerasa Tth presente en el kit de amplicaci on a tiempo real, la secuencia de
1139 nt nunca llego a amplicarse, obteniendose una reacci on 100 % especca, al menos hasta los
lmites ensayados.
50
4.16. Cineticas de produccion de RNA vrico
Se infectaron en paralelo monocapas celulares conuentes de BHK-21 (1 x 10
6
celulas) con el
mismo n umero de PFUs de los virus cuyo crecimiento se quiso comparar (C-S8p260 y C-S8p260p3d).
Los virus se infectaron en monocapas independientes o en mezcla, coinfectando la misma monocapa,
dependiendo del ensayo. Las infecciones se realizaron con una MDI = 20 PFU/celula para evitar
posibles alteraciones de medici on por segundas rondas de infecci on. Despues de una hora de adsor-
ci on se retiro el in oculo viral y las monocapas se lavaron con DMEM, tras los lavados se a nadio 1ml
de DMEM con 1 % de SBF. Para extraer el RNA intracelular, a diferentes tiempos postinfeccion
se retiro el medio de cultivo de las celulas y se lavaron las monocapas con tamp on fosfato 0.1M,
pH 6.0 y con DMEM; tras los lavados se a nadieron 400 l de Trizol (Gibco) directamente sobre las
celulas. Se recogieron las celulas con el Trizol y se continuo el protocolo como en una extraccion
de RNA estandar (apartado 4.11). Cada tiempo y cada replica de la cinetica se determino a par-
tir de una monocapa independiente. Para medir la concentraci on de RNA extracelular, se obtuvo
RNA del sobrenadante de las monocapas de las que se extrajo el RNA intracelular, como se indica
en el apartado 4.11.1. Cuando cada virus infect o una monocapa independiente, el RNA vrico se
determino mediante RT-PCR a tiempo real utilizando los iniciadores A-U (Tabla 2), que permiten
medir la cantidad de RNA vrico total. Cuando se realizaron coinfecciones con mezclas de virus, se
determino la concentraci on de RNA de cada tipo viral mediante las amplicaciones especcas que
se detallan en la Tabla 3.
4.17. Experimentos de competicion y determinacion de la ecacia biologica
relativa o tness
La ecacia biol ogica relativa de diferentes poblaciones o clones virales respecto a un virus com-
petidor, o al clon inicial de referencia C-S8c1, se determin o mediante experimentos de competicion
en pases seriados entre los dos virus en competicion (Holland y col. 1991). Para determinar la e-
cacia biol ogica respecto a C-S8c1 se utilizo como referencia el virus C
9
22
L150 (Escarmis y col. 1999)
que tiene una ecacia biol ogica 10 veces superior a la del clon C-S8c1. Se realizaron infecciones a
alta y a baja MDI. Se infectaron monocapas de celulas BHK-21 con MDI de entre 9,4 y 0,005 de
mezclas del virus problema y el virus de referencia, o de dos virus competidores en proporciones
iguales. Cuando el e.c.p. fue completo se recogi o el sobrenadante de infecci on, se diluy o hasta obte-
ner la MDI deseada y se empleo para infectar una nueva monocapa de celulas BHK-21. El proceso
se repiti o hasta un total de 4 infecciones sucesivas (pases). A continuaci on se extrajo el RNA viral
del in oculo inicial y del sobrenadante de infecci on de cada uno de los pases. Con los oligonucleoti-
dos descritos en las Tablas 2 y 3 y mediante RT-PCR cuantitativa, se calcul o especcamente la
cantidad de RNA viral de cada virus en cada pase y en el in oculo inicial y se calcul o la relaci on
entre ellos en cada pase. La representaci on logartmica de la proporci on de los dos genomas que
compiten frente al n umero de pases, da una curva cuya pendiente se toma como valor de ecacia
biol ogica relativa (Duarte y col. 1992; Holland y col. 1991) (ver Introducci on, secci on 2.2, Figura
3) .
4.18. Tratamiento con RNAasa
El sobrenadante de una infecci on se incubo durante 1 hora con 4gr/ml de RNAasa A pan-
cre atica (Boehringer) como se especica en (Escarmis y col. 1998).
51
4.19. Clonaje Molecular
4.19.1. Clonaje molecular de la regi on no estructural del VFA pase 260
La regi on codicante de protenas no estructurales del VFA se clon o en los pl asmidos que
contenan las deleciones presentes en el pase 260 (417, 999) y las mutaciones propias de la
zona estructural. Para obtener la zona no estructural completa se utilizo como molde para las
amplicaciones por RT-PCR, RNA procedente de la poblacion viral C-S8p260p3d. Se amplico casi
la totalidad de la zona no estructural con las parejas de iniciadores 2BD1-3CD1 y 3AR3-AV2new
(Figura 10). Para evitar o limitar las mutaciones artefactuales en la PCR, se utilizo la enzima
Pfu, una polimerasa de alta delidad (Cline y col. 1996). Los fragmentos resultantes de las dos
amplicaciones se mezclaron en concentraciones equimolares y se amplicaron con los iniciadores
externos 2BR1-AV2new, mediante la tecnica de recombinacion en la PCR. El producto resultante
se purico tras electroforesis en un gel de agarosa y se purico como se indica en la secci on 4.13.
Posteriormente el fragmento se digirio con las enzimas BglII (que corta en la posicion 4201) y
BamHI (posicion 7427). El tratamiento del DNA con enzimas de restriccion (New England Biolabs)
se llev o a cabo siguiendo las especicaciones del proveedor. Los fragmentos de DNA obtenidos
se puricaron como se describe en la secci on 4.13 y se ligaron a los pl asmidos pMT28417 y
pMT28999 (Garcia-Arriaza y col. 2004), previamente digeridos con BglII y BamHI, empleando
la T4 DNA ligasa (Roche). Para impedir la religaci on del vector, previamente se elimin o el grupo
5 fosfato de los extremos del vector por tratamiento con fosfatasa alcalina (USB). Los pl asmidos
resultantes se denominaron pMT260417ns y pMT260999ns.
4.19.2. Construcci on de plasmidos con la deleci on 417 desplazada 3 nucle otidos
hacia el 5 o 3 del RNA
Para desplazar la delecion 417 tres nucleotidos respecto a su posicion en C-S8p260 se utilizaron
oligonucleotidos mutagenicos que contenan la secuencia de la delecion desplazada de su sitio inicial
(Figura 11). El pl asmido pMT260417ns se utilizo como molde para las amplicaciones (Figura 12-
A). Para generar la delecion desplazada hacia el 3 del RNA (+3nt) se utilizo la pareja de iniciadores
[417+3ida-Jd5new y [417+3 back-NR2. Para generar la delecion desplazada hacia el 5 del RNA (-3
nt) se utilizaron las parejas de iniciadores [417-3ida-Jd5new y [417-3 back-NR2. Los dos productos
de amplicaci on se unieron en cantidades equimolares mediante la tecnica de recombinacion en la
PCR, usando los iniciadores externos NR2 y JD5new. El producto de la amplicaci on resultante
se digirio con las enzimas HpaI (posicion 436) y SphI (3661). El fragmento digerido se purico y se
lig o al pl asmido pMT260417ns previamente digerido con las mismas enzimas y defosforilado, tal
y como se indica en el apartado anterior.
4.19.3. Construcci on de un plasmido con la deleci on 417 en el contexto de C-S8c1
Para generar de novo la delecion 417, se utilizaron iniciadores mutagenicos que generan un
fragmento de PCR con la delecion deseada (ver Figura 11). Para las amplicaciones se utilizo DNA
del pl asmido pMT28 como material de partida, que contiene una copia de cDNA del clon de VFA C-
S8c1 (Figura 12-B). Para la amplicaci on se utilizaron las parejas de iniciadores Del417ida-Jd5new
y Del417back-NR2. Estos dos fragmentos se unieron mediante la tecnica de recombinacion en la
PCR mezclando cantidades equimolares de cada uno, usando como iniciadores externos NR2 y
JD5new. El producto de la amplicaci on resultante se digirio con las enzimas HpaI (posicion 436)
y SphI (posicion 3661). El fragmento digerido se purico y se lig o al pl asmido pMT28 previamente
digerido con las mismas enzimas y defosfatado.
52
V
P
4
VP2 VP3 VP1
2A
2B 2C 3A
3B
3C 3D
VPG
PoliC
AA.. A L
C-S8c1p260p3d
2BR1
(3998)
AV2new
(7783)
3AR3
(5704)
3CD1
(6009)
BglII
(4201)
BamHI
(7427)
HpaI (436)
BglII
(4201)
2B
2C 3A
3B
3C 3D
BamHI
(7427)
Digestin con BglII/BamHI
V
P
4
VP2 VP3 VP1
2A
3D
L
999
Vector
Poli A Vector
2 B
V
P
4
VP2 VP3 VP1
2A
L
417
Vector Poli A Vector 3D
2 B
Digestin con BglII/BamHI
Ligasa T4
V
P
4
VP2 VP3 VP1
2A
2C 3A
3B
3C 3D L
999
2 B
Vector
Poli A Vector
pMT28-999
V
P
4
VP2 VP3 VP1
2A
2C 3A
3B
3C 3D L
PoliC
2 B
417
Vector Poli A Vector
pMT28-417
Figura 10: Esquema del genoma de VFA y estrategia de clonaje de la zo-
na no estructural (codicante de las protenas de replicaci on) del virus C-
S8p2603pd. Arriba se indica el genoma de C-S8p260p3d, que se utilizo como molde
para amplicar la zona no estructural, desde 2B (posicion 3998) hasta 3D (posicion
7783). Los tri angulos en este genoma marcan la posicion de los iniciadores que se usa-
ron para las amplicaciones. Las rayas discontinuas representan las zonas amplicadas
que se juntaron mediante la tecnica de recombinacion en la PCR. Las zonas de corte de
las enzimas de restriccion con las que se digirio el material amplicado se se nalan con
una echa. Entre parentesis se indican los puntos de corte de las enzimas y la posicion
donde hibridan los oligonucleotidos. Tras juntar las dos amplicaciones indicadas me-
diante recombinacion en la PCR con los iniciadores externos 2BR1-AV2new y digerir
el producto resultante con BglII/BamHI, se desprende el fragmento indicado. Los dos
ultimos genomas representan los pl asmidos pMT28417 y pMT28999 (Garcia-Arriaza
y col. 2004). En color se representa la zona del genoma correspondiente a C-S8p260 y
en gris se representa la zona del genoma correspondiente a C-S8c1. Los pl asmidos fue-
ron digeridos con BglII/BamHI para ser ligados al fragmento previamente amplicado
y recomponer as la zona no estructural del virus C-S8p260p3d. La secuencia de los
oligonucleotidos empleados se describe en la Tabla 2.
53
[417+3 back
[417+3 ida
[417-3 back
[417-3 ida
Del 417 back
Del 417 ida
*
*
*
*
*
*
*
*
Figura 11: Oligonucle otidos mutagenicos para clonajes moleculares mediante
recombinaci on en la PCR. Los oligonucleotidos aparecen apareados con la zona
complementaria solapante que sirve de uni on para juntar el producto de dos PCRs. Los
asteriscos representan posiciones desapareadas al hibridar con los clones derivados del
VFA C-Sc1 y de pases sucesivos de C-S8c1. La lnea vertical en la pareja Del 417 ida
y back marca los extremos de la delecion de 417 nucleotidos que se genera al utilizar
estos iniciadores.
4.19.4. Transcripci on de plasmidos
Los pl asmidos descritos en la secci on anterior se linealizaron con NdeI (Biolabs). La trans-
cripci on in vitro se realiz o como se describe en (Baranowski y col. 1998). La mezcla de reacci on
contena: 40mM HEPES KOH pH 7.7, 6 mM MgCl
2
, 2mM espermidina, 1mM de cada ribonucleosi-
do trifosfato, 10mM dithiothreitol, 0.l g de alb umina de suero bovina (BSA) por l, 2 unidades de
RNasina (Promega) por l, 1 unidad de SP6 RNA polimerasa (Promega) por l, y una cantidad
de DNA molde de 250ng a 1g. La cantidad de RNA obtenida se estim o mediante electroforesis en
gel de agarosa por comparacion con cantidades conocidas de RNA transcrito de pMT28.
4.20. Analisis de la replicacion en celulas BHK-21 de RNAs transcritos in vivo
4.20.1. Electroporaci on de celulas BHK-21 con RNAs transcritos del virus de cDNA
del genoma del virus de la ebre aftosa
Para las electroporaciones se sembraron celulas BHK-21 (LC) provenientes de monocapas con-
uentes, a dilucion 1:3 el da previo a su utilizaci on. Las celulas se tripsinizaron y se recogieron
en DMEM 5 % SBF. Tras sedimentar las celulas por centrifugacion (2 min., 2000 rpm, 22
o
C), se
lavaron con PBS, se centrifugaron de nuevo y se resuspendieron en PBS (2,4 ml PBS/p100). Se
repartieron en 400 l por cubeta de electroporacion (BIORAD) y se mezclaron con 1 ng de RNA
transcrito a partir de cDNA de VFA. Se electroporaron las celulas aplicando 2 pulsos consecutivos:
Voltaje: 1,5 Kvoltios
Capacitancia: 25 Fd
Resistencia: innito
Una vez electroporadas las celulas se lavaron con 800l de DMEM 10 % SBF y tras un nueva
centrifugacion (5 min., 2000 rpm) se resuspendieron en DMEM 10 % y se sembraron en pocillos de
54
V
P
4
VP2 VP3 VP1
2A
2B 2C 3A
3B
3C 3D
PoliC
417
L
Poli A
Vector
Vector
NR2
(368)
JD5new
(2923)
[417+/-3 ida
[417+/-3 back
V
P
4
VP2 VP3
417+3
L
V
P
4
V
P
4
VP2 VP3
417-3
L
HpaI
(436)
SfiI
(2826)
Digestinmde la
amplificacin
conHpaI / SfiI
VP3 VP1
2A
2B 2C 3A
3B
3C 3D
PoliC
Poli A
Vector
Vector
LigacinconligasaT4
Digestindel
plsmido
conHpaI/SfiI
+
Figura 12: Mutagenesis dirigida para desplazar 3 nucle otidos hacia el 3 o
el 5 del genoma la deleci on de 417 nt en el plasmido pMT260417ns A) El
genoma dibujado arriba corresponde al pl asmido pMT260417ns que se utilizo como
molde para la amplicaci on. Los iniciadores utilizados se representan con tri angulos.
Las echas representan los oligonucleotidos mutagenicos que llevan insertada la secuen-
cia que codica la delecion 417 movida de sitio 3 nucleotidos. Las lneas discontinuas
representan las zonas amplicadas que se juntaron con la tecnica de recombinacion en la
PCR. Los puntos de corte de las enzimas de restriccion con las que se digirio el material
amplicado se se nalan con una echa. Entre parentesis se indican la zona de corte de
las enzimas y la posicion donde hibridan los oligonucleotidos. Tras juntar los productos
de las dos amplicaciones indicadas mediante recombinaci on en la PCR con los oligo-
nucleotidos externos NR2-JD5new y digerir el producto resultante con HpaI/SI, se
producen los dos fragmentos mostrados (uno representa la delecion movida 3 nucleoti-
dos en sentido 3, el otro en sentido 5). Estos fragmentos se ligaron con ligasa T4 al
pl asmido pMT260417ns, previamente digerido con HpaI/SI, tal como se indica.
55
V
P
4
VP2 VP3 VP1
2A
2B 2C 3A
3B
3C 3D L
PoliC
pMT-28
NR2
(368)
JD5new
(2923)
del 417 ida
del 417 back
HpaI
(436)
SfiI
(2826)
V
P
4
VP2 VP3 L
417
Digestin
conHpaI/SfiI
VP3 VP1
2A
2B 2C 3A
3B
3C 3D
PoliC
Vector Vector
Poli A
Digestindel
plsmido
conHpaI/SfiI
+
LigacinconligasaT4
Figura 13: Mutagenesis dirigida para generar de novo la deleci on 417 en el
plasmido pMT28. Clonaje molecular de cDNA con la delecion de 417 nucleotidos en
el contexto de secuencia de C-S8c1. Se sigui o la misma estrategia de clonaje que en
la Figura 12, pero en este caso la amplicaci on inicial se realiz o a partir del pl asmido
pMT28. Los oligonucleotidos representados por echas llevan insertada una secuencia
que genera la delecion de 417 nucleotidos al usarlos en una PCR. La secuencia de los
oligonucleotidos empleados se describe en la Tabla 2.
placas M24.
4.20.2. Marcajes metab olicos y obtenci on de extractos celulares
Para el marcaje radiactivo de protenas en cultivos celulares se empleo la mezcla constituida por
(S35)-metionina y (S35)-cistena (Amersham). Para ello se incubaron las celulas con los amino acidos
(60 Ci/ml) en medio DMEM carente de metionina y cistena durante una hora. Tras este tiempo,
las monocapas celulares se lavaron, se recogieron en tamp on de ruptura, se hirvieron y se analizaron
directamente mediante SDS-PAGE y autorradiografa (Perales y col. 2007)
4.20.3. Analisis de protenas en gel de poliacrilamida y uorografa
El an alisis electroforetico de protenas en geles de poliacrilamida se realiz o en condiciones des-
naturalizantes (SDS-PAGE). Para el an alisis del material marcado radiactivamente con (S35)-
metionina/cistena, los geles se jaron en una solucion de etanol al 20 % (v/v) y acido acetico
al 7,5 % (v/v). La se nal radiactiva se amplicar o mediante uorografa incubando los geles en una
solucion de salicilato s odico 1 M durante 1 hora. Posteriormente, los geles se secaron al vaco y se
expusieron a pelculas autorradiogr acas (Perales y col. 2007).
4.20.4. Inmunodetecci on de protenas mediante Western-blot
Las protenas se separaron electroforeticamente mediante SDS-PAGE y se electrotransrieron
a una membrana de nitrocelulosa (BIO-RAD) en tamp on de transferencia a un amperaje de 200
mA durante 15 horas. La membrana se saturar o con una soluci on de leche desnatada en polvo al
5 % (p/v) en PBS durante una hora con agitaci on suave. A continuaci on, se a nadio una dilucion
adecuada del anticuerpo primario en PBS con leche en polvo al 0,1 %, y se incubo durante dos
horas. Transcurrido este tiempo la membrana se lavo tres veces durante 15 minutos con el tamp on
56
TPBS y se incubo con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado a peroxidasa (dilucion
1:10.000 en TPBS). Transcurrida una hora, se repitieron tres nuevos lavados de 15 minutos con
TPBS y se procedio al revelado mediante quimioluminiscencia (ECL, Amersham) (Perales y col.
2007)
4.21. Secuenciacion de DNA
Para la secuenciacion de DNA se empleo el Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (ABI
Prism) y el secuenciador automatico ABI377 o ABI 3700, como se ha descrito previamente (Ruiz-
Jarabo y col. 2000; Sierra y col. 2000). El an alisis de las secuencias se llev o a cabo con el paquete
DNA Star 4.0 (Lasergene). Cada secuencia se determino con al menos dos reacciones independientes
y se secuenciaron ambas hebras del cDNA. Los oligonucleotidos empleados para la secuenciacion
de DNA se detallan en la Tabla 2.
4.22. Disoluciones y tampones
Disoluci on de Tripsina: 0.5 mg/ml tripsina (Sigma); 0,016 % EDTA (Merck); 0,001 % rojo
fenol (Merck), disueltos en PBS.
PBS (solucion salina tamponada con fosfato): 137mM NaCl (Merck); 2.7mM KCl (Merck);
1.5 mM Na2HPO4 (Merck).
TAE: 40 mM Tris-acetato pH 8.3 (Sigma); 1 mM EDTA (Merck).
TBE: 0.09 M Tris-borato pH 8.3 (Sigma); 0.002 M EDTA (Merck).
TNE: 0.1 M Tris pH 7.5 (Sigma); 0.05M EDTA; 0.5 M NaCl (Merck).
Tampon fosfato pH 6: 12 mM HNa2PO4 (Merck); 88 mM H2NaPO4 (Merck).
Tampon de electroporacion: 21 mM HEPES pH 7.05 (Sigma), 137 mM NaCl (Merck), 5 mM
KCl (Merck), 0.7 mM Na2HPO4 (Merck), 6 mM glucosa (Merck).
BPTG: BSA 1 %, PBS 1x, Triton-X 100, 0.1 % glicina 1M.
Tampon S: acido ctrico 0,025M, Na2HPO4 0,05M, pH=5.
Tampon de ruptura: 160 mM Tris-HCl pH 6,8, 0,1 M DTT, 2 % SDS, 11 % glicerol, 0,033 %
azul de bromofenol.
Tampon de transferencia: 25 mM Tris-HCl, pH 8,3, 190 mM glicina, metanol al 20 % y SDS
al 0,1 %.
TPBS: Tween 20 al 0,05 % (v/v) en PBS.
4.23. Metodos logeneticos
4.23.1. Alineamiento y edici on de secuencias
Se ralizaron multiples alineamientos con el programa CLUSTAL W (Thompson y col. 1994),
incluido en el paquete de software Bioedit (Hall 1999), utilizando VFA C-S8c1 o VFA MARLS
(n umeros de acceso de GenBank AJ133357 y AF274010, respectivamente) como secuencias de
referencia.
57
4.23.2. Analisis logenetico
Se calcul o la matriz de distancias entre distintas secuencias con el programa MEGA3.1 (Kumar
y col. 2004), usando el modelo de Kimura 2 par amteros (Kimura 1980). La topologa se inrio me-
diante el metodo de neighbour-joining (NJ) (Saitou y Nei 1987) usando tambien el paquete de
software MEGA 3.1. Se usaron tambien otros procedimientos alternativos para medir la relaci on
genetica entre muestras. Los metodos de m axima parsimonia (MP), utilizando el programa DNA-
PARS del paquete PHYLIP, permitieron la construcci on de arboles con una topologa que requirio el
mnimo numero de cambios en las secuencias para ir de un nodo a otro (Sober 1988). La robustez
estadstica de los arboles obtenidos por MP y NJ se comprob o con un remuestreo por el metodo de
bootstrap de 1000 veces (Felsenstein 1985). Los arboles de m axima verosimilitud (MV, Maximum
Likelihood) se generaron con el programa PUZZLE (Strimmer y von Haeseler 1997), usando el
modelo de substituci on de Tamura-Nei (Tamura y Nei 1993), y las tasas con distribucion Gamma
con ocho par ametros (TN-8G), como modelo de heterogeneidad.
4.24. Caracterizacion de los espectros de mutantes
Los espectros de mutantes analizados en esta Tesis corresponden a poblaciones obtenidas en el
laboratorio y que han sido descritas (Gonzalez-Lopez y col. 2005; Sierra y col. 2007; Sierra y col.
2000).
La complejidad de los espectros de mutantes se calcul o como la frecuencia de mutacion mnima y
m axima, expresada como el n umero de mutaciones unicas y totales, respectivamente, encontradas
en los clones moleculares (comparados con su secuencia consenso), dividido por el n umero total
de nucleotidos secuenciados. La entropa de Shannon (H) normalizada es tambien una medida de
la complejidad de la poblacion, ya que cuantica la proporci on de secuencias identicas en una
poblacion. Se obtiene calculando:
H =
N

k=1
(p
i
ln p
i
) / ln p
i
(5)
donde N es el n umero total de secuencias y pi es la frecuencia de la secuencia i. El valor de H
esta comprendido entre H=0 (todas las secuencias identicas) y H=1 (todas las secuencias distintas).
El Partition Analisis of Quasispecies (PAQ) es un software que aplica un metodo no jer arquico
que agrupa juntas, bajo un crculo o esfera con un radio previamente establecido, secuencias que
minimizan la distancia genetica (de Hamming) con respecto a un genotipo central (Baccam y col.
2001). El conjunto de clones de cada poblacion viral analizada, se considero como una poblacion
unica, se agrup o bajo el mnimo radio posible, y se obtuvo un valor d, o distancia media. La d es
un valor de dispersi on de distancias respecto al genotipo central, y viene dado por la formula:
d =
_
1
n
_
N

k=1
(D
ic
) (6)
donde n es el n umero de vecinos dentro del grupo con centro en el genotipo c, y D
ic
es la distancia de
Hamming entre las variantes i y c. Las poblaciones se representan como esferas de area proporcional
al valor d.
Las mutaciones no sinonimas corregidas por los sitios no sinonimos (dn), y las mutaciones
sinonimas corregidas por sitio sinonimo (ds) se calcularon mediante el software SNAP (Korber
2000).
58
K
n
y K
s
se calcularon con el n umero de mutaciones no sinonimas y sinonimas respectivamente,
divididas por el n umero de nucleotidos (sin ning un tipo de correccion). Se utilizo el software basado
en ventanas, K-estimator (Comeron 1999). Se analizaron ventanas (regiones) de 200 nucleotidos,
moviendo en cada paso la ventana 100 nucleotidos, hasta cubrir toda la regi on genomica codicante
de la poliprotena de VFA.
4.25. Metodos Numericos
Las simulaciones numericas se realizaron dise nando programas especcos en lenguaje C. La
implementaci on matem atica se realiz o utilizando la Librera Cientca de GNU (GSL), disponible
como software libre bajo la licencia p ublica de GNU en www.gnu.org/software/gsl.
4.26. Programacion con C
El programa dise nado para describir la replicaci on viral se ha escrito en lenguaje C. El programa
funciona en un PC con un sistema Linux o Windows. Se compil o desde un PC con una distribucion
Linux Ubuntu utilizando el programa E-Macs que incluye la GNU compiler collection (gcc). Todos
estos programas son libres bajo la licencia p ublica de GNU. Las animaciones se realizaron mediante
los programas ImageJ y Blender.
59
5. Resultados
5.1. Evolucion del clon VFA C-S8c1 hacia la segmentacion viral
5.1.1. Descripci on de una poblaci on muy heterogenea de genomas defectivos: eviden-
cia de un estado de inestabilidad evolutiva
El clon de VFA C-S8c1 fue sometido en cultivos celulares a 260 pases citolticos seriados y
evoluciono hacia la adquisicion de genomas con deleciones internas en fase que eran infecciosas por
complementaci on (Garcia-Arriaza y col. 2004). Se describi o la aparicion de una delecion de 417
nucleotidos (417) en la zona codicante para la proteasa L y de 999 y 1017 nucleotidos (999,
1017) en la regi on codicante de la capsida (Figura 14). Tras los 260 pases, los genomas con
deleciones (RNAs) se impusieron en la poblacion C-S8p260 y se estim o que su cantidad era como
mnimo 10.000 veces superior a la del virus con genoma de tama no estandar. La complementaci on
sucede cuando un virus delecionado en la L y otro delecionado en la capsida coinfectan la misma
celula (Garcia-Arriaza y col. 2004).
Un an alisis de genomas presentes en placas de lisis individuales obtenidos de la poblacion vi-
ral C-S8p260 mostro que, 61 de 62 placas analizadas contena un genoma con la delecion 417
acompa nado siempre de una de las otras dos deleciones, 999 o 1017. Solo una de las 62 placas
contena un genoma de tama no estandar (Garcia-Arriaza y col. 2004).
Para investigar el grado de homogeneidad en el tipo de deleciones, previo a la imposicion de las
tres ya mencionadas, se analizo la composicion genomica de virus procedentes de placas procedentes
de los pases C-S8p219 y C-S8p225 (ver Materiales y metodos, apartado 4.3.2 y 4.3.4 para detalles
de la selecci on de clones biol ogicos). En estos pases la imposicion de los virus defectivos aun no
era total y el genoma estandar era detectable mediante RT-PCR (Garca-Arriaza y col. 2006).
Contrariamente a los resultados obtenidos con la poblacion C-S8p260, la composicion genomica de
los virus en 4 de 10 placas en la poblacion C-S8p219 y en 3 de 10 placas en la poblacion C-S8p225
difera de la composicion media de la secuencia consenso poblacional (
2
, p<0,001). Los resultados
mostraron la existencia de 7 deleciones adicionales que mantienen la fase de lectura, localizadas
entre los residuos genomicos 1813 (en la regi on codicante de VP4) y 3658 (regi on codicante de
VP1) (Figuras 14 y 15). El genoma 417 estaba presente en todas las placas analizadas. Por tanto,
la evolucion del sistema de VFA alcanzo niveles muy altos de hetereogeneidad genetica, en forma
de un espectro amplio de diferentes genomas de delecion, que nunca llegaron a imponerse en la
poblacion, incluso despues de 260 pases (Figura 14). Las deleciones tampoco se detectaron despues
de 460 pases (Garca-Arriaza y col 06).
5.1.2. Secuencia nucleotdica en torno a los sitios delecionados: evidencia de recom-
binaci on promiscua
Dado que los RNAs derivan del clon biol ogico C-S8c1, que contiene un genoma estandar unico,
las deleciones se debieron generar por recombinacion intramolecular o intermolecular, como progenie
del RNA de C-S8c1. Para comprender mejor los mecanismos moleculares que generaron los RNAs,
se compararon las secuencias nucleotdicas en las zonas anqueantes de los sitios delecionados, de
los 11 genomas descritos con deleciones internas, tanto en clones individuales como en poblaciones
no clonadas (Figura 16). En 6 de las 11 deleciones analizadas se encontraron secuencias identicas
de 4 a 18 nucleotidos, de manera continua o interrumpida anqueando la zona delecionada. Para
determinar la frecuencia con la que esas secuencias repetidas estaban presentes en el genoma de
VFA, se buscaron y contabilizaron a lo largo del genoma de los virus C-S8p100 y C-S8p200. La
b usqueda mostro que una de las dos secuencias que anquean las deleciones 417 y 645 no estaban
60
Lb
Lab
...
...
.
.
.
.
.
.... ...
V
P
4
VP2 VP3 VP1 2B 2C 3A 3C 3D
VPG
PoliC
AA.
L
2A 3B
Figura 14: Esquemas del genoma de VFA y de la posici on de las deleciones internas identicadas
tras pases del clon C-S8c1 en celulas BHK-21. A) Genoma de VFA. Las zonas 5 y 3 no codicantes
(5 UTR, 3 UTR) se representan con rayas horizontales y las zonas codicantes mediante rectangulos en los
que se incluye el nombre de las protenas, tal como se ha descrito en la Introduccion (Figuras 4, 5 y 7). Se
se nalan los dos codones AUG en fase de lectura que inician la sntesis de las dos formas de la proteasa L (Lab,
Lb). Debajo del genoma se indican las deleciones encontradas en diferentes genomas defectivos; el n umero
acompa nado de indica el tama no de la deleci on en nucle otidos, determinado mediante secuenciacion de
nucle otidos. Los rectangulos coloreados representan las deleciones encontradas en las secuencias consenso
de diferentes poblaciones. Los rectangulos negros representan las deleciones encontradas tras aislar virus de
placas individuales a partir de las poblaciones C-S8p219 y C-S8p225. Debajo, las lneas delgadas horizontales
identican las amplicaciones por RT-PCR realizadas y delimitan los productos de amplicacion utilizados
para mapear las diferentes deleciones. Los iniciadores empleados en las amplicaciones indicadas fueron los
siguientes: amplicacion 10: LR1L (s) y 4D1new (a); 17: 3R1-ECOR1new (s) y 2BD1 (a); 21: LR1L (s) y
2BD1 (a); 29: LR2new (s) y JD5new (a); 37 2R3new (s) y PUL (a); 38: 4R1 (s) y 3D1B (a); LJ: LR1L (s) y
JD5new (a); L2: 2R2new (s) y 3D2(a); s, sentido; a, antisentido. Las secuencias de los iniciadores se describen
en la Tabla 2. B) Esquema de los pases seriados del clon C-S8c1 y los genomas identicados en las diferentes
poblaciones. Los clones biol ogicos se representan como cuadrados negros y las poblaciones no clonadas como
crculos blancos; las echas grises grandes representan pases a alta MDI; las echas delgadas representan
pases a baja MDI; el n umero despues de p indica el n umero de pase; ST, genoma de VFA con tama no
est andar. La posicion de la deleci on se muestra como una porci on coloreada en el esquema del genoma, con
el codigo de colores de la parte A) de esta gura. Las poblaciones que se indican con p3d derivan de 3 pases
de C-S8p260 a baja MDI, que ocasionan la perdida de los RNA y la recuperaci on de virus ST como unico
genoma detectable. Debajo de las poblaciones se indican las deleciones caracterizadas en el analisis clonal
(placas individuales) de las poblaciones C-S8p219 y C-S8p225.
61
6 7 8 9 10 6 7 8 9 10
p219 p225
p
3
d
p
2
6
0
4370
2899
2488
2201
1933
417
999
St
M
Figura 15: Variabilidad de tama nos gen omicos en clones individuales. Electro-
foresis en gel de agarosa-TAE de los productos de amplicaci on, mediante la RT-PCR
21 (Figura 14) de clones individuales de las poblaciones C-S8p219 y C-S8p225. Se indica
la poblacion de origen y el n umero de clon. En el carril M se muestran DNAs marcado-
res de tama no, obtenidos por digestion del DNA de 29 con HindIII, con indicacion del
tama no esperado de las bandas. El DNA obtenido con RNA de C-S8p260p3d (p3d) se
muestra como control del tama no de genoma estandar. El DNA obtenido con RNA del
virus C-S8p260 (p260) se muestra como control del tama no de las deleciones 417,
999 y 1017 (estas dos ultimas producen DNAs que no se separan en esta electrofore-
sis). Se puede observar un gran n umero de tama nos intermedios en los diferentes clones
individuales.
representadas en ninguna otra zona del genoma. El resto de secuencias estaban repetidas desde 1
a 44 veces; en particular los tetra y pentanucleotidos estaban presentes entre 15 y 44 veces en el
genoma. Adem as las secuencias anqueantes de las deleciones 744-5, 885 y 603 no mostraron
repeticiones, continuas o interrumpidas, de m as de tres nucleotidos. Los resultados sugieren que no
hay un requerimiento estricto, a nivel de secuencia nucleotdica, para que eventos de recombinacion
den lugar a los RNA como se ha descrito tambien en otros sistemas virales (Gmyl y col. 2003;
Urbanowicz y col. 2005).
62
402
..cg[ACAACug....au]ACGACca..
5
1183 1586
3
417
..aa[AGGUCUUUUACUCCAGACcccc]UGGUAUUUGUUCCAUACga..
1153 1571
5 3
999
..ca[GCGAaa.ggGCGAu]ag..
2793 3793
5 3
1017
..gaAGAC[cg......ccAGAC]aa..
1932 2950
5 3
540
..cgcgUAC[AUgcaccuUAC]GUcu..
2196 2737
5 3
519
..cc[AACAUGacac]UUCAUGuu..
2352 2872
5 3
645
..ac[ACACAACCAac.ca]CCACAAACAca..
1813 2459
5 3
744 -3
..uaCAUG[gucg]CAUGcu..
2913 3658
5 3
744-5
..au[UCUCACUac....ua]CCUGGAUgu..
1937 2682
5 3
603
..guaCA[ug...caacCA]au..
2911 3515 2909 3513
5 3
885
..uu[GGACACAUGcacc]AAGUUCACGuu..
2121 3007
5 3
A B
1928 2946
..cgAC[AACug....auAC]GACca..
..ga[AGACcg......cc]AGACaa.. ..gua[CAug...caac]CAau..
1185 1588
..cgcg[UACAUgcaccu]UACGUcu..
2734 2193
Figura 16: Secuencias de nucle otidos que anquean a los sitios delecionados en
los RNAs de VFA. La localizacion de las diferentes deleciones, y su identicaci on se
resumen en la Figura 14 y la Tabla 4. Las deleciones se representan como cajas de color
(detectadas en una secuencia consenso) o negras (detectadas en clones individuales).
La localizacion de las diferentes deleciones, y su identicaci on se resumen en la Figura
14 y la Tabla 4. Las secuencias de nucleotidos en el sitio de cada delecion donde se
ha encontrado homologa de secuencia se indican en may usculas. Se indican en rojo los
nucleotidos donde hay identidad, interrumpidos por nucleotidos heterologos marcados
en azul. Las zonas delecionadas se muestran entre corchetes; los residuos genomicos
aparecen numerados seg un (Escarms y col. 2006).
63
Composici on de la placa
b
C-S8p219, n
o
de placa C-S8p225, n
o
de placa
Amplicacion
a
1 2 3 4
c
5 6
c
7/8 9 10 1 2 3 4/5 6/7/8 9 10
10 417 417 417 417 417 417 417 417 No 417 417 417 417 417 417 417
17 999 999 999 999
744-
3
603 999 999 (999) 999 999 999 999 999 No No
21 417 417 417 417 417 417 417 417 (417) 417 417 417 417 417 417 417
999 999 999 ST ST 999 999 999 (999) 999

999
999 999 999 519 885
ST
744-
5
645
744-
3
603 ST ST ST 540
29 ST
744-
5
No
ST
ST ST ST
No
ST
ST ST ST
No
ST
450
No
ST
No
ST
519
No
ST
645
37 ND ND ND ND
744-
3
603 999 999 No ND ND 999 ND 999
No

d
No

d
38 No
744-
5
No ND ND ND ND ND ND No ND ND No ND ND ND
Tabla 4: Deleciones gen omicas detectadas mediante amplicaci on del RNA viral de placas individuales de las poblaciones
C-S8p225 y C-S8p219.
a
Las amplicaciones por RT-PCR se identican con n umeros que corresponden a las amplicaciones descritas en la Figura 14-A y a la
secuencia de nucleotidos de los iniciadores se detalla en la Tabla 2.
b
Cada columna muestra los tipos de genomas identicados en la placa correspondiente, indicada en la cabecera. representa la presencia
de una delecion del tama no indicado; para cada amplicaci on se se nala la presencia de una o m as deleciones, basado en el tama no de los
fragmentos de DNA obtenidos. ST signica presencia de genoma con tama no estandar; un parentesis indica que el genoma con la delecion
indicada se amplico con muy baja eciencia; No signica que no se detect o ning un genoma con una delecion; No ST, signica que no
se detect o genoma estandar. ND, no determinado. Las deleciones que no se detectaron en el consenso de la poblacion (Figura 14) y s olo
se detectaron en placas individuales se marcan en negrita.
c
Las placas n umero 4 y 6 de la poblacion C-S8p219 presentan una delecion adicional. Se conrmo mediante las RT-PCR 21 y 29 en la
placa 4, y con las RT-PCR 21 y 17 en la placa 6. Estas deleciones no se pudieron secuenciar debido a problemas tecnicos.
d
La RT-PCR dise nada con un iniciador localizado dentro de las deleciones 519 o 885 no amplico estos genomas defectivos.
6
4
5.1.3. Estabilidad de la deleci on 417
Durante el an alisis clonal descrito en la secci on anterior, se detect o el genoma 417 en to-
das las placas de lisis estudiadas, procedentes de las poblaciones C-S8p219 y C-S8p225. No se
detect o ning un otro genoma con deleciones en la zona codicante de la proteasa L. Sin embargo,
como se ha descrito en el apartado anterior, no parece existir un requerimiento de secuencia estricto
evidente en la evolucion de C-S8c1 para la generacion de RNAs. Para comprobar la estabilidad y
constancia de la delecion 417 se realizaron una serie de construcciones en el clon infeccioso pMT28
de VFA (Toja y col. 1999), encaminadas a alterar tanto la zona delecionada como el contexto de
secuencia (Figura 17). Se obtuvieron pl asmidos codicantes de RNA con la delecion 417 y 999
en el contexto de secuencia del virus C-S8p260 en toda la zona codicante de protenas, denomina-
dos pMT260417ns y pMT260999ns, respectivamente (Figura 17). El pl asmido pMT260417ns
se utilizo como material de partida para desplazar la delecion 417 tres nucleotidos hacia el 5,
o tres nucleotidos hacia el 3 del RNA (obteniendose pl asmidos denominados, respectivamente,
pMT260417ns+3 y pMT260417ns-3). Estos pl asmidos mantenan sendas deleciones 417 en
fase de lectura (Figura 19). La delecion 417 se introdujo tambien en un pl asmido con el contexto
de secuencia de C-S8c1 (denominado pMT28417).
Los genomas con las deleciones 417 se electroporaron individualmente en celulas BHK-21. Se
realiz o un marcaje metabolico de una hora a distintos tiempos (entre 2 y 5 horas) post electropora-
ci on (p.e.) y las protenas marcadas presentes en los extractos celulares se analizaron electroforeti-
camente (Figura 18-A). El patron e intensidad de las bandas de protenas reejan la intensidad
de la expresi on de protenas virales y de la parada de expresi on de protenas celulares (shut o ).
Entre las horas 3 y 4, la parada de la expresi on de protenas celulares se hizo evidente en las celulas
electroporadas con las tres construcciones. Dado que la mayor parte de la regi on del RNA que
codica la proteasa L, encargada del corte proteoltico del complejo de uni on al cap (Devaney y
col. 1988), esta delecionada, la intensidad de la parada no se correlaciona necesariamente en estos
RNAs con su nivel de replicaci on. En menor grado que la proteasa L, la proteasa viral 3C, puede
intervenir tambien en la parada de sntesis de protenas celulares (Belsham y col. 2000). Las celulas
electroporadas con transcritos del pl asmido pMT28, que contienen la secuencia completa del clon
parental C-S8c1, provocaron una parada de sntesis de protenas celulares muy intensa desde las
primeras 2 horas de replicaci on. La expresi on de protenas especicas vricas examinada mediante
Western-blot revel o unos niveles altos de replicaci on en todas las celulas electroporadas con los
RNA ensayados, similar a la expresi on en celulas electroporadas con transcritos del pl asmido
pMT28 (Figura 18-A).
Para analizar la infectividad y virulencia de los RNAs con la delecion 417 en su sitio original
o desplazada 3 nucleotidos, se electroporaron celulas BHK-21 con los RNAs individualmente o
en mezcla junto con el RNA transcrito del pl asmido pMT260999ns. Todos los RNAs produjeron
un efecto citop atico evidente a las 5 h.p.e., siendo ligeramente superior el observado en las celulas
coelectroporadas con RNAs de pMT260417ns y pMT999ns (no se muestran los resultados). A
las 9 h.p.e., las celulas electroporadas con cualquiera de los RNAs ensayados presentaban un efecto
citop atico casi total. Los datos de replicaci on y de virulencia fueron, por tanto, paralelos, ya que
todos los RNA fueron capaces de replicar en cultivos celulares y de producir efecto citopatico
en un corto espacio de tiempo p.e., lo que sugiere que el desplazamiento de tres nucleotidos en la
posicion de la delecion no impide la replicaci on del RNA.
Cuando se analizo la infectividad del sobrenadante de las celulas, recogido a las 8 h.p.e., se obser-
varon diferencias signicativas en cuanto a la producci on viral.

Unicamente las celulas coelectropo-
radas con los dos RNA con las deleciones en el sitio original (pMT260417ns y pMT260999ns)
y la coelectroporacion con pMT260417ns+3 y pMT260999ns, produjeron un ttulo viral supe-
65
V
P
4
VP2 VP3 VP1
2A
2B 2C 3A
3B
3C 3D L
VPG
PoliC
AA.. A pMT28
V
P
4
VP2 VP3 VP1 2C 3A
3B
3C 3D L
VPG
PoliC
AA.. A 2 B pMT999
V
P
4
VP2 VP3 VP1
2A
2C 3A
3B
3C 3D L
VPG
PoliC
AA.. A
2 B
417
pMT417
V
P
4
VP2 VP3 VP1
2A
2C 3A
3B
3C 3D L
VPG
PoliC
AA.. A 2 B pMT260999ns
V
P
4
VP2 VP3 VP1
2A
2B 2C 3A
3B
3C 3D
VPG
PoliC
AA.. A
417
L
pMT260417ns
V
P
4
VP2 VP3 VP1
2A
2B 2C 3A
3B
3C 3D
VPG
PoliC
AA.. A
417+3
L
V
P
4
pMT260417+3ns
V
P
4
VP2 VP3 VP1
2A
2B 2C 3A
3B
3C 3D
VPG
PoliC
AA.. A
417-3
L
pMT260417-3ns
V
P
4
VP2 VP3 VP1
2A
2B 2C 3A
3B
3C 3D L
VPG
PoliC
AA.. A
417
pMT28417
V
P
4
VP2 VP3 VP1
2A
2B 2C 3A
3B
3C 3D
VPG
PoliC
AA.. A
L
pMT260p3d
4201
7427
436
Figura 17: Derivados del plasmido pMT28 con deleciones en distintos con-
textos de secuencia. Las zonas 5 y 3 no codicantes se representan con rayas
horizontales y las zonas codicantes mediante rectangulos con el nombre de las pro-
tenas codicadas. La protena VPg y el tramo de poli C se representan como un crculo
y una raya vertical, respectivamente, en la zona 5 no codicante. Las cajas en gris o
lneas en negro corresponden a la regi on clonada a partir de C-S8c1 y las zonas en color
corresponden a las zonas clonadas a partir de C-S8p260. Cuando aparecen indicados,
los n umeros en la parte superior de cada genoma indican el primer y ultimo nucleotido
de la regi on clonada perteneciente a C-S8p260. A la derecha de cada genoma se indica
el nombre de la construcci on.
66
P
F
U
/
m
l
10
5
10
4
10
3
2-3 H.P.E.
Mr (KDa)
211.8
121
100.2
54.3
38.7
29.8
20
3-4 4-5 2-3 3-4 4-5 2-3 3-4 4-5 2-3 3-4 4-5 2-3 3-4 4-5
B
H
K
-
2
1
p
M
T
2
8
p
M
T
2
6
0

4
1
7
n
s
p
M
T
2
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0

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1
7
+
3
n
s
p
M
T
2
6
0

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3
n
s
3CD
A
3D
2C
B
Actina
38.7
VP3
VP1
B
H
K
-
2
1
p
M
T
2
6
0

9
9
9
n
s
p
M
T
2
6
0

4
1
7
n
s
p
M
T
2
6
0

9
9
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n
s

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p
M
T
2
6
0

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1
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n
s
p
M
T
2
6
0

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s

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p
M
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0

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1
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-
3
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s
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M
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p
M
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2
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1
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+
3
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s
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M
T
2
6
0

9
9
9
n
s

+
p
M
T
2
8

4
1
7
Figura 18: Capacidad replicativa e infecciosa de RNAs derivados de pMT28. A) Se
electroporaron celulas BHK-21 con un sobrenadante de celulas no infectadas (BHK), o con 50g
de RNA de transcritos infecciosos que expresan el VFA C-S8c1 (pMT28) o RNA de transcritos
incluyendo la delecion 417 en el contexto de secuencia de C-S8c1 (pMT260417ns), la delecion
deplazada 3 nucleotidos hacia el 3 del RNA (pMT260417+3ns) o la delecion desplazada 3 nu-
cleotidos hacia el 5 del RNA (pMT260417-3ns). Las protenas se marcaron con [35S]Met/Cys
a las 2-3h, 3-4h y 4-5h post-electroporacion, y se separaron mediante electroforesis en geles de
acrilamida SDS-PAGE; Mr (kDa), marcador de masa molecular de protenas. Las protenas virales
correspondientes a las bandas mayoritarias se indican en la derecha. El panel inferior corresponde
al Western-blot anti actina. B) Ttulo de virus infeccioso en cada uno de los sobrenadantes. El
sobrenadante se recogi o al observar efecto citop atico completo (aproximadamente 8h p.e.). Cada
barra representa la media y la desviacion estandar de cuatro titulaciones. Se inocularon 200l de
sobrenadante en un pocillo de 35cm
2
. La lnea horizontal marca el lmite de detecci on del expe-
rimento: 1x10
4
PFU/ml. Los metodos de titulacion y de correccion del ttulo se describen en los
apartados 4.3.2. y 4.3.3. de Materiales y metodos. Estos ensayos se realizaron en colaboracion con
la Dra. C.Perales
67
pMT260 417ns
...GAG AAA A|UG GUA UUU...
...GAG AAA AAG G|UA UUU...
...GAG A|UC CUG G UA UUU...
417:
417+3:
417-3:
5' 3'
Glu Lys Met Val Phe
Lys
Ile Leu
5'
3'
V
P
4
VP2 VP3 VP1
VPG
PoliC
417-3
L
pMT260 417-3
GAC GGC GAG A............................UC CUG GUA
Ile
.....
V
P
4
VP2 VP3 VP1
VPG
PoliC
417+3
L
V
P
4
pMT260 417+3
GAG AAA AAG G.............................UA UUU GUU.
Val
.....
V
P
4
VP2 VP3 VP1
VPG
PoliC
417
L
Met
GAG AAA A.............................UG GUA UUU GUU.
.....
417:
417+3:
417-3:
Figura 19: Representaci on esquematica de las deleciones 417 y
417+3/417-3. El panel izquierdo representa la parte 5 del genoma de VFA. En
cada genoma se muestra la localizacion de la delecion delecion en la zona que codica
L. En rojo se indica el nuevo codon que se genera en la deleci on original y en la delecion
desplazada tres nucleotidos hacia el 5 del RNA (417-3ns) o tres nucleotidos hacia
el 3 del RNA (417+3ns); los amino acidos codicados son Met, Val e Ile, respectiva-
mente. El esquema en la parte derecha muestra las secuencias de nucleotidos alineadas
que se generan en cada delecion. En negrita se indica el triplete que se genera al juntar
los dos nuevos extremos de la delecion. En rojo se indica los nucleotidos diferentes en
las deleciones desplazadas respecto a 417. Debajo se muestran las mismas secuencias
traducidas en amino acidos. Los puntos representan posiciones en las que el amino acido
es el mismo que en 417ns. En rojo se marcan los amino acidos diferentes.
rior al lmite de detecci on del experimento (Figura 18-B). Sin embargo el ttulo producido por la
coelectroporacion pMT260417ns y pMT260999ns fue 3.4 veces mayor que en la coelectropo-
raci on con pMT260417ns+3 y pMT260999ns (en experimentos paralelos, la coelectroporacion
pMT260417ns y pMT260999ns produjo un ttulos hasta 6.2 veces mayores que la coelectropora-
ci on pMT260417ns+3 y pMT260999ns). Por tanto, a pesar de que la replicaci on de los RNA
no se ve alterada al desplazar la delecion, s se altera el ciclo viral completo, puesto que los RNAs
con la delecion desplazada del sitio original presentaron menor producci on viral que los pl asmidos
con las deleciones originales.
Al desplazar 3 nucleotidos la delecion 417 se gener o una nueva secuencia en el entorno del
sitio de la delecion. Sin embargo, debido a que exista cierta homologa en los extremos anquean-
tes a la delecion, las dos nuevas secuencias generadas presentan un unico nucleotido diferente
en pMT260417+3ns y 3 n ucleotidos diferentes en pMT260417-3ns, que corresponden a 1 y 2
amino acidos diferentes, respectivamente (Figura 19). No obstante, en los tres casos esas diferencias
se localizan en la regi on que codica la proteasa L, la cual esta delecionada en un 70 %. Por tanto las
diferencias en la producci on viral se debieron a cambios mnimos en la secuencia de nucleotidos que
afectaron a una protena no funcional. Estos resultados apoyan la hip otesis inicial de que cambios
menores en la delecion 417 pueden afectar sensiblemente el ciclo de replicaci on viral.
68
5.1.4. La capacidad replicativa de los RNA es dependiente del contexto de secuencia
Durante los 260 pases a los que fue sometido C-S8c1 en celulas BHK-21, los RNA acumularon
un total de 32 mutaciones puntuales repartidas a lo largo del genoma: 6 en la regi on no traducida
del 5 del RNA, 12 en la regi on que codica las protenas estructurales, 14 en la regi on que codica
las protenas de replicaci on y ninguna en la regi on 3 no traducida (determinadas a partir de la
secuencia consenso de C-S8p260 (Garcia-Arriaza y col. 2004) (Tabla 1 en la Introducci on). Para
investigar la inuencia que estas mutaciones pudieran tener en la aparicion o mantenimiento de los
RNA, se obtuvieron pl asmidos codicantes de RNA con las deleciones en el contexto de secuencia
del virus C-S8p260 en la zona codicante de protenas no estructurales, y el contexto de secuencia
del virus C-S8c1 de la zona codicante de protenas de replicaci on (denominados pMT417 y
pMT999, respectivamente) (Figura 17). Tambien se obtuvieron pl asmidos codicantes de RNA
con las deleciones 417 y 999 en el contexto de secuencia del virus C-S8p260 en toda la zona
codicante de protenas, tanto estructurales como de replicaci on, denominados pMT260417ns y
pMT260999ns, respectivamente (Figura 17).
Se estudio la expresi on de protenas y producci on de progenie viral en distintos RNAs. Los
RNAs en los dos contextos de secuencia (de C-S8c1 y de C-S8p260) se electroporaron individual-
mente o en mezcla (417 + 999) en celulas BHK-21. Se realiz o un marcaje metabolico a distintas
h.p.e. Los niveles de protenas en extractos celulares se analizaron electroforeticamente (Figura
20-A,B). El patron e intensidad de las bandas de protenas reejan la intensidad de la expresi on
de protenas virales y de la parada de expresi on de protenas celulares. Los genomas con 417 in-
dujeron la parada de expresi on de protenas celulares, incluso desde horas tempranas, unicamente
en el contexto de secuencia de C-S8p260. Los genomas con 999 en ambos contextos de secuencia
indujeron la parada desde horas tempranas. La coelectroporacion de los transcritos pMT260417ns
y pMT260999ns indujo mayor parada que la electroporacion de RNA de pMT417 y pMT999,
como indica la densitometra de los geles de electroforesis. La sntesis de actina celular a las 6
h.p.e., en celulas electroporadas con pMT417, pMT999 o la mezcla fue del 82,03 %, 32,21 % y
32,57 % respectivamente, comparado con la sntesis observada en celulas electroporadas con tamp on
de carga (BHK, Figura 20). La sntesis de actina celular a las 6 h.p.e., en celulas electroporadas con
pMT260417ns, pMT260999ns o la mezcla fue del 14,84 %, 13,94 % y 12,07 % respectivamente.
Las protenas procesadas VP3 y 3D, y el intermediario funcional 3CD se detectaron de manera
muy evidente en las coelectroporaciones con pMT260417ns y pMT260999ns. En cambio, estas
protenas se detectaron s olo levemente, o no se detectaron, en las coelectroporaciones con RNA de
pMT417 o RNA de pMT999. En la electroporacion con RNA de pMT260417ns tambien se
detect o la protena VP3, que no se detect o en las electroporaciones con pMT260999ns, como era
de esperar ya que este RNA tiene delecionada la regi on que codica para esta protena (Figura
17). Las protenas 3D y 3CD tambien se detectaron desde horas tempranas en las electroporaciones
individuales con RNA de pMT260417ns o RNA de pMT260999ns.
La citopatologa producida por los distintos transcritos fue muy paralela a los datos de replica-
ci on. Las coelectroporaciones con pMT260417ns y pMT260999ns (en mezcla o individualmente)
produjeron m as del 90 % de efecto citop atico en las primeras 8 h.p.e. (el efecto citopatico fue algo
menor en las celulas electroporadas unicamente con pMT260417ns). Las celulas electroporadas
con los transcritos de pMT417 y pMT999 s olo presentaron un efecto citopatico evidente cuando
los dos fueron coelectroporados, alcanzando un m aximo del 50 % a las 8 h.p.e.
La producci on de progenie infecciosa durante las primeras 8 h.p.e. s olo se pudo detectar en las
celulas coelectroporadas con pMT260417ns y pMT260999ns. El ttulo incremento desde 1,910
4
hasta 6,610
4
PFUs a las 8 h.p.e. (Figura 18-B).
Estos resultados demuestran que tanto la expresi on de protenas virales, como la virulencia para
69
p
M
T

9
9
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B
H
K

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Mr (KDa)
VP3 29.8
B
H
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s
+
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Mr (KDa)
54.3
38.7 38.7
Actina
3D
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p
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2
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+
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2
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s

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M
T
2
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4
1
7
n
s
3CD
pMT260999ns
pMT260417ns
pMT260999ns
+ pMT260417ns
BHK
h.p.e.
T

t
u
l
o

v
i
r
a
l

(
P
F
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s
/
m
l
)
4 6 8
pMT999
pMT417
pMT999
+ pMT417
BHK
h.p.e.
4 6 8
T

t
u
l
o

v
i
r
a
l

(
P
F
U
s
/
m
l
)
10
3
10
4
10
5
10
3
10
4
10
5
RNA de genomas de VFA Efecto citoptico
4 h 6 h 8 h
pMT28 + + + +
pMT999
- - -
pMT417
- - -
pMT999 + pMT417 - - -
a
+ + + +
- - -
- - -
- - -
pMT260999ns + + + + + +
pMT260417ns
+/-
+ + +
pMT260999ns + pMT260417ns + + + + + +
+ + + + + +
+/
+ + +
+ + + + + +
BHK - - - - - -
A B
C
D
E
Figura 20: Comparacion del efecto de las mutaciones en la zona codicante de protenas no estruc-
turales en la capacidad replicativa e infecciosa de los RNAs transcritos. A) Las celulas se electroporaron
con un sobrenadante de celulas no infectadas (BHK), o con 25g de RNA de transcritos de los plasmidos pMT999,
pMT417 o la mezcla de los dos. B) Mismo dise no experimental, empleando el RNA transcrito de los plasmidos
pMT260999ns, pMT260417ns o la mezcla de los dos. En las electroporaciones con mezclas de RNAs (en A y B)
se utilizo 12,5g de cada RNA. Las protenas se marcaron con [35S]Met/Cys entre las horas 2 y 4, 4 y 6 y entre
las horas 6 y 8 post-electroporacion. Los extractos proteicos se separaron mediante SDS-PAGE; Mr (kDa), marcador
de masa molecular de protenas. Las protenas especcas de virus (VP3, 3D, 3CD) se detectaron mediante reaccion
con anticuerpos monoclonales en ensayos de Western-blot (paneles inferiores). La cantidad de protena celular se
controlo observando la cantidad de actina, visualizada mediante Western-blot (ver apartado 4.20. de Materiales y
Metodos). C) Efecto citopatico observado (en unidades arbitrarias) a diferentes horas tras electroporacion de celulas
BHK-21 con el RNA genomico de las construcciones indicadas. La primera columna indica los RNAs transcritos a
partir de las diferentes construcciones que se detallan en Materiales y metodos y en la Figura 17; BHK, celulas elec-
troporadas con tampon de carga (control negativo). (+) < 20 % celulas afectadas); (++) 20 %-80 % celulas afectadas;
(+++) > 90 % celulas afectadas; (-) ausencia de efecto citopatico comparado con el control negativo. D, E) El ttulo
viral se determino en el sobrenadante obtenido a diferentes horas post electroporacion (h.p.e.); se muestra la media y
desviacion estandar. Se inocularon 200l de sobrenadante en un pocillo de 35cm
2
. La lnea horizontal marca el lmite
de deteccion del experimento: 110
4
PFU/ml. El metodo de titulacion y de correccion del ttulo se describen en los
apartados 4.3.2. y 4.3.3. de Materiales y metodos. Estos ensayos se realizaron en colaboracion con la Dra. C. Perales
70
celulas BHK-21 y la producci on de progenie infecciosa de los RNA en celulas coelectroporadas, fue
mucho m as intensa y eciente cuando las deleciones se encontraban dentro del contexto de secuencia
de la zona codicante de protenas no estructurales de C-S8p260, que en el contexto correspondiente
del clon parental C-S8c1. La evolucion de C-S8c1 hacia la segmentaci on se favorecio por la aparicion
de mutaciones puntuales que probablemente facilitaron la recombinacion asociada a la aparicion de
RNAs (ver Discusion, apartado 6.1.5).
5.2. Estudio de la ventaja selectiva de los virus defectivos
5.2.1. Determinaci on de la ecacia biol ogica de C-S8p260 y C-S8p260p3d
Una de las preguntas clave que plantea la transicion evolutiva hacia la segmentaci on del VFA
es la base molecular de la ventaja replicativa de los genomas con deleciones que se complementan,
sobre virus estandar. Como primer paso para abordar esta pregunta se investig o si la imposicion
natural de las partculas defectivas, en las poblaciones originales (Figura 14), se correlacionaba con
su ecacia biol ogica en un ensayo estandar en cultivos celulares. La poblacion C-S8p260, dominada
por RNAs, se compitio con C-S8p260p3d (el virus estandar derivado de la misma) (Garcia-Arriaza
y col. 2004) (Introducci on, apartado 2.6.5.) a alta MDI. C-S8p260 efectivamente se impuso al ST
C-S8p260p3d, con una ecacia biol ogica relativa de 2,5 (Figura 21-A, Tabla 5).
Los ensayos de tness con poblaciones virales con RNAs requieren alta MDI para mantener
la complementaci on. Esto limita el n umero de pases que se pueden realizar. Para solventar este
problema, se realizaron nuevos ensayos de competicion manteniendo la MDI alta, pero reduciendo
la cantidad inicial de virus defectivo e incrementando la del virus estandar de manera compensatoria.
Se realizaron nuevas competiciones utilizando una relaci on inicial 1:1000 de virus defectivo respecto
al ST, de este modo se garantizo la complementaci on del virus defectivo. Con este procedimiento
se consiguio realizar ensayos de entre 6 y 9 pases. Los resultados (Figura 21-B) muestran que la
ventaja selectiva del virus defectivo: (i) es constante a lo largo de los pases, ya que el incremento
en la poblacion de C-S8p260 es lineal en escala logartmica (R
2
= 0,9793) (Maree y col. 2000; Wu
y col. 2006); (ii) es independiente de la frecuencia, ya que la frecuencia relativa de cada tipo de
genoma viral cambia a lo largo de los pases, a medida que uno desplaza a otro. El valor de ecacia
biol ogica relativa obtenido fue de 2,4, un valor muy similar al obtenido previamente al realizar la
competicion comenzando con una proporci on mayor de C-S8p260 (Figura 21-A, Tabla 2).
El virus C-S8p260p3d posee un genoma recombinante de los genomas defectivos mayoritarios
presentes en C-S8p260 (Introducci on, Figura 7). Por este motivo, C-S8p260p3d y C-S8p260 com-
parten el contexto genetico (Garcia-Arriaza y col. 2004) (Introduccon, Tabla 1). Por tanto, las
diferencias observadas en ecacia biol ogica, parecen atribuibles a la presencia al sistema de seg-
mentaci on en s y no a la presencia de mutaciones especcas que conrieran una mayor capacidad
replicativa. No obstante, una sola mutaci on en un genoma viral puede modicar su comportamiento
y tness (Domingo 2007).
Para investigar la ventaja selectiva proporcionada por el sistema de segmentaci on, se compi-
ti o el virus defectivo C-S8p260 contra varios virus ST de distinto contexto de secuencia y distinta
tness. En paralelo, se compitio el virus ST C-S8p260p3d contra los mismos virus (Figura 21-D,
E, F, Tabla 5). El virus defectivo C-S8p260 se impuso al virus ST C
9
22
l150 (origen de los virus en
Materiales y metodos, 4.2) con aproximadamente el doble de ecacia biol ogica relativa con la que
lo hizo el ST C-S8p260p3d, en concordancia con el valor de tness relativa obtenido tras competir
directamente C-S8p260 y C-S8p260p3d entre si. El virus ST C-S8p260p3d perdio en competicion
contra el virus ST de alto tness C-S8p460p5d (ver Tabla 5). El virus defectivo C-S8p260, sin
embargo, desplazo en competicion al ST C-S8p460p5d, con un valor de tness relativa de nuevo
71
R
N
A
p
2
6
0
p
3
d
/
R
N
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C
L
1
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2
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2
6
0
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3
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10
-2
y = 0,318e
0,917x
R
2
= 0,9218
R
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2
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3
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10
1
10
2
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10
-
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10
-
4
10
-
3
10
-
2
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1
10
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10
1
10
2
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2
6
0

/

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N
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4
6
0
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3
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0 2 4 6 8
10
-
5
10
-
4
10
-
3
10
-
2
10
-
1
10
0
10
1
10
2
1 2 3 4 5 6
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
0 2 4 6 8
10
- 1
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
-1
10
0
10
1
10
2
R
e
l
a
c
i

n

d
e

R
N
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r
m
a
l
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z
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d
a
n pase
9
2
2
0 1 2 3 4
10
-2
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
0 2 4 6 8
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
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-1
10
0
10
1
10
2
10
-5
10
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10
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10
-1
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0
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1
10
2
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10
-
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10
-
4
10
-
3
10
-
2
10
-
1
10
0
10
1
10
2
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5
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-
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2
10
-
1
10
0
10
1
10
2
0 2 4 6 8
0 2 4 6 8
10
-
5
10
-
4
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-
3
10
-
2
10
-
1
10
0
10
1
10
2
10
-
5
10
-
4
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-
3
10
-
2
10
-
1
10
0
10
1
10
2
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
10
-1
10
0
10
1
10
2
10
3
0 2 4 6 8
10
- 1
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
0 2 4 6 8
10
- 1
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
-1
10
0
10
1
10
2
n pase
A C
E
B
D
F
C-S8p260/C-S8p260p3d
C-S8p260/C-S8p460p5d
C-S8p260/C L150
C-S8P260P3d/C9.22
9
22
R
N
A
p
2
6
0
p
3
d
/
R
N
A

C
L
1
5
0
9
2
2
Figura 21: Competici on entre mutantes de VFA. Los experimentos de competicion
entre C-S8p260 y otras poblaciones y clones de VFA se realizaron tal y como se especi-
ca en el apartado 4.17 de Materiales y metodos. Las variantes virales se compitieron
dos a dos en infecciones a MDI=7-14 PFU/celula, sin diluir el virus entre pases. Al
nal de cada pase se midi o la relaci on de genomas de los dos virus en competicion. La
pendiente del ajuste exponencial entre los diferentes puntos se tom o como valor de e-
cacia biol ogica (Tabla 2). Los iniciadores empleados para la detecci on especca de cada
virus se describen en las Tablas 2 y 3. A) Competicion entre C-S8p260 y C-S8p260p3d
mezclados inicialmente en proporci on 1:1 en PFU. B) Competicion entre C-S8p260 y
C-S8p260p3d mezclados inicialmente en proporci on 1:1000 en PFU (410
7
PFU de C-
S8p260p3d) C)Competicion entre C-S8p260 y C-S8p460p3d mezclados inicialmente en
proporci on 1:1000 en PFU (810
7
PFU de C-S8p460p3d). D) Competicion entre C-
S8p260 y C
9
22
L150 mezclados inicialmente en proporci on 1:1000 de PFU (410
7
PFU de
C
9
22
l150). E) Competicion entre C-S8p260p3d y C
9
22
L150 mezclados inicialmente en pro-
porci on 1:1000 en PFU (410
7
PFU de C
9
22
L150). F) Representaci on de los experimentos
B-E normalizando la relaci on de RNA respecto al punto inicial. Los smbolos que se re-
presentan debajo del panel F son validos solamente para distinguir las competiciones
representadas en el panel F y no en los paneles A a E. El ajuste exponencial de cada
competicion sigue las siguientes ecuaciones: 260/C-S8p260p3d: y = 0,7297e
0,8986x
, R
2
= 0,9793; 260/p5d: y = 2,1653e
0,7803x
, R
2
= 0,8667; 260/C
9
22
L150: y = 3,9919e
1,6056x
,
R
2
= 0,9393; C-S8p260p3d/C
9
22
L150: y = 1,7365e
0,7087x
, R
2
= 0,8449.
72
C-S8p260 C-S8p260p3d C-S8p460p5d C
9
22
L150 C-S8p460
C-S8p260 2,45
a
2,18 4,35 C-S8p460
b
C-S8p260p3d C-S8p460p5d 2,30 ND
C-S8p460p5d ND ND
C
9
22
L150 ND
C-S8p460
Tabla 5: Valor de ecacia biol ogica relativa de variantes del VFA. Los valores representados
corresponden a la ecacia biol ogica (tness) de la variante viral indicada en la primera columna,
calculada como se explica en el apartado 4.17 de Materiales y metodos, a partir de los resultados
de competicion mostradas en la Figura 21. El virus competidor se indica en la la superior. En la
competicion entre C-S8p260p3d y C-S8p260p5d no se determin o un valor de tness y el ultimo
virus fue el dominante, determinado por secuenciacion. N.D, no determinado.
a
Media obtenida con los experimentos mostrados en la Figura 21-A y B.
b
No se determino un valor de tness. Virus dominante seg un (Garca-Arriaza y col. 2006).
cercano a 2 (ver solapamiento de las curvas normalizadas C-S8p260 frente C-S8p260p3d y C-S8p260
frente a C-S8p460p5d en la Figura 21-F y Tabla 5). Este resultado fue muy inesperado ya que los
virus procedentes de una misma serie evolutiva tienden a aumentar su tness con el n umero de
pases (Arias y col. 2004; Escarmis y col. 1999; Garca-Arriaza y col. 2006; Novella y col. 1995; No-
vella y Ebendick-Corpus 2004). De hecho, el virus defectivo C-S8p460 s desplazo en competicion
al defectivo C-S8p260, tal y como se report o previamente (Garca-Arriaza y col. 2006) (Tabla 5).
Los resultados de las competiciones sugieren que el virus defectivo mantiene el doble de ecacia
biol ogica respecto al virus ST homologo de secuencia, tanto en competicion directa entre ellos,
como al comparar su tness relativa respecto a virus con menor ecacia biol ogica.
5.2.2. Cineticas de replicaci on del RNA
Para localizar la fase del ciclo de replicaci on viral en la que resida la ventaja selectiva del sistema
defectivo, se determino la cinetica de sntesis de RNA vrico. La velocidad de replicaci on del RNA
intracelular del virus defectivo y ST se calcul o midiendo el RNA total de C-S8p260 y C-S8p260p3d,
en infecciones paralelas tal y como se explica en el apartado 4.16 de Materiales y metodos (Figura
22-A). Las infecciones se realizaron a alta multiplicidad de infecci on (MDI=20 PFU/celula), para
asegurar que la totalidad o la mayora de las celulas estaban coinfectadas y que se permita la
complementaci on entre los dos tipos de partculas defectivas. Asimismo, a alta MDI se da una sola
ronda de infecci on evitando posibles distorsiones derivadas de infecciones sucesivas. La replicaci on
intracelular del RNA viral en los picornavirus es un proceso exponencial (Regoes y col. 2005). La
tasa de sntesis de RNA viene determinada por la pendiente en una representaci on semilogartmica
(Figura 22). Tanto C-S8p260 como C-S8p260p3d presentaron una cinetica exponencial de sntesis
de RNA tras el breve perodo de entrada (Figura 22-A). Las dos cineticas presentan una pendiente
muy similar y solapada. Los resultados sugieren que los virus defectivos no poseen una mayor
velocidad de replicaci on que el virus estandar cuando los dos tipos virales replican sin coinfectar
celulas.
Para investigar si una posible ventaja replicativa del virus defectivo se manifestaba s olo en
competicion con virus estandar se determino la cinetica de replicaci on del RNA viral en celulas
coinfectadas. Mediante iniciadores especcos se distingui o la proporci on del RNA de cada virus en
73
Defectivo
Estndar
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
10
7
80 130
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l

c
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l
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R
N
A
/
c

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l
a
0 20 40 60 80 100
tiempo (min.)
60 110 160 210 260
60 110 160 210
10
1
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2
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3
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4
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5
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1
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2
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tiempo (min.)
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1
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4
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5
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7
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1
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2
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3
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4
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6
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7
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1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
10
7
A B
C D
Figura 22: Cineticas de replicaci on de RNA de virus defectivo y estandar en celulas
BHK-21.Las cineticas se realizaron midiendo RNA viral intracelular o extracelular mediante RT-
PCR a tiempo real, como se especica en el apartado 4.16 de Materiales y metodos. Las celulas se
infectaron a una MDI=20 PFU/celula. Para discriminar el RNA de los competidores en las infec-
ciones con mezclas de C-S8p260p3d y C-S8p260, se utilizaron iniciadores especcos de cada virus
para RT-PCR. Para estimar la cantidad de RNA de la poblacion C-S8p260 se midi o el RNA 999
y se multiplic o por 2,5 (Garcia-Arriaza y col. 2004). Los datos estan normalizados y se muestran
como moleculas de RNA/celula. En todos los experimentos se midi o en paralelo el RNA viral en
celulas sin infectar, y en todos los casos la amplicaci on fue negativa. A) Cinetica de la variacion
del RNA viral total intracelular en infecciones paralelas (separadas) de C-S8p260p3d (Estandar)
y C-S8p260 (Defectivo). Cada punto representa la media de dos determinaciones de dos infeccio-
nes independientes en cada tiempo. Se indican los tiempos post-inoculaci on. Las lneas continua y
discontinua representan el ajuste exponencial a la replicaci on de C-S8p260p3d y C-S8p260, respec-
tivamente (C-S8p260p3d: y = 888,86e
0,0544x
, R
2
= 0,9227; C-S8p260: y = 485,35e
0,065x
= 0,9374).
B) Cinetica de entrada en la coinfecci on de C-S8p260p3d y C-S8p260. Cada punto representa la
media y desviacion estandar de la cantidad de RNA intracelular determinando tres infecciones
independientes en paralelo. El eje de abscisas representa el tiempo que se deja adsorber al virus
antes de extraer el RNA intracelular. C) Cinetica de replicaci on intracelular en coinfecci on de C-
S8p260p3d y C-S8p260 usando iniciadores especcos para la detecci on del genoma de cada virus.
Cada punto representa la media y desviacion estandar de tres infecciones independientes realizadas
en paralelo. El tiempo inicial corresponde a la incubaci on post-inoculaci on. D) Cantidad de RNA
en el sobrenadante de las infecciones utilizadas en C). Cada punto representa la media y desviacion
estandar de tres determinaciones en infecciones paralelas
74
distintos momentos del ciclo de replicaci on viral. De este modo se midi o: (i) la velocidad a la que
el RNA de ambos virus penetra dentro de la celula, (ii) la velocidad de replicaci on en el citoplasma
y (iii) la velocidad de salida al medio extracelular.
La entrada de las dos especies de RNA en la coinfecci on de celulas BHK-21 sigui o tambien una
cinetica paralela (Figura 22-B). Los dos tipos virales entran rapidamente en la celula, y alcanzan
ambos un primer pico de virus intracelular a los 15 minutos post-inoculaci on. Posteriormente la
cantidad de RNA se mantuvo aproximadamente constante en los dos virus hasta los 60 minutos
post-inoculaci on. En ese punto comenz o el proceso de sntesis de RNA de manera exponencial, que
de nuevo presento una cinetica paralela y solapada en los dos tipos virales. Los procesos tempranos
de replicaci on viral siguen, por tanto, un curso paralelo en celulas coinfectadas por los dos tipos
virales.
Los niveles intracelulares de RNA viral en celulas coinfectadas con C-S8p260 y C-S8p260p3d se
determinaron durante todo el ciclo de replicaci on (Figura 22-C). Paralelamente se midi o la cinetica
de salida del RNA al medio extracelular utilizando el sobrenadante de las mismas infecciones
(Figura 22-D). La replicaci on intracelular de los dos virus se volvio exponencial tras 60 minutos
post-inoculaci on (tal como se observ o en el experimento mostrado en la Figura 22-B). Las pendientes
de la curva de sntesis de RNA sugieren que los dos virus poseen la misma tasa de acumulacion
de RNA, tambien en condiciones de coinfecci on. A los 160 minutos post-inoculaci on la tasa de
incremento exponencial de RNA intracelular disminuyo paralelamente en los dos virus, al alcanzar
una concentraci on de RNA intracelular algo mayor de 10
5
moleculas de RNA genomico/celula.
Ello quiza reeje un equilibrio entre la sntesis de RNA y la salida de este al medio extracelular
en forma de partculas virales, puesto que la tasa de salida del RNA al medio extracelular no
disminuyo durante el ciclo de replicaci on.
La tasa de salida del virus de la celula (Figura 22-D) sigui o tambien una cinetica exponencial
durante el tiempo en que se realizaron las mediciones. Entre el minuto 105 y 135 post-inoculaci on
comenz o la salida de los virus al medio extracelular, que presentaron una cinetica muy paralela
(Figura 22-D). Estos resultados sugieren que la replicaci on de los virus ST y defectivo siguen una
cinetica muy similar tanto de acumulacion de RNA intracelular en infecciones paralelas, como de
velocidad de entrada, replicaci on intracelular y salida al medio extracelular, en celulas coinfectadas
con los dos tipos virales.
No se pudo detectar, por tanto, variaciones en la relaci on de RNA defectivo respecto al RNA
ST. Dicha relaci on se mantuvo constante durante todo el proceso de replicaci on intracelular y
tambien cuando la celula lis o y el RNA se libero al medio (Figura 22). Para descartar que el
RNA no encapsidado interriese en las mediciones de RNA, enmascarando la relaci on de partculas
virales, el sobrenadante de seis coinfecciones paralelas a alta MDI con los dos virus, se trato con
RNAasa A (Materiales y metodos, 4.18). El tratamiento del sobrenadante de infecci on con RNAasa
no alter o las proporciones relativas de cada tipo viral (Figura 23), lo que sugiere que la relaci on de
RNA vrico total es la misma que la relaci on de RNA encapsidado.
5.2.3. Cinetica de expresi on de protenas virales
Dado que no se detectaron diferencias en la tasa de replicaci on del RNA se investig o si la traduc-
ci on de protenas estaba adelantada o retrasada en alguno de los dos virus. Se determino la cinetica
de sntesis de protenas virales, mediante marcaje metabolico. Se electroporaron celulas BHK-21
con RNA transcrito de los pl asmidos pMT260p3d y la mezcla pMT260417ns y pMT260999ns
(Figura 17). Las celulas se marcaron con [35S]Met/Cys como se especica en la secci on 4.20.2 de
Materiales y metodos, a distintos tipos post-electroporacion. El an alisis electroforetico de extractos
proteicos y de densitometra de protenas especcas virales, muestra una cinetica muy paralela en
75
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
Sin
RNAasa
Con
RNAasa
M
o
l

c
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l
a
s
d
e
R
N
A
p
2
6
0
/
p
2
6
0
p
3
d
Figura 23: Ensayo de protecci on a RNAasa. Una parte del sobrenadante de infec-
ciones con mezclas de C-S8p260 y C-S8p260p3d, despues de observar efecto citopatico
completo, se trato durante una hora con RNAasa A, seg un se especica en el apartado
4.18 de Materiales y metodos. Otra parte se trato en paralelo en ausencia de RNAasaA.
La relaci on de moleculas del virus defectivo y estandar se midi o mediante amplicaci on
con oligonucleotidos especicos de cada virus. Se muestra el promedio de 6 determina-
ciones procedentes de infecciones paralelas.
la expresi on de protenas en las celulas electroporadas con RNAs respecto a las celulas electro-
poradas con RNA ST (Figura 24). Por tanto, la mayor ecacia biol ogica de la poblacion C-S8p260
respecto a C-S8p260p3d no se asocia con una cinetica mas rapida de expresi on de protenas virales.
5.2.4. Determinaci on de la infectividad especca y su relacion con tness
Resultados previos en el laboratorio sugirieron que la producci on de partculas virales totales al
nal del ciclo de infecci on pudiera ser diferente en C-S8p260p3d y en C-S8p260 (Garcia-Arriaza y
col. 2004). El n umero de moleculas de RNA vrico en el sobrenadante de infecci on, tras observarse
efecto citop atico completo, resulto ser 2,60,47 veces mayor en el virus ST que en el virus defectivo
(Tabla 6). Para poder conrmar estadsticamente ese resultado, se midi o el n umero de moleculas
de RNA genomico de los dos virus en el sobrenadante resultante de 7 infecciones independientes y
paralelas, tras observarse efecto citop atico completo. La cantidad de RNA total progenie producido
por C-S8p260p3d resulto ser 2,822,06 veces superior al de C-S8p260 (T-student, p<0,01; Tabla
6), en concordancia con los resultados previamente descritos. La cuanticaci on de la cantidad
de partculas virales mediante microscopa electronica mostro que la producci on de partculas con
genoma ST resulto ser 2,730,42 veces mayor que de virus con RNA (Garcia-Arriaza y col. 2004),
de acuerdo con los resultados obtenidos al medir moleculas de RNA. Sin embargo ambos virus
presentaron un ttulo de 2,210
8
PFU/ml. Por tanto, estos resultados indican que la infectividad
especca, es decir, la relaci on de virus infeccioso respecto a virus no infeccioso en el virus ST es
0,38 veces la del virus defectivo (es decir, el virus defectivo tiene una infectividad especca 2,6
veces mayor que el virus ST) (Tabla 6). Las diferencias observadas en infectividad especca del
virus defectivo respecto al ST, fueron muy similares a las diferencias en tness entre los mismos
virus (Tabla 6).
Para calcular el ttulo viral de de las poblaciones virales con genoma segmentado es necesario
76
RNA total
a
Partculas Virales
b
Ttulo viral
c
Infectividad especca
d
(n
o
moleculas/ (n
o
de partculas/ (PFU/ml)
ml sobrenadante) ml sobrenadante
C-S8p260p3d 9,5 0, 8 10
11
1, 5 0, 6 10
9
2, 2 1 10
8
2, 4 10
4
C-S8p260 3,61, 68 10
11
5, 5 0, 8 10
8
2, 2 1, 37 10
8
6, 3 10
4
Relacion
e
2, 6 0, 47 2, 73 0, 42 1 0, 4 0,38
p260p3d/p260 (2, 8 2, 1)
f
P (T Student)
g
p < 0,01 p < 0,01 p > 0,05 p < 0,01
Tabla 6: Infectividad especca de los virus estandar y defectivo.
a
Cantidad de RNA total medida en el sobrenadante de infecciones en celulas BHK-21, tras efecto citopatico
completo. Estos valores fueron calculados previamente (Garcia-Arriaza y col. 2004); cada valor es la media
de tres determinaciones independientes.
b
Este valor se obtuvo por microscopa electronica cuantitativa, utilizando preparados virales puricados por
gradiente de sacarosa (Garcia-Arriaza y col. 2004). Cada valor fue calculado a partir de 10 determinaciones
independientes.
c
Ttulo viral calculado como se especica en el apartado 4.3.2 de Materiales y metodos (promedio de 5
determinaciones independientes).
d
Calculado como el cociente entre el RNA total y el ttulo viral.
e
Estos valores (en toda la la) son el cociente de los valores indicados en las dos primeras las.
f
El valor entre parentesis procede de dividir la estimacion en 7 experimentos independientes en esta Tesis
Doctoral (no se muestran los datos), la relaci on de moleculas de RNA vrico C-S8p260p3d/C-S8p260.
g
Signicaci on estadstica mediante el test T de Student de las diferencias observadas en cada columna entre
el virus defectivo y el virus est andar.
77
211.8
121
100.2
54.3
38.7
29.8
20
Mr (KDa) 1
-
1
.
5
H.P.E.
BHK
3CD
VP3
Actin
1
.
5
-
2
2
-
2
.
5
2
.
5
-
3
3
-
3
.
5
3
.
5
-
4
4
-
4
.
5
pMT260p3d
pMT260999ns+
pMT260417ns
VP1
38.7
H.P.E.
S

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B
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+
pMT260417ns
pMT260p3d
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2
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5
Figura 24: Cinetica de expresion de protenas de virus ST o segmentado. Las celulas
se electroporaron con un sobrenadante de celulas no infectadas (BHK), o con 12,5g de RNA de
transcritos de los plasmidos pMT260417ns, pMT260999ns y su mezcla, o con el RNA trans-
crito de pMT260p3d. Las protenas se marcaron con [35S]Met/Cys a partir de los 30 minutos
post-electroporacion, cada 30 minutos, y se separaron mediante SDS-PAGE; Mr (kDa), marcador
de masa molecular de protenas. Las protenas especcas de virus (VP3, 3D, 3CD) se detectaron
mediante reaccion especca con anticuerpos monoclonales en ensayos de Western-blot (pane-
les inferiores). La cantidad de protena celular se controlo observando la cantidad de actina,
visualizada mediante Western-blot (ver apartado 4.20.4 de Materiales y Metodos). A) Patron
de expresi on de protenas en celulas BHK-21 electroporadas con RNAs de pMT260417ns mas
pMT260999ns y pMT260p3d. B) Densitometra de protenas, en unidades arbitrarias, expre-
sadas por los RNAs transcritos, en los tiempos indicados. C) Datos de densitometra de la parte
B, sumando en cada tiempo los valores obtenidos en los tiempos anteriores. Estos ensayos se
realizaron en colaboracion con la Dra. C.Perales.
78
Lisis2
10
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Figura 25: Disecci on de la competici on entre el virus defectivo y estandar.
Celulas BHK-21 fueron coinfectadas con las mismas PFU de virus defectivo y estandar
a una MDI de 20 PFU/celula. Se calcul o la cantidad de RNA de cada virus utilizando los
iniciadores especcos descritos en las Tabla 2 y 3, y se estim o su relaci on en el in oculo
inicial (in oculo), en el medio intracelular tras 60 minutos de entrada (entrada), al nal de
la replicaci on exponencial 120 minutos despues la entrada, y en el sobrenadante cuando
las celulas estaban lisadas (lisis). A) Cada punto es la media de 5 determinaciones
en infecciones realizadas en paralelo (excepto en el in oculo inicial que es la media de
tres determinaciones). B) El sobrenadante obtenido, tras lisar las celulas en una primera
ronda de infecci on, se utilizo para iniciar una nueva infecci on. El ciclo se repiti o un total
de 3 veces. Cada punto representa la media y desviacion est andar de 4 determinaciones
procedentes de infecciones independientes. El incremento en la relaci on de RNA, entre el
in oculo y la entrada, se indica en el interior de la gr aca). El cuadro peque no dentro del
grande representa los valores del in oculo y lisis de la gr aca principal; la lnea representa
un ajuste exponencial, equivalente a una gr aca de tness con valor de ecacia biol ogica
relativa de 1,93. Los valores del eje de abscisas equivalen al n umero de pases en una
gr aca de tness estandar.
79
aplicar una correccion matem atica, como se explica en Materiales y metodos (Apartado 4.3.3).
Cabe la posibilidad de que dicha correccion pudiera tener un error mayor que la diferencia de dos
veces observada en infectividad especca. Un error de dos veces es algo factible cuando se miden
valores con ordenes de magnitud en torno a 10
8
. Para contrastar las diferencias en infectividad
especca se busco un experimento alternativo que corroborara esos datos y que arrojara luz sobre
la coincidencia entre las diferencias en ecacia biol ogica e infectividad especca.
Experimentos previos con el PV (Barclay y col. 1998a), midieron la capacidad infectiva de
partculas defectivas en un preparado viral, dejando adsorber los virus a una monocapa celular y
midiendo la cantidad de partculas que penetraban en la celula. Se aplico esta tecnica para investigar
las diferencias en infectividad especca del VFA defectivo y ST. Para ello se midi o la cantidad de
RNA de cada tipo viral que entraba dentro de las celulas, dada una relaci on inicial de los dos
tipos de virus en el in oculo de infecci on. Cuando los dos virus entraron en la celula (60 minutos
post-inoculaci on), se observ o un incremento en la proporci on de virus defectivo (entrada respecto
in oculo en la Figura 25-A). Sin embargo, esta relaci on se mantuvo constante al medirla al nal
del proceso de replicaci on y tras el efecto citop atico completo, tal y como se observ o previamente
(Figura 22-C,D). Dado que la cinetica de entrada en la celula transcurre paralela en los dos virus
(Figura 22-B), los datos demuestran que, efectivamente, los preparados de virus defectivo son m as
infecciosos que los de virus ST, de acuerdo con los datos observados mediante determinaciones de
cantidad de RNA, ttulo viral, y cuanticaci on de partculas virales por microscopa cuantitativa.
Para investigar cuantitativamente la importancia que la ventaja de la infectividad especca
puede tener en el ciclo de replicaci on viral, se midi o la relaci on de los dos tipos de genomas virales
separando el ciclo de infecci on en tres fases: (i) in oculo, es la relaci on de virus en el preparado
inicial; (ii) entrada, es la relaci on de virus intracelular tras los 60 minutos post-inoculaci on; en
ese punto todo el virus infeccioso ha entrado en la celula (Figura 22-B); (iii) lisis, o relaci on de
los dos virus en el sobrenadante, tras observar efecto citop atico completo, aproximadamente a los
240 minutos post-inoculaci on (Figura 25-B). El sobrenadante del punto de lisis se utilizo como
in oculo para establecer una nueva infecci on. Este proceso se repiti o hasta medir la relaci on entre los
dos tipos de genomas en 3 entradas consecutivas. La relaci on de RNA de los dos virus se mantuvo
constante entre el punto de entrada y de lisis, es decir, durante la replicaci on viral ning un virus
aumento su proporci on relativa. Sin embargo toda la variacion en la frecuencia relativa de los dos
virus se midi o entre el in oculo y el virus que ha entrado en la celula. El incremento en la relaci on de
los dos virus fue de aproximadamente dos veces durante los tres ciclos consecutivos (Figura 25-B).
Al eliminar el punto de entrada de la gr aca, se obtiene la gr aca tpica de un ensayo de tness
con un valor aproximado de 2 (ver cuadro insertado en la Figura 25-B). Por tanto los resultados
sugieren que el virus defectivo es m as infeccioso que el ST. Las diferencias en infectividad especca
descritas previamente (Tabla 6) son del mismo rango que la ecacia biol ogica relativa del C-S8p260
respecto a su homologo estandar C-S8p260p3d (Tabla 5).
5.2.5. Analisis de la estabilidad de los virus C-S8p260 y C-S8p260p3d
Para investigar si el aumento en la infectividad especca se deba a un aumento en la estabilidad
de las partculas, se midi o la infectividad de los dos tipos de partculas vricas tras una incubaci on
a 37
o
C. Se utilizaron preparados de virus C-S8p260 y C-S8p260p3d con aproximadamente igual
n umero de PFUs. Se incubaron vol umenes identicos de cada preparado viral a 37
o
C durante 2h.
Paralelemante y durante el mismo tiempo se mantuvieron otras alcuotas de los mismos preparados
a 0
o
C. Al nal de la incubaci on se determino el ttulo viral de los virus. El ttulo de C-S8p260p3d
tras la incubaci on a 37
o
C fue 104 veces menor que el mismo virus mantenido en fro, mientras que
el de C-S8p260 fue 9 veces menor, lo que representa una diferencia de 11 veces (Figura 26-A).
80
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10
8
0 1 2 3 4 5 6 7 8
p260 p3d
10
6
10
7
10
8
10
9
p3d p260
2h, 4C
2h, 37C
0 1 2 3 4 5 6 7 8
p260 p3d
Tiempo (h)
P
F
U
/
m
l
P
F
U
/
m
l
A
B
Figura 26: Comparaci on de la estabilidad de las partculas defectivas y
estandar a 37
o
C. Alcuotas de preparados virales del virus defectivo y est andar se
incubaron a 37
o
C en vol umenes identicos. A distintos tiempos se retiraron las alcuotas
y se mantuvieron a 0
o
C. Paralelamente, en todo el proceso se mantuvieron alcuotas
del virus a 0
o
C. Posteriormente se titularon las muestras en paralelo. A) Media y des-
viaci on estandar de la titulacion de tres muestras virales sometidas a la incubaci on a
37
o
C o a 0
o
C durante 2h. B) Media y desviacion estandar de la titulacion de tres mues-
tras de virus a cada tiempo indicado. La cinetica de inactivaci on del VFA se ajusta a
una exponencial negativa de valor medio equivalente al tiempo medio de inactivaci on
de una partcula (Mateo y col. 2007): C-S8p260: y = 4x10
7
xe
0,9073x
, R
2
= 0,9954;
C-S8p260p3d: y = 4x10
7
xe
1,1896x
, R
2
= 0,982.
81
10
-1
10
0
10
1
10
2
I
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c
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l
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1
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t
r
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1
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o
2
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2
(
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i
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.
)
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A
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i
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o
/
R
N
A
e
s
t

n
d
a
r
Figura 27: Efecto de la estabilidad de las partculas virales en la infectividad.
Celulas BHK-21 fueron coinfectadas con las mismas PFU de virus defectivo y estandar
a una MDI de 20 PFU/celula. Se calcul o la cantidad de RNA de cada virus utilizando
los iniciadores especcos descritos en las Tablas 2 y 3, y se estim o su relaci on en el
in oculo inicial (in oculo 1), en el medio intracelular tras 60 minutos de entrada (entrada
1); los datos aparecen normalizados respecto al in oculo inicial. A los 350 min. post-
inoculaci on (tras observarse efecto citop atico completo) se midi o la relaci on de cada
RNA en el medio extracelular (in oculo 2); ese preparado viral se utilizo a su vez como
in oculo para una nueva infecci on, en la que se determino la relaci on de RNA viral en
el medio intracelular tras 60 minutos de entrada (entrada 2). Los valores de in oculo
2 y entrada 2 aparecen normalizados respecto al in oculo 2. Se muestran la media y
desviacion estandar de tres determinaciones independientes.
En un segundo experimento se determino la cinetica de inactivaci on. Los ttulos obtenidos se
ajustaron a una exponencial negativa (Figura 26-B) (Mateo y col. 2007). De nuevo, se observ o mayor
estabilidad en las partculas defectivas, con una vida media de 66 minutos para C-S8p260 y de 50
minutos para C-S8p260p3d (p< 0,001).
Para investigar la relaci on de la estabilidad de las partculas del virus C-S8p260 con su infec-
tividad especca, y por tanto con su ecacia biol ogica, se realizaron tres coinfecciones paralelas a
alta MDI con los virus ST y defectivo (Figura 27). El sobrenadante de la infecci on se recogi o a los
350 minutos post-inoculaci on (aproximadamente, 100 minutos m as tarde que en el resto de experi-
mentos) para permitir la inactivaci on de los virus. Ese sobrenadante se utilizo para establecer una
nueva infecci on. El incremento observado previamente en la frecuencia relativa del virus defectivo
entre la entrada y el in oculo (Figura 25), se incremento 5 veces cuando la infecci on se dej o durante
un tiempo sostenido a 37
o
C. En conclusi on, los resultados obtenidos sugieren que la ventaja se-
lectiva de la versi on segmentada de C-S8c1 se debe, primordialmente, a una mayor estabilidad de
las partculas virales. En la Discusion (apartado 6.2) se proponen posibles mecanismos moleculares
que pueden subyacer a esta diferencia de estabilidad.
5.3. Vacunacion de ratones C57BL/6 con virus defectivos
El pase de virus en cultivos celulares es un metodo cl asico de atenuaci on de virus (revisiones en
Bloom y Lambert 2003; Graham y Crowe Jr. 2007). La poblacion C-S8p260 tiene una historia de
82
0 15 30 45 60 75 90 105 120 0 15 30 45 60 75 90 105 120
A
B
n=21
10 PFUC-S8p260p3d
7
10 PFUC-S8c1
4
n=4 100%muertos
entre 24-48h
n=16
510 PFUC-S8p260
6
10 PFUC-S8c1
4
n=4
100%muertos
entre 24-48h
n=16
10 PFU (dilucin 1:100) C-S8p260
3
10 PFUC-S8c1
4
n=4 100%muertos
entre 24-48h
1/2 3 15 30 90/1/2/3 15 30 Sangra
(das)
Inoculacin virus
atenuado (vacunacin)
Desafo con virus letal
Figura 28: Vacunaci on de ratones adultos C57BL/6 con C-S8p260 y C-
S8p260p3d. A) Esquema del protocolo de vacunacion, tiempos de tomas de muestra
(sangras, tri angulos negros invertidos) y desafo con virus letal (C-S8c1); 21 ratones
hembra C57BL/6 fueron vacunados con 110
7
PFU del virus con genoma de tama no
estandar C-S8p260p3d. A los 90 das post vacunacion los ratones fueron desaados
con una dosis letal (110
4
PFU) del clon biol ogico de VFA C-S8c1. Cuatro animales
sin vacunar fueron inoculados con C-S8c1 como control positivo de infecci on. B) Die-
ciseis ratones hembra C57BL/6 fueron vacunados con 110
7
PFU del virus defectivo
C-S8p260; 15 ratones hembra C57BL/6 fueron vacunados con una dilucion 1:100 de
C-S8p260 (equivalente 110
3
PFUs del virus defectivo). A los 90 das post-vacunacion
los animales fueron desaados tal como se ha descrito en A).
83
S
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p
e
r
v
i
v
e
n
c
i
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e
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(
%
)
Das
post-desafo
Das post
vacunacin
0
20
40
60
80
100
0 1 2 7 15 30 90 1 2 3 15 30
10
7
PFU de
C-S8p260p3d
Ratones no
vacunados
10
4
PFU
de C-S8c1
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 15 30 90 1 2 3 15 30
510
6
PFU de
C-S8p260
Ratones no
vacunados
10
4
PFU
de C-S8c1
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 15 30 90 1 2 3 15 30
10
3
PFU de
C-S8p260
Ratones no
vacunados
10
4
PFU
de C-S8c1
Das
post-desafo
Das post
vacunacin
Das
post-desafo
Das post
vacunacin
Figura 29: Respuesta de ratones C57BL/6 a la vacunaci on con virus vivo
atenuado y a dosis letales del VFA C-S8c1. Supervivencia de ratones C57BL/6 a
la inoculaci on con el virus vacunal (parte izquierda de los paneles, hasta 90 das post-
vacunacion) y al posterior desafo con C-S8c1 (parte derecha de los paneles). El virus
vacunal o de desafo y dosis se indica en el interior de cada panel.
260 pases en celulas BHK-21. En el transcurso de estos pases acumul o 32 mutaciones en la secuencia
consenso, de las cuales 25 dan lugar a un cambio de amino acido. Ninguna mutacion afecto a residuos
directamente implicados en las propiedades antigenicas del virus (Mateu y Verdaguer 2004). Estas
caractersticas hacen de esta poblacion una excelente candidata a ser inmunogenica y atenuada.
Adem as, la poblacion C-S8p260 necesita de alta MDI para mantener la complementaci on e infectar
celulas productivamente (Garcia-Arriaza y col. 2004). Durante las infecciones in vivo, es probable
que se den las condiciones de alta MDI en la zona inicial de inoculaci on y que posteriormente el virus
se diluya en el organismo desencadenando una respuesta inmune pero con baja probabilidad para
dar virus progenie. Por estas razones, en colaboracion con el grupo de la Dra. Noem Sevilla (CISA,
INIA) se investig o el virus C-S8p260 como posible candidato a cepa vrica atenuada. De resultar
atenuado, este virus podra ser candidato a vacuna viva atenuada con dos niveles de seguridad: (i)
la atenuaci on propia de los m ultiples pases en cultivos celulares, y (ii) la necesidad de alta MDI
para complementar y producir progenie infecciosa.
La capacidad inmunogenica de C-S8p260 en ratones adultos C-57BL/6 fue estudiada adminis-
trando las dosis vricas y con el cronograma y controles descritos en la Figura 28. Paralelamente, se
inocularon ratones con el virus C-S8p260p3d para ensayar la virulencia del posible virus estandar
que pudiera surgir por recombinacion de los RNAs tras la vacunacion con C-S8p260. El virus ST
C-S8p260p3d se inoculo a la concentraci on m axima que se pudo obtener con preparados de infec-
ciones en cultivos celulares. Se obtuvieron muestras de sangre a distintos tiempos post-inoculaci on
de los virus ensayados. A los 90 das los animales fueron desaados con 110
4
PFU del clon de VFA
C-S8c1, virulento para ratones C57BL/6 (Salguero y col. 2005). En paralelo, se desaaron ratones
control que no haban sido vacunados. Se obtuvieron muestras de sangre a distintos tiempos despues
del desafo.
5.3.1. Protecci on por la vacunaci on con C-S8p260 y C-S8p260p3d
Se realiz o un seguimiento peri odico de los ratones con especial atencion a la aparicion de snto-
mas clnicos asociados a la infecci on por VFA (deshidrataci on, apata, postura encorvada, ataxia,
etc., descritos en (Salguero y col. 2005)). Ninguno de los ratones vacunados presento sntomas clni-
cos evidentes. La supervivencia de los ratones a la inoculaci on con el virus ST C-S8p260p3d y a
84
las distintas dosis de C-S8p260 fue del 100 %, con un total de 52 animales analizados (Figura 29).
A los 90 das post-vacunacion todos los ratones fueron desaados con C-S8c1. Los animales que
haban sido inoculados con C-S8p260 o C-S8p260p3d permanecieron sin sntomas clnicos durante
m as de un mes post-desafo. El 100 % de los ratones control sin vacunar murieron entre las 24-48h
post inoculaci on. Los resultados demuestran que las poblaciones C-S8p260 y C-S8p260p3d son ate-
nuadas para ratones C-57/BL6, y que la administracion de estos dos virus protege de la infecci on
con dosis letales del clon virulento C-S8c1.
5.3.2. La vacunaci on con virus defectivos conere protecci on esteril
Para investigar si la protecci on conferida por los virus C-S8p260 y C-S8p260p3d era esteril
(es decir, evitaba la replicaci on viral), se titulo la infectividad viral presente en la fraccion de
suero de las muestras de sangre, obtenidas de los ratones a distintos tiempos post-vacunacion y
post-desafo. El nivel de viremia fue indetectable en los animales inoculados con C-S8p260 tras
la vacunacion y tambien despues de la inoculaci on con el virus de desafo C-S8c1 (Figura 30).
Algunos de los animales inoculados con el virus estandar C-S8p260p3d presentaron viremia (14
de los 20 analizados a las 24h post-vacunacion y 17 de los 20 a las 48 h post-vacunacion), no
asociada a sntomas clnicos. Sin embargo, la viremia disminuyo a niveles indetectables a los siete
das post-inoculaci on. Estos mismos ratones presentaron viremia indetectable despues del desafo
con C-S8c1.
Los resultados indican que la vacunacion con el virus C-S8p260 conere protecci on esteril.
No se detect o replicaci on del virus C-S8p260 en ning un rat on vacunado, ni replicaci on de C-S8c1
despues del desafo. Tampoco se detect o, mediante titulacion de sueros, la aparicion de virus ST
recombinante en animales vacunados con virus defectivo.
5.3.3. Capacidad inmun ogena de la vacunaci on con C-S8p260
El suero de los ratones vacunados con C-S8p260 y C-S8p260p3d se analizo mediante ELISA
para la detecci on de anticuerpos del tipo IgG2, a distintos tiempos post-vacunacion y post-desafo
(Figura 31). Los resultados demostraron que, tanto los ratones vacunados con C-S8p260, como los
vacunados con C-S8p260p3d, presentan un elevado ttulo de anticuerpos anti-VFA en sangre. En
los primeros das tras la vacunacion, el ttulo de anticuerpos aumento hasta alcanzar un m aximo
el da 15 post-vacunacion, con los dos inmunogenos y dosis ensayados. Los ratones vacunados con
C-S8p260p3d alcanzaron un ttulo de anticuerpos un orden de magnitud superior que los ratones
vacunados con C-S8p260. El ttulo alcanzado a los 15 das post-vacunacion se mantuvo constante
en el suero pre-desafo y en los sueros obtenidos tras el desafo con C-S8c1. El ttulo de anticuerpos
fue muy similar al que proporciona la vacunacion de la misma estirpe de ratones con la vacuna de
VFA inactivada comercial (Salguero y col. 2005).
5.3.4. Los ratones vacunados con C-S8p260 generan anticuerpos neutralizantes
La respuesta inmune contra el VFA en el hospedador natural es principalmente del tipo Th2
o humoral (McCullough y Sobrino 2004). La presencia de anticuerpos neutralizantes en el suero
de animales vacunados se ha correlacionado con los niveles de protecci on de vacunas frente a VFA
(Barteling 2004). Para evaluar la capacidad neutralizante de los anticuerpos presentes en ratones
vacunados con las poblaciones C-S8p260 y C-S8p260p3d, se realizaron ensayos de neutralizaci on de
infectividad de C-S8c1 en celulas BHK-21 (Tabla 7). Se analizaron sueros de 10 animales vacunados
con distintas dosis de cada virus, y se calcul o el PRN70 (ver apartado 4.10.4 de Materiales y
metodos). Tanto los ratones inoculados con la dosis alta como los vacunados con la dosis baja de
85
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 1 2 7 15 30
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t
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l
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g
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10
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PFU
C-S8p260p3d
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5
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510
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C-S8p260
B
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3
4
5
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9
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3
PFU
C-S8p260
9
1
2
3
4
5
6
7
8
0 1 2 3 4
10
4
PFU C-S8c1
1
2
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4
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6
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0 1 2 3 4
10
4
PFU C-S8c1
1
2
3
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5
6
7
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0 1 2 3 4
10
4
PFU C-S8c1
9
9
Das post-vacunacin
Das post-desafo
A C
Figura 30: Ttulo viral en el suero de ratones C57BL/6 vacunados. Ratones
hembra con ocho semanas de edad fueron inoculados en la almohadilla plantar con
diferentes variantes y dosis del VFA, indicadas en cada panel. En los das indicados se
extrajo sangre, se separo el suero y se titulo la carga viral del virus vacunal (C-Sp260p3d
o C-S8p260) en celulas BHK-21 (paneles superiores). A los 90 das post vacunacion los
animales fueron desaados con 1 10
4
PFU de C-S8c1. Los das siguientes al desafo
(paneles inferiores) se titulo el suero extrado de la sangre, para detectar replicaci on de
C-S8c1. A) Media y desviacion estandar del tulo viral en el suero de 19 animales. La
lnea punteada representa el lmite de detecci on del ttulo de C-S8p260p3d o C-S8c1.
B) y C) Media y desviacion estandar del ttulo viral en el suero de 16 animales. La
lnea de puntos y rayas representa el lmite de detecci on del ttulo de C-S8p260. Los
lmites de detecci on para C-S8p260p3d (panel superior) o para C-S8c1 (panel inferior)
se representan con una lnea punteada.
86
1
2
3
4
5
6
1 2 7 15 30 90 1 2 3 15 30
C-S8p260p3d
(110
7
PFU)
7
1
2
3
4
5
6
1 2 3 15 30 90 1 2 3 15 30
1
2
3
4
5
6
1 2 3 1 2 3 15 30
C-S8p260
(510
6
PFU)
T

t
u
l
o
E
L
I
S
A
(
L
o
g
1
0
)
Das
post-vacunacin
Das
post-desafo
Das
post-vacunacin
Das
post-desafo
Das
post-vacunacin
Das
post-desafo
C-S8p260
(510
6
PFU)
30 9 1 0
A B C
Figura 31: Respuesta de anticuerpos en ratones vacunados con C-S8p260p3d
y C-S8p260. Ttulo de anticuerpos IgG2 (calculado como se describe en el apartado
4.10.5 de Materiales y metodos) estimado mediante ELISA en el suero de animales
vacunados. En el interior de cada panel se indica el virus y dosis de vacunacion o
desafo con el que fueron inoculados los animales. A) Media y desviacion estandar del
ttulo de anticuerpos en el suero de 20 animales. B) Media y desviacion estandar del
ttulo de anticuerpos en el suero de 16 animales. C) Media y desviacion estandar del
ttulo de anticuerpos en el suero de 15 animales.
C-S8p260p3d
a
C-S8p260
b
Pre-desafo Pre-desafo 72h post-desafo Pre-desafo 72h post-desafo
rat on PRN70 rat on PRN70 rat on PRN70 rat on PRN70 rat on PRN70
1 2,9 5 2,0 5 1,8 5 2,0 5 1,9
2 2,6 6 2,0 6 2,0 6 2,1 6 1,8
3 2,7 8 2,4 8 2,2 8 0 7 1,8
4 2,7 9 2,1 9 1,9 9 1,7 8 1,8
5 2,7 10 1,3 10 1,5 10 1,4 9 2,4
6 2,6 11 1,7 11 1,8 11 1,6 10 1,8
7 2,7 12 0,4 12 1,9 12 1,4 11 1,8
8 3,1 13 1,7 13 1,8 13 0,6 12 1,1
9 1,8 14 2,7 14 2,4 14 1,4 14 1,5
10 3,0 15 1,9 15 1,9 15 1,7 15 1,8
Media 2,7 1,8 1,9 1,4 1,8
Desv. Est. 0,3 0,6 0,2 0,6 0,3
Tabla 7: Ttulo de anticuerpos neutralizantes en ratones vacunados con C-S8p260 y
C-S8p260p3d. El ttulo de anticuerpos neutralizantes se estim o calculando el PRN70, como se
especica en el apartado 4.10.4 de Materiales y metodos.
a
Ttulo de anticuerpos neutralizantes en sueros de ratones vacunados con 110
7
PFU de
C-S8p260p3d, en el momento del desafo con C-S8c1 (90 das post vacunacion). Los ratones
empleados aparecen numerados. Poblaciones virales discriminadas positivamente mediante las
amplicaciones especcas indicadas.
b
Ttulo de anticuerpos neutralizantes en sueros de ratones vacunados con 510
6
o 110
3
PFU de
C-S8p260, en el momento del desafo con C-S8c1 (90 das post vacunacion) y 72h despues del desafo.
87
C-S8p260, presentaron un PRN70 cercano a 2 a las 72h post-desafo. El suero pre-desafo de los
ratones vacunados con la dosis baja presentaba un ttulo de neutralizaci on algo menor. Los animales
vacunados con C-S8p260p3d presentaron un PRN70 cercano a 3 en los sueros previos al desafo.
Los resultados conrman que la vacunacion con virus defectivo induce la aparicion de anticuerpos
neutralizantes dirigidos contra VFA.
5.4. Topologa de poblaciones virales sometidas a mutagenesis
El presente estudio esta dirigido a analizar retrospectivamente grupos de secuencias de nucleoti-
dos tanto consenso como de poblaciones clonales, obtenidas en nuestro laboratorio a partir de pobla-
ciones del VFA sometidas a infecciones citolticas en celulas BHK-21. Las infecciones se realizaron
en ausencia o en presencia de los an alogos de base o nucleosidos mutagenicos 5-uorouracilo (FU),
5-azacitidina (AZC), ribavirina (R) (Gonzalez-Lopez y col. 2004; Gonzalez-Lopez y col. 2005; Sierra
y col. 2007; Sierra y col. 2000) (Figura 32).
5.4.1. Evaluaci on logenetica de la diversicaci on genetica inducida por la mutagene-
sis en las poblaciones de VFA
Se obtuvo una representaci on de cada cuasiespecie determinando la secuencia de nucleotidos de
5 a 21 clones de cDNA de cada poblacion, y determinando los tipos de mutacion y la complejidad
del espectro de mutantes. Se utilizo la regi on codicante de la polimerasa 3D (Tabla 8). Los arboles
logeneticos se construyeron a partir de secuencias de nucleotidos de clones de cDNA individuales,
incluyendo tambien la secuencia consenso de la poblacion correspondiente. Como secuencia externa
(outgroup), se introdujeron secuencias de varios virus de referencia para establecer las relaciones
mnimas y previamente conocidas, as como para denir la estructura general del arbol. Se utilizo el
algoritmo de NJ (Saitou y Nei 1987), con el modelo de Kimura 2-parametros (Kimura 1980) para
reconstruir las logenias, tal como se describe en Materiales y metodos. En algunos casos se con-
rm o la topologa de los arboles mediante los metodos de m axima verosimilitud (MV) y m axima
parsimonia (MP) (Felsenstein 1989) (vease Materiales y metodos 4.23 y apendice logenetico). La
comparacion de los arboles logeneticos realizada a partir de las secuencias de nucleotidos de clones
procedentes de poblaciones de VFA pasadas 1 y 25 veces en presencia o ausencia de AZC o FU,
muestra una expansion de las distancias geneticas entre los componentes del espectro de mutantes
de las poblaciones, como resultado del tratamiento con FU y, en menor medida, como resultado
del tratamiento con AZC (Figura 33). Esta expansion no se observa en el pase 1 en presencia o
en ausencia de AZC o de FU. Las ramas irradian de las secuencias consenso correspondientes sin
agrupaciones (clusters) discernibles dentro de cada poblacion.
En las poblaciones de VFA clon MARLS (ver Materiales y metodos, apartado 4.2), pasadas
en presencia de R (Figura 34) se observ o un patron m as complejo de distancias geneticas intrapo-
blacionales. La topologa general de poblaciones sometidas a un tratamiento mutagenico continuo
(RAp35, RAp45 y RAp60; cuyas historias de pases se muestran en la Figura 32-B), indica de nue-
vo la ausencia de agrupaciones signicativas. En todos los casos, un grupo de clones divergen de
manera centrfuga a partir de la secuencia consenso, localizada en la base del grupo. A medida
que aumenta el n umero de pases en presencia de R, se incrementan sustancialmente las distan-
cias geneticas entre las secuencias consenso de cada poblacion y el clon parental MARLS (hasta
11 veces desde el pase 35 al pase 60; Figura 34-A). Es muy notable que las dos poblaciones que
fueron sometidas en paralelo a 30 pases en presencia de R y despues a 5 pases en ausencia de R,
presentan una estructura interna modicada, tal y como se reeja en la topologa m as compacta y
en la distribucion de los arboles logeneticos con ramas estructuradas en subgrupos (RA0p35* y
88
C-S8c1
p1 p25
.....
p1 p25
.....
p1 p25
.....
sin droga
[200g/ml]
FU
A
B

C-S8c1
p1
p213
MARLS
.....

RAp35
[200-800mM] R
[800mM] R

RAp45
RAp60
RA0p35
[800mM] R
sin droga

[800-5000mM] R
RAp30

sin droga
CAp35

RB0p35
sin droga

[200g/ml]
FU
[10g/ml]
AZC
[10g/ml]
AZC
sin droga
sin droga

[200-800mM] R
sin droga
Figura 32: Esquema de pases del clon biol ogico C-S8c1 en celulas BHK-21, su-
jeto a diferentes tratamientos. Los clones biol ogicos se representan como cuadrados
negros y las poblaciones sin clonar como crculos blancos. Las echas gruesas indican
pases a alta MDI (1 a 5 PFU/celula). La ausencia o presencia de droga y su concentra-
ci on se indica encima de las echas correspondientes. A) El clon biol ogico C-S8c1 fue
sometido a tres series paralelas de infecciones citolticas, en presencia de 5-uorouracilo
(FU) o de 5-azacitidina (AZC) o en ausencia de droga. B) C-S8c1 fue sometido a 213
pases, a partir de cuya poblacion se aisl o el clon MARLS como mutante resistente al
anticuerpo monoclonal SD6 (echa delgada). Las poblaciones RA y RB se originaron
tras infecciones citolticas seriadas, en paralelo, del clon MARLS en presencia de las
concentraciones indicadas de R. En el pase 30 se realiz o una bifurcacion y la pobla-
ci on fue sometida a 5 pases adicionales en ausencia de R, dando lugar a la poblacion
RA0p35. CAp35 es la poblacion obtenida tras pasar en paralelo el clon MARLS 35 veces
en ausencia de droga.
89
C
S
8
c
1
M
A
R
L
S
0.001
C-S8c1
M
A
R
L
S
Pase 1
Pase 25
A
Z
C
p
1
*
F
U
p
1
*
s
i
n
d
r
o
g
a
p
1
*
A
Z
C
p
2
5
*
sin droga p25*
F
U
p
2
5
*
65
65
51
64
P
P
P
P
P
Figura 33: Analisis logenetico de clones moleculares individuales de las po-
blaciones de VFA pasadas en ausencia y en presencia de mutagenos. Los
arboles se construyeron con secuencias de la regi on que codica la polimerasa 3D (nu-
cleotidos 6609 a 8013; numeraci on de los residuos del genoma del VFA C-S8c1 seg un
(Escarmis y col. 1996)). El an alisis se realiz o con la progenie del virus C-S8c1 obtenida
tras los pases 1 y 25 en celulas BHK-21 (Figura 32-A), en presencia o ausencia de 5-
uorouracilo (FU) o 5-azacitidina (AZC) . Se utilizo el metodo de NJ, con el algoritmo
de Kimura 2-parametros, y un muestreo por bootstrap de 1000 veces. Los valores de
bootstrap mayores de 50 se indican en los nodos correspondientes. Cada punto represen-
ta la secuencia de un clon individual de la siguiente manera: rojo, clones de poblaciones
pasadas en ausencia de droga (sin droga); verde, clones procedentes de poblaciones pasa-
das en presencia de FU; azul, clones procedentes de poblaciones pasadas en presencia de
AZC. La posicion de la secuencia consenso de las correspondientes poblaciones se indica
con un asterisco. MARLS se incluye como secuencia de referencia externa (outgroup).
La barra marca la escala de distancia genetica seg un el modelo de Kimura 2 par ametros.
Las secuencias centrales seg un PAQ se indican con una echa. El origen de los virus, los
procedimientos para el an alisis clonal y las determinaciones de la secuencias se detallan
en Materiales y metodos.
90
0.002
R
A
p
6
0
*
M
A
R
L
S
p
2
6
0
p
3
d
p
2
0
0
C
S
8
c
1
99
100
79
98
76
C
S
8
c
1
p
2
6
0
p
3
d
p
2
0
0
M
A
R
L
S
R
A
p
3
5
*
78
(73)
76
R
A
0
p
3
5
*
MARLS
p
2
6
0
p
3
d
p
2
0
0
C
S
8
c
1
98
(71)
0.002
A B
CAp35*
MARLS
p200
p260p3d
C
S
8
c
1
99
(65)
RAp45*
M
A
R
L
S
p
2
6
0
p
3
d
p200
C
S
8
c
1
99
99
(66)
(64)
P
P
P
R
A
p
3
5
*
M
A
R
L
S
p
2
6
0
p
3
d
p
2
0
0
C
S
8
c
1
99
81
91
(63)
(62)
(70)
P
P
P
R
B
0
3
5
*
M
A
R
L
S
p3d
p
2
0
0
C
S
8
c
1
91
98
85
53
65
Figura 34: Analisis logenetico de clones moleculares individuales de las subpoblaciones
de MARLS pasadas en presencia o ausencia de ribavirina. Los arboles se construyeron con
el metodo de NJ, con el modelo de Kimura 2-parametros, con un valor de muestreo de bootstrap de
1000 veces. Los nodos con valores de bootstrap mayor de 50 se indican en el arbol. Cada arbol re-
presenta una unica poblacion del linaje de MARLS representado en la Figura 32-B. Cada poblacion
se identica con el nombre de su secuencia consenso correspondiente, indicado con un asterisco.
Cada punto representa la secuencia de un clon molecular individual. Las secuencias centrales seg un
PAQ se indican con una echa. A)

Arboles construidos con secuencias de la regi on que codica la
polimerasa 3D (nucleotidos 6667 a 7997; numeraci on de los residuos seg un Escarmis y col. 1996).
B) Comparaci on de la posicion logenetica de los clones derivados de las poblaciones RAp35 y
RA0p35.

Arboles construidos con los residuos 7150-7997 que corresponden a la regi on genomica
que codica la polimerasa 3D. N otese la reestructuracion de la poblacion tras 5 pases en ausencia
de R (segundo y tercer arbol respecto al primero).
91
RB0p35* en la Figura 34-B).
Debido a las relaciones tan cercanas entre las secuencias de nucleotidos analizadas, los valores
de bootstrap en los arboles NJ indican que la robustez de las agrupaciones obtenidas es limitada. A
pesar de ello, al reconstruir las mismas logenias utilizando los metodos de MP y MV (ver apendice
logenetico) la topologa general de los arboles fue coherente con la encontrada con el metodo de
NJ.
La poblacion control CAp35, obtenida tras 35 infecciones citolticas seriadas del clon MARLS
en cultivos celulares y en ausencia de mutageno, presenta un arbol caracterstico con una diversidad
evidentemente menor que las poblaciones tratadas con mutageno (Figura 34-A). Dicha poblacion
tiene unos valores de frecuencia de mutaci on 12 veces menores que su paralela RAp35 pasada en
presencia de R (Tabla 8), as como un tama no medio mucho menor de longitud de ramas.
92
Poblaci on
a
Residuos
b
N
o
clo-
nes
Nt
secuen-
ciados
Tratamiento
c
Muta-
ciones
d
Transi-
ciones
e
Transver-
siones
e
Frecuencia
mnima
de muta-
cion
f
Frecuencia
maxima de
mutacion
g
Relaci on
min/max
H
h
d
i
Sin droga p1
6609-
8013
5 7025 Sin droga 2/2 0.50 0.50 0.28 0.28 1 0.64 0.50
AZCp1
6609-
8013
5 7025 [10mg/ml] AZC 1/1 0 1 0.14 0.14 1 0.31 0.25
FUp1
6609-
8013
5 7025 [200mg/ml] FU 2/2 1 0 0.28 0.28 1 0.64 0.50
Sin droga
p25
6609-
8013
5 7025 Sin droga 1/3 1 0 0.14 0.42 0.33 0.8 0.75
AZCp25
6609-
8013
18 25290 [10mg/ml]AZC 13/19 0.21 0.79 0.51 0.75 0.68 0.73 2.31
FUp25
6609-
8013
5 7025 [200mg/ml] FU 14/19 1 0 1.99 2.7 0.74 1 6.75
CAp35
7150-
8020
21 27951 Sin droga 17/17 0.88 0.12 0.61 0.61 1 0.23 0.85
RA0p35
7150-
7997
21 18291 [800M] R, 17/68 0.75 0.25 0.93 3.71 0.25 1 3.62
Sin droga
RAp35
6667-
7997
14 18634 [500-800M] R 55/139 0.91 0.09 2.95 7.46 0.39 1
13.15
(7.85)
RAp45
6667-
7997
12 15972 [800M] R 31/49 0.76 0.24 1.96 3.07 0.64 1 6.91
RAp60
6667-
7997
15 18634 [800-5000M] R 55/80 0.97 0.02 2.95 4.29 0.69 1 7.62
Tabla 8: Caracterizaci on de los espectros de mutantes de poblaciones sometidas a diferentes tratamientos mutagenicos.
a
El origen de las distintas poblaciones de VFA se detalla en Materiales y metodos, y se representan esquematicamente en la Figura 32.
b
Los residuos gen omicos analizados corresponden a la zona que codica la polimerasa 3D del genoma de VFA, siguiendo la numeracion del genoma
de VFA descrita en (Escarmis y col. 1996).
c
El tratamiento con drogas (AZC, azacitidina; FU, 5-uorouracilo; R, ribavirina), y las concentraciones son las descritas en la Figura 32.
d
El primer n umero indica la cantidad total de mutaciones diferentes encontradas en todos los clones analizados, contando una sola vez las mutaciones
repetidas; el segundo n umero hace referencia al numero total de mutaciones, contando las repetidas.
e
Expresado por 1 en cada poblaci on.
f
La frecuencia de mutacion mnima es el n umero de mutaciones diferentes dividido por el total de nucle otidos secuenciados.
g
La frecuencia de mutacion maxima es el n umero de mutaciones totales dividido por el total de nucle otidos secuenciados.
h
H es la entropa de Shannon normalizada (Volkenstein, 1994).
i
d es la distancia genetica media.
9
3
5.4.2. Partition analysis of quasispecies (PAQ) aplicado al analisis clonal de pobla-
ciones de VFA mutagenizadas
Para caracterizar en profundidad la estructura clonal de las poblaciones mutagenizadas de VFA,
se aplico el programa informatico PAQ a las mismas poblaciones vricas estudiadas por logenia.
Las secuencias, determinadas a partir de los clones moleculares de cada poblacion, fueron tratadas
como poblaciones individuales, y todas las secuencias se agruparon juntas bajo el mnimo radio
posible sin tener en cuenta ninguna particion. Se midi o el valor d (distancia genetica media),
que se utilizo como medida de diversidad intrapoblacional (Figura 35). La ausencia de particiones
intrapoblacionales es una suposicion realista a priori, dado que cada poblacion viral deriva de
ancestros bien denidos, y su evolucion tuvo lugar en condiciones controladas de laboratorio. El
an alisis PAQ de las poblaciones derivadas del clon C-S8c1 tras 25 pases en presencia de FU o
AZC, o ausencia de mutageno, muestra una expansion de 6 veces en la diversidad intrapoblacional,
como resultado de la propagacion del virus en ausencia de mutageno, y una expansion de 13,5
y 9,2 veces como resultado de pases en presencia de FU o AZC, respectivamente (Figura 35-
B). Estos valores ilustran de nuevo el mayor potencial mutagenico del FU que del AZC (test de
Tukey post hoc, p=0.004) para el VFA replicando en celulas BHK-21 (Sierra y col. 2000). Los
datos son tambien concordantes con el incremento en distancias geneticas entre componentes de
las poblaciones mutagenizadas que se observa en la logenia (comparese con la Figura 33).
El an alisis por PAQ revel o un efecto dramatico al comparar las poblaciones MARLS pasadas
en presencia o ausencia de R (Figura 35-B). De una manera notable, m ultiples pases en presencia
de concentraciones de hasta 800M de R (la concentraci on de R se incremento secuencialmente
a lo largo de los pases, comenzando con 200M), dio como resultado poblaciones con diferencias
signicativas en el valor d (One-way ANOVA: F=85.5, df=65, p<0.001.). La poblacion RAp35
presenta un valor d 15,5 veces mayor que la poblacion control CAp35 (test post hoc de Tukey,
p<0,001), que se pas o en paralelo 35 veces en ausencia de droga (Figura 35-B). La extensa diversidad
alcanzada en presencia de R disminuyo signicativamente, cuando la poblacion RAp35 se sometio a
pases adicionales en presencia de 800M R. La reduccion fue de 1,9 veces en el valor d (test post
hoc de Tukey, p<0,001). La diversidad no aumento signicativamente (1,1 veces, test post hoc de
Tukey, p=0,9) despues de 15 pases adicionales en presencia de concentraciones crecientes de R,
hasta alcanzar R 5000M.
La diversidad intrapoblacional vuelve a ser baja en la poblacion RA0p35, que es la resultante
de replicar durante 5 pases en ausencia de R, despues de 30 pases en presencia de R (Figura 32-B).
La distancia media d de RA0p35 es 2,1 veces menor que la de RAp35 (test post hoc de Tukey,
p<0,001). Estos resultados concuerdan con la estructura m as compleja de los arboles logeneticos
de la poblacion RA0p35 respecto a la poblacion RAp35 (ver Figura 34-B para los arboles NJ y el
apendice logenetico para los arboles MV y MP).
La polimerasa 3D de la poblacion de VFA RAp35, y las poblaciones derivadas de esta, inclu-
ye la mutaci on M296I, la cual disminuye la sensibilidad del VFA por la R (Sierra y col. 2007)
(Introducci on, apartado 2.3.1.). As pues, la complejidad de la cuasiespecie puede sufrir dos tipos
de transicion, primero un temprano incremento cuando las poblaciones son sometidas a una mu-
tagenesis incrementada, y segundo, una reduccion de la diversidad intrapoblacional debido a la
eliminacion de la R, o la selecci on de virus con mayor resistencia a R.
La modicaci on de la relaci on entre componentes del espectro de mutantes no se ve reejada en
la entropa de Shannon (la cual se satura en el valor m aximo, 1, en todas las poblaciones del linaje
RA analizadas). Asimismo, la frecuencia m axima de mutacion vara en una rango estrecho de entre
1,7 y 2,4 veces, cuando las diferentes poblaciones se comparan con RAp35. La relaci on de frecuencia
de mutaci on mnima/m axima, que describe el grado de relaci on entre clones, es ligeramente menor
94
No drug p1
d=0.50
AZCp1
d=0.25
FUp1
d=0.50
sin droga p25
d=0.75
AZCp25
d=2.31
FUp25
d=6.75
C-S8c1
A
d=0.0
RAp35
d=13.15
(7.85)
RAp45
d=6.91
RAp60
d=7.62
CAp35
d=0.85
MARLS
[200-800 M] R
[800 M] R
sin droga
[800-5000 M] R
B
RA0p35
d=3.62
d=0.0
sin droga
(desde el pase30)
[800 M] R
sin droga
[200 g/ml] FU
[10 g/ml] AZC

Figura 35: Analisis con el software PAQ aplicado a secuencias derivadas de las
poblaciones mutagenizadas de VFA. El clon biol ogico inicial de cada serie de pases
se representa con un punto negro, al cual se le atribuye arbitrariamente una distancia
media intrapoblacional con un valor de d=0.0. Las poblaciones analizadas en A y B son
aquellas descritas en las Figuras 32-A y 32-B, respectivamente. Se indica el tratamiento
mutagenico: FU, 5-uorouracilo; AZC, azacytidina; R, ribavirina. El valor de d para
cada poblacion se calcul o sin considerar ninguna particion. Los valores se basan en
las secuencias de nucleotidos de la regi on que codica la polimerasa 3D (nucleotidos
6609 a 8013 para A, y 6667 a 7997 para B), excepto para la poblacion RA0p35 en
la que se utilizo la zona comprendida entre los nucleotidos 7150 y 7997. Para facilitar
las comparaciones, el valor d de RAp35, medido con los nucle otidos 6667 a 7997, se
representa como un crculo de lnea discontinua dentro del crculo grande, obtenido con
los nucleotidos 6069 a 8013. El di ametro de los crculos es proporcional al valor d, que
aparece indicado al lado de cada crculo. Los procedimientos de secuenciacion y an alisis
PAQ se describen en Materiales y metodos.
95
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 A
/
C
A
/
G
A
/
U
C
/
A
C
/
G
C
/
U
G
/
A
G
/
C
G
/
U
U
/
A
U
/
C
U
/
G
FUp1
FUp25
P
o
r
c
e
n
t
a
j
e
d
e
m
u
t
a
c
i
o
n
e
s
A
/
C
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/
G
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U
C
/
A
C
/
G
C
/
U
G
/
A
G
/
C
G
/
U
U
/
A
U
/
C
U
/
G
sin droga-p25
(C-S8c1)
CAp35 (MARLS)
CBp35 (MARLS)
C-S8c1
AZCp1
AZCp25
C-S8c1
A
/
C
A
/
G
A
/
U
C
/
A
C
/
G
C
/
U
G
/
A
G
/
C
G
/
U
U
/
A
U
/
C
U
/
G
MARLS
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,2
0,4
0,6
0,8
1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
A
/
C
A
/
G
A
/
U
C
/
A
C
/
G
C
/
U
G
/
A
G
/
C
G
/
U
U
/
A
U
/
C
U
/
G
RAp35
RAp45
RAp60
RAp035
Figura 36: Proporci on de los diferentes tipos de mutaciones halladas en los
clones de las poblaciones de VFA. Cada tipo de mutaci on (eje de abscisas) se
conto para las poblaciones indicadas en cada panel, que derivan de MARLS o de C-
S8c1 (indicado dentro de cada panel). Las poblaciones analizadas se representan en
la Figura 32, y se pueden identicar en funcion de su tratamiento mutagenico (FU,
5-uorouracilo; AZC, azacitidina; R, ribavirina; y las poblaciones denominadas sin
droga o denominadas con una C son poblaciones control pasadas en ausencia de
droga. Los tipos de mutaci on se han contado comparando la secuencia de nucleotidos de
cada clon molecular individual con su correspondiente secuencia consenso poblacional.
Las regiones genomicas y el n umero de nucleotidos analizados para cada poblacion se
describen en la Tabla 8.
(menos diversidad) en la poblacion RA0p35 que en RAp35, aunque esta diferencia no es signica-
tiva (one-way ANOVA: F=2.57, gl=1.33, p=0.118). Sorprendentemente, la relaci on frecuencia de
mutaci on mnima/m axima es mayor en las poblaciones RAp45 y RAp60 (mayor diversidad) que
en la poblacion RAp35 (test post hoc de tukey, p=0,0073 y p=0,013, respectivamente), a pesar de
de tener valores de d menores y por tanto menor diversidad intrapoblacional. Estas comparaciones
sugieren que el valor d es un descriptor m as sensible y realista de la diversidad intrapoblacional
que la frecuencia de mutacion.
5.4.3. Analisis mutacional y tasas de jaci on de nucle otidos
El perl de mutaciones en los componentes del espectro de mutantes de cada poblacion analizada
(Figura 36), indic o la presencia de un patron especco de mutaciones asociado a cada mutageno. Las
poblaciones tratadas con FU acumularon un exceso de transiciones UC (Agudo y col. 2008; Sierra
y col. 2000), mientras que las poblaciones tratadas con R jaron preferencialmente transiciones
CU y GA (Pariente y col. 2005). El sesgo mutacional asociado a la mutagenesis por AZC en
VFA no esta claro (Sierra y col. 2000), y en las poblaciones aqu analizadas la expansion de la
diversidad desde el pase 1 al 25 en presencia de AZC se debio principalmente a transversiones
GC y CG.
Los arboles NJ construidos con secuencias consenso de genomas completos de VFA de las
poblaciones RA y virus relacionados, mostro una inusual y rapida jacion de mutaciones en la
secuencia consenso de RAp45 (Figura 37-A). Durante el transcurso de pases citolticos seriados de C-
S8c1 en celulas BHK-21, se acumularon mutaciones con una tasa promedio de 0,20 mutaciones/pase
(Escarms y col. 2008). El clon MARLS mostro una tasa similar de 0,24 mutaciones/pase. Sin
embargo, el linaje RA se desvio de estos valores y presento una tasa de acumulacion de mutaciones
de 1,13 mutaciones/pase, sugiriendo que se produce una evolucion extremadamente rapida en los
virus pasados en presencia de R (Figura 37-B).
96
0
20
40
60
80
100
120
100 200 300
Nmero de pase
M
u
t
a
c
i
o
n
e
s
f
i
j
a
d
a
s
0
Linaje C-S8c1
MARLS
RAp45
p260 p3d
p200
MARLS
RAp35
RAp45
p143
p100
p50
CS8c1
C
280a
10
FMDV-C-Oberbayern
100
100
100
87
97
0.002
A B
Figura 37: Cuanticaci on de la divergencia genotpica de poblaciones de VFA
pasadas en presencia de ribavirina. Se analizaron las poblaciones de VFA derivadas
de C-S8c1 o MARLS que se muestran en la Figura 32-A)

Arbol logenetico basado en
secuencias consenso de genomas completos de las poblaciones vricas derivadas del clon
C-S8c1 (p50, p100, p143, p200, p260p3d) y de MARLS (RAp35, RAp45). C
10
280a
es un
clon de C-S8c1 que fue sometido a 280 pases seriados en cuello de botella (placa a placa;
Escarmis y col. 1996; Escarms y col. 2008). VFA C-Oberbayern es un aislado natural
(Carrillo y col. 2005) cuya secuencia se utiliza como referencia. El algoritmo utilizado es
el de NJ con un valor de remuestreo de 1000 replicas (se indican los nodos con valores
superiores a 75). B) N umero absoluto de mutaciones (incluyendo reversiones), relativo
a la secuencia de C-S8c1 y pases sucesivos (linaje C-S8c1) en funcion del n umero de
pases de cada poblacion. Los valores se han calculado a partir del an alisis de secuencias
consenso de genomas completos. Se muestra una recta de regresion lineal construida con
los puntos del linaje C-S8c1 (y=0.1987x-1.6922; R
2
=0.9882). La posicion de MARLS y
RAp45 se especica en la gr aca.
5.4.4. Evidencia de selecci on puricadora durante la mutagenesis incrementada
Hemos examinado si la elevada acumulacion de mutaciones en los genomas RA era debida a
una jacion al azar de mutaciones a lo largo del genoma, o si, por el contrario, las mutaciones
se acumularon de manera preferencial en determinadas zonas del genoma. Se utilizo el software
K-estimator (Comeron 1999) (descrito en Materiales y metodos, apartado 4.24) para medir la
distribucion de mutaciones a lo largo del marco de lectura abierto (la regi on codicante de la
poliprotena) de MARLS, RAp35 y RAp45. Los resultados (Figura 38) indican que en ciertas
zonas del genoma, la Ka (mutaciones no sinonimas/nucleotido) y la Ks (mutaciones sinonimas/
nucleotido) de RAp35 y RAp45 muestran valores que son signicativamente superiores a la media.
La distribucion asimetrica de mutaciones sugiere que, a pesar de la elevada presi on mutacional
impuesta por el tratamiento con R, alg un tipo de selecci on sigue actuando durante la replicaci on
del virus con baja delidad de copia.
Para distinguir si la distribucion asimetrica de mutaciones a lo largo del genoma se debio prin-
cipalmente a selecci on positiva o negativa (puricadora), se calcul o para las distintas poblaciones
la tasa de mutaciones no sinonimas corregidas por sitios no sinonimos (dn) dividida por el n umero
de mutaciones sinonimas corregidas por el n umero de sitios sinonimos (ds) (Tabla 9). El linaje RA
presenta un exceso de entre 6 y 15 veces de mutaciones sinonimas sobre no sinonimas, tanto al ana-
lizar secuencias consenso como clones moleculares. Este resultado sugiere que la estirpe RA estuvo
sometida a una fuerte selecci on puricadora. Contrariamente, poblaciones que han evolucionado
sin restricciones de tama no poblacional ni fueron sometidas a tratamiento mutagenico en los pases
97
L
VP4
VP2 VP3 VP1 2B 2C 3A 3C
2A
3D
5 UTR 3
UTR
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
K
s
L
VP4
VP2 VP3 VP1 2B 2C 3A 3C
3B
2A
3D
3
UTR
5 UTR
0.002
0.006
0.01
0.014
0.018
0
K
a
MARLS
RAp35
RAp45
L
VP4
VP2 VP3 VP1 2B 2C 3A 3C
3B 2A
3D
5 UTR
Ks RAp45
Ka RAp45
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
Genoma VFA
K
a
,
K
s
3
UTR
3B
A
C
B
MARLS
RAp35
RAp45
Figura 38: Distribuci on de los valores para Ka y Ks a lo largo de la secuencia
consenso de la regi on codicante en los genomas VFA MARLS, RAp35 y
RAp45. El origen de estas poblaciones se muestra en la Figura 32. Para los calculos
se compararon las secuencias con respecto a C-S8c1. El calculo de Ka (mutaciones no
sinonimas por nucleotido) y Ks (mutaciones sinonimas por nucleotido) se realiz o me-
diante el software K-estimator (Comeron 1999). Los genomas se analizaron en ventanas
de 200 nucleotidos, desplazandose 100 nucleotidos en cada paso. El eje de abscisas se
ha substituido por un esquema a escala de la regi on codicante de C-S8c1 (Sobrino y
Domingo 2004). La lnea discontinua horizontal que cruza las gr acas marca el lmite
superior del intervalo de conanza seg un la distribucion de Poisson. A) Relacion Ka. B)
Relacion Ks. C) Comparaci on de las relaciones Ka y Ks de la poblacion RAp45.
98
dn/ds dn/ds
Poblaci on viral
a
(clones moleculares)
b
(secuencias consenso)
c
RAp35 0.16 N.D
RAp45 0.08 0.09 (MALRS)
RAp60 0.07 0.08 (MARLS)
RA0p35 0.12 N.D.
C-S8c1 pases 1263 ND 0.63 (C-S8c1)
MARLS 1.21
d
0.65 (C-S8c1)
Tabla 9: Tasa corregida de mutaciones no sin onimas por mutaciones sin onimas en
poblaciones y clones moleculares de VFA con diferente historia evolutiva.
a
El origen de las distintas poblaciones de VFA se detalla en Materiales y metodos, y se representan
esquem aticamente en la Figura 32.
b
dn/ds es la relaci on de mutaciones no sinonimas (corregidas por sitio no sinonimo) respecto a
mutaciones sinonimas (corregidas por sitio sinonimo), calculado como se describe en Materiales y
metodos (Nei, 1986; Korber, 2001). Los valores corresponden a los calculos utilizando secuencias
de nucleotidos de clones moleculares (como se describe en la Tabla 8). N.D, no determinado.
c
dn/ds, calculado como en b, aplicado a secuencias consenso de genomas completos, comparadas
con el clon parental correspondiente (en parentesis).
d
Este valor se calcul o con clones biol ogicos derivados de MARLS, usando la regi on que codica la
proteasa L y la capsida.
citolticos (ver MARLS y linaje C-S8c1 (Garca-Arriaza y col. 2006) en la Tabla 9), presentaron una
relaci on dn/ds entre 17 y 7,5 veces mayor que las poblaciones RA al comparar clones moleculares,
y entre 7 y 8 veces mayor al comparar secuencias consenso. Ello sugiere un efecto mucho m as debil
o ausente de la selecci on puricadora en los virus que replicaron en ausencia de mutageno.
Los resultados de la determinacion de la relaci on dn/ds, junto con la observaci on de la distri-
bucion asimetrica de mutaciones, sugiere que la seleccion puricadora act ua durante la evolucion
de poblaciones virales sometidas a tratamiento mutagenico.
5.4.5. Extinci on viral sin un exceso aparente de mutaciones
Pases en cultivos celulares del VFA en presencia de bases mutagenicas o an alogos de nucleosidos
puede ocasionar la extinci on viral, en una proceso denominado mutagenesis letal (Anderson y col.
2004; Domingo 2005; Eigen 2002; Graci y Cameron 2002) (ver Introducci on, apartado 2.3). Para
investigar si la extinci on de VFA por mutagenesis letal se asoci o a un aumento inusual de la
divergencia intrapoblacional, se realiz o un an alisis PAQ de poblaciones derivadas de C-S8c1 tras 3
pases citolticos seriados en presencia de una combinacion de FU y el inhibidor de la replicaci on de
picornavirus clorhidrato de guanidinio (G) (Pincus y Wimmer 1986) (Figura 39). La combinacion
de FU y G di o lugar a una extinci on muy eciente del VFA (Pariente y col. 2001). C-S8p3-FUG es
la ultima poblacion de la serie de pases mostrada en la Figura 39-A, que todava produjo material
genetico amplicable por RT-PCR (Gonzalez-Lopez y col. 2004). La poblacion preextincion C-S8p3-
FUG mostro un incremento modesto en la complejidad de su espectro de mutantes con respecto
a la poblacion control C-S8p3. Adem as, la complejidad de C-S8p3-FUG fue mucho menor que la
correspondiente a RAp35, tanto seg un el an alisis por PAQ (comparaci on de las distancias medias:
T-student, t=12.19, p<0.001) como seg un la topologa general de los arboles logeneticos (Figura
39-B,C). Por tanto, la extinci on viral se puede conseguir sin un incremento muy evidente de las
99
M
A
R
L
S
C
S
8
c
1
C
1
0
2
8
0
98
91
60
74 0.001 0.001
p260p3d
p
2
0
0
d=12.38
RAp35
d=0.60
C-S8p3-FUG
d=0.37
C-S8p3
A
C-S8c1
[4mM] G
sin droga
[200 g/ml] FU,
*
B
C
C-S8p3-FUG
C-S8p3
P
P

Figura 39: Analisis logenetico y PAQ de poblaciones vricas preextinci on. A) Esquema
de pases del clon de VFA C-S8c1 en ausencia de droga o en presencia de 5-uorouracilo (FU) y
clorhidrato de guanidinio (G). B) Distancia media d y crculos correspondientes al an alisis PAQ de
las poblaciones RAp35, C-S8p3-FUG y C-S8p3. El di ametro de las esferas es proporcional al valor
d. C) An alisis logenetico de clones moleculares individuales de una poblacion MARLS pasada en
presencia de ribavirina (RAp35, ver Figura 34), y clones del linaje C-S8c1 pasado en presencia
o ausencia de FU y G. Los puntos negros del arbol representan clones moleculares individuales
de la poblacion RAp35. Los clones pertenecientes a las poblaciones derivadas de C-S8c1 tras tres
pases en presencia de FU m as G o ausencia de droga estan representados por estrellas verdes y
puntos rojos, respectivamente. Las secuencias centrales seg un PAQ se indican con una echa. El
origen de las poblaciones virales se explica en Materiales y metodos y se representa en la Figura
32. Para construir el arbol se utilizo la regi on comprendida entre los nucleotidos 6670 a 7871,
correspondientes a la zona que codica la polimerasa 3D en el genoma de VFA. Se utilizo el metodo
de NJ y el algoritmo de Kimura 2 par ametros con un bootstrap de 1000 muestreos.
100
p260p3d
C-S8c1 p200 p260
..
p219
...
p225
....
p240
....
p240p3d p225p3d p219p3d
p200p3d
p200p5d
..
p50 p100

a b c d

a
200G1, 200G2
b
219G1, 219G2
c
225G1, 225G2
d
240G1, 240G2
Figura 40: Esquema de pases del clon C-S8c1 en infecciones citolticas en celu-
las BHK-21. Las poblaciones sin clonar se representan como crculos vacos, los clones
biol ogicos se representan como cuadrados negros. Las echas grandes grises indican pa-
ses a alta MDI (de 1 a 5 PFU/celula); las series de echas delgadas indican infecciones
a baja MDI; a baja MDI el sobrenadante de una infecci on se diluye 1000 veces y se usa
para establecer la nueva infecci on; las echas delgadas y largas representan el aislamien-
to de clones biol ogicos con genoma de tama no estandar (sin deleciones internas). C-S8c1
es el clon biol ogico inicial y los pases sucesivos se denominan con una p delante del
n umero de pase: p50 a p260. Las poblaciones que recibieron tres o 5 pases diluidos se
denominan con el nombre de la poblacion seguido de p3d o p5d, respectivamente.
Los clones biol ogicos se designan con el mismo nombre que la poblacion de donde se
recuperaron seguidos de G y el n umero de pase: 219G1, 240G4, etc.
distancias geneticas medias entre los componentes de la cuasiespecie.
En resumen, los an alisis logeneticos y de diversidad intrapoblacional de los espectros de mu-
tantes sometidos a mutagenesis letal, han revelado notables expansiones y posteriores compresiones
de la diversidad interna de las cusaiespecies. El an alisis estadstico de las mutaciones, tanto su
n umero, tipo, como su distribucion sugieren la accion de la selecci on puricadora en la evolucion
de poblaciones virales sometidas a mutagenesis. Estos resultados tienen implicaciones para enten-
der las bases moleculares y los procesos evolutivos que modulan la selecci on de virus sometidos a
mutagenesis incrementada, como se comenta en el apartado 6.4 de la Discusion.
5.5. Diversicacion de un clon de VFA en dos poblaciones con diferentes estra-
tegias evolutivas: colonizadores y competidores
El clon de VFA C-S8c1 se pas o en cultivos de celulas BHK-21, en infecciones citolticas seriadas.
El virus resultante de cada infecci on se utilizo directamente (sin diluir) para establecer la siguiente
infecci on (MDI 1-10 PFU/celula, Figura 40). Este proceso se repiti o 260 veces (Garcia-Arriaza y
col. 2005). En los pases p200, p219, p225 y p240 se aislaron clones biol ogicos ST tal como se describe
en la secci on 4.3.4 (Materiales y metodos). Los clones aislados fueron analizados por RT-PCR para
vericar la ausencia de genomas con deleciones internas (Tabla 10). El genoma de los clones ST se
secuencio desde la zona codicante de la proteasa L hasta el nucleotido 3853 (mitad de la protena
2A). Con las secuencias obtenidas se reconstruyo la logenia del clon C-S8c1 desde el pase 1 al 260
mediante el metodo de NJ (Figura 41-A). Los arboles muestran que el clon C-S8c1 y su progenie
en pases sucesivos siguen una evolucion coherente: el pase 200 deriva del pase 100, este del 50 y
el 50 deriva del p1 (C-S8c1), validando la topologa del arbol. Al analizar clones biol ogicos de las
101
Virus
a
RT-PCR
b
Composicion
c
200G1-G5 17, 10 ST
219G1-G5 17, 10 ST
225G6-G9 17, LJ ST
240G1-G3 17, 10, 29 ST
240G4-G5 17, 10, 29 ST, 417, 999
240G6-G13 17, 10 ST
C-S8p260P1-P2 17, 10 417, 999/1017
C-S8p260p3dG1-G2 17, 10 ST
C-S8p260 10, 17, 21, 29, 37, 38, L2 417, 999, 1017
C-S8p260p3d 10, 17, 21, 29, 37, 38, L2 ST
Tabla 10: Analisis gen omico de placas de lisis de tama no grande en diferentes poblaciones
a
Clones biol ogicos analizados individualmente. El origen de las poblaciones virales donde fueron aislados
se describe en el apartado 4.2 de Materiales y metodos. Los clones que producen placas de lisis de tama no
grande o peque no se indican con G o P, respectivamente, despues del nombre de la poblaci on.
b
Amplicaciones mediante RT-PCR utilizando las parejas de iniciadores indicadas en la Tabla 2 y Figura
14.
c
ST, genoma de tama no est andar; 417, 999, 1017, genomas delecionados, indicados en la Figura 14
poblaciones pase 219, 225 y 240, sorprendentemente, se agruparon en dos grupos estadsticamente
diferentes, como indica el remuestreo mediante bootstrap. Uno de los conjuntos se agrupa con el
virus de referencia MARLS (en rojo, Figura 42-B) y el otro se agrupa con el virus de referencia
C-S8p200 (en azul). Por tanto, a estas dos subpoblaciones las hemos denominado tipo-MARLS
y tipo-p200. Todas las poblaciones analizadas desde el pase 219 incluyeron como mnimo un
representante de cada tipo, sugiriendo que los dos tipos han coexistido a lo largo de los pases.
5.5.1. Detecci on de clones recombinantes en la poblaci on C-S8p200
Al incluir los clones biol ogicos ST de la poblacion C-S8p200 en un arbol logenetico, los clones
no se agruparon ni en la subpoblacion tipo-MARLS y ni en la tipo-p200, sino que se situaron en
medio de las dos, desestructurando el arbol logenetico (Figura 42-D). Esta sintomatologa es tpi-
ca de secuencias recombinantes. Para vericar que los clones podan ser realmente recombinantes
y no contaminaci on entre clones con genomas de secuencia distinta, los clones fueron diluidos y
replaqueados en cultivos celulares. El genoma de los clones aislados y replaqueados se secuencio y
se dividio la zona secuenciada en una parte 5 y otra 3. Cuando se construy o la logenia con la
zona 5 del genoma de los clones procedentes de C-S8p200, los clones se agruparon con la subpo-
blacion tipo-MARLS (Figura 41-E). Cuando se construy o la logenia con la zona 3 del genoma,
los mismos clones se agruparon con la subpoblacion tipo-p200 (Figura 41-F). Estos resultados su-
gieren fuertemente que en la poblacion C-S8p200 existen clones individuales que son recombinantes
entre representantes de la subpoblacion tipo-MARLS y genomas representantes de la subpoblacion
tipo-p200.
5.5.2. Origen de la subpoblaci on MARLS
El virus MARLS posee un patron de mutaciones divergente con respecto a la secuencia consenso
mayoritaria en la poblacion C-S8p200 (Tabla 11). Para identicar el origen de la divergencia de
la poblacion tipo-MARLS, se obtuvo un arbol logenetico por el metodo de MV. Se utilizaron los
virus de referencia de la serie evolutiva originada en C-S8c1 de los que se conoce la secuencia de
nucleotidos completa de su genoma. En el arbol obtenido, la secuencia de MARLS se agrup o con
102
C-Oberbayern
p1
p50
p100
p143
MARLS
p200 p200
100
93
100
98
100
p260
p1
225G6 225G6
219G2 219G2
240G13 240G13
240G1 240G1 100
99
98
97
219G5
219G4
219G3
240G15
225G8
MARLS
240G6
240G7
240G10
240G11
91
240G8
240G12
240G2
91
96
C-Oberbayern
p1
p50
p100
p143
MARLS
p260
94
81
88
100
p1
p100
MARLS
200G2-c1
200G2-C2
200G2-C3
200G2-C4
200G3-C2
200G3-C3
200G3-C1
p200
p260
p50
100
98
93
89
100
100
100
p1
p200
200G2-c1
200G2-C2
200G2-C3
200G2-C4
MARLS
200G3-C1
200G3-C3
200G3-C2
100
100
100
100
p1
MARLS
p200 p200
199G2-c1 199G2-c1
199G2-C2 199G2-C2
199G2-C3 199G2-C3
199G2-C4 199G2-C4
199G3-C2 199G3-C2
199G3-C3 199G3-C3
199G3-C1 199G3-C1
95
A B C
D E F
p200 p200
p200 p200
Tipo-p200
Tipo-MARLS
Figura 41: Diversicaci on del clon C-S8c1 en dos subpoblaciones. Evidencia de recombi-
naci on entre las subpoblaciones. A) Reconstrucci on logenetica de la evolucion del clon C-S8c1
y los pases sucesivos utilizando la secuencia completa del genoma. El arbol se construy o mediante el
metodo de NJ, usando el modelo de Kimura-2 par ametros. Los valores de remuestreo por la tecnica
de bootstrap mayores de 70 se indican en los nodos correspondientes. FMDV-C-Oberbayern, es un
aislado natural que se utilizo como referencia externa (outgroup) (Carrillo y col. 2005). El origen
de las poblaciones virales se describe en la Figura 40 y en Materiales y metodos. B) An alisis lo-
genetico que diferencia clones tipo-p200 (azul) de clones tipo-MALRS (rojo). Los clones biol ogicos
aislados a partir de las poblaciones C-S8p200, C-S8p219, C-S8p225 y C-S8p240 se denominan con
el n umero de pase de la poblacion seguido de G y el n umero de clon: 240G1, 225G2, etc. El
arbol se construy o mediante la tecnica de MV. Se utilizo la regi on del genoma de VFA que abarca
los residuos 1033-3853 (numeraci on seg un Escarmis y col. 1996). Esta regi on comprende la zona
codicante de las protenas L, VP4, VP2, VP3, VP1 y parcialmente 2A. C) Origen de las pobla-
ciones tipo-MARLS.

Arbol logenetico construido por el metodo de MV con los virus de referencia
derivados de pases masivos del clon C-S8c1. Los valores de remuestreo por la tecnica de bootstrap
mayores de 70 se indican en los nodos correspondientes. D) Reconstrucci on logenetica (MV) de
la evolucion de los distintos pases derivados de C-S8c1 junto con los clones biol ogicos del pase 200.
Los clones no se agrupan junto a ninguna poblacion. E) reconstruccion logenetica (MV) de la zona
5 del genoma (nucleotidos 1044 al 2622) de los clones biol ogicos del pase 200. Los clones se agrupan
junto a MARLS. F) Reconstrucci on logenetica (MV) de la zona 3 del genoma (nucleotidos 2623
hasta el 3853) de los clones del pase 200. Los clones se agrupan junto al pase 200.
103
A
p1
p200
219999
225999
240999
219p3d
200p3d
MARLS
225p3d
240p3d
100
100
100
100
p1
p200
219417
225417
240417
200p3d
MARLS
219p3d
225p3d
240p3d
100
100
100
100
B
Figura 42: Las poblaciones tipo-MARLS estan suprimidas por la cuasiespecie
dominante. Reconstrucci on logenetica por el metodo de MV empleando la secuencia
consenso de las poblaciones C-S8p200, C-S8p219, C-S8p225, C-S8p240, antes y despues
de tres infecciones a baja MDI. Se utilizo la regi on del genoma de VFA que abarca
los residuos 1033-3853 (numeraci on seg un Escarmis y col. 1996). Las poblaciones que
fueron sometidas a tres pases diluidos se indican con p3d despues del nombre de la
poblacion. Los virus tipo-MARLS se indican en rojo y los virus tipo-p200 en azul. Las
poblaciones virales antes de los pases con virus diluido incluyen: A) la delecion 999
(que afecta a los residuos 2794-3792 y a las protenas VP3 y VP1), y B) la delecion
417 (que afecta a los residuos 1154-1570 y a la proteasa L).
las secuencias de los virus situados entre los pases 143 y 200 (Figura 41-C). Por tanto, MARLS
coexisti o con los virus tipo-p200 en un rango de 97 pases (p240 es el ultimo pase en el que se
rescataron clones tipo-MARLS).
5.5.3. Las poblaciones tipo-MARLS estan suprimidas por la cuasiespecie
Datos previos en el laboratorio sugieren que el clon MARLS originalmente aislado de la po-
blacion C-S8p213, es el de m as alta tness de entre todos los mutantes de VFA a los que se les
ha medido la tness en el laboratorio (Garcia-Arriaza y col. 2005; Sierra y col. 2000). Los valo-
res oscilaron entre 25 y 110 respecto a C-S8c1. Las diferencias entre las distintas determinaciones
probablemente se deben a que las medidas se realizaron a distintas MDI (ver aparatado Selecci on
dependiente de densidad en las poblaciones Tipo-MARLS y Tipo-p200, en 5.5.4). A pesar de que
MARLS posee una ecacia biol ogica elevada, su patron de mutaciones tpico no aparecio en la
secuencia consenso de ninguna poblacion derivada de C-S8c1, sugiriendo que no se llego a imponer
en las poblaciones donde se gener o. Una posible interpretacion de la ausencia de dominancia es que
la poblacion tipo-MARLS pudiera ser una poblacion de alta tness suprimida por la cuasiespecie,
tal como fue descrito para un mutante de alta tness del virus de la estomatitis vesicular (VSV) (de
la Torre y Holland 1990). En ese estudio con VSV, un clon de alta tness se impuso en competicion
frente a la poblacion donde se origin o, s olo en condiciones de baja MDI. Este dato llev o a los autores
a proponer el concepto de supresi on de mutantes de alta tness por el espectro de mutantes de la
cuasiespecie (de la Torre y Holland 1990). La supresi on de virus por espectros de mutantes ha sido
descrita en otros casos (ver captulo 6.5.3 de Discusion).
104
Regi on
a
C-S8p200 MARLS
b
Cambio
c
Estructura Regi on
a
C-S8p200 MARLS
b
Cambio
c
Estructura
aa
secundaria
d
aa secundaria
d
Fragmento S C247U C247U ZNC VP1 A3328G A3328G K41E Cadena B
(368579) C338U C338U ZNC (3208-3828) A3344G/A D46G
Pseudonudos G476A G476A ZNC U3387C/U =
U518C ZNC C3423U =
U3433C =
IRES ZNC U3638C L144S Bucle GH
sitio A
e
Proteasa L G1066G/U V10L A3797G A3797G H197R C terminal
sitio C
(1039-1641) G1091U R18I C3806A P200Q C terminal
sitio C
C1105U P23S 2B A4036A/G A4036G T52A
A1154A/U K39M (3883-4344)
C1158C/A = 2C G4583A G4583A S80N
C1180C/U H48Y (4345-5298) A5110G A5110G T256A
A1532G E165G G5133C G5133C Q263H
A5191G/A A5191G M283V
VP4 3A A5364C =
(1642-1896) (5299-5757) U5454U/C =
VP2 G2285A G130D Bucle EF A5606A/G D103G
(1897-2550) U2622C = 3C U6225C =
VP3 C2624U C2624U A25V N terminal (5971-6609) A6295C M109L
(2551-3207) C2826U = 3D U6744C =
C3064G/C H172D (6610-8022) A7305C Q232H
G3067A G3067A E173K Bucle GH G7554U =
U3082A C178S Bucle GH U7564C
C3202A C3202A Q218K C terminal U7932C
Tabla 11: Mutaciones secuenciadas respecto a C-S8c1 en las poblaciones C-S8p200 y MARLS. Las mutaciones se determi-
naron respecto a la secuencia de C-S8c1 siguiendo la numeraci on en (Escarms y col 2006).
a
Zonas reguladoras y protenas codicadas en el genoma de VFA. Se indican las posiciones en el genoma inicial y nal de cada regi on.
b
En rojo aparecen indicadas las mutaciones exclusivas de MARLS, que no se han descrito en ning un otro virus secuenciado derivado de
C-S8c1.
c
ZNC, zona no codicante; =, mutaci on sinonima.
d
Estructuras secundarias asociadas con virulencia de VFA para celulas BHK-21 (Baranowski y col. 1998)
e
Sitios antigenicos seg un (Mateu y col. 1994)
1
0
5
Para comprobar si la poblacion tipo-MARLS estaba efectivamente suprimida por la cuasiespecie
dominante tipo-p200, se realizaron infecciones a baja MDI para minimizar la coinfecci on e interac-
ci on entre los individuos del espectro de mutantes. Las poblaciones C-S8p200, C-S8p219, C-S8p225
y C-S8p240 fueron sometidas a tres pases a baja MDI (diluyendo 1000 veces el sobrenadante de cada
infecci on para realizar la siguiente; Figura 42-A). El RNA del virus resultante de los tres pases y del
preparado inicial se secuencio y se reconstruyo la logenia (Figura 42). Los arboles muestran que
las secuencias consenso de las poblaciones C-S8p200, C-S8p219, C-S8p225 y C-S8p240 se agrupan
juntas, formando la subpoblacion tipo-p200. Sin embargo, las secuencias consenso de las poblacio-
nes que han sufrido tres pases a baja MDI pasan a agruparse con el clon MARLS, formando as la
subpoblacion tipo-MARLS. Estos resultados sugieren fuertemente que las poblaciones tipo-MARLS
estan efectivamente suprimidas por la cuasiespecie dominante, de tipo-p200, y que la supresi on se
elimin o o mitig o con los pases a baja MDI.
5.5.4. Selecci on dependiente de densidad en las poblaciones tipo-MARLS y tipo-p200
Los resultados de las infecciones diluyendo virus sugieren fuertemente que la ecacia biol ogica
de las poblaciones estudiadas pueda variar en funcion de la MDI. Por este motivo se realizaron 4
ensayos de competicion entre clones biol ogicos y poblaciones representativas de las subpoblaciones
tipo-MARLS y tipo-p200. Se escogieron los clones 240G2 y 240G12, representativos de la poblacion
tipo-MARLS, y los clones 240G1 y 240G13 representativos de la poblacion tipo-p200 (Figura 41).
Los virus C-S8p200p5d y C-S8p200 se utilizaron como poblaciones representativas de las subpo-
blacioens tipo-MARLS y tipo-p200, respectivamente. Los ensayos cubrieron un rango de MDI de
entre 0,005 y 9,4 PFU/celula. Los resultados muestran que tanto las poblaciones como las mezclas
de clones tipo-MARLS tienen mayor ecacia biol ogica cuanto menor es la MDI, con una diferencia
de aproximadamente 5 veces entre una MDI de 0,005 y 9,4 PFU/celula (Figura 43). Dado que la
MDI hace referencia a la densidad de virus sobre un n umero de celulas en cultivo, estos resultados
demuestran la accion de selecci on dependiente de densidad sobre las poblaciones estudiadas. La
modulacion que ejerce la densidad sobre la tness resulto ser drastica ya que ocasiono un cam-
bio cualitativo en el sistema, puesto que, independientemente del grado de variacion de ecacia
biol ogica, una subpoblacion pas o de ganar la competici on a perderla.
5.5.5. Las poblaciones tipo-MARLS son mas virulentas que las poblaciones tipo-p200
Para investigar si las diferencias genotpicas que presentan las poblaciones tipo-MARLS respec-
to a las tipo-p200 se correlacionan con alguna diferencia fenotpica, se compar o la capacidad de
matar celulas BHK-21 de ambas poblaciones, mediante ensayos de virulencia. Resultados previos
demostraron que el virus MARLS presentaba uno de los registros de virulencia m as altos entre los
diferentes mutantes ensayados en el laboratorio (Herrera y col. 2007). Como control del ensayo, se
midi o la virulencia de dos virus anteriormente catalogados como de alta virulencia (Herrera y col.
2007): el clon MARLS y la poblacion viral C-S8p260p3d. La virulencia calculada para estos virus
coincida con la obtenida anteriormente (Herrera y col. 2007). Los resultados (Figura 44) demues-
tran que tanto los clones como las poblaciones tipo-MARLS presentan una mayor virulencia para
las celulas BHK-21 que los clones y poblaciones tipo-p200.
5.5.6. Posible compromiso entre la producci on de progenie y la virulencia
Una hip otesis cl asica en ecologa arma que explotar muy rapido un recurso puede ir en detri-
mento del rendimiento que se le pueda sacar a ese recurso (Maynard Smith 1998). Ello favorece
un compromiso (o trade o ) en la explotacion. En virologa se ha propuesto que hay virus que
106
M
o
l

c
u
l
a
s
R
N
A
t
i
p
o
-
M
A
R
L
S
/
t
i
p
o
-
p
2
0
0
y = 0,3716e
0,7305x
R
2
= 0,857
MDI = 0,1
y = 3,1324e
-0,5349x
R
2
= 0,6496
MDI = 9,4
10
0
10
1
0
1
2 3 4
10
-1
0 1 2 3 4
10
0
10
1
10
-1
y = 0,9727e
-0,2208x
R
2
= 0,7937
MDI = 2,0
0 1 2 3 4
10
0
10
1
10
-1
A
B
Nmero de pase
y = 0,176e
1,0528x
R
2
= 0,9935
MDI = 0.005
0 1 2 3 4
10
0
10
1
10
-1
Figura 43: Experimentos de competici on entre las poblaciones y clones tipo-
MARLS y tipo-p200, a distinta MDI. Las competiciones se realizaron tal y como
se indica en el apartado 4.17 de Materiales y metodos. La multiplicidad de infecci on
(MDI) empleada en cada experimento se indica en cada gr aco. Cada punto representa
el n umero de moleculas de RNA de los virus tipo-MARLS dividido por el n umero de
moleculas de RNA de los virus tipo-p200, en el n umero de pase indicado en abscisas.
En cada gr aco se representa la ecuaci on de la recta de regresion junto con la R
2
.
A) Competicion entre las poblaciones virales p200 y p200p5d (tipo-MARLS). B) Dos
clones representativos de la poblacion tipo-MARLS del pase 240 (240G2 y 240G12) se
mezclaron y se compitieron contra dos clones, previamente mezclados con igual PFUs,
representativos de la poblacion tipo-p200 (240G1 y 240G13) (ver arbol en la Figura 41).
107
Tiempo (horas)
P
F
U
/
m
l
5 15 25 35 45
10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
240G1
240G2
240G12
240G13
C
A
5 10 15 20 25 30 3
5 10 15 20 25 30 35 40
p200
p200p5d
10
1
10
2
10
3
10
4
10
5
10
6
B
5
240G12
240G1
p3d
MARLS
10
3
10
4
10
5
10
6
10
7
10
8
Figura 44: Virulencia de las poblaciones tipo-MARLS y tipo-p200 para celu-
las BHK-21. PFUs necesarias para matar 10
4
celulas BHK-21 en funcion del tiempo.
Los valores para virus tipo-MARLS y tipo-p200 se indican en rojo y azul, respectiva-
mente. A) Virulencia de los clones virales 240G12 (tipo-MARLS), 240G1 (tipo-p200)
comparado con las poblaciones virales C-S8p260p3d y MARLS. Cada punto representa
la media de dos determinaciones independientes. B) Virulencia de las poblaciones virales
C-S8p200 y C-S8p200p5d. C-S8p200 es la poblacion tipo-p200 original. C-S8p200p5d
es la poblacion tipo-MARLS obtenida a partir de C-S8p200 despues de 5 pases citolti-
cos a baja MDI en celulas BHK-21. Cada punto representa la media de tres determi-
naciones independientes; se muestran las barras de error. C) Virulencia de los clones
240G1 y 240G13 (logeneticamente relacionados con MARLS), y 240G2 y 240G12 (-
logeneticamente relacionados con C-S8p200). Cada punto representa la media de dos
determinaciones independientes.
108
Virus
a
PFU/ml
b
240G1 2,9510
7
9,8410
6
240G13 3,4310
7
4,4110
6
240G2 3,7410
7
5,4910
6
240G12 6,9010
7
2,7810
7
Tabla 12: Ttulos virales de clones procedentes de poblaciones tipo-MARLS y tipo-
p200.
a
El origen de los clones virales se describe en la gura 40 y en Materiales y metodos.
b
Resultado de 2 titulaciones independientes realizadas con dos preparados virales independientes.
han optimizado el momento en el que matan a la celula hospedadora, en funcion del rendimiento
obtenido de la celula, y de la capacidad de transmitirse, dependiendo de una salida temprana o
tarda de la celula (Messenger y col. 1999). Seg un este modelo, virus menos virulentos se podran
transmitir ms lentamente, pero sin embargo lo haran en mayor n umero (Nowak y May 2000). Para
comprobar si existan diferencias en la producci on viral, se crecieron preparados virales de los clo-
nes tipo-p200 (240G1, 13) y tipo-MARLS (240G2, 240G12), en identicas condiciones, y partiendo
del mismo n umero inicial de PFUs y celulas (4.3.1. Materiales y metodos). Al observarse efecto
citop atico total se procedio a la titulacion de los sobrenadantes de los cultivos infectados. Los resul-
tados (Tabla 12) demuestran que no existen diferencias signicativas en cuanto a producci on viral
entre las poblaciones ensayadas.
5.5.7. Las poblaciones tipo-p200 intereren con las poblaciones tipo-MARLS, modu-
lando la virulencia
Se aplico el ensayo de interferencia en la virulencia tal como se describe detalladamente en
el apartado 4.7 de Materiales y metodos. Brevemente, este ensayo detecta si dos poblaciones que
coinfectan celulas son capaces de ejercer una inuencia mutua en su nivel de virulencia. Se infectaron
celulas BHK-21 a muy alta MDI, separadamente con poblaciones o clones tipo-MARLS por un lado,
o tipo-p200 por otro lado. Paralelamente se infectaron celulas con mezclas de los dos tipos de virus.
Las infecciones con clones muestran que el clon tipo-MARLS 240G12 presenta mayor virulencia que
el clon tipo-p200 240G1 (Figura 45). Identico resultado se observ o al comparar las poblaciones p200
y p200p5d. Sin embargo, al realizar infecciones con mezclas de los clones 240G1 y 240G12, o de
las poblaciones p200 y p2005d, la virulencia disminuyo hasta valores muy similares a los obtenidos
para el clon tipo-p200 y para la poblacion p200 individualmente. Este resultado no es un efecto de
la dosis de virus inoculada (el doble en las mezclas), puesto que al utilizar el doble de la dosis de los
virus virulentos, se obtuvo un resultado identico al obtenido con la dosis simple. Esta interferencia
en la virulencia es especca de los virus menos virulentos hacia los m as virulentos, ya que cuando se
infectaron celulas con mezclas de poblaciones muy virulentas (p200p5d con p260p3d), no se obtuvo
ninguna disminucion en la virulencia (Figura 45).
5.5.8. Modelo matematico de replicaci on y competici on de virus en celulas en cultivo
Hemos aplicado el modelo basico de din amica viral (Bonhoeer y col. 1997; Nowak y May 2000;
Perelson y col. 1996), que describe un proceso de infecci on in vivo, a una infecci on en cultivos
celulares (ver Apendice matem atico). El modelo es similar al descrito por Perelson y col.(Wu y col.
109
10
2
10
3
10
4
10
5
C
e
n
t
r
o
s
i
n
f
e
c
c
i
o
s
o
s
10
3
10
4
10
5
10
2
10
3
10
4
2
4
0
G
1
2
2
4
0
G
1
/
G
1
2
2
4
0
G
1
2
2
4
0
G
1
2
(
2
X
)
p
2
0
0
p
5
d
p
2
0
0
/
p
2
0
0
p
5
d
p
2
0
0
p
2
0
0
p
5
d
(
2
X
)
p
2
0
0
p
5
d
p
2
6
0
p
3
d
p
2
0
0
p
5
d
/
p
2
6
0
p
3
d
Figura 45: Ensayo de interferencia en la virulencia para celulas BHK-21. El
eje de ordenadas representa el n umero de centros infecciosos necesarios para matar 10
4
celulas BHK-21 en 12h (los centro infecciosos son celulas infectadas en suspensi on, que
se utilizan para establecer una infecci on en un nuevo cultivo, tal y como se indica en
Materiales y metodos, 4.3.5 y 4.7). En el eje de abscisas se indican los virus o mezclas de
virus utilizadas en el experimento. Cada barra representa la media de cuatro determi-
naciones independientes. Se muestran las desviaciones estandar. En azul se representan
virus tipo-p200 y en rojo los virus tipo-MARLS. C-S8p260p3d es una poblacion de alta
virulencia, similar a la de las poblaciones MARLS (Herrera y col. 2007), pero logeneti-
camente relacionado con C-S8p200. En los virus cuyo nombre aparece seguido de (2X),
las celulas fueron inoculadas con el doble de la dosis habitual con la que se inocula un
virus individual.
110
2006) pero en nuestro caso las celulas se pueden coinfectar por dos variantes virales en competicion.
Los diferentes par ametros del modelo matem atico se han estimado a partir de las observaciones
experimentales. La predicci on principal del modelo, esto es, que la tness es dependiente de den-
sidad, se ha podido corroborar con los experimentos (Figura 46). Los virus tipo-MARLS pierden
ecacia biol ogica a medida que aumenta la MDI. Existe una MDI crtica a partir de la cual los
virus tipo-MARLS son desplazados en la competicion por los tipo-p200.
1e- 03 1e- 02 1e- 01 1e+00 1e+01
0
.
5
1
.
0
2
.
0
5
.
0
MDI
f
i
t
n
e
s
s
r
e
l
a
t
i
v
a
prediccion del modelo
datos experimentales
Figura 46: Selecci on dependiente de densidad en las poblaciones tipo-MARLS
y tipo-p200. Ajuste del modelo matematico a los resultados experimentales.
Representaci on de la ecacia biol ogica de las poblaciones y clones tipo-MARLS, en
funcion de la MDI, tras competiciones con las poblaciones y clones tipo-p200. Los datos
experimentales de ecacia biol ogica son los obtenidos en los experimentos representados
en la Figura 43. Los valores de ecacia biol ogica se calcularon como se indica en el
apartado 4.17 de Materiales y metodos. Las predicciones del modelo se obtuvieron
de las simulaciones numericas realizadas con los par ametros descritos en el apendice
matem atico.
111
6. Discusion
6.1. Origen y evolucion de la segmentacion genomica: el VFA como modelo
Los genomas defectivos que surgen durante la replicaci on de virus RNA, com unmente requie-
ren la participacion de un virus ST para mantenerse como una entidad replicativa (Huang 1973;
Kirkwood y Bangham 1994a; Perrault 1981a; Roux y col. 1991b; Simon y col. 2004; Vogt y Jackson
1999). Inesperadamente, el sistema de genomas delecionados de VFA consiguio replicar autonoma-
mente sin la participacion de virus ST. En esta Tesis Doctoral se han investigado los mecanismos
moleculares que dieron lugar a la aparicion del sistema segmentado y la ventaja selectiva del sistema
de replicaci on segmentado sobre el virus ST.
6.1.1. Descripci on de una cuasiespecie de virus defectivos en el transcurso de la
evoluci on hacia un virus segmentado
El tpico espectro de mutantes de las cuasiespecies de un genoma ST se ha ampliado a la
descripci on de un espectro de genomas con deleciones internas. El espectro incluyo deleciones
internas en fase que afectaron desde 402 a 1017 residuos en las regiones que codican para la
proteasa L y la capsida (4.9 % al 12.5 % respectivamente, del genoma de VFA C-S8c1, excluyendo los
tractos homopolimericos). Durante los pases intermedios 219 y 225, pero no en el pase 260 (Garcia-
Arriaza y col. 2004), se identicaron una serie de genomas defectivos en la regi on que codica
para la capsida, que coexistan con el RNA 417. Posteriormente, en el pase 260, la constelacion
de deleciones observadas incluyo unicamente las tres formas de RNA: 417, 1017, 999. Estas
comparaciones sugieren que el sistema segmentado de VFA, a pesar de replicar en un ambiente
constante, es muy din amico en cuanto a la generacion y competicion de formas delecionadas y en
su sistema de complementaci on.
6.1.2. Recombinaci on exuberante
Dado que el linaje evolutivo en el que los RNAs se generaron se inicio a partir del clon C-S8c1
con un genoma ST unico (Sobrino y col. 1983), los RNAs deben haber surgido por eventos de
recombinacion intramolecular o intermolecular, dentro de celulas infectadas. En los virus de RNA se
pueden distinguir varios tipos de recombinacion: homologa, no homologa, replicativa y no replicativa
(revisi on en Agol 2006). La comparacion de las secuencias de nucleotido alrededor de los extremos
de la delecion no permitio identicar ning un requerimiento obvio asociado a la recombinacion.
Adem as, la predicci on de las estructuras secundarias energeticamente m as favorables en los RNAs
402, 417, 519, y 540, usando M-fold (Zuker 2003), no revel o ninguna estructura secundaria
local obvia (no se muestran los datos), que en otros sistemas se ha asociado a recombinacion
(Figlerowicz y Bibillo 2000; Havelda y col. 1997). Por tanto, el an alisis molecular no ha permitido
precisar un mecanismo por el que se pudieron generar los RNAs (Agol 2006). De hecho, no
podemos descartar que los diferentes RNAs se hayan generado por mecanismos diferentes. As, los
RNAs que muestran una identidad de secuencia signicativa en los extremos de la delecion pueden
haberse generado mediante el mecanismo de salto de hebra (copy choice) entre la misma o diferentes
moleculas (Figura 6) (Agol 2002). En los casos en los que no se hall o identidad de secuencia entre
los extremos de la delecion, esta se pudo generar mediante recombinacion no homologa replicativa
o no replicativa. La generacion del virus ST C-S8p260p3d a partir de los RNAs se puede explicar
por recombinacion homologa (Garcia-Arriaza y col. 2004; Garca-Arriaza y col. 2006).
Las observaciones sobre recombinacion descritas anteriormente para VFA y otros picornavirus
(King 1988; Agol 2002; Agol 2006; Beard y Mason 2000; Escarms y col. 1992; Giraudo y col. 1990;
112
Kim y col. 2005; King 1988; Knowles y Palmenberg 1998), sugieren que la recombinacion puede
ser un proceso frecuente durante la replicaci on de los picornavirus. Es posible que muchos recombi-
nantes no se detecten debido a su baja capacidad replicativa o debido a la ausencia de marcadores
que identiquen a los genomas como recombinantes. La interpretacion de la recombinacion como
un importante mecanismo de la genetica del RNA ha sido recientemente subrayadao por Bujarski
y colegas, basado en su trabajo de recombinacion promiscua con el virus del mosaico del bromo
(Urbanowicz y col. 2005).
6.1.3. El modelo de la deleci on maestra
Dado que la generacion de genomas recombinantes no parece ser una limitacion en el sistema
de VFA, resulto interesante investigar por que la transicion hacia la dominancia de RNAs y la
replicaci on independiente de virus ST, necesit o entre 143 y 219 pases. Una hip otesis es que s olo un
n umero limitado de los muchos genomas con deleciones internas que se generan espontaneamente
sea neutral, o moderadamente ventajoso, para su mantenimiento en la poblacion. Para que los
RNAs puedan llevar a cabo una replicaci on independiente del ST, es necesario que, al menos,
se mantenga balanceado el aporte de protenas para la trans-complementaci on y que se procesen
correctamente las poliprotenas expresadas por los dos RNAs. Esto incluye el mantenimiento del
sitio autocataltico de la proteasa L, y el mantenimiento de los sitios de procesamiento de la proteasa
3C (Ryan y col. 2004; Ypma-Wong y col. 1988). El genoma 1017 presenta la substituci on K201R
en la posicion -1 del sitio de corte L-VP4, aunque el aa R en la posicion 201 se halla en varios tipo
O y SAT3 (Ryan y col. 2004). El cambio Q218K afecta a la posici on -1 del sitio de corte VP3-VP1
en el genoma de todos los RNAs en los que el sitio de corte esta presente, aunque tambien se
encuentran cambios en esta posicion en el resto de serotipos.
El factor que provoco la dominancia de los RNAs pudo ser una delecion que ocurrio al azar
y que no comprometio la capacidad replicativa del virus. La delecion probablemente conri o al
sistema una ventaja selectiva sobre la replicaci on del genoma ST individualmente. Esa delecion
pudo ser el genoma 417 ya que fue el primero en aparecer en la lnea evolutiva de C-S8c1 (junto
con el 402; Charpentier y col. 1996a), y estaba presente en todas las placas analizadas en los pases
219 y 225. Por tanto, proponemos el modelo de delecion maestra, mediante el cual, una delecion
inicial se genera aleatoriamente, y puede coexistir con el virus ST. Una vez se produce ese RNA,
el sistema posee los requerimientos moleculares basicos para que un nuevo RNA se seleccione y
le complemente, desplazando as al genoma ST.
El concepto basico en virologa de las cuasiespecies, con la presencia de una secuencia maestra,
se extiende a genomas delecionados, que replican como un complejo espectro din amico de mutantes
diferentes, pero relacionados entre s (en cuanto a longitud y posicion de las deleciones)(Biebricher
y Eigen 2006; Domingo 2006; Domingo y col. 2001b)
6.1.4. Analisis de la estabilidad de la deleci on 417
Mediante ingeniera genetica se introdujo el mnimo cambio en fase posible en el clon infeccioso
pMT260417ns que contena la delecion 417 en el contexto de secuencia del pase 260. La delecion
417 se desplazo 3 nucleotidos hacia el 5 y hacia el 3 del RNA (pMT260417+3ns y pMT260417-
3ns, respectivamente). RNAs transcritos de ambas construcciones fueron capaces de replicar y
expresarse ecientemente, seg un el an alisis electroforetico de la expresi on de protenas. Los niveles
de protenas expresadas a partir de ambos RNAs fueron indistinguibles de los del RNA transcrito
de pMT260417ns. Sin embargo, tras coelectroporacion de los RNAs junto con el RNA transcrito
de pMT260999ns, se rescat o menos virus infeccioso del sobrenadante de celulas electroporadas
113
con los RNAs que tenan la delecion desplazada del sitio original.
Los RNAs 417+3 y 417-3 presentan 1 y 3 sustituciones de nucleotidos, respectivamente,
respecto al RNA 417, en la zona del RNA que codica la proteasa L. Estas sustituciones co-
rresponden a los cambios de amino acidos M39K en 417+3 y K38I, M29L en 417-3. Por tanto,
cambios muy sutiles en la secuencia de la delecion 417 implic o efectos fenotpicos muy evidentes.
Cabe destacar que la proteasa L en estos virus esta delecionada en un 70 % (con perdida del sitio
cataltico), por lo que probablemente no sea funcional. Esos resultados conrman la idea propuesta
en el modelo de la delecion maestra, que sugera que la delecion de los nucleotidos ausentes en 417
es clave, ya que mnimas variaciones en la zona delecionada implicaron una perdida sustancial de
infectividad.
6.1.5. Importancia del contexto de secuencia
La posible importancia del contexto de secuencia en la replicaci on de los RNAs se inves-
tigo comparando los pl asmidos que contenan la secuencia del p260, bien en la zona estructural
(pMT999, pMT417), bien en todo el genoma (pMT260999ns, pMT260417ns). La incorpo-
raci on de las mutaciones presentes en las protenas de replicaci on en el pase 260 incremento sen-
siblemente la capacidad de replicar de los RNAs. Los ensayos de expresi on de protenas por
Western-blot y marcaje metabolico revelaron niveles altos de protenas de replicaci on virales y de
parada de la sntesis de protenas celulares a las 4h post-electroporacion en celulas electroporadas
con pMT260999ns, pMT260417ns o con la mezcla de ambos. En ese tiempo se pudo detectar
efecto citop atico y ttulo viral. Esto supone un avance de m as de 8 horas en el ciclo infectivo respecto
a los transcritos de pl asmidos sin las mutaciones en la zona estructural.
Los resultados indican que la delecion 417ns requiere un contexto de secuencia adecuado
para poder replicar ecientemente, lo cual probablemente explique por que se necesitaron entre
143 y 219 pases a alta MDI para aislar RNAs de VFA. Las mutaciones adquiridas durante los
260 pases en cultivos celulares incrementaron sustancialmente la capacidad de replicaci on de los
RNAs. La eliminacion de esas mutaciones reduce la capacidad replicativa de los RNAs. Sin
embargo, los RNAs transcritos de pMT28, que contienen la secuencia completa de C-S8c1, replicaron
ecientemente y produjeron un elevado ttulo viral, lo que demuestra la viabilidad de los virus
con el contexto de secuencia de C-S8c1. El papel de las mutaciones puntuales en la evolucion
de virus (Domingo 2007), as como el papel de la recombinacion ha sido ampliamente abordado
tanto experimentalmente como teoricamente (Agol 2006; Boerlijst y col. 1996; Holland y col. 1982;
Kouyos y col. 2007). En esta Tesis se presenta una nueva relaci on directa entre la mutacion puntual
y la recombinacion. Los resultados obtenidos sugieren que durante la evolucion del VFA los eventos
de mutaci on puntual propiciaron la selecci on de genomas con cambios geneticos m as drasticos,
como son genomas con deleciones internas generadas por recombinacion. Tanto la mutacion como
la recombinacion favorecieron una primera fase de una transicion hacia la segmentaci on viral.
6.2. Ventaja selectiva del sistema segmentado de VFA C-S8p260
6.2.1. La presencia de deleciones es un determinante de tness.
Al competir los virus C-S8p260 y C-S8p260p3d en paralelo contra virus de mayor o menor
tness, el virus defectivo siempre mostro una ecacia biol ogica 2 veces superior a su ST homologo.
Esa diferencia se corresponde con la ecacia biol ogica relativa de C-S8p260 respecto a C-S8p260p3d,
determinada mediante competicion directa entre ellos. Inesperadamente, el virus defectivo fue capaz
de desplazar a un virus con 200 pases m as en cultivos celulares. La pendiente de las curvas de todos
los ensayos de tness fue constante en escala logartmica, lo que indica que la ventaja selectiva
114
de estos virus fue constante durante cada ensayo. Dado que el virus defectivo y ST comparten el
contexto de secuencia, los resultados indican que el sistema de segmentaci on conere per se una
ventaja selectiva de 2 veces independiente de la capacidad replicativa del virus competidor.
No podemos descartar, sin embargo, que entre los diferentes mecanismos moleculares que ope-
ran durante las competiciones entre virus ST y defectivo, el virus ST pueda complementar con
sus productos genicos a la replicaci on del virus defectivo. Esta complementaci on ocurrira indepen-
dientemente de la propia complementaci on existente entre los distintos genomas delecionados que
componen la poblacion C-S8p260.
6.2.2. Las tasas de replicaci on del RNA y de expresi on de protenas son constantes
en el virus ST y en el defectivo
Una hip otesis extendida en virologa es que los virus defectivos se enriquecen en la poblacion
ya que al tener el genoma m as corto, pueden replicar m as rapido (Holland 1990) (Perrault 1981a).
Mediante cuanticaci on por RT-PCR a tiempo real se quiso investigar esta posibilidad en el sistema
segmentado de VFA, midiendo la cantidad de RNA de los virus C-S8p260 y C-S8p260p3d durante
la entrada del virus en la celula, la replicaci on intracelular y la salida al medio extracelular.
Cuando los dos virus se analizaron en infecciones paralelas se observ o que presentaban la misma
cinetica de acumulacion intracelular de RNA. Los resultados mostraron que los dos virus entran
en las celulas, tambien, con la misma cinetica, la entrada se satura en los dos virus en el mismo
momento y comienzan paralelamente la replicaci on exponencial. A su vez, la replicaci on exponencial
del RNA es paralela en los dos virus durante todo el proceso, as como la salida del virus al medio
extracelular.
Los sobrenadantes de infecciones con los virus ST y defectivo se trataron con RNAasa para
eliminar la presencia de RNAs no encapsidados en el medio extracelular. La comparacion de los
niveles extracelulares de RNA, en muestras tratadas y sin tratar con RNAasa, no mostro ninguna
diferencia en las porporciones de virus defectivo y ST. Por tanto, la relaci on de RNA encapsidado
de los dos tipos virales en el medio extracelular no sufri o tampco ninguna variacion, respecto a la
relaci on de RNA total intra y extracelular (Barclay y col. 1998a; Holland y col. 1989; Valcarcel y
Ortin 1989).
Los resultados de la expresi on de protenas especcas de virus mostraron de nuevo cineticas
muy similares para los dos virus. Se observ o una mayor expresi on total de protenas estructura-
les en el virus ST. Estos resultados pueden ser debidos a que el 100 % de los RNAs ST pueden
producir protenas estructurales, mientras que en los RNAs s olo lo hace el RNA transcrito de
pMT260417ns. Las cineticas de replicaci on del RNA y de expresi on de protenas demuestran que
las diferencias en tness entre los virus ST y defectivo no se deben a diferencias en la tasa de repli-
cacion, como ya se describio previamente para las DIs del PV (Cole y Baltimore 1973a; Lundquist
y col. 1979).
6.2.3. El virus segmentado posee mayor infectividad especca que el virus ST.
En la descripci on original del sistema defectivo de VFA, se observ o que el virus ST produca
el doble de RNA vrico y de partculas vricas durante su ciclo de infecci on (Garcia-Arriaza y col.
2004). Las diferencias en la cantidad de RNA se han podido corroborar estadsticamente mediante 7
determinaciones independientes. Inesperadamente, gracias a la correccion del ttulo viral aplicada en
esta Tesis Doctoral, se ha podido determinar que no existen diferencias signicativas entre el ttulo
de los virus C-S8p260 y C-S8p260p3d. Por tanto, la infectividad especca de C-S8p260 (medida
como la relaci on entre RNA vrico y partculas infecciosas) es el doble que la de C-S8p260p3d. Para
115
corroborar experimentalmente este resultado, basado en una correccion matem atica, se dise no un
experimento alternativo que mide la cantidad de RNA en un preparado viral que es capaz de entrar
en las celulas (Barclay y col. 1998b). Los resultados muestran que el RNA de C-S8p260 entra
en las celulas con el doble de eciencia que el virus ST, una diferencia que esta de acuerdo los
datos de infectividad especca. La relaci on entre los dos virus al principio y nal de la replicaci on
exponencial se mantuvo constante, como se ha descrito durante las cineticas de replicaci on del
RNA. Estos resultados fueron consistentes en varios experimentos independientes, y demuestran
que el incremento en infectividad especca del virus C-S8p260, le conere un aumento en tness
del mismo orden de magnitud que el determinado en los ensayos de competicion.
6.2.4. El virus defectivo es mas estable que el virus ST
El RNA del VFA se encuentra compactado dentro de una capsida icosaedrica dividida en
pentameros proteicos (Acharya y col. 1989). Esta partcula es muy inestable como se ha demostrado
mediante ensayos de inactivaci on por calor (Mateo y col. 2003; Mateo y col. 2007). El ttulo viral,
tanto de C-S8p260 como C-S8p260p3d, decayo rapidamente al incubar preparados virales a 37
o
C.
Sin embargo, la vida media del virus defectivo fue signicativamente mayor que la del virus ST
(p<0,001).
Dada la rapida inactivaci on del VFA a 37
o
C, y la importancia que tiene este par ametro en la
din amica de la infecci on viral (Ho y col. 1995; Nowak y May 2000; Wei y col. 1995), el incremento
observado en la estabilidad de la partcula viral que contiene RNAs puede conferir una gran
ventaja selectiva a un virus. Al medir la infectividad de preparados virales con mezclas de virus,
se observ o un aumento de la infectividad relativa del virus defectivo respecto al ST, cuando los
preparados se incubaron a 37
o
C.
En conclusi on, el virus de VFA con genoma segmentado ha demostrado tener mayor ecacia
biol ogica que el virus ST. Esta ventaja selectiva se ha atribuido a la presencia de deleciones,
dado que los dos virus comparten el mismo contexto genetico. Esta ventaja resulto ser constante
e independiente de la tness del virus competidor lo que esta de acuerdo con que no se hayan
observado diferencias en la capacidad replicativa de los dos virus. Los resultados indican que la
presencia de deleciones ejerce una inuencia estabilizando la partcula viral. Probablemente, un
RNA m as corto pudo relajar el alto grado de compactaci on de la capsida del VFA (Acharya y
col. 1989). El sistema de complementaci on 417-999 mantuvo la informaci on genetica completa
acortando la longitud del RNA, generando un sistema de replicaci on m as eciente que el virus ST.
6.2.5. Origen poliletico de la segmentaci on viral: conclusiones a partir de la evolu-
ci on de las DIs
Existe una serie de evidencias, tanto en virus RNA como en virus DNA, de eventos geneticos
similares a la segmentaci on. En unos casos se ha observado complementaci on entre particulas de-
fectivas naturales que rescatan virus infeccioso. Es el caso del coronavirus de la hepatitis murina
(+RNA, cadena simple)(Kim et al. 1997), o de SV40 (DNA bicatenario)(ONeill y col. 1982). En
otros casos, mediante ingeniera genetica se ha conseguido rescatar infectividad de virus con el
genoma divido en dos partes, de nuevo con SV40 (Geigenm uller-Gnirke y col. 1991), encapsidado
en partculas diferentes. Mediante ingeniera genetica, tambien, se consiguio dividir en tres partes
el genoma del virus del sarampi on (Takeda y col. 2006). Los tres segmentos se encapsidaron dentro
de la misma partcula.
Como se ha comentado en la Itroduccion (apartado 2.6.4), el termino interferencia es ambiguo
en muchas descripciones de DIs. Dado que las DIs no se detectan en un ensayo de plaqueo con
116
agarosa, es difcil distingir cuando una partcula DI es realmente intereferente, de cuando hace
bajar el ttulo a su competidor. Existen pocas decripciones moleculares del proceso de interferencia.
Las evidencias, sin embargo, apuntan a que los mecanismos de interferencia y enriquecimiento son
diferentes en virus RNA de cadena positiva o negativa, y de los virus DNA. En DIs de virus DNA se
han descrito duplicaciones del origen de replicaci on del genoma que provocaran su enriquecimiento
respecto al virus ST. En virus RNA de cadena negativa se han descrito DIs que replican sin realizar
el proceso de transcripci on y posterior traduccion, que aprovecharan del virus ST (Holland 1990).
En esta Tesis doctoral se ha descrito un aumento preferencial de virus con deleciones internas en
el VFA (RNA cadena positiva), debido a su aumento en la estabilidad.
Por estos motivos proponemos un modelo poliletico para el origen de la segmentaci on viral.
Seg un nuestro modelo las partculas defectivas podran ser precursoras de la segmentaci on viral.
6.3. Desarrollo de una vacuna atenuada basada en la poblaci on C-S8p260
Historicamente las vacunas para prevenir la FA fueron de las primeras que se prepararon y
aplicaron al control de una enfermedad animal (Valee y col. 1925). A pesar de ello y a sucesivas
mejoras en los metodos industriales de preparacion (Bahnemann 1972), hasta el dia de hoy no se
dsipone de una vacuna efectiva y segura para prevenir la FA, enfermedad zoonotica en muchos
pases del mundo.
Entre otras dicultades tecnicas, la inactivaci on del VFA ha sido un problema durante muchos
a nos en la b usqueda de una vacuna efectiva contra el VFA. El PV se atenuo mediante pases seriados
en cultivos celulares, y proporcion o una vacuna muy efectiva contra la poliomelitis (Murdin y col.
1996; Sabin 1960). Esta tecnica no ha resultado efectiva para el VFA bien porque el virus no
perda su virulencia in vivo, bien porque cambiaba sus propiedades antigenicas (Barteling 2004).
Actualmente existen varios pases que poseen el estatus de libres de FA sin vacunacion, gracias
a las campa nas de vacunacion con la vacuna comercial inactivada. Sin embargo la potencia, la
duraci on de la inmunidad, y la capacidad de conferir protecci on frente a variantes de VFA de la
vacuna inactivada son muy limitadas. La vacuna debe suministrarse con varias dosis de recuerdo y
formulada con un adyuvante. Estos inconvenientes suelen mejorarse, en parte, con el uso de vacunas
vivas atenuadas que presentan los eptopos con la conformaci on del virus natural, y que con una
baja replicaci on activan una respuesta m as amplia y potente del sistema inmune (Bloom y Lambert
2003; Graham y Crowe Jr. 2007).
El virus defectivo con el que se ha trabajado en esta Tesis Doctoral se adapt o a la replicaci on
en cultivos celulares durante 260 pases citolticos en celulas BHK-21. Ninguno de los 25 cambios
de amino acido acumulados en la secuencia consenso afecto a residuos directamente implicados en
las propiedades antigenicas del virus (Mateu y Verdaguer 2004). Por este motivo se investig o la
capacidad inmunogena de la poblacion dominada por RNAs, como posible vacuna atenuada contra
el VFA, en el modelo de ratones C-54/BL-6, susceptibles a la infecci on por C-S8c1 (Salguero y col.
2005).
6.3.1. La vacunaci on con la poblaci on viral C-S8p260 proporciona una protecci on
esteril al desafo de ratones C57BL/6 con el clon de VFA C-S8c1
Todos los ratones sobrevivieron a la vacunacion con el virus vivo y posterior desafo con una dosis
letal del clon de VFA C-S8c1. No presentaron ninguno de los sntomas de la enfermedad inducida
por el VFA en estos ratones durante todo el proceso de vacunacion (Salguero y col. 2005). Estos
resultados demuestran el caracter atenuado de la poblaci on C-S8p260 para ratones C57BL/6. No se
detect o replicaci on en sueros de los animales desaados ni del virus vacunal C-S8p260. Por tanto la
117
vacunacion con diferentes dosis de la poblacion de VFA C-S8p260 conri o protecci on esteril frente
a la infecci on con VFA en el 100 % de los animales desaados. Asimismo, el 100 % de los ratones
sobrevivio a la inoculaci on con dosis altas del virus ST recombinante C-S8p260p3d y al posterior
desafo con dosis letales de C-S8c1. Esto demuestra que el virus ST C-S8p260p3d (inoculado en
exceso) esta atenuado y conere protecci on frente a la infecci on con VFA, conrmando la seguridad
de la vacunacion con C-S8p260.
6.3.2. La vacunaci on con la poblaci on viral C-S8p260 proporciona niveles altos de
anticuerpos neutralizantes
El nivel de anticuerpos neutralizantes ha sido relacionado con la protecci on in vivo a la infecci on
contra VFA (Barteling 2004; McCullough y col. 1992; McCullough y Sobrino 2004). La vacunacion
con diferentes dosis de C-S8p260 produjo niveles altos de anticuerpos IgG comparables a los niveles
inducidos por la vacuna comercial inactivada (Salguero y col. 2005). Adem as, el suero de los ratones
inmunizados fue capaz de neutralizar la infecci on de C-S8c1 en celulas BHK-21.
En conclusi on, la vacuna atenuada de VFA, basada en la poblacion dominada por RNAs
C-S8p260, ha resultado ser efectiva en un modelo de rat on. La vacunacion de ratones con virus
vivo necesit o una unica dosis, y no requiri o adyuvante. Resultados no publicados obtenidos por el
grupo de la Dra. N.Sevilla han demostrado que la vacuna basada en C-S8p260 conere tambien
protecci on en cerdo, uno de los hospedadores naturales m as importantes del VFA (manuscrito
en preparacion y solicitud de patente n
o
P200801583). Una de las ventajas de este nuevo tipo
de vacunacion es que incluye dos niveles de seguridad: (i) la baja capacidad replicativa del virus
segementado in vivo debido a la continua necesidad de complementaci on y (ii) la atenuaci on tras
260 pases en cultivos celulares, tanto del virus segmentado como de su homologo ST recombinante,
en caso de que este se generara in vivo. Por tanto, la evolucion del VFA hacia formas genomicas
segmentadas ha proporcionado un nuevo dise no de vacuna atenuada, aplicable a otros serotipos de
VFA y probablemente a otros virus RNA.
6.4. El estudio de la topologa logenetica y de particion de cuasiespecies reve-
lan los patrones evolutivos de poblaciones virales sometidas a mutagenesis
incrementada
Cuando las poblaciones virales replican en presencia de agentes mutagenicos, tales como an alo-
gos de bases, ocurren cambios notables en el espectro de mutantes de las cuasiespecies. Los ex-
perimentos iniciales de J.J.Holland y colegas documentaron incrementos muy modestos (de 1,1 a
2,8 veces) de la frecuencia de mutaciones puntuales de PV y VSV, asociados con una severa dis-
minucion de la infectividad, como consecuencia de la mutagenesis incrementada con una variedad
de agentes mutagenicos (Holland y col. 1990). Trabajos posteriores mostraron que la replicaci on
de virus en presencia de bases mutagenicas o an alogos de nucleosido puede llevar al virus a la
extinci on, acompa nada de incrementos muy modestos (desde apenas cuanticable hasta 6,4 veces)
en la frecuencia de mutaci on, (Loeb y col. 1999; Sierra y col. 2000; Tapia y col. 2005; revisiones en
Anderson y col. 2004; Domingo 2005; Graci y Cameron 2002).
En nuestros estudios previos con el VFA y el virus de la coriomeningitis linfocitaria de rat on
(LCMV) hemos observado que en el curso de la transicion hacia la extinci on viral: (i) existe una
cada de 10
2
a 10
3
veces en la infectividad especca (n umero de partculas infecciosas dividido por
el n umero total de cantidad de RNA); (ii) una carga viral baja y una baja capacidad replicativa
(tness) favorecen la extinci on; y (iii) interacciones interferentes entre los virus de una misma
cuasiespecie sometida a mutagenesis juegan un papel principal en la extinci on viral (Gonzalez-
118
Lopez y col. 2004; Gonzalez-Lopez y col. 2005; Grande-Perez y col. 2005a; Grande-Perez y col.
2005b; Grande-Perez y col. 2002; Pariente y col. 2003; Perales y col. 2007; Sierra y col. 2000).
La crtica participacion del espectro de mutantes en la extinci on viral propicio la propuesta de la
defecci on letal como modelo de extinci on de virus debido a la mutagenesis incrementada (Grande-
Perez y col. 2005b; Perales y col. 2007). Por estos motivos, resultaba interesante analizar mediante
logenia y PAQ, espectros de mutantes procedentes de poblaciones virales sometidas a mutagenesis.
6.4.1. Analisis PAQ y logenetico revelan cambios drasticos y rapidos en la estructura
poblacional
Los resultados observados concuerdan con nuestras conclusiones previas sobre el aumento en la
complejidad del espectro de mutantes de poblaciones mutagenizadas, documentados en esta Tesis
Doctoral como un aumento de la dispersi on media de los arboles logeneticos y cuanticaci on del
par ametro d. Adem as se han descrito nuevas caractersticas poblacionales asociadas a la mutagenesis
incrementada.
El arbol de NJ de una poblacion que ha evolucionado sometida a mutagenesis incrementada
consta de una secuencia consenso situada en la base y los componentes individuales de la poblacion
radiando a partir de ella. Cuanto m as mutada esta una poblacion mayor es la radiacion de las
ramas. En la topologa de este tipo de arboles no se aprecia una organizacion evidente ni robusta
que indique la presencia de subgrupos o subdivisiones. Los arboles construidos con las poblaciones
de VFA cuya polimerasa 3D inclua una mutaci on que disminuye la sensibilidad de R (RAp45 y
RAp60) (Sierra y col. 2007), mostro una ligera reduccion en la longitud de las ramas, pero mantuvo
la misma topologa general. Este resultado contrasta con la topologa del arbol derivado de la
poblacion RA0p35, el cual, tras s olo 5 pases en ausencia de R, presento una estructura interna
completamente reorganizada. La topologa del arbol realizado mediante NJ se conrmo con los
metodos de MP y MV.
El par ametro d del PAQ reeja el detalle no de la estructura intrapoblacional mejor que
otros estimadores usados tradicionalmente, tales como la frecuencia de mutacion o la entropa de
Shannon. La frecuencia de mutaci on no es sensible a la distribucion que siguen las mutaciones en
los componentes individuales de un espectro de mutantes. La entropa de Shannon se satura al
alcanzar el valor de 1, cuando todas las secuencias comparadas son diferentes, independientemente
de la carga mutacional. PAQ puede solventar esta falta de resoluci on mediante una comparacion
clon a clon respecto a una secuencia que el propio an alisis determina como central. En este sentido,
cualquier variacion, por sutil que sea, en la distribucion espacial de la frecuencia de mutacion puede
amplicarse. De este modo, se obtiene una descripci on m as sensible y no saturable de la estructura
interna de una poblacion. El presente an alisis ha documentado expansiones muy notables en la
distancia genetica media intrapoblacional asociadas a los tratamientos mutagenicos. El an alisis
revel o que, tras una expansion inicial de la diversidad intrapoblacional, ocurrio una contraccion
de la distancia media, en dos situaciones. Primero, cuando se elimin o el tratamiento mutagenico
a la poblacion. Segundo, en las poblaciones de VFA con la sustituci on en la polimerasa 3D, que
disminuye la sensibilidad a R (Sierra y col. 2007). Los resultados mostraron que las frecuencias de
mutaci on (ambas, la mnima, la m axima y su relaci on) y la entropa de Shannon, son sensiblemente
menos descriptivas que el PAQ para caracterizar la diversidad genetica interna de las poblaciones
virales mutagenizadas.
119
6.4.2. Las poblaciones mutagenizadas estan sometidas a selecci on puricadora
Las poblaciones derivadas de MARLS que replicaron en presencia de R, mostraron una alta
e inesperada resistencia a la extinci on en el pase 35 y pases sucesivos, asociada a la mutacion
de resistencia a R (Sierra y col. 2007). A pesar de presentar dicha mutacion, el n umero total de
mutaciones jadas en la secuencia consenso de la poblacion fue muy alto. El patron especco de
mutaciones de la poblaciones tratadas con mutagenos, y el incremento en frecuencia de mutacion
con respecto a las poblaciones control, esta de acuerdo con los resultados de ensayos in vitro con
la polimerasa de VFA (Agudo y col. 2008; Sierra y col. 2007).
A pesar de las altas frecuencias de mutaci on inducidas por los mutagenos, las mutaciones no
se acumularon al azar, sino que lo hicieron en zonas preferenciales del genoma. La acumulacion no
aleatoria de mutaciones as como el exceso de mutaciones sinonimas corregidas, son consistentes con
la accion de selecci on puricadora (o negativa; eliminacion de genomas no aptos en replicaci on) en
la evolucion de las poblaciones mutagenizadas. Los virus que posean menos mutaciones deletereas
debieron tener una ventaja selectiva en un entorno de virus altamente perjudicados. Bajo este
punto de vista, la cuasiespecie ejercio una actividad de tamponamiento de mutaciones, aceptando
aquellas mutaciones menos detrimentales. Esta din amica es paralela a la observada en el transcurso
de los pases tipo cuello de botella llevados a cabo con el mismo clon C-S8c1 de VFA (Escarmis y
col. 1996; Escarmis y col. 1999; Escarmis y col. 2002; Escarms y col. 2008; Manrubia y col. 2005);
revisi on en (Escarms y col. 2006). En las transferencias tipo cuello de botella se acent ua la accion
del trinquete de M uller y se seleccionan clones individuales que son capaces de replicar. En los
clones que han resistido a la extinci on se describi o un exceso de mutaciones sinonimas (Escarmis y
col. 2002; Escarms y col. 2008) y una distribucion no aleatoria de mutaciones a lo largo del genoma
(Escarmis y col. 2002).
El presente estudio poblacional apoya el modelo de defecci on letal para la extinci on viral dado
que se ha observado que un n umero bajo de mutaciones puede ser suciente para llevar a un virus a
la extinci on (Grande-Perez y col. 2005b; Loeb y col. 1999; Tapia y col. 2005). La comparacion con
clones de VFA sometidos a m ultiples transferencias placa a placa (tipo cuello de botella) resulta muy
signicativa ya que estos clones resistieron a la extinci on a pesar de que sus genomas presentaron
unas frecuencias de mutacion entre 5 y 37 veces superiores a las asociadas con la extinci on viral
mediante mutagenesis letal (Escarms y col. 2008; Gonzalez-Lopez y col. 2005; Pariente y col.
2001; Sierra y col. 2000). Se ha propuesto que en las transferencias placa a placa, la cinetica
de acumulacion de mutaciones permite la jacion de mutaciones beneciosas compensatorias que
contrarrestan el efecto del trinquete de M uller (Escarmis y col. 1999; Escarmis y col. 2002; Escarms
y col. 2006; Manrubia y col. 2005).
A la luz de estos datos, proponemos que la cinetica o tasa a la que se acumulan las mutaciones
pueda ser m as importante que la cantidad total de mutaciones acumuladas. La extinci on viral se
conseguira, junto con la accion de la defecci on letal, forzando al virus a acumular mutaciones rapi-
damente, no necesariamente como resultado de la acumulacion de un gran n umero de mutaciones.
Una cinetica rapida de acumulacion de mutaciones, que sobrepase la capacidad del virus para gene-
rar mutantes viables en una poblacion, puede llevarla a la extinci on. Una tasa baja de acumulacion
de mutaciones, por el contrario, permite la selecci on de clones que han acumulado mutaciones me-
nos deletereas, amplicandolos secuencialmente, y aumentando su frecuencia de mutacion. Como
se extrae de los pases placa a placa, la secuencia de VFA es robusta y capaz de tolerar gran n umero
de mutaciones. Por este motivo predecimos que el exito en el tratamiento de infecciones virales sea
aquel que ejerza un efecto m as rapido a pesar de durar menos tiempo, en lugar de un tratamiento
leve que haga que el virus acumule mutaciones secuencialmente.
Los an alisis logeneticos y de PAQ, para investigar la organizacion intrapoblacional de los
120
espectros de mutantes, puede ser de gran ayuda para entender la evolucion de los virus RNA,
sobre todo en aquellas poblaciones que han sido sometidas a mutagenesis incrementada. La crtica
participacion del conjunto de individuos de la cuasiespecie hace necesario el empleo de nuevas
tecnicas que permitan su monitorizaci on y cuanticaci on.
6.5. Estrategias de tness virales: la hipotesis de los dos nichos ecologicos
Cuando el espacio donde interact uan especies ecologicas se encuentra estructurado, se pueden
seleccionar individuos especialistas que aprovechen los recursos de manera diferencial. En este sen-
tido pueden existir individuos que puedan ser m as rapidos colonizando los recursos, los llamados
colonizadores, e individuos que sean m as ecientes cuando se compite por un mismo recurso, los
llamados competidores. Cuando un competidor se encuentra con un colonizador para optar a un
mismo recurso, el competidor es capaz de desplazar al colonizador (Tilman 2007). La evolucion de
la virulencia en poblaciones virales que infectan y superinfectan un mismo huesped se ha estudiado
desde este punto de vista ecologico (May y Nowak 1994; Nowak y May 1994). Las celulas, organiza-
das en tejidos, organos o cultivos en monocapa, se pueden considerar como un recurso parcheado,
discreto, en el que la unidad funcional, cada recurso discreto, es la celula.
6.5.1. Colonizadores y competidores
En esta Tesis doctoral se ha descrito un sistema experimental en el que una poblacion clonal
se ha diversicado en una subpoblacion colonizadora y otra competidora. Los virus tipo-MARLS
presentan una cinetica de muerte celular y de replicaci on viral m as rapida que los virus tipo-p200.
Estos resultados fueron consistentes al estudiar tanto poblaciones como clones biol ogicos indivi-
duales. Los virus tipo-MARLS son, por tanto, m as virulentos que los tipo-p200 y constituyen el
equivalente viral a un colonizador, ya que son m as rapidos compitiendo por el recurso global, inde-
pendientemente del rendimiento que produzcan en cada celula individualmente, o de la capacidad
competitiva dentro de ellas.
Las celulas coinfectadas con igual cantidad de los dos tipos de virus, producen m as cantidad
de virus tipo-p200. Los virus tipo-p200 fueron capaces de retrasar la cinetica de muerte celular
provocada por los virus tipo-MARLS. Sin embargo, cuando se estudio la productividad de cada
virus de manera separada, los dos tipos virales produjeron ttulos muy similares, sugiriendo que no
existe un compromiso entre producci on y virulencia, al menos en el rango de valores estudiado. Por
tanto, las poblaciones tipo-p200 son competidores, pues son capaces de desplazar (parcialmente) a
un colonizador cuando interact uan dentro de un mismo recurso.
6.5.2. Diversicaci on genetica con un origen clonal com un
Las estrategias de competicion y colonizacion se han originado y seleccionado espontaneamente
en cultivos celulares, puesto que las poblaciones tipo-p200 y tipo-MARLS tienen un origen clonal
com un (el clon C-S8c1, clonado dos veces en cultivos celulares para asegurar su pureza (Sobrino
y col. 1983)). La evolucion de este clon en cultivos celulares a lo largo de los pases di o lugar
a dos subpoblaciones, geneticamente distinguibles mediante metodos logeneticos, apoyadas por
valores estadsticos altos. Estas dos poblaciones muestran un patron de mutaciones muy diferente y
caracterstico y convivieron durante un gran n umero de pases. Estos resultados sugieren fuertemente
que las estrategias de competicion y colonizacion ocupan dos nichos ecologicos muy denidos, puesto
que el virus se adapta a ellos con cambios geneticos sostenidos en el tiempo.
121
6.5.3. Selecci on dependiente de densidad
La evolucion de las estrategias de colonizacion y competicion, enfrentadas en ensayos de tness,
mostro una dependencia sensible a las condiciones iniciales de densidad. En condiciones de baja
densidad evoluciono la estrategia de colonizacion, y en condiciones de alta densidad evoluciono la
estrategia de competicion. Estos resultados se deducen de una serie de competiciones con pobla-
ciones o clones derivados de cada tipo viral, en los que se vario la MDI inicial, el equivalente a la
densidad de individuos. A este tipo de selecci on se le denomina selecci on dependiente de densidad
(SDD).
Se ha desarrollado un modelo matem atico para investigar la SDD entre las poblaciones que ex-
plotan la estrategia de colonizacion (tipo-MARLS) y la de competicion (tipo-p200). Es un modelo
epidemiol ogico SIR (del ingles, susceptible, infectado y curado) adaptado de los modelos que descri-
ben la din amica viral de HIV en pacientes infectados (Nowak y Bangham 1996; Nowak y May 2000;
Perelson y col. 1996). Consiste en un sistema de ecuaciones diferenciales que adapta la din amica de
una epidemia modelizando los par ametros basicos para denir una infecci on en cultivos celulares.
Se han realizado cuanticaciones a partir de los experimentos (descritas en el apendice matem atico)
y se ha determinado que: (i) los virus colonizadores (tipo-MARLS) matan m as rapido a las celulas
que los competidores. Sin embargo los dos producen la misma cantidad total de virus tras matar
una celula (tama no de progenie). (ii) Las celulas infectadas por los dos tipos virales mueren con la
misma tasa que lo hacen las infectadas por los competidores, que son la variante lenta (tipo-p200).
(iii) El virus competidor es capaz de desplazar parcialmente al colonizador cuando ambos coinfectan
la misma celula.
Introduciendo las relaciones entre par ametros en el modelo matem atico junto con los valores
absolutos estimados (ver apendice matem atico), se ha podido reproducir la SDD entre dos especies
virales en competicion. Tras reescalar el modelo, se observ o que la din amica de competicion entre dos
virus, sujetos a las reglas anteriormente expuestas, es sensible unicamente a dos par ametros nuevos:
(i) las diferencias relativas en virulencia de los dos tipos virales (a); (ii) la diferencia relativa de la
capacidad competitiva de cada tipo viral en celulas coinfectadas (c). Estos dos nuevos par ametros
denen de manera precisa las dos estrategias evolutivas: por un lado los virus colonizadores, que
son aquellos virus m as virulentos, son estrategas de la a. Por otro lado, los virus competidores
que son menos virulentos, pero capaces de desplazar al virus colonizador en celulas coinfectadas,
son estrategas de la c.
La SDD se puede explicar bas andonos en los par ametros a y c, y en su signicado biol ogico.
En un escenario de competicion en el que hay pocos virus pero muchas celulas, el virus que es m as
rapido completando el ciclo de replicaci on (mayor a), saldra antes de la celula que sus competidores,
y podra colonizar antes el resto de celulas y dispersarse rapidamente. Esta estrategia de competicion
desplaza al otro virus por agotamiento de recursos. En un escenario en el que la relaci on virus/celula
es alta, se producen muchos eventos de coinfecci on. En estas circunstancias no quedan recursos
disponibles (celulas) para las segundas rondas de infecci on. Por tanto, la poblacion es dominada
por el virus con mayor capacidad competitiva o interferente dentro de la celula (mayor c).
Existen evidencias previas de SDD. La primera descripci on se realiz o en nuestro laboratorio con
el VFA (Sevilla y col. 1998a). Experimentos en cultivos celulares demostraron que virus adaptados
a replicar a diferentes MDI, desplazaban a sus competidores s olo en las condiciones de MDI en
las que se haban seleccionado. Posteriormente se observaron resultados similares con el fago 6
(Turner y Chao 1998; Turner y Chao 1999). La descripci on m as exhaustiva de SDD en virus se
ha descrito con el VSV (Novella y col. 2004). En otro estudio con VSV (de la Torre y Holland
1990) mutantes de alto tness se mantuvieron en baja proporci on en las poblaciones originales de
donde se puricaron. Esas poblaciones originales procedan de un regimen de pases a alta MDI.
122
Sin embargo, cuando se realizaron competiciones con los clones usando baja MDI, los clones eran
capaces de imponerse muy ecientemente en las competiciones. Se sugiri o que durante los pases a
alta MDI, en los que la coinfecci on es frecuente, la poblacion dominante ejerca un efecto supresor
sobre los otros mutantes (de la Torre y Holland 1990). El mismo modelo se propuso para explicar
los otros experimentos, anteriormente citados, realizados con VSV y con 6. Sin embargo, en estos
estudios no se documento interferencia. Las interacciones entre virus que coinfectan celulas han
sido ampliamente descritas (Baulcombe 1996; Bull y Molineux 1992; Gonzalez-Lopez y col. 2004;
Grande-Perez y col. 2005b; Holland 1990; Holland y col. 1989; Novella y col. 2004; Perales y col.
2007; Russel 1992; Sachs y Bull 2005; Valcarcel y Ortin 1989; Wilke y col. 2004b). Tampoco se ha
propuesto ning un modelo, basado en resultados experimentales, que describa el comportamiento de
los virus que evolucionan en condiciones de baja MDI. Existen trabajos te oricos que demuestran que,
en ciertas condiciones, fuera del equilibrio, suceden fen omenos estocasticos que pueden contribuir
a seleccionar virus de menor tness (Aguirre y Manrubia 2007; Aguirre y Manrubia 2008).
La observaci on de SDD y la supresi on de mutantes con un alto tness potencial en virus muy
distintos, sugiere fuertemente que la aparicion de las dos estrategias de replicaci on (a y c) que
dan lugar a SDD pueda ser una caracterstica general en virus RNA. Siguiendo las conclusiones de
los trabajos anteriormente citados, los virus competidores, evolucionados a alta MDI, poseen una
capacidad supresora sobre los colonizadores, demostrada en este trabajo tanto mediante an alisis
genomico de poblaciones pasadas en infecciones diluidas, como con ensayos de interferencia en la
virulencia. Proponemos que los virus colonizadores son aquellos virus dotados de mayor virulencia,
entendida como virus m as rapidos matando celulas o con mayor velocidad de replicaci on (Bonhoeer
y col. 2002; Maree y col. 2000; Wu y col. 2006).
6.5.4. Evoluci on de la virulencia
Trabajos previos en el laboratorio demostraron que mutaciones en diferentes zonas del genoma
de VFA pueden contibuir a una virulencia incrementada para celulas BHK-21 (Herrera y col. 2007).
De hecho, durante la replicaci on de virus RNA y DNA continuamente surgen virus con distinto
grado de virulencia (Baranowski y col. 1998; Buenz y Howe 2006; Kim y col. 2005; Lopez-Bueno
y col. 2006; Mason y col. 2003; Regoes y Bonhoeer 2005; Shankarappa y col. 1999; Tracy y col.
2006). El destino de estos mutantes, y las condiciones en las que se seleccionan, han sido objeto
de un extenso abordaje te orico y, sin embargo, no se ha llegado a un consenso general que prediga
la evolucion de la virulencia (May y Nowak 1994; May y Nowak 1995; Messenger y col. 1999;
Nowak y May 1994; Regoes y col. 2000; Saldana y col. 2003). Incluso se ha observado en diferentes
sistemas virales que la tness y la virulencia son rasgos que pueden no seguir una correlaci on directa
(Carrasco y col. 2007; Herrera y col. 2007; Voronin y col. 2005; Wodarz 2007).
Hasta donde hemos podido comprobar, la asociaci on de la virulencia y la SDD, desvelada en
la presente Tesis Doctoral, representa la primera descripci on experimental de las condiciones que
determinan la evolucion de mutantes virulentos en una cuasiespecie vrica. En este sentido, nuestro
modelo predice que en infecciones in vivo se seleccionaran variantes m as virulentas en los organos
donde se den condiciones de baja MDI. Esto puede suceder en organos muy irrigados, que incluyan
celulas susceptibles, en las que el virus pueda dispersarse facilmente e iniciar nuevas infecciones
aisladas. En organos muy estructurados o con baja irrigaci on, donde el virus puede dispersarse s olo
localmente, tras la primera infecci on se pueden dar condiciones de alta MDI. En un experimento
reciente de infecciones de rat on por el VFA, se analizaron virus de diferentes organos. El estudio
demostr o que cuanto m as irrigado estaba un organo, m as virulento (medido como capacidad de
matar ratones en nuevas infecciones) era el virus obtenido de ese organo. El virus obtenido de
la sangre fue el que produjo mayor virulencia (Sanz-Ramos y col. 2008). Aunque, obviamente,
123
en infecciones in vivo m ultiples factores pueden contribuir a la selecci on de virus virulentos, los
resultados estan de acuerdo con nuestro modelo de interacci on entre competidores y colonizadores.
En conclusi on, durante la replicaci on de virus RNA emergen y se seleccionan espontaneamente
dos tipos de subpoblaciones con dos tipos basicos de estrategias de tness: virus colonizadores, con
mayor virulencia y virus competidores, con mayor capacidad competitiva intracelular o interferente.
Estas dos estrategias estan sometidas a SDD. La selecci on de estas estrategias se debe a una
propiedad fsica del medio donde replican los virus, ya que las celulas son un recurso parcheado y
estructurado en dos nichos ecologicos diferentes. La descripci on de la SDD tiene varias implicaciones
en el concepto de tness viral. El resultado de un ensayo de tness puede ser radicalmente distinto,
en funcion de la MDI con la que se realice, si entre las variantes enfrentadas existen diferencias
en virulencia o velocidad de replicaci on, en la capacidad competitiva o interferente, o en ambas.
Adem as, la SDD puede ser relevante en el desarrollo de infecciones in vivo.
124
7. Conclusiones
1. En el transcurso de la evolucion de una forma segmentada del virus de la ebre aftosa (VFA)
se han identicado m ultiples formas minoritarias con deleciones internas. Se ha obtenido
evidencia de un estado transitorio de inestabilidad genetica.
2. La capacidad replicativa del segmento de RNA del VFA con la delecion 417 disminuye
cuando la posicion de la delecion 417 se modica en tres nucleotidos hacia el 5 o 3 del
RNA. Las mutaciones puntuales acumuladas durante la replicaci on del VFA contribuyeron a
aumentar la capacidad replicativa de la forma segmentada que se gener o.
3. La ventaja selectiva de la forma segmentada del VFA se debe principalmente a la mayor esta-
bilidad de las partculas, respecto al virus estandar. En cambio, no se han podido demostrar
diferencias en la entrada del virus en la celula, niveles de RNA intracelular o extracelular,
expresi on de protenas o salida del virus de la celula.
4. Las partculas de virus segmentado de VFA coneren protecci on de ratones C57/BL6 al
desafo con dosis letales del virus estandar. El sistema es candidato a una vacuna anti-ebre
aftosa.
5. Se ha adoptado el programa PAQ (Partition Analisis of Quasispecies) al an alisis de po-
blaciones mutagenizadas del VFA. Los resultados han documentado rapidas expansiones y
compresiones de la diversidad intrapoblacional en aquellas poblaciones que sobreviven al tra-
tamiento mutagenico. Se ha observado una baja diversidad intrapoblacional en las poblaciones
preextincion. La selecci on puricadora act ua durante el proceso de la mutagenesis.
6. Se ha descrito la diversicacion genetica y fenotpica de un clon de VFA durante su multipli-
cacion en cultivos celulares, y de formas recombinantes entre las dos subpoblaciones.
7. Las dos subpoblaciones dieren en su capacidad para matar celulas y capacidad interferente.
Su comportamiento corresponde a un modelo de colonizacion frente a competicion, como
resultado de la adaptaci on a un ambiente parcheado (conjunto de celulas).
125
8. Apendice logenetico
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E
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8
7
3
5
7
7
6
0.002 0.002
A B C
D E F
Figura 47: Reconstrucci on logenetica de las poblaciones RAp35 y RAp035 mediante
los metodos de Neighbour-joining, maxima verosimilitud y maxima parsimonia. La
secuencia consenso de cada poblacion se marca con un asterisco. Los clones se indican enumerados.
La barra debajo de los arboles indica la distancia. A) y D) Metodo Neighbor-joining, modelos de
Kimura-2 par ametros. Los valores de remuestro por bootstrap (1000 replicas) mayores de 50 se
indican en rojo en el arbol. B) y E) Metodo de m axima verosimilitud, modelo de substituci on
de Tamura-Nei y tasas gamma de distribucion de mutaciones con ocho par ametros (TN-8) como
modelo de hetereogeneidad. C) y F) Metodo de m axima parsimonia. Se muestran en rojo los valores
de conanza mayores de 50.
126
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0.002
Figura 48: Analisis logenetico de poblaciones de VFA mediante el metodo de maxima
verosimilitud, modelo GTR. Los clones individuales en el arbol se indican con su nombre. La
secuencia consenso se inidica con el nombre de la poblacion seguido de -cons. Como medida de
robustez de cada nodo se utilizo el test de tasa aproximada de verosimilitud.
127
9. Apendice matematico: modelo basico de dinamica viral en cul-
tivos celulares
El modelo basico de la din amica viral en cultivos celulares describe la abundancia de celulas no
infectadas, x, celulas infectadas, y, virus libre, v, en funcion del tiempo, como
x = xv
y = xv ay
v = ky uv
con las condiciones iniciales x(0) = x
0
, y(0) = 0, y v(0) = v
0
.
Este sistema de ecuaciones diferenciales ordinarias (EDO) describe la infeccion de celulas no
infectadas con una eciencia . Las celulas infectadas mueren y liberan la progenie con una tasa
a. El virus libre se produce con una tasa k y se inactiva con una tasa u. Los valores tpicos de los
par ametros se dan en la Tabla 13.
N otese que, contrariamente a lo que sucede en el modelo basico de din amica viral in vivo
(Nowak y May 2000), en cultivos celulares, no existe un suministro externo de celulas no infectadas.
Denimos = v
0
/x
0
como la multiplicidad de infecci on (MDI), esto es, la densidad inicial de virus
por celula.
1 2 5 10 20 50 100
1
e
+
0
0
1
e
+
0
2
1
e
+
0
4
1
e
+
0
6
1
e
+
0
8
u = 0
tiempo en horas
c
u
e
n
t
a
x, celulas sin infectar
y, celulas infectadas
v, virus libre
1 2 5 10 20 50 100
1
e
+
0
0
1
e
+
0
2
1
e
+
0
4
1
e
+
0
6
1
e
+
0
8
u > 0
tiempo en horas
c
u
e
n
t
a
Figura 49: Cinetica del modelo basico de dinamica de infecci on viral.
La din amica de este modelo se muestra en la Figura 49. Con par ametros genericos, las celulas
no infectadas se convierten en infectadas y producen nuevos virus durante la lisis. Este proceso,
con una tasa de inactivaci on de virus libre mayor que cero, lleva a la eventual extinci on de los virus
y de las celulas. Si despreciamos la inactivacion del virus libre y establecemos u = 0, la din amica
de las celulas son casi identicas, mientras que el n umero de virus libre se satura al alcanzar una
abundancia m axima de v

= v
0
+ (k/a)x
0
. La producci on nal de virus incrementa con la MDI si
no eliminamos el virus inicial
v

=
_
+
k
a
_
x
0
. (7)
128
Parametro Descripci on Virus 1 Virus 2
(competidores) (colonizadores)
a tasa de mortalidad de celulas infectadas 0.14 0.25
tasa de infecci on 7,8 10
8
7,8 10
8
c prob. de tipo 1 en la progenie viral 0.62 0.38
k tasa de producci on de virus libre 34.6 62.5
K = k/a tama no de progenie 250 250
r
0
tasa inicial de crecimiento viral 1.43 1.94
R
0
tasa reproductora bascia 69.5 69.5
u tasa de inactivacion de virus libre 0.28 0.28
Tabla 13: Parametros del modelo basico de la dinamica viral en cultivos celulares.
9.1. Competicion de dos virus en cultivos celulares
Consideremos ahora dos virus diferentes v
1
y v
2
que compiten por el conjunto de celulas x.
Tenemos celulas infectadas-simple y
1
e y
2
, y celulas superinfectadas y
12
. Los par ametros del modelo
estan indexados coherentemente. Asumimos que no existen diferencias en las eciencias de infecci on,

1
=
2
=
12
=
21
= ; las tasas de inactivacion viral tambien se asume que son iguales
u
1
= u
2
= u; sabemos (experimentalmente) que el tama no de progenie es igual
K =
k
1
a
1
=
k
2
a
2
=
k
12
a
12
,
lo cual implica k
12
= k
1
, and a
12
= a
1
. Para el sistema de dos virus obtenemos las ecuaciones
x = xv
1
xv
2
y
1
= xv
1
y
1
v
2
a
1
y
1
y
12
= y
1
v
2
+y
2
v
1
a
1
y
12
y
2
= xv
2
y
2
v
1
a
2
y
2
v
1
= k
1
y
1
+ck
1
y
12
uv
1
v
2
= k
2
y
2
+ (1 c)k
1
y
12
uv
2
El par ametro adicional c denota la probabilidad de que un virus producido por una celula superin-
fectada sea del tipo 1. Se dene 0 c 1. Estamos interesados en la situacion en la que el primer
virus es m as efectivo en las celulas superinfectadas y el segundo es m as rapido matando celulas y
libernado nuevas partculas virales.
c
1
> 0,5 and a
1
< a
2
.
En esta situacion, nos referimos al primer virus como el competidor y al segundo virus como el
colonizador. Los competidores producen una mayor descendencia cuando compiten por los recursos
dentro de las celulas, mientras que los colonizadores son m as ecientes dispersando la infecci on.
La din amica del modelo de dos virus se muestra en la Figura 50; el competidor y el colonizador se
denen por los par ametros en la Tabla 13.
9.2. Dinamica in silico frente dinamica in vitro
Queremos estudiar el efecto de la MDI en el resultado de los experimentos de competicion.
Antes de comparar las predicciones del modelo a los resultados experimentales, debemos realizar
129
0.1 0.5 1.0 5.0 10.0 50.0
1
e
+
0
0
1
e
+
0
2
1
e
+
0
4
1
e
+
0
6
1
e
+
0
8
MOI baja
tiempo en horas
c
u
e
n
t
a
total v
1
total v
2
v
1
v
2
y
1
y
12
y
2
0.1 0.5 1.0 5.0 10.0 50.0
1
e
+
0
0
1
e
+
0
2
1
e
+
0
4
1
e
+
0
6
1
e
+
0
8
MOI alta
tiempo en horas
c
u
e
n
t
a
clula
infectada-simple
a
1
a
2
a
12
k
1
k
2
c

k
12
(1-c) k
12
+
clula
susceptible
virus
libre

clula
infectada-simple
clula
infectada-doble
A
B
Figura 50: Dinamica de dos virus en competici on en cultivos celulares. A) Esquema de la
din amica de celulas susceptibles, infectadas y virus libre durante una infecci on con dos variantes
virales. B) Din amica de dos virus en competicion en cultivos celulares con baja (izquierda) y alta
(derecha) MDI.
130
peque nos ajustes al modelo basico presentado arriba.
9.2.1. Condiciones iniciales
Para poder controlar la cantidad de virus que se a nade a un cultivo celular, los primeros pasos
de la infecci on se llevan a cabo del mismo modo que un ensayo de titulacion. Se a nade un volumen
con cantidad conocida de virus al cultivo. Al cabo de una hora se retira el in oculo viral, eliminando
as el virus libre no adsorbido a las celulas. Posteriormente se a nade medio fresco a las celulas. De
este modo, durante la primera infecci on, debemos tratar con celulas infectadas pero sin virus libre.
Para ello, calculamos el n umero de celulas infectadas en la primera ronda de infecci on y usamos
esos valores, en lugar de utilizar el n umero inicial de virus, como solucion inicial del sistema de
EDOs
Consideremos primero un unico virus con MDI inicial = v/x
0
. La probabilidad de encontrar
celulas k veces infectadas, indicado como X = k, tras una ronda de infeccion sigue una distribucion
de Poisson.
Prob(X = k) =

k
e

k!
.
Por tanto, la probabilidad de que una celula este infectada por al menos una partcula viral es
Prob(X 1) = 1 Prob(X = 0) = 1 e

.
Para dos virus con
1
= v
1
/x
0
y
2
= v
2
/x
0
, sea X
i
= k que indica una infecci on de k veces
con el virus i, i = 1, 2. Si asumimos que las infecciones son independientes, obtenemos
p
00
= Prob(X
1
= 0, X
2
= 0) = e
(
1
+
2
)
p
01
= Prob(X
1
= 0, X
2
1) = e

1
_
1 e

2
_
p
10
= Prob(X
1
1, X
2
= 0) =
_
1 e

1
_
e

2
p
11
= Prob(X
1
1, X
2
1) =
_
1 e

1
__
1 e

2
_
usamos las siguientes condiciones iniciales para el sistema de EDOs
x(0) = p
00
x
0
y
1
(0) = p
10
x
0
y
2
(0) = p
01
x
0
y
12
(0) = p
11
x
0
v
1
(0) = 0
v
2
(0) = 0
9.2.2. Determinaci on de la cantidad de virus
Como medida comparativa del exito de dos virus en competicion en cultivos celulares, cuan-
ticamos sus abundancias al nal del experimento de infecci on. Dado que la lectura de virus en
los procedimientos experimentales no permite distinguir las partculas virales infecciosas de las no
infecciosas, en el modelo matem aticao, tambien se cuentan los virus inactivados. Las abundancias
de los virus inactivados, w
1
y w
2
, siguen las ecuaciones,
w
1
= uv
1
w
2
= uv
2
.
131
Denimos t

como el primer tiempo en el que el n umero de celulas infectadas es menor de uno,

t

=nf{t 0 | y
1
(t) < 1, y
2
(t) < 1, y
12
(t) < 1},
y escribimos v(t

) = v

, etc. La medida computacional es la tness relativa del virus 2, el coloniza-

dor, sobre el virus 1, el competidor,
f =
v

2
+w

2
v

1
+w

1
.
N otese que f
0
= v

2
/v

1
es una aproximacion a f para valores de u y f = f
0
, cuando u = 0.
9.2.3. Predicciones del modelo y resultados experimentales
La Figura 50 ilustra que, de acuerdo con el modelo, el ganador de la competicion puede ser tanto
el competidor como el colonizador, dependiendo de la MDI inicial. En condiciones de baja MDI,
los colonizadores tienen ventaja. Sin embargo, en condiciones de alta MDI, los competidores son
m as ecaces. Por ete motivo, el modelo predice la accion de la selecci on dependiente de densidad
en el resultado de la competicion.
Hemos investigado experimentalmente la abundancia nal total de ambos virus, para diferentes
densidades iniciales. Los valores observados se comparan con las predicciones de los valores de
tness realizadas con el modelo, f, para diferentes MDI.
=
v
0,1
+v
0,2
x
0
.
La Figura 51 muestra las prediciones del modelo y los datos experimentales observados, ambos
ajustados a un modelo lineal. Las predicciones se ajustan a las observaciones coherentemente. Los
datos experimentales conrman la predicci on principal del modelo, esto es, la tness es dependiente
de densidad, y con los par ametros dados en la Tabla 13, ambos resultados (v
1
o v
2
ganador) son
posibles. La ventaja del colonizador decrece con la densidad inicial de virus, hasta el punto en el
que el competidor puede desplazar al colonizador, en condiciones de muy alta densidad.
9.3. Parametros del modelo
Hemos realizado varios experimentos y empleado ciertas consideraciones te oricas para obtener
los valores de los par ametros mostrados en la Tabla 13.
Tama no de progenie, k/a. El tama no de progenie (cantidad de partculas virales producidas
por una celula infectada) k
1
/a
1
= k
2
/a
2
= k
12
/a
12
se ha determinado mediante titulacion del
sobrenadante de cultivos de celulas infectadas (por v
1
, v
2
o v
1
+v
2
) a alta MDI. En estas condiciones,
s olo se produce una ronda de infecci on y el resultado de toda la infecci on es la media de los eventos
(producci on de progenie) en cada celula infectada.
Tasa de inactivaci on del virus libre, u. La infectividad de VFA decae exponencialmente con
el tiempo (Mateo, R. et al, JGV 06), con un valor medio de u = 0,28h
1
(Davila, M., and Domingo,
E., resultados no publicados).
Tasa de mortalidad de celulas infectadas por el virus 2, a
2
. El valor de a
2
se calcul o por
observaci on directa al microscopio de muerte celular mediante la tecnica de exclusion de azul
tripano.
132
l
1e- 03 1e- 02 1e- 01 1e+00 1e+01
0
.
5
1
.
0
2
.
0
5
.
0
MDI
f
i
t
n
e
s
s
r
e
l
a
t
i
v
a
prediccion del modelo
datos experimentales
Figura 51: tness vs. MDI. Los datos experimentales son los obtenidos de las competiciones
representados en la Figura 43
Tasa reproductora basica, R
0
. La tasa reproductora basica de un virus se dene como el
n umero de infecciones secundarias, esto es, el n umero de infecciones que resultan a partir de una
celula individual, cuando todas las celulas permanecen sin infectar. Si R
0
> 1, cada celula infectada
infecta de media a m as de una nueva celula, y la poblacion viral crecer a inicialmente de manera
exponencial seg un v(t) e
r
0
t
. La tasa de crecimiento, r
0
, es la raz cuadarada mayor de la ecuaci on
r
2
0
+ (a +u)r
0
+au(1 R
0
) = 0. (8)
A partir de esta ecuaci on, podemos despejar la tasa reproductora basica (Nowak y May 2000).
La tasa de crecimiento de cada virus, r
0,i
, se ha determinado experimentalmente promediando
la pendiente de varias curvas de crecimiento viral (Figura 52).
0 2 4 6 8
y = 0,74e
0,5x 2
; R = 0,94
y = 1,03e
0,61x 2
; R = 0,99
G1:
G2:
10
10
10
10
10
3
2
1
0
-1
y = 1,22e
0,82x 2
; R = 0,98
y = 1,09e
0,26x 2
; R = 0,97
G1:
G2:
10
10
10
10
10
3
2
1
0
-1
0 2 4 6 8
y = 0,95e
0,31x 2
; R = 0,96
y = 1,33e
0,56x 2
; R = 0,92
G1:
G2:
10
10
10
10
10
3
2
1
0
-1
0 2 4 6 8
0 2 4 6 8 0 2 4 6 8
y = 0,74e
0,5x 2
; R = 0,94 y = 0,74e
0,5x 2
; R = 0,94
y = 1,03e
0,61x 2
; R = 0,99
G1:
G2:
10
10
10
10
10
3
2
1
0
-1
10
10
10
10
10
3
2
1
0
-1
y = 1,22e
0,82x 2
; R = 0,98 y = 1,22e
0,82x 2
; R = 0,98
y = 1,09e
0,26x 2
; R = 0,97
G1:
G2:
10
10
10
10
10
3
2
1
0
-1
10
10
10
10
10
3
2
1
0
-1
0 2 4 6 8
y = 0,95e
0,31x 2
; R = 0,96 y = 0,95e
0,31x 2
; R = 0,96
y = 1,33e
0,56x 2
; R = 0,92
G1:
G2:
10
10
10
10
10
3
2
1
0
-1
0 2 4 6 8
Figura 52: Curvas de crecimiento viral. La tasa de crecimiento exponencial (r
0
) se deter-
mino mediante titulacion de sobrenadante de infecciones tal y como se especica en Materiales y
metodos, 4.4. Cada panel representa un experimento diferente.
133
Eciencia de infeccion, . La tasa reproductra basica se puede escribir como R
0
= kx
0
/au
(Nowak y May 2000), a partir de la cual se obtiene .
Tasa de mortalidad de celulas infectadas por el virus 1, a
1
. Una vez se conocen el resto
de par ametros del virus 1, as como su crecimiento exponencial r
0
, se puede despejar de manera
precisa a
1
a partir de la ecuaci on 8
Probabilidad de producir virus 1 en la descendencia, c. Como se ha descrito para el calculo
del tama no de progenie, el resultado de la producci on viral en una infecci on a alta MDI representa
una media de la producci on en cada celula. Los ensayos de tness a la mayor MDI ensayada, donde
la gran mayora de las celulas estan coinfectadas, permiten distinguir la produccion de progenie
viral perteneciente a v
1
o a v
2
en celulas que estan coinfectadas por ambas variantes virales.
9.4. Analisis matematico
Para el an alisis matem atico del sistema de EDOs para la competicion de dos virus, asumimos
u = 0 y reescribimos las ecuaciones usando K = k/a,
x = xv
1
xv
2
y
1
= xv
1
y
1
v
2
a
1
y
1
y
12
= y
1
v
2
y
2
v
1
a
1
y
12
y
2
= xv
2
y
2
v
1
a
2
y
2
v
1
= Ka
1
y
1
+cka
1
y
12
v
2
= Ka
2
y
2
+ (1 c)ka
1
y
12
.
Con las condiciones iniciales x(0) = x
0
, y
1
(0) = y
2
(0) = y
12
(0) = 0, y v
i
(0) = v
i,0
, i = 1, 2.
9.4.1. Ley de conservaci on
Abusando ligeramente de la anotacion, establecemos, para i = 1, 2,
v

i
= v
i
() = lm
t
v
i
(t).
La suma
= x +y
1
+y
12
+y
2
+
v
1
K
+
v
2
K
es una cantidad conservada del sistema, por ejemplo,

= 0. Desde (0) = () se deduce que
v

1
v
1,0
+v

2
v
2,0
= Kx
0
.
Esta ecuaci on no determina la cantidad nal de ambos virus, pero dene una restriccion a esa
cantidad. Esta restriccion no depende de (incluso si no hubiesemos asumido que todas las tasas
de infeccion son iguales). Usando = (v
1,0
+v
2,0
)/x
0
obtenemos una ecuaci on similar a la ec. 7,
v

1
+v

2
= (K +)x
0
.
134
a
c
0 20 40 60 80 100
0
.
2
0
.
4
0
.
6
0
.
8
MDI = 1e- 06
a
c
0 20 40 60 80 100
0
.
2
0
.
4
0
.
6
0
.
8
MDI = 1e- 04
a
c
0 20 40 60 80 100
0
.
2
0
.
4
0
.
6
0
.
8
MDI = 0.01
Figura 53: Resultado de la competici on viral. Cada panel indica el ganador del experimento
de competicion (rojo: gana el colonizador; azul: gana el competidor) a lo largo del espacio de
par ametros completo (el plano a-c). Las tres subguras corresponden, de izquierda a derecha, a
MDI crecientes.
9.4.2. Espacio de parametros
Hemos introducido el siguiente cambio linear a las coordenadas,

t = a
1
t, x =

a
1
x, y
1
=

a
1
y
1
, y
12
=

a
1
y
12
, y
2
=

a
1
y
2
, v
1
=

Ka
1
v
1
, v
2
=

Ka
1
v
2
,
para obtener el sistema de EDOs simplicado
x = xv
1
xv
2
y
1
= xv
1
y
1
v
2
y
1
y
12
= y
1
v
2
y
2
v
1
y
12
y
2
= xv
2
y
2
v
1
ay
2
v
1
= y
1
+cy
12
v
2
= ay
2
+ (1 c)y
12
donde a = a
2
/a
1
. El nuevo sistema tiene s olo dos par ametros, a saber a y c. Hemos eliminado las
dependencias indirectas en , K, y a
1
. N otese que el competidor y el colonizador descritos en la
Tabla 13 dieren unicamente en esos dos restantes par ametros, precisamente.
Para poder explorar el espacio de par ametros del modelo es suciente considerar el caso en el
= 1, K = 1, y a
1
= 1. Estamos interesados en si la tness
f
0
=
v

2
v

1
=
(1 +)x
0
v

1
1
es mayor o menor que 1 para cualquier valor dado de a y c. La Figura 53 explora esta cantidad
mostrando su logaritmo en el plano a-c para tres MDI diferentes. Para valores de c < 0,5, los
colonizadores ganaran siempre, mientras que para valores de c > 0,5 y valores peque nos de a, los
competidores desplazar an siempre a los colonizadores. Para c > 0,5 y a 1, el resultado de la
competicion depende de la MDI inicial de la infeccion: los colonizadores ganaran en condiciones de
baja densidad, mientras que los competidores lo har an en las condiciones de alta MDI inicial.
135
10. Apendice informatico
Se ha desarrollado una simulacion en C sobre la din amica b asica de replicaci on de virus en
cultivos celulares. La simulacion consta de una gradilla de celulas, adyacentes unas a otras, suscep-
tibles de ser infectadas. Al ejecutar el programa, el usuario decide el n umero inicial de celulas y de
virus con el que comienza la infeccion. Los virus iniciales son distibuidos al azar a lo largo de la
gradilla, estableciendo as la primera ronda de infecci on. Las celulas infectadas liberan nuevo virus
(de todos los tipos por los que han sido infectadas). El virus liberado se desplaza en dos dimensiones
seg un una simulacion fsica de difusion de partculas. Las nuevas partculas tienen la posibilidad de
infectar celulas susceptibles. Las nuevas partculas se van inactivando a lo largo del tiempo.
Granularidad. El tiempo en la simulacion se mide como granularidad. La granularidad es pro-
porcional a las veces que el programa ejecuta un loop. As, un tiempo de 100 equivale a 100 loops
del programa.
Celulas. Las celulas estan ubicadas en una matriz hexagonal. Es decir, cada celula tiene 6 veci-
nos. La vecindad de 6 establece que, respecto a una celula central, cualquier celula adyacente es
equidistante. Las celulas, en ausencia de infecci on, son inmortales.
Virus. El progarama tiene la capacidad de denir tantos tipos virales como se desee. Cada tipo
viral esta denido por ciertos par ametros:
Capacidad de carga, K
i
. La capacidad de carga, que tecnicamente es una propiedad de la
celula, depende del tipo viral por el que la celula esta infectada. Equivale al tama no de progenie,
denido en el texto principal y en el apendice matem atico.
Tasa de crecimiento, r
i
. Equivale a la tasa de crecimiento inicial r
0
(apendice matem atico).
Es la cantidad de virus producido por unidad de tiempo.
Tasa de inactivaci on, u. Equivale a la tasa del mismo nombre del apendice matem atico. Es
la proporci on de virus inactivado por unidad de tiempo.
Factor de competici on, c. Una celula que esta infectada por dos variantes virales distintas,
produce una proporci on c
i
de cada tipo. Siendo

n
i=0
c
i
= 1
Velocidad de difusi on. Las partculas virales, una vez son liberadas fuera de la celula,
difunden por la matriz. Se mide como la granularidad necesaria para atravesar una celula.
Las partculas virales son liberadas de las celulas siguiendo una funcion logstica:
N(t) =
K e
rt
K +N
t
(e
rT
1)
(9)
D onde T es el tiempo que tarda la celula en producir las K partculas.
Las partculas se distibuyen en dos dimensiones siguiendo los gradientes de concentraci on de
partculas. Las partculas se desplazan en la direccion inversamente propocrcional a la cantidad de
vecinos. Es decir, las zonas con menos partculas atraen con mayor fuerza a las nuevas partculas,
y viceversa. Esta difusion sigue la regla:
136
x
i
=
_

_
1 +
_
_
_
N
6
n
i
N
_
_
_
_

_
(10)
D onde X
i
es el n umero de partculas que pasa de un area a la adyacente i. Cada area se dene
como el espacio ocupado por una celula. 6 es el n umero de areas vecinas. N es el n umero de
partculas en un area determinada. n
i
es el n umero de partculas en el area vecina i.
Se ha generado un video con el resultado de las simulaciones (Figura 54). El video transforma de
manera proporcional la matriz hexagonal en pxeles. Las celulas vivas se representan como puntos
blancos. Aparece un espacio intercelular, por motivos visuales unicamente, en negro. La celula se
vuelve de color verde o rojo en funcion de la variante viral que la infecta. La celula act ua como foco
de dispersi on de virus, que se representan como pxeles rojos o verdes. La intensidad del color es
proporcional a la cantidad de virus. Las celulas amarillas estan coinfectadas por las dos variantes.
137
Figura 54: Simulaci on de virus. De izquierda a derecha y de arriba a abajo, serie temporal de la
simulacion de una infecci on con dos variantes virales (en rojo y verde).
138
10.1. Codigo fuente
/* Albert Cardona and Samuel Ojosnegros
* Simulating viral populations of competitor and colonizer viruses.
* 2008 at INI Zurich.
*
* With much help from Stephan Saalfeld regarding C++ aspects.
*
* Compile with:
* g++ -O2 -Wall -o sim-sin.o sim-sin.c 2>&1 | less
*/
#include <math.h>
#include <time.h>
#include <stdlib.h>
#include <stdio.h>
#include "utilities.cpp"
#define E 2.718281828459
/* A very large number to use as initalizer when looping to find a minimal number.*/
#define MAX_VALUE 99999999
/* VIRUS TYPE */
typedef struct {
int rep_cyc_len; /* replication_cycle_length */
int delay;
float half_life;
float K; /* Carrying capacity of the virus. */
float R; /* Growth rate or replication rate. */
float IR; /* Infectivity rate. */
} VirusType; /*Not a virion particle, but a virus type. */
/* Longest life length of an infected cell, from infection point to death: */
const int infected_cell_lifespan = 100;
/* Time granularity: relative to the longest cycle of all viruses. */
const int granularity = infected_cell_lifespan * 1;
/* VirusType constructor. */
VirusType* make_virus(const int rep_cyc_len, const int delay, const float
half_life, const float K, const float R, const float IR) {
VirusType* virus = static_cast< VirusType* >( malloc(sizeof(VirusType)) );
virus->rep_cyc_len = rep_cyc_len;
virus->delay = delay;
virus->half_life = half_life;
virus->K = K;
virus->R = R;
virus->IR = IR;
139
return virus;
}
/* Types of viruses */
#define NUM_VIRUS_TYPES 2
/*Slow virus: competitor */
VirusType* competitor;
/*Fast virus: */
VirusType* colonizer;
/* All virus types into an array. */
VirusType* virus_types[NUM_VIRUS_TYPES];
void initVirusTypes(float K1, float R1, float HL1, float IR1, float K2, float
R2, float HL2, float IR2) {
competitor = make_virus(1 * infected_cell_lifespan, 20, HL1, K1, R1, IR1);
colonizer = make_virus((int)(0.7 * infected_cell_lifespan), 15, HL2, K2, R2, IR2);
virus_types[0] = competitor;
virus_types[1] = colonizer;
printf("Initialized competitor with K=%f, R=%f, HL=%f\n", K1, R1, HL1);
printf("Initialized colonizer with K=%f, R=%f, HL=%f\n", K2, R2, HL2);
}
/* Forward declaration for Cell so it can refer to itself. */
typedef struct Cell_ Cell;
/* CELL */
struct Cell_ {
//int index; /* The index of this cell in the array. */
VirusType** virus_type; /* Array of virus types infecting this cell, of size
NUM_VIRUS_TYPES. An entry is null when not in use, and means that virus (same
order as in global virus_types array) is not infecting this cell. */
bool succeptible; /* Whether the infection by a new virus has any effect. */
int infection_start_time; /* -1 by default, meaning not infected yet. */
bool alive; /* true by default. */
Cell** neighbors;
int n_neighbors;
float n_virions[NUM_VIRUS_TYPES]; /* Of length NUM_VIRUS_TYPES, counts the
n_virions for each type floating on top of this cell. Its a floating point
so it accumulates the values after the coma. Same ordering as in global
virus_types and Cell->virus_type. */
};
140
/* CELLS lie on a hexagonal grid. */
// Commented out to disable: does not even get compiled when disabled!
// #define DEBUG_NEIGHBORS 1
/* Find all neighbors for cell i in the hexagonal grid of length n_cells and
row length side*/
void find_neighbors(Cell** cells, const int n_cells, const int i, const int side) {
const int x = i % side;
const int y = i / side;
Cell** neighbors = static_cast< Cell** >(malloc(sizeof(Cell*) * 6)); // array
const int rem = y % 2; // reminder: 0 means even, 1 means odd
int next = 0; // from 0 to 6, indicates the number of neighbors found
// tops: only when y > 0
if (y > 0) {
if (0 == x) {
if (0 == rem) {
// EVEN Y
// ADD top-left
const int p = (y-1) * side + x;
neighbors[next++] = cells[p];
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
printf("Adding to %i top-left %i\n", i, p);
#endif
}
// else NO top-left
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
else {
printf("NOT Adding top-left to %i\n", i);
}
#endif
// ADD top-right
const int p = (y-1) * side + x + (0 == rem ? 1 : 0);
neighbors[next++] = cells[p];
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
printf("EX Adding to %i top-right %i\n", i, p);
#endif
} else if (x == side-1) {
if (0 != rem) {
// ODD
// ADD top-right
const int p = (y-1) * side + x;
neighbors[next++] = cells[p];
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
printf("Adding to %i top-right %i\n", i, p);
141
#endif
}
// else NO top-right
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
else {
printf("NOT Adding top-right to %i\n", i);
}
#endif
// ADD top-left
const int p = (y-1) * side + x - rem;
neighbors[next++] = cells[p];
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
printf("EX Adding to %i top-left %i\n", i, p);
#endif
} else {
// top-left
const int pl = (y-1) * side + x - rem;
neighbors[next++] = cells[pl];
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
printf("Adding to %i top-left %i\n", i, pl);
#endif
// top-right
const int pr = (y-1) * side + x + (0 == rem ? 1 : 0);
neighbors[next++] = cells[pr];
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
printf("Adding to %i top-right %i\n", i, pr);
#endif
}
}
// left
if (x > 0) {
// ADD left
neighbors[next++] = cells[i-1]; // same: [y * side + x -1];
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
printf("Adding to %i left %i\n", i, i-1);
#endif
}
// right
if (x < side-1) {
// ADD right
neighbors[next++] = cells[i+1]; // same: [y * side + x +1];
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
printf("Adding to %i right %i\n", i, i+1);
#endif
}
// bottoms: only when y < side-1
142
if (y < side-1) {
// bottom-left
if (0 == x) {
if (0 == rem) {
// EVEN
// ADD bottom-left
const int p = (y+1) * side;
neighbors[next++] = cells[p];
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
printf("Adding to %i bottom-left %i\n", i, p);
#endif
}
// else NO bottom left
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
else {
printf("NOT Adding bottom-left to %i\n", i);
}
#endif
// ADD bottom-right
const int p = (y+1) * side + x + (0 == rem ? 1 : 0);
neighbors[next++] = cells[p];
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
printf("EX Adding to %i bottom-right %i\n", i, p);
#endif
} else if (x == side -1) {
if (0 != rem) {
// ODD
// ADD bottom-right
const int p = (y+1) * side + x;
neighbors[next++] = cells[p];
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
printf("Adding to %i bottom-right %i\n", i, p);
#endif
}
// else NO bottom-right
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
else {
printf("NOT Adding bottom-right to %i\n", i);
}
#endif
// ADD bottom-left
const int p = (y+1) * side + x - rem;
neighbors[next++] = cells[p];
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
printf("EX Adding to %i bottom-left %i\n", i, p);
#endif
} else {
// ADD both
143
// bottom-left
const int pl = (y+1) * side + x - rem;
neighbors[next++] = cells[pl];
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
printf("Adding to %i bottom-left %i\n", i, pl);
#endif
// bottom-right
const int pr = (y+1) * side + x + (0 == rem ? 1 : 0);
neighbors[next++] = cells[pr];
#ifdef DEBUG_NEIGHBORS
printf("Adding to %i bottom-right %i\n", i, pr);
#endif
}
}
cells[i]->neighbors = neighbors;
cells[i]->n_neighbors = next; /* Next now acts as a length. */
/* // debug: test if any neighbor is the same cell
int j;
for (j=0; j<next; j++) {
if (cells[i] == neighbors[j]) printf("WARNING cell[%i] is self-assigned
to neighbor[%i]\n", i, j);
}
*/
/*// debug: test if any neighbor is repeated
int g;
for (j=0; j<n_neighbors; j++) {
for (g=j+1; g<n_neighbors; g++) {
if (neighbors[j] == neighbors[g]) printf("WARNING: cell[%i] has
repeated neighbor %i,%i\n", i, j, g);
}
}
*/
}
Cell** create_cells(const int side) {
const int n_cells = side * side;
Cell** cells = static_cast< Cell** >(malloc(sizeof(Cell*) * n_cells));
/* square grid */
int x, y;
int i;
for (y=0; y<side; y++) {
for (x=0; x<side; x++) {
Cell* cell = static_cast< Cell* >(malloc(sizeof(Cell)));
cell->virus_type = NULL;
cell->succeptible = true;
cell->infection_start_time = -1;
144
cell->alive = true;
for (i=0; i<NUM_VIRUS_TYPES; i++) {
cell->n_virions[i] = 0; // init to zero
}
/* Store into array: */
cells[y * side + x] = cell;
// DEBUG
// cell->index = y * side + x;
}
}
/* Now find the neighbors of each cell, and its number too. */
for (i=0; i<n_cells; i++) {
find_neighbors(cells, n_cells, i, side);
}
return cells;
}
void inactivate_virions(Cell* cell) {
/* e^-(granularity * time) */
/* x(t) = x * e^(1/virion_half_life * (current_time - start_time) */
int k;
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
/* recalculate the number of viral particles of each type: */
//printf("before: n_virions[%i] = %i -- ", k, cell->n_virions[k]);
cell->n_virions[k] = cell->n_virions[k] * virus_types[k]->half_life;
//printf("after: n_virions[%i] = %f\n", k, cell->n_virions[k]);
}
}
void infect(Cell* cell, const int k_virus_type, const int time_tick) {
if (! cell->succeptible) return;
/*Add the virus type to the cell */
int i;
/*If the cell has not yet been infected: */
if (NULL == cell->virus_type) {
cell->virus_type = static_cast< VirusType** >(malloc(sizeof(VirusType*)
* NUM_VIRUS_TYPES)); /* MUST BE increased if there are any more virus
types than just 2 !*/
for (i=0; i<NUM_VIRUS_TYPES; i++) {
if (k_virus_type == i) cell->virus_type[i] = virus_types[k_virus_type];
145
else cell->virus_type[i] = NULL;
}
cell->infection_start_time = time_tick;
return;
}
/* If the cell was already infected by any virus: */
/* Search the infecting_types if the cell has it already */
if (NULL != cell->virus_type[k_virus_type]) {
/* The cell is already infected by virus type k */
return;
}
/* Else, the cell was not infected by k_virus_type yet: */
cell->virus_type[k_virus_type] = virus_types[k_virus_type];
/* ... BUT, for sure, was infected by another type! Find out if its infected
by all possible types already. */
for (i=0; i<NUM_VIRUS_TYPES; i++) {
if (NULL == cell->virus_type[i]) return; /* At least one type is NOT
infecting it, so the cell is still succeptible if it hasnt passed yet
its infecting viruses delay period. */
}
/* Else, all possible virus types are already infecting the cell: */
cell->succeptible = false; /* This is an optimization to avoid scanning cells
when a cell contains all possible types of viruses: accepting more is
disabled in this simulation (has no effect). */
}
/* Add all viruses from temporary hash maps to the neighbor cells, and subtract
them from the self. */
void send_viruses_to_neighbors(Cell* cell, float** send)
{ //float send[NUM_VIRUS_TYPES][6]) {
Cell** neighbors = cell->neighbors;
const int n_neighbors = cell->n_neighbors;
int j,k;
// for each virus type
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
// for each neighbor
for (j=0; j<n_neighbors; j++) {
/*
if (cell->index == 12) { // DEBUG
printf("Cell %i sends to neighbor %i the amount %f\n",
146
cell->index, neighbors[j]->index, send[k][j]);
}
*/
neighbors[j]->n_virions[k] += send[k][j];
/* Add to the neighbor */
cell->n_virions[k] -= send[k][j];
/* Subtract from the source cell */
}
}
//printf("\n");
}
#define NORMAL 11
#define INFECTED 22
#define DEAD 33
/* Returns the largest delay of all virus types infecting a cell, if any.
Otherwise returns zero. */
int find_max_delay(const Cell* cell) {
int k;
int max = 0;
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
if (NULL == cell->virus_type[k]) return max;
const int delay = cell->virus_type[k]->delay;
if (delay > max) max = delay;
}
return max;
}
/* Returns true if the cell is not infected, or when infected, if the delay
is not over. */
bool is_infectable(Cell* cell, const int time_tick) {
if (! cell->alive) return false;
/* Dead! */
if (-1 == cell->infection_start_time) return true;
/* Not infected yet */
if (cell->infection_start_time + time_tick > find_max_delay(cell)) return true;
/* Infected, but still within delay. */
/* Else already infected and beyond delay window: not infectable. */
return false;
}
/* Attempt to infect the cell with its current load. Returns the cell state:
DEAD or INFECTED or NORMAL. */
unsigned char attempt_to_infect(Cell* cell, const int time_tick) {
if (! cell->alive) return DEAD;
unsigned char state = NORMAL;
147
if (-1 != cell->infection_start_time) {
if (! is_infectable(cell, time_tick)) {
return INFECTED; /* Cannot be infected by any more viruses. */
}
state = INFECTED;
// else attempt to infect with another virus
}
// DEBUG: observing the spread of a single virus
// if (true) return state;
// else attempt to infect, from the pool of floating virions on top of the cell
// for each virus type:
int k, i;
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
const int n_virions = (int)(cell->n_virions[k] + 0.5f); /* rounding */
// Now apply infectivity rate to each of the n_virions
for (i=0; i<n_virions; i++) {
// attempt to infect at random: drand48 returns a value from zero
(inclusive) to 1 (not-inclusive)
if (drand48() < virus_types[k]->IR) { // INFECTIVITY_RATE is from 0 to 1
// virus enters cell
infect(cell, k, time_tick); /* Infect with virus_types[k] virus. */
// virus is removed from pool of viruses floating over the cell
cell->n_virions[k] -= 1;
// new cell state:
state = INFECTED;
}
}
}
return state;
}
/* Find the longest replication cycle length of all viruses infecting the cell. */
int find_max_rep_cycle_len(const Cell* cell) {
int max = 0;
int k;
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
if (NULL == cell->virus_type[k]) continue;
const int rep_cyc_len = cell->virus_type[k]->rep_cyc_len;
if (rep_cyc_len > max) max = rep_cyc_len;
}
return max;
}
148
/* Kill the cell when infected and the time of infection plus the longest
replication cycle of all the viruses that infect it is the same or larger
than the current time. */
bool attempt_to_kill(Cell* cell, const int time_tick) {
if (-1 == cell->infection_start_time) return false; /* Not infected
, and alive. */
/* Try if cell can die. */
if (time_tick - cell->infection_start_time >= find_max_rep_cycle_len(cell)) {
cell->alive = false;
cell->succeptible = false;
//printf("Killed cell ");
return true; // dead
}
/* Try if cell can stop being succeptible. */
if (time_tick - cell->infection_start_time >= find_max_delay(cell)) {
cell->succeptible = false;
}
return false; // alive
}
/* At each time tick, the proportion of floating virions that move from one
cell onto all its neighbors. */
#define MOVING_PROPORTION 0.25f
/* Move viruses from one cell to the send (which will be later passed on to
neighbors). */
void move_viruses(Cell* cell, float** send /*, const int cell_index, const int
time_tick*/ ) { // float send[NUM_VIRUS_TYPES][6]) {
int k, i;
/* Check if the cell (as a location) has any viruses to send to its
neighbors. */
float n_virions = 0;
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
n_virions += cell->n_virions[k];
}
const int n_neighbors = cell->n_neighbors;
if (n_virions <= 0) {
// reset to zeros
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
for (i=0; i<n_neighbors; i++) {
send[k][i] = 0;
}
}
149
// ... and finish
return;
}
Cell** neighbors = cell->neighbors;
/* Compute amount to transfer to each neighbor, following this equation:
* Xi = (1/n_neighbors) * ( 1 + ( (N/n_neighbors - ni) / N ) )
* where Xi is the proportion of virions to send to each neighbor
* where N is the total amount of virions in the neighborhood of 6 cells,
not including the self
* where ni is the amount of virions of type k in a neighbor i
*/
float N = 0; // Total amount of virions of all types in the neighbor cells.
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
for (i=0; i<n_neighbors; i++) {
N += neighbors[i]->n_virions[k];
}
}
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
if (0 == N) {
/* The neighbors dont have any viruses at all. */
/* Send 1/n_neighbors * MOVING_PROPORTION to each. */
for (i=0; i<n_neighbors; i++) {
send[k][i] = cell->n_virions[k] * MOVING_PROPORTION / n_neighbors;
//printf("NONE at all: send[%i][%i] = %f -- n_neighbors=%i,
cell_index=%i\n", k, i, send[k][i], n_neighbors, cell_index);
}
} else {
for (i=0; i<n_neighbors; i++) {
const float Xi = ( 1 + ( (N / n_neighbors) - neighbors[i]->
n_virions[k]) / N ) / n_neighbors;
//printf("N=%f, ni=%f, n_neighbors=%i, Xi=%f\n", N, ni,
n_neighbors, Xi);
/* Weighted by the moving proportion, which simulates the
time that it takes a virion particle to move across the
span of one cell */
send[k][i] = cell->n_virions[k] * MOVING_PROPORTION * Xi;
//printf("send[%i][%i]=%f\n", k, i, send[k][i]);
//printf("neighbors[%i]->n_virions[%i] = %f and send[%i][%i] =
%f\n", i, k, neighbors[i]->n_virions[k], k, i, send[k][i]);
/*
if (time_tick == 30) {
printf("neigh %i/%i gets sent %f\n", i, n_neighbors,
send[k][i]);
}
*/
}
150
}
}
}
/* // Not in use
float find_min_R(Cell* cell) {
int k;
float min_R = MAX_VALUE;
for (k=1; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
if (NULL == cell->virus_type[k]) continue; // Means: k virus type is not
infecting this cell.
if (cell->virus_type[k]->R < min_R) min_R = cell->virus_type[k]->R;
}
return min_R;
}
*/
/* // Not in use
float find_min_K(Cell* cell) {
int k;
float min_K = MAX_VALUE;
for (k=1; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
if (NULL == cell->virus_type[k]) continue; // Means: k virus type is not
infecting this cell.
if (cell->virus_type[k]->K < min_K) min_K = cell->virus_type[k]->K;
}
return min_K;
}
*/
/* Logistic equation. */
float leq(const float K, const float R, const int time_tick) {
return (float)(( K * pow(E, R * time_tick) ) / (K + -1 + pow(E, R *
time_tick)));
}
void attempt_emit_virions(Cell* cell, const int time_tick, const float prop) {
if (-1 == cell->infection_start_time) return; // not infected
int k;
/* No matter how many virus types infect, the R will be that of the slowest
one,
which also has the longest delay.*/
float min_R = 0;
float min_K = 0;
int max_delay = 0;
151
int i_slow = 0; // the index of the slowest one
int n_infecting_viruses = 0;
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
if (NULL == cell->virus_type[k]) continue; /* Means: k virus type is not
infecting this cell. */
n_infecting_viruses++;
/* Look for the longest delay. */
const VirusType* vt = cell->virus_type[k];
if (vt->delay > max_delay) {
max_delay = vt->delay;
min_K = vt->K;
min_R = vt->R;
i_slow = k;
}
}
//printf("max_delay=%i\n", max_delay);
/* If delay time is not over, cant emit. */
if (time_tick - cell->infection_start_time < max_delay) {
return;
}
/* The K is proportional to the number of virus types infecting. */
min_K /= n_infecting_viruses;
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
if (NULL == cell->virus_type[k]) continue; /* Means: k virus type is not
infecting this cell. */
/* Add new virions of type k to the column above the cell: */
float K = min_K;
/* When more than one virus is infecting, scale down the K of all viruses
except the slowest one. */
if (n_infecting_viruses > 1 && i_slow != k) {
K *= prop;
}
/** Add to the free virions floating on top of the cell: */
const int rel_tick = time_tick - cell->infection_start_time - max_delay;
/* Elapsed time relative to end of delay. */
const float n_last = leq(K, min_R, rel_tick-1);
const float n_now = leq(K, min_R, rel_tick);
//printf("TYPE=%i, n_now=%f, n_last=%f, adding %f\n", k, n_now, n_last,
(float)(n_now - n_last));
cell->n_virions[k] += (float)(n_now - n_last); /* Adding the difference! */
}
}
152
int MYround(const double value) { // 89.7787
const int v = (int)value; // 89
if ( (value - v) > 0.5) {
return v + 1;
} else {
return v;
}
}
int randint(const int min, const int max) {
return min + MYround( (max-min) * drand48() );
}
void debug(Cell** cells, const int i, const char label, float prev[][2]) {
int k;
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
if (0 == (int)cells[i]->n_virions[k] && 0 != (int)prev[i][k]) {
printf("%c - CHANGE from non-zero to zero for cell %i, at k=%i\n",
label, i, k);
}
/*
if (i > 69) {
printf("%c - i=%i\n", label, i);
}
*/
// set current prev
prev[i][k] = cells[i]->n_virions[k];
}
}
// Activate reporting of sum of virions
//#define DEBUG
#ifdef DEBUG
void sum_n_virions(Cell** cells, int n_cells, int time_tick, char label) {
float n[NUM_VIRUS_TYPES];
int i, k;
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
n[k] = 0;
}
for (i=0; i<n_cells; i++) {
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
n[k] += cells[i]->n_virions[k];
}
153
}
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
printf("%i -- %c -- k=%i type has n=%f\n", time_tick, label, k, n[k]);
}
}
#endif
int binarize(const int val, const int n_bins, const int max) {
/*
const int bin = max / n_bins;
int b = 0;
do {
if (val < b) return b;
b += bin;
} while (val < max);
return max;
*/
if (val < 1) return 0;
if (val < 73) return 73;
if (val < 146) return 146;
return 220;
}
#define LOG10_2 0.3010299956639812
/* Reuses the pixel array to paint the current state of dead cells and virion
load. */
void paint_frame(Cell** cells, const int n_cells, const int side, const int
time_tick, unsigned int* pixels, const bool BINARIZE) {
/*
* Cells are defined as an hexagonal grid within a square grid, like this:
* _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _
* | | | | | | |
* | | C | | C | | C |
* |_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|
* | | | | | | |
* | | 1 | 1 | | | |
* |_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|
* | | | | | | |
* | C | 1 | C1 | | C | |
* |_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|
* | | | | | | |
* | | | | | | |
* |_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|
* | | | | | | |
154
* | | C | | C | | C |
* |_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|_ _ _|
*
* A cell C1 owns its own pixel (where it paints black when dead)
* and the left, top-left and top pixels (where it paints the number
of free floating virions).
*
*
* RGB:
*
* Green channel: competitor, virus_types[0]
Gradient of green 0, 0-200, 0
* Red channel: colonizer, virus_types[1],
Gradient of red 0-200, 0, 0
*
* Non-infected cell: White 255, 255, 255
* Infected cell with colonizer: Red 255, 0, 0
* Infected cell with competitor: Green 0, 255, 0
* Doubly infected: Yellow 255, 255, 0
* Dead cell: Black 0, 0, 0
*
*
*/
int y, x, i;
int offset = 1;
const int width = side * 2;
const int height = width -1;
/* Ratio to scale n_virions to fit within 0-200 pixel intensity range: */
const float prop1 = 220.0f / virus_types[0]->K;
const float prop2 = 220.0f / virus_types[1]->K;
// writing in byte order: ARGB (as ImageJ expects them in "Import -> Raw...")
/* For every other row, starting at row 0: */
for (y=0; y<height; y+=2) {
/* For every other column, starting at column 0 or 1 (the offset): */
for (x=offset; x<width; x+=2) {
// The index in the cells array:
i = (y / 2) * side + (x-offset)/2;
// The index in the pixels array where the cell state is painted:
const int i_pix = y * width + x;
// Now just read cells[i] and paint its state at pixel i_pix
if (! cells[i]->alive) pixels[i_pix] = 0xff000000; // dead cell
// Pure black
else if (NULL != cells[i]->virus_type) { // at least one virus
is infecting
unsigned short state = 0;
155
if (NULL != cells[i]->virus_type[0]) state += 1;
if (NULL != cells[i]->virus_type[1]) state += 2;
// same as += (1 << 1);
switch (state) {
case 1: // infected only by virus_type[0], the competitor
pixels[i_pix] = 0x0000ff00; // Pure green
break;
case 2: // infected only by virus_type[1], the colonizer
pixels[i_pix] = 0xffff0000; // Pure red
break;
case 3: // infected by both
pixels[i_pix] = 0xffffff00; // Pure yellow
break;
}
} else {
// not infected
pixels[i_pix] = 0xffffffff; // = 255 + (255<<8) + (255<<16)
// Pure white
}
// Compute pixel intensity for number of free virions on top of
each cell
int pix_competitor = (int)(cells[i]->n_virions[0] * prop1 + 0.5f);
//if (pix_competitor > 220) pix_competitor = 220;
//else if (pix_competitor < 0) pix_competitor = 0;
// floating-point errors ...
int pix_colonizer = (int)(cells[i]->n_virions[1] * prop2 + 0.5f);
//if (pix_colonizer > 220) pix_colonizer = 220;
//else if (pix_colonizer < 0) pix_colonizer = 0;
// floating-point errors ...
// exagerate color
if (BINARIZE) {
pix_competitor = binarize(pix_competitor, 3, 220);
pix_colonizer = binarize(pix_colonizer, 3, 220);
}
// Compound RGB value of free virions:
const unsigned int intensity = 0xff000000 + (pix_competitor << 8)
+ (pix_colonizer<<16); // red + green
// Now paint the virus density on the left, top and bottom pixels
if (x > 0) { // Paint left pixel
pixels[i_pix-1] = intensity;
/*
if (y > 0) { // Paint top-left pixel
156
pixels[i_pix - width - 1] = intensity;
}
*/
}
if (y > 0) { // Paint top pixel
pixels[i_pix - width] = intensity;
}
if (y < height-1) { // Paint bottom pixel
pixels[i_pix + width] = intensity;
}
}
// flip: if 0, then 1. If 1, then 0. See drawing above to understand why.
offset ^= 1;
}
/* Write pixels to file: */
FILE* frame = fopen(concatenate(getZeroPaddedNumber(time_tick, 8), ".raw"),
"w");
if (NULL == frame) {
printf("Saving frame image: could not open file for writing.");
return;
}
// write in one step
fwrite(pixels, width * height * sizeof(unsigned int), 1, frame);
/*
for (i=0; i<width*height; i++) {
fprintf(frame, "%c%c%c%c", ((pixels[i]&0xff000000)>>24),
((pixels[i]&0x00ff0000)>>16),
((pixels[i]&0x0000ff00)>>8),
((pixels[i]&0x000000ff)));
}*/
fclose(frame);
}
int main(const int n_args, const char* argv[]) {
if (n_args < 14) {
printf("\nUsage: ./sim.o <n_start_competitor> <n_start_colonizer>
<grid side> <K1> <R1> <HL1> <infectivity_rate_1> <K2> <R2> <HL2>
<infectivity_rate_2> <prop_K> <binarize_color>\n\n");
printf("For example:\n./sim-sin.o 10 10 10 500 0.16 0.995 0.0001
500 0.13 0.995 0.0001 0.8 0\n\n");
return 0;
}
157
printf("OK reading %i args\n", n_args);
const int n_start_competitor = strtol(argv[1],NULL, 10);
const int n_start_colonizer = strtol(argv[2],NULL, 10);
const int side = strtol(argv[3],NULL, 10);
const float K1 = (float)strtod(argv[4], NULL);
const float R1 = (float)strtod(argv[5], NULL);
const float HL1 = (float)strtod(argv[6], NULL); // half_life
const float IR1 = (float)strtod(argv[7], NULL);
const float K2 = (float)strtod(argv[8], NULL);
const float R2 = (float)strtod(argv[9], NULL);
const float HL2 = (float)strtod(argv[10], NULL); // half_life
const float IR2 = (float)strtod(argv[11], NULL);
const float PROP = (float)strtod(argv[12], NULL); /* The slow virus make
the fast virus emit virions slower. */
const bool BINARIZE = (1 == strtol(argv[13], NULL, 10)); /* Whether to
paint n_virions in 3 bins 0-73, 74-146 and 1467-220, or in a continuous
palette 0-220. */
printf("Read args ...\n");
const int n_cells = side * side;
printf("Going to create %i cells...\n", n_cells);
Cell** cells = create_cells(side);
printf("Created %i cells.\n", n_cells);
/* Create the VirusType instances. */
initVirusTypes(K1, R1, HL1, IR1, K2, R2, HL2, IR2);
/* Seed with time */
int now = difftime(time(NULL), 0);
//printf("\nTime now: %i\n", now);
srand48(now);
printf("Initalized random seed with time %i\n", now);
int i, j, k;
/* Starting at time 1 and not 0, to avoid potential problems in hash
tables regarding NULL == 0. */
int time_tick = 1;
/* Use the initial viruses to directly infect random cells. */
printf("... infecting cells with competitor:");
158
for (i=0; i<n_start_competitor; i++) {
int ri = randint(0, n_cells-1);
printf(" %i", ri);
infect(cells[ri], /*competitor*/ 0, time_tick);
}
printf("\n... infecting cells with colonizer:");
for (i=0; i<n_start_colonizer; i++) {
int ri = randint(0, n_cells-1);
printf(" %i", ri);
infect(cells[ri], /*colonizer*/ 1, time_tick);
}
printf("\n");
// DEBUG: observing the spread of one single virus
// infect(cells[12], 0, time_tick);
/* Pre-build an array of arrays of int to use as temporary placeholders
for the viruses to send to neighbors. */
//float send[n_cells][NUM_VIRUS_TYPES][6];
float*** send = static_cast< float*** >(malloc(sizeof(float***) * n_cells));
for (i=0; i<n_cells; i++) {
send[i] = static_cast< float** >(malloc(sizeof(float**)
* NUM_VIRUS_TYPES));
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
send[i][k] = static_cast< float* >(malloc(sizeof(float*) * 6));
for (j=0; j<6; j++) {
send[i][k][j] = 0;
}
}
}
/* Reuse pixels array for each frame to paint. */
const unsigned int width = side*2;
const unsigned int height = side*2 -1;
printf("Frame width=%i, height=%i\n", width, height);
unsigned int* pixels = static_cast< unsigned int* >(malloc(sizeof(unsigned int)
* width * height));
/* Paint first frame. */
paint_frame(cells, n_cells, side, 1, pixels, BINARIZE);
//printf("Initialized send array.");
int n_dead_cells = 0;
float n_total_virions[NUM_VIRUS_TYPES]; /* Reset at each time tick. */
159
bool any_infected = false;
bool any_viruses = false;
/* Time tick 1 */
printf("Tic-Tac\tN-competitor\tN-colonizer\tdead\n1\t%i\t%i\t0\n",
n_start_competitor, n_start_colonizer);
/* Advance time ticks */
while (true) {
time_tick++;
/* Reset */
any_infected = false;
any_viruses = false;
/* First loop: inactivate virions. Must be done separately than
the move_viruses, otherwise it would bias the difussion simulation
towards movement to the left! */
for (i=0; i<n_cells; i++) {
inactivate_virions(cells[i]);
}
/* Second loop: compute and store number of viruses to move, and update
cell state. */
for (i=0; i<n_cells; i++) {
/* Store in the temporary array send the number of virions that
would be sent to each neighbor.
* Later, when its done for all cells, the value of send will
cbe added to the cells n_virions[NUM_VIRUS_TYPES], and subtracted
from the sending cells n_virions. */
move_viruses(cells[i], send[i] /*, i, time_tick*/ ); /* Will
empty and refill temporary send array */
const unsigned char cell_state = attempt_to_infect(cells[i],
time_tick);
//printf("%i ", cell_state);
if (!any_infected) {
switch (cell_state) {
case DEAD:
break;
case INFECTED:
any_infected = true;
break;
default:
break;
}
160
}
}
//printf("\n");
/* Third loop: send viruses that left the space over any cell to
the neighbor cell spaces. */
/* This can be done now that all cells can be updated safely. */
for (i=0; i<n_cells; i++) {
send_viruses_to_neighbors(cells[i], send[i]);
}
/* Reset counters of virions */
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
n_total_virions[k] = 0;
}
/* Emit new viruses from each cell, if possible. And kill the cell
when over time. */
for (i=0; i<n_cells; i++) {
if (cells[i]->alive) {
/* If the cell is infected: */
if (cells[i]->infection_start_time > 0) {
/* Check if its time for the cell to die: */
const bool killed = attempt_to_kill(cells[i], time_tick);
if (killed) {
n_dead_cells++;
} else {
/* Else, emit virions if beyond the delay time: */
attempt_emit_virions(cells[i], time_tick, PROP);
}
}
}
/* Cells are also places in space, which contain free virions
in them: */
/* Count virions */
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
n_total_virions[k] += cells[i]->n_virions[k];
//printf("Counting: %i ", cells[i]->n_virions[k]);
}
//printf("\n");
}
/* finish if possible */
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
if (n_total_virions[k] > 0.99) any_viruses = true;
}
/* Print data */
161
printf("%i\t", time_tick);
for (k=0; k<NUM_VIRUS_TYPES; k++) {
printf("%f\t", n_total_virions[k]);
}
printf("%i", n_dead_cells);
printf("\n");
if (0 == (time_tick-1) % 10) {
paint_frame(cells, n_cells, side, time_tick, pixels, BINARIZE);
}
if (n_dead_cells == n_cells || ( !any_viruses && !any_infected) ) {
// FINISH
printf("\nAny cells infected? %c ", (any_infected ? t:f));
printf("\nAny virions floating? %c ", (any_viruses ? t:f));
printf("\nDone at time tick %i.\n", time_tick);
break; /* Breaks the while(true) infinite loop */
}
}
return 0;
}
162
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12. Artculos publicados
179
Dynamics of Mutation and Recombination in a
Replicating Population of Complementing,
Defective Viral Genomes
Juan Garca-Arriaza, Samuel Ojosnegros, Mercedes Dvila
Esteban Domingo and Cristina Escarms
Centro de Biologa Molecular
Severo Ochoa(CSIC-UAM),
Cantoblanco, E-28049 Madrid,
Spain
In a previous study, we documented that serial passage of a biological clone
of foot-and-mouth disease virus (FMDV) at high multiplicity of infection
(moi) in cell culture resulted in viral populations dominated by defective
genomes that included internal in-frame deletions, affecting the L and
capsid-coding regions, and were infectious by complementation. In the
present study, analyses of the defective genomes present in individual viral
plaques, and of consensus nucleotide sequences determined for the entire
genomes of sequential samples, have revealed a continuous dynamics of
mutation and recombination. At some points of high genetic instability,
multiple minority genomes with different internal deletions co-existed in the
population. At later passages, a new defective RNA arose and displaced a
related, previously dominant RNA. Nucleotide sequences of the different
genomic forms found in sequential isolates have revealed an accumulation
of mutations at an average rate of 0.12 substitutions per genome per passage.
At the regions around the deletion sites, substantial, minor or no nucleotide
sequence identity is found, suggesting relaxed sequence requirements for
the occurrence of internal deletions. Competition experiments indicate a
selective advantage of late phase defective genomes over their precursor
forms. The defective genome-based FMDVretained an expansion of host cell
tropism, undergone by the standard virus at a previous stage of the same
evolutionary lineage. Thus, despite a complex dynamics of mutation and
recombination, and phases of high genetic instability, a biologically relevant
phenotypic trait was stably maintained after the evolutionary transition
towards a primitive genome segmentation. The results extend the concept of
a complex spectrum of mutant genomes to a complex spectrum of defective
genomes in some evolutionary transitions of RNAviruses.
2006 Elsevier Ltd. All rights reserved.
*Corresponding author
Keywords: genome segmentation; defective genomes; virus evolution;
recombination cross-over sites; foot-and-mouth disease virus
Introduction
Passage of biological clone C-S8c1 of foot-and-
mouth disease virus (FMDV) in serial cytolytic
infections of BHK-21 cells at high multiplicity of
infection (moi) resulted in an unusual evolutionary
transition towards a population dominated by
defective genomes that were infectious by comple-
mentation.
1
The transition occurred gradually and
its first manifestation was the identification at
passage 143 of two FMDV RNAs with internal
deletions of 402 and 417 nucleotides (402 and
417 RNAs, respectively), affecting the L protease.
2
These RNAs co-existed and replicated with wild-
type, standard (st) FMDV RNA (Figure 1), and did
not interfere with st virus replication.
2
Then, at
passage 260 the population was dominated by 417
RNA, together with 999 and 1017 RNAs whose
Abbreviations used: FMDV, foot-and-mouth disease
virus; moi, multiplicity of infection; st, standard; NJ,
neighbor-joining; CHO, Chinese hamster ovary; pfu,
plaque-forming unit(s).
E-mail address of the corresponding author:
edomingo@cbm.uam.es
doi:10.1016/j.jmb.2006.05.027 J. Mol. Biol. (2006) 360, 558572
0022-2836/$ - see front matter 2006 Elsevier Ltd. All rights reserved.
deletions affected the capsid-coding region. All the
deletions identified maintained the open reading
frame of the viral genome, encoding a shortened
version of the polyprotein. 417 and 999 RNAs
were infectious by complementation in the absence
of st FMDVRNA, as shown by: (i) two-hit kinetics
for cell killing; (ii) the presence of defective genomes,
and undetectable st RNA, within individual, isolated
viral plaques formed on cell monolayers; and (iii) cell
killing achieved after co-electroporation of cells with
417 and 999 RNAs synthesized in vitro, but not
after electroporation with a single RNA. Further-
more, measurements of the amount of RNA and
the number of viral particles indicated that each
RNA was packaged into a single viral particle of
standard size.
1
The population at passage 260 interfered with
replication of the cognate st virus.
3
Such interfer-
ence could contribute to the selective advantage of
complementing, defective genomes over st RNA.
The evolution of FMDV towards populations of
defective genomes can be regarded as an initial
evolutionary step towards genome segmentation.
Although deleted forms of viral RNAgenomes capa-
ble of complementation have been engineered,
46
the FMDV transition towards defective genomes
Figure 1. FMDVgenome and position of internal deletions identified upon passage of biological clone C-S8c1 in BHK-
21 cells. (a) The FMDV genome with indication of the regulatory regions (5 UTR, 3 UTR) and coding region (L, P1, P2,
P3). Individual proteins are depicted as boxes. VPg is the protein (3B) covalently linked to the 5 end of the RNA; poly(C)
is the internal polycytidylate tract, and poly(A) the 3 terminal polyadenylate; the two in-frame AUG codons that initiate
the two forms of L (Lab, Lb) are indicated. Below the genome, the position of the deletions found in several defective
genomes is indicated; the number following indicates the size of the deletion in nucleotides, determined by nucleotide
sequencing. Colored rectangles depict deletions found in consensus sequences of several populations, as described in
Table 1. Black rectangles depict deletions found in the analysis of individual plaques, obtained by plating populations C-
S8p219 and C-S8p225. Below, the thin horizontal lines describe the RT-PCR amplifications covering the entire FMDV
genome, used to map the different deletions. (b) Scheme of the serial passages of clone C-S8c1 and genomes identified in
different populations. The genome composition of C-S8c1, C-S8p143, C-S8p260, and C-S8p260p3d was described;
1
all
other populations and clones are described here for the first time. Biological clones are depicted as filled squares and
populations as open circles; large grey arrows indicate high moi passages; thin arrows indicate low moi passages; the
number following p indicates passage number; st, standard FMDV genome. The position of the deletion is shown as a
colored portion in the scheme of the genome; the parenthesis in the 999 genome indicates its lowproportion in C-S8p360
(compare with Table 1). Populations identified as p3d and p5d correspond to those derived by three or five low moi
(dilute) passages, which resulted in loss of RNAs, and with st as the sole genome detected. At the bottom left, deletions
characterized in a clonal (individual plaque) analysis of populations C-S8p219 and C-S8p225 are indicated. Procedures are
described in Materials and Methods.
559 Mutation and Recombination in Defective Virus
occurred in the course of replication within a host
cell, without external intervention. Furthermore,
low moi passage of the complementing defective
forms resulted in rapid dominance of st virus, with
no detectable defective genomes in the population.
1
Thus, this FMDV system allows comparison of an
evolved segmented population with its unsegment-
ed counterpart, thus providing an experimental
approach to investigate in a controlled fashion, the
advantages of segmentation (a primitive form of
sex) in a genetic system. This is a fundamental
question, extensively addressed in evolutionary and
theoretical biology.
710
A prerequisite for genetic studies is a detailed
molecular characterization of the system, including
the molecular basis of the evolutionary transition
towards deleted sub-genomic FMDV RNAs. Here,
we have pursued serial high moi infections of C-
S8p260 up to passage 460, and have compared the
clonal composition in defective genomes of the
populations at passage 219, 225 and 260 (Figure 1).
These analyses have revealed points of high genetic
instability, and a continuous dynamics of mutation
and recombination. Nucleotide sequences around
the deletion sites suggest relaxed sequence con-
straints for internal deletions to occur, probably
limited by functional constraints to ensure efficient
complementation between RNAs. Evolution of
infectivity titers, viral RNA levels, and analysis of
mixtures of populations from different passages
subjected to growth-competition experiments, indi-
cate an increasing selective advantage of late
defective genomes over preceding forms. An expan-
sion of host cell tropism acquired when the
evolutionary lineage was dominated by st virus
was maintained after the transition towards genome
segmentation.
Results
Evolution through multiple FMDV genomes with
internal deletions
To study the evolution of the defective FMDV
system, FMDV C-S8p260, a population dominated
by defective RNAs (417, 999 and 1017),
1
was
subjected to 200 additional high moi passages
(Figure 1). The genomic composition was exam-
ined from passage 199 to passage 460, using eight
different RT-PCR reactions to sample the L and
capsid-coding regions. The results (Table 1) show
that 417 RNA was present at all passages
examined, and that 999 RNA was first detected
at passage 209, and rapidly became dominant. In
contrast, at late passages, 999 RNA was dis-
placed very slowly, over at least a 109 passage
interval, by 951 RNA, which included an in-
frame deletion spanning residues 2038 to 2988,
affecting the VP2 and VP3-coding region (residue
numbering as by Escarms et al.
11
). None of the RT-
PCR amplifications with RNA from passage 260 to
460 detected full-length st FMDV RNA (less than
one st genome per 10
4
RNA molecules
1
). Thus, a
defective genome-based FMDV replication system
was maintained with no detectable st RNA at least
up to passage 460, with the constant presence of
417 RNA and a dynamics of change of other
RNAs.
Highly heterogeneous populations of defective
genomes: evidence of evolutionary instability
A previous analysis of the genomes present in
individual viral plaques derived from C-S8p260
showed that the virus in 61 out of 62 plaques
analyzed contained 417 RNA and either 999 or
1017 RNA, and no detectable st RNA (one plaque
contained only standard RNA).
1
The clonal compo-
sition found is in agreement with the genome
composition determined for the average (uncloned)
C-S8p260 population, and no other deletions were
identified using the standard set of amplification
reactions (Figure 1(a) and Table 1). To test whether a
similar level of homogeneity with regard to internal
deletions occurred prior to the dominance of 417,
999 and 1017 RNAs, we analyzed the genome
composition in virus from individual plaques of
populations C-S8p219 and C-S8p225. Contrary to
the results with C-S8p260, the genomic composition
of virus from four out of ten plaques from C-S8p219,
and from three out of ten plaques from C-S8p225
differed from the average composition of the
corresponding parental populations. This difference
in heterogeneity between C-S8p260 and C-S8p219 or
C-S8p225 is statistically significant (p<0.001,
2
test). The results (Table 2 and Figure 1) revealed
seven additional types of internal, in-frame dele-
tions located between genomic residues 1813 (at the
VP4-coding region) and 3658 (at the VP1-coding
region), and the presence of 417 RNAin virus from
each of the plaques analyzed. Thus, during some
passages in evolution towards segmentation, the
FMDV system showed extreme evolutionary insta-
bility with swarms of genomes with deletions that
never attained dominance at least up to passage 460
(compare Tables 1 and 2).
Continuous dynamics of mutation and
recombination
To investigate the molecular basis of defective
genome evolution, entire genomic nucleotide
sequences for the major RNAs were determined
at passages 260, 360 and 460 using sets of oligonu-
cleotide primers whose amplification products
covered the complete genome and discriminated
among different sub-genomic forms (Materials and
Methods). In addition, virus with st genome was
rescued by three to five low moi passages of
populations C-S8p260, C-S8p360 and C-S8p460,
yielding populations C-S8p260p3d, C-S8p360p5d,
and C-S8p460p5d, respectively (Figure 1(b)). These
populations contained st RNA and no detectable
RNAs (see the legend to Table 1); the entire st RNA
nucleotide sequence was also determined. The
560 Mutation and Recombination in Defective Virus
alignment of nucleotide sequences (Figure 2) indi-
cates a sequential accumulation of mutations rela-
tive to the parental C-S8c1 RNA, and multiple points
of heterogeneity (two nucleotides at the same
position). The average rate of accumulation of
mutations derived from comparing st RNA
sequences was of 0.13 mutation per genome per
passage, and for the RNAs the value was 0.050.11
mutation per genome per passage. The average ratio
of transition to transversion mutations was very
similar for st RNA (4.21.2) than for RNAs (4.2
1.5) (Table 3). Mutations were unevenly distributed,
with a twofold lower frequency in the 3B, 3C and
3D-coding regions than in the rest of the genome
(p<0.005;
2
test). (A more complete description of
the mutations, their distribution along the genomes,
Table 1. Genomic deletions detected by RT-PCR amplification of RNA from viral populations derived from C-S8p199
upon passage at
high moi in BHK-21 cells
a
Different RT-PCR amplification reactions used to map internal deletions in the FMDV C-S8c1 lineage;
1
the regions amplified are
depicted in Figure 1(a).
b
Each column includes the types of genomes identified in the corresponding population given at the top, determined using the amQ
plification reactions indicated in the first column, and confirmed by nucleotide sequencing (Figure 2). A parenthesis means that a very
small amount of the PCR product was produced in the amplification reaction. Color code corresponds to that depicted in Figures 1 to 5.
No indicates the absence of a genomic deletion. No st means undetectable st FMDV RNA. NA indicates absence of amplification,
and ND, not done. As controls, none of the amplifications detected any RNA when C-S8p260p3d, C-S8p360p5d and C-S8p460p5d
(origin of these genomes given in Figure 1(b)) RNAs were used as template. Procedures are detailed in Materials and Methods.
c
Virus fromone individual plaque, isolated from C-S8p225 contained st RNAin addition to RNAs (see Table 2). Occasionally, analyQ
sis of RNA from C-S8p220 to C-S8p228 detected st RNA.
Table 2. Genomic deletions detected by RT-PCR amplification of RNA from virus in individual plaques of populations
C-S8p219 and C-S8p225
a
Amplification procedures are as for Table 1.
b
Designation of the deletions and symbols are as for Table 1. Individual plaques from C-S8p219 and C-S8p225 are numbered.
Deletions not detected in the consensus population (see Table 1) and identified only in individual plaques are depicted in bold.
c
Plaques number 4 and 6 from C-S8p219 have one additional deletion. They were confirmed by RT-PCRs 21 and 29 (in plaque 4),
and 21 and 17 (in plaque 6). These deletions were not sequenced due to technical problems.
d
RT-PCR amplification designed with one primer located inside 519 or 885 RNAs did not amplify these new defective genomes.
561 Mutation and Recombination in Defective Virus
and resulting amino acid replacements will be
presented elsewhere.)
A comparison of each nucleotide sequence with
that of the parental C-S8c1 genome shows mutation
frequencies of 9.810
-4
to 7.110
-3
substitutions per
nucleotide, the latter attained with C-S8p460p5d;
these values correspond to eight and up to 58
mutations per genome (Table 3). Counting repeated
mutations only once (and excluding as mutations
those nucleotides in mixtures whose proportion
was lower than 50%), transitions amounted to 80%
of all mutations, AG being the most represented
mutation type (32% of all transitions, and 26% of all
mutations); transversion UG was not repre-
sented. The average dn/ds ratio for the entire
genome, calculated relative to the C-S8c1 RNA
sequence was in the range of 0.5 to 1.5 (Table 3); a
pairwise comparison of all genomic nucleotide
sequences with respect to C-S8c1 RNA gives an
average dn/ds =1.00.4. Prior to the dominance of
RNAs there were a total of 12 reversions, and in
four of them the initial nucleotide was regained at a
later passage. Because of quasi-species dynamics, it
is not possible to know whether they are true
reversions or apparent reversions resulting from
alternate dominance of genome sub-populations.
Interestingly, eight out of the 12 reversions ob-
served occurred between passages 100 and 143,
resulting in an transient decrease in the accumula-
tion of mutations (Figure 3); these were the
passages in which two RNAs affecting the L
protease were found (compare Figures 1(b) and 3).
A phylogenetic analysis of entire genomes using
neighbor-joining (NJ), confirmed the relationships
suggested by the sequence alignment, and the
gradual increase in genetic distance of the different
RNAs and their st derivatives, with 45% of the
branching points being supported by significant
bootstrap values (>75%) (Figure 4(a)). Only minor
alterations were seen in the trees when considering
or not as mutations nucleotides present in a 50%
mixture at any given position (indicated in Figure 2
and Table 3), or when the trees included or
excluded the regions corresponding to the deletion
in the RNAs. When the 5-region and the rest of
the genome were analyzed separately, the trees
(Figure 4(b) and (c)) suggested a region for the
location of a recombination cross -over point that
could lead to the generation of C-S8p260p3d, C-
S8p360p5d and C-S8p460p5d. The 5 region of C-
S8p260p3d, C-S8p360p5d and C-S8p460p5d
grouped with C-S8p260999, C-S8p360951 and
C-S8p460951, respectively. The rest of the genome
of C-S8p260p3d, C-S8p360p5d and C-S8p460p5d
grouped with C-S8p260417, C-S8p360417 and
C-S8p460417, respectively (compare the recombiQ
Figure 2. Location of mutations in st and FMDV genomes, observed upon passage of FMDV C-S8c1 in BHK-21
cells. The scheme of the FMDV genome, and position of the deletions in the different RNAs are as for Figure 1(a). The
origin of the different RNA populations analyzed (identified on the right of each genome depicted as a horizontal line) is
described in the legend to Figure 1(b). Mutations are represented by vertical lines on the genome; in red are the positions
that show a mixture of about equal amounts of two nucleotides, due to genetic heterogeneity in the genome population
(see Materials and Methods). The incomplete horizontal line for C-S8p260 1017 indicates that only a partial nucleotide
sequence was determined. For residues 1 to 367 (preceding the poly(C) tract) sequences for the different RNAs could not
be distinguished (see Materials and Methods). The vertical dotted lines linking two RNAs delimit putative
recombination cross-over sites when st RNA was rescued by low moi passage (1629 to 1809 in C-S8p260, and 1624 to
1627 in C-S8p360 and C-S8p460). Asummary of the types of mutations found is given in Table 3. Procedures are described
in Materials and Methods.
562 Mutation and Recombination in Defective Virus
nation cross-over points proposed on the basis of
the sequence alignments (Figure 2) with the
groupings derived from the NJ trees (Figure 4(b)
and (c))).
Recombination to rescue st RNA
The nucleotide sequence alignments (Figure 2),
supported by the phylogenetic analyses (Figure 4),
suggest that the st genomes rescued by low moi
passage of C-S8p260, C-S8p360 and C-S8p460
(Figure 1(b)) are the result of recombination between
the dominant defective genomes in the respective
populations. A possible alternative is that st RNA
pre-existed in the populations at low levels (as a
memory of the genomes that dominated the
population before the appearance of RNAs
12
),
and that it rose to dominance during infections at
low moi because of suppression of infectivity of the
bipartite defective system, without the involvement
of recombination. This alternative is rendered
unlikely by the phylogenetic relationship of each st
RNA with the defective genomes of equivalent
passage number (Figure 4(b) and (c)), and the
incompatibility of the nucleotide sequences of the
rescued st RNAs with the sequences of the st RNA
present at earlier evolutionary phases of the same
lineage. Additional evidence that defective genomes
can readily recombine to produce st genome came
from an analysis of the progeny of co-electropora-
tion of BHK-21 cells by 417 RNA and 999 RNA,
produced independently by transcription of two
separate plasmids.
1
In the initial progeny of the co-
electroporation only 417 RNA and 999 RNA
were detected. However, upon further low moi
infection, st RNA with a constellation of mutations
that identified it as a mosaic of 417 RNA and 999
RNA was present (sequencing results not shown,
and the experiment described by Garca-Arriaza et
al.
1
). Also, dilute passage of virus from individual
plaques, which contained RNAs and undetectable
st RNA, yielded st RNA (data not shown). Thus,
several independent observations support the view
that st RNA was generated by recombination of
RNAs.
Nucleotide sequence at the deletion sites:
evidence of promiscuous recombination
Since genomes with internal deletions are derived
from biological clone C-S8c1, containing a single st
genome (Figure 1(b)), intramolecular or intermolec-
ular recombination events must have generated the
RNAs as progeny of C-S8c1 RNA. To gain insight
into the molecular mechanisms that generated
RNAs, the nucleotide sequences around the
deletion site of the 12 RNAs characterized in
uncloned populations and in individual biological
clones were compared (Figure 5). Continuous or
interrupted nucleotide sequence identities of four to
18 nucleotides occurred in seven out of the 12
deletions analyzed. In one case (999 RNA) the
four-nucleotide identity was between nucleotides at T
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563 Mutation and Recombination in Defective Virus
the 5 side and the 3 side of the deleted part, and in
another case (744-3 RNA) the four nucleotide
identity is found outside of the deleted part. To
determine the frequency with which the sequences
repeated at the deletion boundaries are found in the
FMDV genome, the different sequences were
searched for in the FMDV C-S8p100 and C-S8p200
RNA sequences. The search revealed that the two
sequences flanking 951 and one of the two
sequences that flank 417 and 645 were not
represented in the entire C-S8p100 or C-S8p200
RNAs. All other sequences were found once and up
to 44 times; in particular, the tetra- and pentanucleo-
tides (either interrupted or not interrupted), were
represented from 15 to 44 times. Furthermore, the
sites around the deletions in RNAs 744-5, 885,
and 603 did not show continuous or interrupted
repetitions of more than three nucleotides. The
results suggest that there are no stringent require-
ments at the nucleotide sequence level for the
recombination events leading to RNAs.
Complexity of the evolutionary pattern, and
increased replicative capacity of the FMDV
defective genome system
The different complexity in RNA composition at
different passages (Figure 1(b) and Table 1), the
rapid increase of 999 in only three passages (Table
1), and the much slower displacement of 999 by
951 at later passages (Table 1) suggested a com-
plex, irregular dynamics of competition involving
multiple RNA species. To investigate population
dynamics between passages 260 and 460, virus
titers, and total amount of viral RNA released from
cells were examined (Figure 6). Neither viral titers
nor total viral RNA molecules increased linearly
with time, with maximum values detected at
passage 360 (Figure 6(a)).
These results prompted us to examine whether a
basic observation of viral population dynamics, that
is that large population passages result in fitness
gain,
13,14
applied also to the RNA FMDV lineage.
However, standard fitness determinations to obtain
relative fitness values are complicated in a comple-
menting defective genome system due to a bias in
relative progeny production when a different
particle to cell ratio is attained by the two
competitors.
3
For this reason, we carried out a
qualitative direct experiment of competing equal
amounts of C-S8p260 and either C-S8p360 or C-
S8p460 for four passages, without intervening
dilution of the virus. In both competition series the
fate of the competing RNAs was followed by
estimating the proportion of nucleotides at posi-
tions 1091 (G for 999 of C-S8p260 and U for 951
of C-S8p360 and C-S8p460), 1105 (C, U, U,
respectively) and 1180 (U, C, C, respectively). The
results (Figure 6(b)) show a selective advantage of
the population at passage 460 over that at passage
260, and of the population at passage 360 over that
at passage 260. Thus, the tenet of quasi-species
dynamics, that is, increased replicative capacity
with large population passages,
13,14
is maintained
in the complementing, defective RNA, FMDV
system.
An expansion of host cell tropism is maintained
in the defective FMDV genome system
Passage of FMDV C-S8c1 at high moi resulted
in an expansion of host cell tropism that included
acquisition of capacity of the virus to replicate in
Chinese hamster ovary (CHO) cells and in a
number of primate and human cell lines that were
highly restrictive for the parental C-S8c1.
1517
To
test whether the FMDV populations dominated
by defective genomes maintained the expanded
Figure 3. Normalized accumulated number of mutations relative to the C-S8c1 RNA sequence as a function of
passage number. Data are fromTable 3. The different populations analyzed and the mutations included are those depicted
in Figure 2. Deletions are not considered. The black line indicates mutations in the st genome (p3d at passage 260, and p5d
at passages 360 and 460; compare with Figure 1(b)); mutations in 417 (), 951 (), and 999 () are also indicated.
Positions at which a mixture of nucleotides was documented (see Figure 2 and Material and Methods) are counted as
mutation when the nucleotide that differs fromthat in C-S8c1 RNAamounts to 50%(or higher) in the mixture. Procedures
are described in Materials and Methods.
564 Mutation and Recombination in Defective Virus
cell tropism, the capacity of populations C-
S8p260, C-S8p360, C-S8p460 and of their st
genome derivatives to infect CHO and Jurkat
(human lymphoid) cells was tested. The progeny
genomes were titrated and analyzed by RT-PCR
amplification (Table 4). In both CHO and Jurkat
cells, all viruses showed a progeny production
comparable to MARLS (a representative of FMDV
showing the expanded host cell tropism
17
) and
10
3
to 10
5
times higher than C-S8c1. In all cases,
the genomic composition of the infecting virus
was conserved in the progeny (Table 4). We
conclude that an expanded host cell tropism,
that was acquired upon passage of C-S8c1 in
BHK-21 cells at a stage in which the population
was dominated by FMDV with st genome was
Figure 4. Phylogenetic relationships among st and RNAs in the evolutionary lineage of FMDV C-S8c1 provide
evidence of generation of st RNA through recombination. The origin of the genomes analyzed is depicted in Figure 1(b).
Each tree has been derived by the neighbor-joining (NJ) method, and the significance of each node estimated by bootstrap
re-sampling (1000 replicas).
58
Numbers at the nodes represent the bootstrap re-sampling values. Trees exclude the regions
deleted in RNAs. Positions at which a mixture of nucleotides was documented (see Figure 2, Table 3 and Materials and
Methods) are counted as mutation in the derivation of the tree when the nucleotide that differs from that in C-S8c1
amounts to 50% (or higher) of the mixture. (a) NJ tree of the entire genomic sequences. (b) NJ trees of the 5 region of the
genome (residues 1 to 1623 or 1 to 1628). (c) NJ trees of the remaining genomic residues (1624 to 8115 or 1629 to 8115; C-
S8c1 RNAresidue numbering
11
). Groupings of st and RNAs are indicated by boxes. Procedures are detailed in Materials
and Methods.
565 Mutation and Recombination in Defective Virus
maintained following evolution of FMDV towards
defective genomic forms.
Discussion
An unusual and complex defective RNA system
Most commonly, the defective viral genomes that
arise during virus replication require a helper, st virus
for continued maintenance as a replicative entity.
1823
Unexpectedly, the defective FMDV system achieved
autonomous replication without participation of st
FMDV genomes. The typical mutant spectrum of a st
genome quasi-species was extended to defective
genomes, each including an internal deletion affecting
from 402 up to 1017 residues at the L and capsid-
coding regions (representing 4.9% to 12.5%, respec-
tively, of the FMDV C-S8c1 genome, excluding
homopolymeric tracts).
1
Here, we have compared the
genome composition, infectivity, and RNA levels of
sequential populations dominated by defective gen-
omes (RNAs), as well as the entire nucleotide
sequences of nine genomes, including RNAs, and
their st RNA derivatives. The analyses have identified
discontinuities in the evolutionary process, as revealed
by non-linear increases in infectivity and viral RNA
levels, despite an overall increase of replicative
capacity as the infection proceeds (Figure 6).
At the intermediate passages 219 and 225, but not
at passage 260, the population consisted of a
heterogeneous array of genomes harboring different
internal deletions in the capsid-coding region, and
each of them invariably coexisted with 417 RNA
(Figures 1, 5 and Table 2). At late passages, a new
951 RNA, that was not represented among the
RNAs characterized in previous passages, gradu-
ally displaced 999 and 1017 from the population
(Table 1). Thus, the defective genome-dominated
FMDV population replicating in the relatively
constant biological environment of a clonal BHK-
21 population in culture, is highly dynamic regard-
ing the generation of deleted forms, and competition
among them. The complex mutant spectra of
different but related (in location and length) dele-
tions extend to defective genomes what is well
established as spectra of point mutations in st RNA
of FMDV populations in cell culture and in vivo.
24,25
Exuberant recombination
Since the evolutionary lineage in which RNAs
were generated was initiated by a single C-S8c1
genome
26
(Figure 1(b)), RNAs must have arisen by
Figure 5. Nucleotide sequences flanking the deletion sites of FMDV RNAs show no obvious requirement for the
occurrence of deletions. The location of the different deletions, and their identification during the evolution of FMDV C-
S8c1 are summarized in Figure 1, Table 1 and Table 2. Deletions are indicated by boxes. Nucleotide sequences around the
deletion sites are shown with capital letters where nucleotide sequence identity around the cross-over points has been
identified; identical nucleotides are indicated in red, that are interrupted sometimes by heterologous nucleotides which
are depicted in blue; in the sequences, the deleted regions are bracketed; genomic residues are numbered.
11
(a) Deletions
that belong to consensus genomes that were dominant in some of the populations analyzed. (b) Deletions found in the
clones frompassages 219 (first column) and 225 (second column). For 402, 540, 603 and 1017 two alternative 5 and
3 deletion sites are compatible with the sequence data. Procedures are described in Materials and Methods.
566 Mutation and Recombination in Defective Virus
intramolecular or intermolecular recombination
events inside the infected cells. Several types of
recombination have been distinguished in RNA
viruses: homologous, non-homologous, replicative
and non-replicative.
27
Comparison of nucleotide
sequences around the deletion sites did not reveal
any obvious shared requirement for recombination
to occur. Also, prediction of the energetically most
favorable secondary structures in 402, 417, 519,
and 540 RNAs using M-fold,
28
did not reveal any
obvious local secondary structures (data not shown)
that in other systems have been associated with
recombination.
29,30
Therefore, the molecular analy-
ses did not allow a distinction among a number of
alternative mechanisms to generate RNAs.
27
In
fact, we cannot exclude that different RNAs were
generated by different mechanisms (RNAs which
show significant nucleotide sequence identity
around the cross-over points (Figure 5) may have
been produced by homologous recombination
involving polymerase switching from a template
site to another site either of the same template
molecule (intramolecular switching) or of a different
template molecule (intermolecular switching);
31
in
cases with no discernible sequence identity at the
deletion sites, replicative non-homologous or non-
replicative recombination could be involved). Sev-
eral results, including phylogenetic analyses (Figure
4) indicate that recombination events were involved
also in the generation of st RNAs from their
defective counterparts.
In mixed infections in cell culture, with FMDV
mutants of the same parental genome, under
conditions that restrict the growth of the individual
mutants, it was estimated that 10% to 20% of
genomes undergo recombination in a single growth
cycle.
32
The recombination frequency dropped
sharply when the two parental genomes belonged
to a different FMDV subtype, and even more when
they were of a different serotype.
32
This, and the
Figure 6. Selective advantage of the RNAs with internal deletions at late passages. (a) Evolution of the production of
infectious units (pfu/ml) (), corrected for the bipartite nature of the infectious agent (see Materials and Methods), and of
the number of viral RNA molecules (), determined by quantitative RT-PCR. Data are the average of at least two
independent experiments, each carried out in triplicate; standard deviations are shown. (b) Competition between
populations C-S8p260 and either C-S8p360 (left) or C-S8p460 (right), estimated from the proportion of discriminating
nucleotides (position 1091: G in C-S8p260, U in C-S8p360 and C-S8p460; position 1105: C in C-S8p260, U in C-S8p360 and
C-S8p460; position 1180: U in C-S8p260, C in C-S8p360 and C-S8p460) in the sequencing peaks. Bars indicate the
proportion of the nucleotide indicated at the bottom in the initial mixture (p
o
) and in passages one to four. Procedures are
described in Materials and Methods.
567 Mutation and Recombination in Defective Virus
infrequent occurrence of double infections in vivo by
distinguishable FMDVs, may explain the very
limited role that recombination appears to play in
the natural evolution of FMDV.
33,34
Nevertheless,
point, short, and block deletions have been identi-
fied in FMDV, and sometimes they have been
associated with major biological alterations. Natu-
rally occurring deletions in the 3A-coding region can
affect virulence and host range.
35,36
Sequence align-
ments of divergent isolates (that belong to different
FMDV serotypes) suggest the occurrence of short
deletions at the genomic regions encoding exposed
capsid loops, and point deletions and block dele-
tions at the 5 and 3- untranslated regions.
37
In
plaque-to-plaque transfers of FMDV, three point
deletions have been observed in homopolymeric
tracts; the mechanism probably being slippage
mutagenesis.
38
A deletion of 69 nucleotides (span-
ning genomic residues 1052 to 1120) occurred in a
number of FMDV subclones, in the course of fitness
recovery of an FMDV clone with an internal
oligoadenylate tract;
14
in this case a selective force
in favor of the deletion was probably the need to
eliminate the highly deleterious internal oligoade-
nylate insertion.
11,14
Recombination is frequent in other picorna-
viruses.
31
A case in point is the identification of
internal deletions within the 5-untranslated region
of coxsackievirus B3 replicating in cardiac tissue of
mice.
39
Frequent intertypic and intratypic poliovirus
recombinants (often involving vaccine and wild-
type strains) have been described in vivo.
27
Taken
together, the observations on recombination of
FMDVand other picornaviruses suggest that recom-
bination may be very frequent during picornavirus
replication but that many recombinants are never
recorded either because of their low fitness or
because of absence of markers to identify genomes
as recombinants. Recombination to generate st RNA
from genomes with internal deletions has been
described for plant viruses.
40
The view of recombi-
nation as an important mechanism of RNA genetics
has been recently emphasized by Bujarski and
colleagues, based on their work on promiscuous
recombination of brome mosaic bromovirus.
41
In the
view that the occurrence of recombination is not a
limitation in FMDV, the key question is what could
be the elements that triggered the transition towards
dominance of RNAs and replicative independence
of st RNA, between passage 143 and 219.
The master deletion model
One of our hypotheses is that only a limited
number of the many spontaneously arising internal
deletions are neutral or very slightly advantageous
with respect to its maintenance, together with st
virus, in the replication system. A balanced supply
of proteins for trans-complementation may require
an effective co-translational processing of two
versions of a shortened polyprotein encoded by
two RNAs, including the autocatalytic cleavage of
L, and maintenance of cleavage sites and their
adequate context.
42
Some amino acid substitutions
affect residues around polyprotein cleavage sites in
some RNAs. Replacement K201R is located at
position -1 of the L-VP4 cleavage site in 1017,
although R201 is found in several type O and SAT3
FMDVs.
43
Also, A85S affects position -1 of the VP4-
VP2 cleavage site in C-S8p360417, and Q218K
affects position -2 of the VP3-VP1 cleavage site in all
RNAs in which the cleavage site is present. Other
substitutions affect residues located at positions -5 to
-19 and position +12 of various cleavage sites of a
number of genomes with deletions (cleavage site
sequences are based on Ryan et al.
43
). Additional
biochemical studies are needed to elucidate whether
amino acid replacements around polyprotein pro-
cessing sites could modulate protein expression and
Table 4. Expansion of cell tropism by defective FMDV populations and their standard recombinant derivatives
Virus
Cell type
CHO Jurkat
c.p.e.
a
Titer (pfu/ml)
b
Composition of the progeny
c
c.p.e.
a
Titer (pfu/ml)
b
Composition of the progeny
c
C-S8p260 + 4.13.110
9
417, 999 or 1017 + 4.32.710
6
417, 999 or 1017
C-S8p360 + 5.85.410
9
417, 951 + 1.510
7
417, 951
C-S8p460 + 1.210
8
417, 951 + 1.310
7
417, 951
C-S8p260p3d + 8.73.110
7
st + 6.52.110
5
st
C-S8p360p5d + 4. 10
8
st + 3. 10
6
st
C-S8p460p5d + 1.51.410
8
st + 1.50.610
6
st
MARLS + 1.20.710
8
st + 1. 10
6
st
C-S8c1 7.610
3
1.610
2

a
Cytopathology of cells in culture.
b
In C-S8p260, C-S8p360, and C-S8p460 the titer is corrected for the effect of the dilution
1
(Manrubia et al. unpublished results).
Titrations were carried out on BHK-21 cell monolayers in triplicate, and standard deviations are indicated. In CHO cells the titration was
carried out after complete cytophatic effect. In Jurkat cells, the titration was made after 5 h post-infection. Procedures are detailed in
Materials and Methods.
c
RT-PCR amplification number 21 (see Figure 1(a) and Table 1) was used to detect the composition in defective or st genomes. -,
undetectable RNA. Other symbols are as for Table 1.
Knowles, N.J. & Palmenberg, A. (1998). Picornavirus.
Sequence alignments and phylogenetic trees. www.iah.
bbsrc.ac.uk/virus/picornaviridae/sequencedatabase/
alignments/alignmts.hts
568 Mutation and Recombination in Defective Virus
contribute to the stability of the RNA-based
system.
The triggering factor towards dominance of
RNAs could be the stochastic occurrence of a
deletion event that did not compromise fitness and
perhaps conferred the system with a minimal
selective advantage over replication of st RNA
alone. 417 RNA is a candidate to fulfill such a
requirement, since 402 was the first RNA
identified in the C-S8c1 lineage
2
(Figure 1(b)), and
it is present in each of the populations examined
throughout passage 460, including virus from
individual plaques from passages 219 and 225
(Figure 1(b) and Table 2). We propose a model that
we term the master deletion model, according to
which an initial deletion (in the present system
417) of essentially a neutral character is stochasti-
cally generated, and it can co-exist with st RNA.
Once such a triggering RNA is produced, the
system has the basic biochemical requirements to
explore the space of deleted forms for fitness
increase, following typical quasispecies dynamics.
25,44
Once RNAs with increased fitness appear, they
displace the st RNA. Competitions between RNAs
from different passages (Figure 6(b)) indicate the
occurrence of positive selection. The dn/ds ratios (Table
3) suggest that either a few non-synonymous (or a
combination of non-synonymous and synonymous)
mutations mediated selection. Further experiments
are required to explore the impact of mutation in the
stability of the FMDV RNA system.
A total of 53 amino acid replacements have been
identified in the C-S8c1 lineage up to passage 460
(Figure 2 and Table 3). Seven of those affect residues
that are invariant in an alignment of 103 FMDV
genome sequences
33
. The amino acid substitutions
that in the capsid of passaged FMDV were respon-
sible for the expanded host cell tropism of the virus
(replacements E-173-K, in VP3; Q-218-K, in VP3, and
H-197-R, in VP1) were maintained throughout the
evolutionary transition towards defectiveness and
its maintenance (Figure 2). Thus, despite a continu-
ous dynamics of genetic variation some salient
phenotypic traits acquired by the st genome may
be exploited by the defective counterparts.
The RNA-based complementation system
remained stable for at least 200 passages, despite a
complex set of recombination and mutation events,
and evidence of evolutionary discontinuities. The
basic concept in virology that replicating viruses
evolve as dynamic mutant spectra rather than
defined genetic entities, in agreement with quasi-
species theory,
25,44,45
has been extended to spectra of
RNAs occurring at late evolutionary stages of the
multiply passaged C-S8c1 lineage. Complementa-
tion or interference among components of a mutant
spectrum can influence the behaviour of the quasi-
species as a whole,
4651
emphasizing that an ensem-
ble rather than an individual is the unit of selection.
Furthermore, defective viral genomes can be trans-
mitted in vivo.
52
The FMDV defective system offers
an extreme case of evolution towards complete
dependence on complementation for survival.
Materials and Methods
Cells, viruses and infections
The origin of BHK-21 and CHO cells, and procedures for
cell growth, infection of cell monolayers with FMDV in
liquid medium, for plaque assays in semi-solid agar
medium, and for infections of Jurkat cells growing in
suspension have been described.
15,17,26,53
FMDVC-S8c1 is a
plaque-purified virus of the European serotype C, derived
fromnatural isolate C
1
Santa-PauSpain70.
26
Serial passages
of C-S8c1 were carried out by infecting BHK-21 cell
monolayers with the corresponding supernatants of the
previous infection. The p following C-S8 indicates passage
number. FMDVs C-S8p219, C-S8p225, C-S8p260, C-S8p360
and C-S8p460 are viral populations obtained after 219, 225,
260, 360 and 460 serial cytolytic passages, respectively, of C-
S8c1 at high moi in BHK-21 cells (210
6
BHK-21 cells
infected with the virus contained in 200 l of the
supernatant from the previous infection, estimated to
contain 110
7
to 510
7
corrected plaque-forming unit(s)
(pfu)) (corrected refers to the application of a correction
factor to account for the effect of dilution on the titration of
the multi-partite FMDV, as described
1
(Manrubia et al.,
unpublished results). FMDV C-S8p260p3d, C-S8p360p5d
and C-S8p460p5d are viral populations obtained after three
or five serial cytolytic passages of C-S8p260, C-S8p360 and
C-S8p460 at low moi in BHK-21 cells (210
6
BHK-21 cells
infected with 200 l of a 10
-3
dilution of the supernatant
from the previous infection, or about 110
4
to 510
4
corrected pfus) (see also Figure 1(b)). FMDV MARLS is a
monoclonal antibody escape mutant obtained from FMDV
C-S8c1 passaged 213 times in BHK-21 cells.
2
In all infection
experiments, mock-infected BHK-21 or CHO cell mono-
layers and Jurkat cells growing in suspension were
incubated in parallel to ascertain the absence of contamina-
tion. Also, during the serial passages of defective FMDV
populations in BHK-21 cells, serial infections with super-
natants of mock-infectedcells were maintainedinparallel to
control for the absence of viral contamination. No evidence
of contamination was seen at any time.
Virus competition assays
Growth competition experiments were carried out as
described,
11,14
with some modifications. About 10
6
BHK-
21 cells were infected with mixtures of C-S8p260 and C-
S8p360 or C-S8p260 and C-S8p460 at a ratio of about 1:1 in
viral particles. When the cytopathic effect was complete,
the progeny virus was recovered and used to infect a fresh
cell monolayer. Atotal of four serial infections were carried
out, without dilution of virus prior to infection. RNA from
the virus produced in each passage was extracted,
amplified by RT-PCR and sequenced. The proportion of
the two competing genomes (999 in C-S8p260 or 951 in
C-S8p360 and C-S8p460) at the different passages was
estimated by measuring the proportion of specific dis-
criminating nucleotides (Figure 6(b)).
RNA extraction, RNA quantification,
cDNA synthesis and PCR amplification
Viral RNA was extracted from supernatants of infected
cells or from individual viral plaques by treatment with
Trizol (Invitrogen) as described.
54
Total FMDV RNA quan-
tification was performed by real-time (RT) PCR with the
LightCycler Instrument (Roche) using the LightCycler RNA
569 Mutation and Recombination in Defective Virus
Master SYBR Green I Kit (Roche). The primers used to
quantify total FMDV RNA in viral populations between C-
S8p260 and C-S8p460 were 5 GGATGCCATCTGGCTGT 3
(5 end at genomic position 7493) and 5 AGGAGATCATG-
GTGTAGGTGTC 3 (5 end at genomic position 7615). Re-
verse transcription was carried out using either avian
myeloblastosis virus (Promega) or Transcriptor (Roche)
reverse transcriptase, as specified by the manufacturers.
PCR amplification was performed using either the Ampli-
Taq polymerase (Perkin-Elmer) or Expand High Fidelity
DNApolymerase system(EHF) (Roche), as specified by the
manufacturers. Amplification products were analyzed by
1%(w/v) agarose gel electrophoresis andethidiumbromide
staining. Negative controls (amplifications in the absence of
RNA) were included in parallel to ascertain absence of con-
taminationbytemplate nucleic acids. Buffers, templates and
DNA products were handled in separate locations, and no
evidence of contamination was seen in the experiments
reported here.
Sequence analysis
Full-length FMDV genome sequences were obtained by
reverse transcriptionof the viral genomic RNA, followedby
PCR amplification using primers specific for each type of
RNA or the st genome, and sequencing of overlapping
cDNAfragments spanning the entire viral genome. Specific
primers were used to amplify differentially RNAs and st
RNAs; their sequence, positioninthe genome, amplification
number for identification, have been described.
1,47
Briefly,
the amplified overlapping cDNA fragments used to se-
quence the different 417 RNAs were, amplifications 11
(FMDVpositions 368 to 1835),
1
13 (FMDVpositions 1002 to
2926),
1
and an amplification covering FMDVpositions 2767
to 8115. For 999 RNA they were, amplification 22 (FMDV
positions 368 to 4189),
1
and an amplification covering
FMDVpositions 2767 to 8115. For 951 RNAs they were, an
amplification covering FMDV positions 368 to 1267, or 368
to 3333, amplification 21 (FMDV positions 1002 to 4189),
1
and an amplification covering FMDV positions 1692 to
8115. For C-S8p260p3d they were, amplifications 22 (FMDV
positions 368 to 4189),
1
6 (FMDV positions 3573 to 5699),
1
7
(FMDV positions 5344 to 6609),
1
and 8 (FMDV positions
5971 to 8115).
1
For C-S8p360p5d they were, amplifications
11 (FMDVpositions 368 to 1835),
1
13 (FMDVpositions 1002
to 2926),
1
19 (FMDV positions 1692 to 4189),
1
and an
amplification covering FMDVpositions 2767 to 8115. For C-
S8p460p5d they were, amplifications 11 (FMDV positions
368 to 1835),
1
21 (FMDV positions 1002 to 4189),
1
and an
amplification covering FMDV positions 2767 to 8115. The
fragments corresponding to the different defective RNAs
(417, 999, and 951) were purified by agarose gel elec-
trophoresis. Only the nucleotide sequence of residues 1 to
367 (preceding the internal poly(C) tract; Figure 1) couldnot
be discriminated among the different RNAs forms. No
deletions in the P2, P3 and UTR genomic regions were de-
tected in populations at passages 260, 360 and 460. Nu-
cleotide sequencing was carried out as described,
11,54,55
using an ABI 373 automated DNA sequencer (Applied Bio-
systems). Most nucleotide sequences (and all of those
showing nucleotide mixtures) were determined two or
more times using different sense and antisense primers.
Further details of the primers used, their position in the
FMDV genome, and the amplification and sequencing
strategies will be provided upon request. The entire FMDV
genome was sequenced for defective viral genomes C-
S8p260417, C-S8p260999, C-S8p360417, C-
S8p360951, C-S8p460417, C-S8p460951, as well as for
the recombinant st genomes C-S8p260p3d, C-S8p360p5d
andC-S8p460p5d. Due to the quasi-species nature of FMDV
populations, mixtures of nucleotides were detected at some
nucleotide positions; in all cases they were confirmed with
independent sequencing reactions. Nucleotide sequences
were aligned and compared using BioEdit.
56
Multiple
alignments were performed with CLUSTAL W.
57
Phyloge-
netic trees were derived for genomic and sub-genomic re-
gions of st and RNAs using the neighbor-joining
method,
58
contained in MEGA2. Analyses of non-synony-
mous/synonymous substitutions ratios were calculated by
using SNAP.
59,60
Nucleotide sequence accession numbers
The Genbank accession numbers for the complete
genome sequences of FMDV used for this study are
AJ133357 for C-S8c1,
61
and DQ409183 to DQ409191 for the
defective genomes and their st derivatives.
Acknowledgements
We thank Eric Baranowski and Armando Arias for
valuable information. Work was supported by
grants BMC 2001-1823-C02-01 and BFU 2005-00863
from MEC and QLRT-2001-00825 from the EU, and
by Fundacin Ramn Areces. S.O. was supported by
a predoctoral fellowship from MEC.
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Edited by J. Karn
(Received 26 February 2006; received in revised form 5 May 2006; accepted 10 May 2006)
Available online 24 May 2006
572 Mutation and Recombination in Defective Virus
BioMed Central
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BMC Evolutionary Biology
Open Access
Research article
Topology of evolving, mutagenized viral populations: quasispecies
expansion, compression, and operation of negative selection
Samuel Ojosnegros
1
, Rubn Agudo
1
, Macarena Sierra
1
, Carlos Briones
2,3
,
Saleta Sierra
1,4
, Claudia Gonzlez- Lpez
1,5
, Esteban Domingo*
1,2,3
and
Juan Cristina
1,6
Address:
1
Centro de Biologa Molecular "Severo Ochoa", UAM-CSIC. Campus de Cantoblanco, 28049, Madrid, Spain,
2
Laboratorio de Evolucin
Molecular, Centro de Astrobiologa (CSIC/INTA), Instituto Nacional de Tcnica Aeroespacial, Ctra de Torrejn a Ajalvir, km 4, 28850 Torrejn de
Ardoz, Madrid, Spain,
3
Centro de Investigacin Biomdica en Red de Enfermedades Hepticas y Digestivas (CIBERehd), Spain,
4
Institute of
Virology, University of Cologne, Fuerst-Pueckler Str. 56, D-50935 Cologne, Germany,
5
MRC Laboratory for Molecular Cell Biology & Cell Biology
Unit, University College London, Gower Street, London, WC1E 6BT, UK and
6
Laboratorio de Virologa Molecular, Centro de Investigaciones
Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la Repblica, Igu 4225, 11400 Montevideo, Uruguay
Email: Samuel Ojosnegros - sojosnegros@cbm.uam.es; Rubn Agudo - ragudo@cbm.uam.es; Macarena Sierra - msierra@cbm.uam.es;
Carlos Briones - brioneslc@inta.es; Saleta Sierra - saleta.sierra-aragon@uk-koeln.de; Claudia Gonzlez- Lpez - dmcbcgl@ucl.ac.uk;
Esteban Domingo* - edomingo@cbm.uam.es; Juan Cristina - cristina@cin.edu.uy
* Corresponding author
Abstract
Background: The molecular events and evolutionary forces underlying lethal mutagenesis of virus
(or virus extinction through an excess of mutations) are not well understood. Here we apply for
the first time phylogenetic methods and Partition Analysis of Quasispecies (PAQ) to monitor
genetic distances and intra-population structures of mutant spectra of foot-and-mouth disease
virus (FMDV) quasispecies subjected to mutagenesis by base and nucleoside analogues.
Results: Phylogenetic and PAQ analyses have revealed a highly dynamic variation of
intrapopulation diversity of FMDV quasispecies. The population diversity first suffers striking
expansions in the presence of mutagens and then compressions either when the presence of the
mutagenic analogue was discontinued or when a mutation that decreased sensitivity to a mutagen
was selected. The pattern of mutations found in the populations was in agreement with the
behavior of the corresponding nucleotide analogues with FMDV in vitro. Mutations accumulated at
preferred genomic sites, and dn/ds ratios indicate the operation of negative (or purifying) selection
in populations subjected to mutagenesis. No evidence of unusually elevated genetic distances has
been obtained for FMDV populations approaching extinction.
Conclusion: Phylogenetic and PAQ analysis provide adequate procedures to describe the
evolution of viral sequences subjected to lethal mutagenesis. These methods define the changes of
intra-population structure more precisely than mutation frequencies and Shannon entropies. PAQ
is very sensitive to variations of intrapopulation genetic distances. Strong negative (or purifying)
selection operates in FMDV populations subjected to enhanced mutagenesis. The quantifications
provide evidence that extinction does not imply unusual increases of intrapopulation complexity,
in support of the lethal defection model of virus extinction.
Published: 17 July 2008
BMC Evolutionary Biology 2008, 8:207 doi:10.1186/1471-2148-8-207
Received: 29 February 2008
Accepted: 17 July 2008
This article is available from: http://www.biomedcentral.com/1471-2148/8/207
2008 Ojosnegros et al; licensee BioMed Central Ltd.
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0),
which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
BMC Evolutionary Biology 2008, 8:207 http://www.biomedcentral.com/1471-2148/8/207
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Background
RNA viruses replicate as mutant distributions termed viral
quasispecies. This is a consequence of high mutation rates
operating during RNA genome copying, due to the
absence of proofreading-repair activities in the relevant
RNA-dependent RNA polymerases and RNA-dependent
DNA polymerases [1,2]. Most phylogenetic relationships
among RNA viruses have been established using the con-
sensus (or population) genomic sequences that represent
a weighted average of multiple, closely related sequences
present at each time point, in each virus sample obtained
for analysis [3]. Phylogenetic relationships established
with consensus viral sequences have been instrumental to
classify viruses and to determine origin of emergent
viruses and rates of virus evolution [1,4,5]. For many pur-
poses it is important to analyze phylogenetically the rela-
tionship among different genomes from the same mutant
spectrum of a viral quasispecies. This type of analysis may
reveal the existence of genome subpopulations within
mutant spectra that might encode different phenotypic
traits. Also, it allows the calculation of average genetic dis-
tances among individual components of the mutant spec-
trum, a parameter that can be a predictor of biological
behaviour [1]. As an example, a study with a poliovirus
mutant which displays a -3-to 5-fold higher template-cop-
ying fidelity than the wild type documented that a narrow
mutant spectrum impeded the virus to reach the brain of
susceptible mice and produce neuropathology [6,7]. An
early study documented that complexity of the coronavi-
rus murine hepatitis virus quasispecies influenced the
pathogenic potential of this virus for mice [8]. A broad
hepatitis C (HCV) virus mutant spectrum was associated
with poor response to treatment by ribavirin and inter-
feron [9], and rapid early evolution of the virus led to a
chronic infection [10]. Some studies have found an asso-
ciation between a reduction of mutant spectrum complex-
ity of HCV at early stages of treatment and viral clearance
([11]; reviewed in [12]). Recently, the role of the mutant
spectrum in adaptation of West Nile virus has been docu-
mented [13,14]. Therefore, there is a need to develop
methods to describe the relationship among components
of mutant spectra in viral populations.
An estimate of the complexity and internal relationships
among genomes within a mutant spectrum can be
obtained through application of distance-based phyloge-
netic methods, such as neighbour-joining (NJ) [15] or
maximum likelihood [16] procedures. However, the reli-
ability of the derived genome clusters may be questiona-
ble when the number of mutations distinguishing
different components of a mutant spectrum is small.
Small genetic distances among genomes of a mutant spec-
trum are found when a viral clone (single genome) has
undergone a limited number of passages in cell culture
[17]. Despite this limitation, the general topology of a NJ
tree may be robust enough to provide information about
the evolutionary pattern undergone by the viral popula-
tion.
An alternative method developed to group closely related
sequences is Partition Analysis of Quasispecies (PAQ),
which is considered a non-hierarchical clustering method
[18]. PAQ groups together the viral sequences separated
by the shortest genetic distances. For this purpose a centre
genotype that nucleates a group of sequences within a cir-
cle (cluster) with a previously set radius is selected. High
compactness of a group is defined by having a larger
number of variants near the centre of the circle than at its
boundary. In this fashion, multiple, overlapping or non-
overlapping groups can be defined within mutant spectra
of viral quasispecies. PAQ has been successfully used to
analyze subpopulations of equine infectious anemia virus
[19], Ty1-copia retrotransposon sequences [20], regula-
tory sequences of bovine viral diarrhoea virus [21], and
sequential isolates of hepatitis A virus [22]. PAQ should
find increasing application to describe viral quasispecies
in view of its power to quantify relationships among
related sequences, and of the critical role of mutant spec-
tra in virus behaviour.
Our laboratory has studied quasispecies dynamics and
evolution of foot-and-mouth disease virus (FMDV), a
widespread picornavirus pathogen that causes the eco-
nomically most important animal viral disease (reviews in
[23,24]). The molecular epidemiology of FMDV has been
analyzed in detail by establishing an extensive database of
genomic nucleotide sequences, as well as by defining phy-
logenetic relationships among and within serotypes and
subtypes of the virus [25-27]. FMDV has been used as a
model system to investigate lethal mutagenesis, a term
coined to describe virus extinction through an increase of
viral mutation rate during replication ([28]; reviews in
[29-31]). Studies on the interference that mutated FMDV
and lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) popula-
tions exert on the infectivity of the corresponding stand-
ard genomes [32-35] led to the proposal of the lethal
defection model of virus extinction [34]. According to this
model, extinction can occur with a modest average
number of mutations per genome that generates a class of
genomes termed defectors, that can replicate but interfere
with replication of the standard genomes [34,36]. Defec-
tor genomes differ from defective-interfering (DI) parti-
cles described for many viruses [37] in that DI particles are
dependent on helper virus for replication while defectors
are replication-competent [34,35].
In the course of the studies on lethal mutagenesis of
FMDV, biological clones of the virus were subjected to
serial cytolytic passages in cell culture in the absence or
presence of the mutagenic bases or nucleoside analogues
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5-fluorouracil (FU), ribavirin (1--D ribofuranosyl-1, 2,
3- triazole- 3 carboxamide) (R), or 5-azacytidine (AZC)
[32,38-41]. These treatments have provided a number of
viral populations differing in their mutant spectrum com-
plexity, as measured by the average mutation frequency
and Shannon entropy within mutant spectra [38-42].
However, possible alterations of phylogenetic relation-
ships among components of the mutant spectra of muta-
genized quasispecies have not been studied. To
characterize possible changes among components of
FMDV mutant spectra as a result of the mutagenic treat-
ments, here we compare phylogenetic and PAQ analyses
of several multiply-passaged FMDV populations, and
their mutagenized counterparts. The results show that
phylogenetic and clustering methods can provide a quan-
tification of the mutagenic activity exerted on viral popu-
lations by reflecting changes in genetic distances among
components of the mutant spectra of the viral quasispe-
cies. PAQ analysis describes mutant distributions as
spheres with size which is proportional to the genetic
diversity, which varies as a result of enhanced mutagene-
sis. This type of representation has revealed that viral pop-
ulations can respond rapidly to environmental changes,
with striking switches between relaxation and compact-
ness of the population diversity, that were not apparent
from the comparison of mutation frequencies or Shannon
entropies. Evidence is presented that identical or closely
related consensus sequences may hide different subpopu-
lations of genomes bearing distinct relationships among
them.
Methods
Cells, viruses, and infections
The origin of BHK-21 cells, and procedures for cell
growth, and infection of cell monolayers with foot-and-
mouth disease virus (FMDV) have been previously
described [39-41,43,44]. The following FMDV clonal
populations have been used in the studies on lethal muta-
genesis: i) FMDV C-S8c1, a plaque-purified derivative of
the natural isolate C
1
Santa-Pau Spain 70 [44], a represent-
ative of European serotype C FMDV [23], GenBank acces-
sion number NC_002554; ii) C-S8c1 multiply passaged at
high multiplicity of infection (m.o.i.) in BHK-21 cells; the
viral populations derived from each passage are indicated
with a "p" before the passage number (i.e. C-S8p50 means
C-S8c1 passaged 50 times in BHK-21 cells). iii) FMDV
MARLS, a monoclonal antibody (mAb)-escape mutant,
selected from population C-S8c1p213 [45], GeneBank
accession number AF274010. iv) C-S8c1p260p3d, the
viral population resulting from three diluted serial infec-
tions (mo.i. = 0.1) of C-S8c1p260 in BHK-21 cells [46];
gene bank accession number DQ409185; v) C
10
280
, a
clone derived from subjecting C-S8c1 to 280 plaque-to-
plaque transfers in BHK-21 cells [47,48].
Extraction of RNA, cDNA synthesis, PCR amplification
and nucleotide sequencing
Procedures for extraction of RNA from the supernatants of
infected cell cultures, reverse transcription (RT) of FMDV
RNA and PCR amplification with high fidelity Pfu DNA
polymerase have been previously described
[32,39,40,48]. Molecular cloning in plasmids pET-
28a3Dpol or pMT-28, as well as controls to ensure that
molecular clones reflect accurately the composition of the
quasispecies under analysis, were described in the primary
publications that produced the genomic sequences ana-
lyzed here [46,49-52]. Nucleotide sequencing was per-
formed using the Big Dye Terminator Cycle Sequencing
Kit (Abi Prism; Applied Biosystems) and the automated
sequencer ABI 373 and ABI 3730; all sequences were
determined at least in duplicate, from independent
sequencing reactions.
Mutagenic agents and treatments
The procedures used for the mutagenic treatment have
been described in detail in the primary references
[30,33,38-40]. Here we provide a summary.
Treatment with ribavirin
A 100 mM solution of R (kindly provided by JC de la
Torre) was prepared in PBS, sterilized by filtration, and
stored at -20C. Prior to use, the stock solution was
diluted in DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's
medium) to reach the desired working concentrations
(generally 200 M to 5000 M). Cell monolayers were
preincubated with R for 7 h prior to infection. Infections
in the absence of R, and mock-infected cells were main-
tained in parallel. FMDV MARLS was serially passaged in
the presence and absence of increasing concentrations
(200 M to 800 M) of R (Figure. 1). For each passage, 4
10
6
BHK-21 cells were infected with 14 10
6
PFU of
virus from the previous passage until cytopathology was
complete (about 30 h in the presence of R, and 16 h in the
absence of R) [40,53].
Treatment with fluorouracil, azacytidine and guanidine hydrochloride
5-fluorouracil (FU) and azacytidine (AZC) were used as
mutagenic base analogues (Figure 1), while guanidine
hydrochloride (G) was used as inhibitor of FMDV replica-
tion, as previously described [38,39,41]. FU medium con-
tained 200 g/ml FU, and FUG medium contained 200
g/ml FU and 4 mM G. Solutions were sterilized by filtra-
tion and stored at 4C for a maximum of 15 days before
use. Infections in the presence of FUG were performed as
previously described [38,39,41].
The sources of all reagents for molecular studies are given
in the corresponding references that describe the nucle-
otide sequences used in the present analyses
[32,33,39,40].
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Phylogenetic analysis
Multiple alignments of consensus sequences and molecu-
lar clones were carried out with the program CLUSTAL W
[54], inserted into Bioedit package [55], using FMDV C-
S8c1 and/or FMDV MARLS (GenBank accession numbers
AJ133357 and AF274010, respectively) as the reference
sequences. Pairwise distances matrix was generated by the
program MEGA3.1 [56], using the Kimura-2 parameter
model [57]. Tree topology was inferred by three phyloge-
netic methods: (i) Neighbor-Joining (NJ) [15] using also
the MEGA3.1 package [56]; bootstrap re-sampling (1000
data sets) of the multiple alignments was used to test the
statistical robustness of the trees obtained by NJ [58]. (ii)
Maximum Parsimony (MP) (using the program DNA-
PARS from PHYLIP v3.5 package) [59]. (iii) Maximum
Likelihood (ML) trees were generated by the program
PUZZLE [16] using the Tamura-Nei substitution model
[60], and the Gamma distributed rates with eight param-
eters (TN-8) as heterogeneity model (see additional file
1). Additionally, for the additional file 2, a ML analysis of
mutagenized populations of FMDV was performed by
means of the program Modelgenerator [61], useful to
identify the optimal evolutionary model (Akaike Informa-
tion Criteria and Hierarchical Likelihood Ratio Test indi-
cated that the GTR model best fit the sequence data).
Using this model, ML trees were constructed using soft-
ware from the PhyML program [62], available at [63]. As
a measure of the robustness of each node, we used an
approximate Likelihood Ratio Test (aLRT), which assesses
that the branch being studied provides a significant likeli-
scheme of passages of biological clone C-S8c1 in BHK-21 cells, in the presence or absence of mutagenic base and nucleotide analogues Figure 1
scheme of passages of biological clone C-S8c1 in BHK-21 cells, in the presence or absence of mutagenic base
and nucleotide analogues. Biological clones are depicted as filled squares and uncloned populations as empty circles. Thick
arrows indicate high m.o.i. passages (1 to 5 PFU/cell). Drug concentrations during the infections are indicated on the corre-
sponding arrows. A) The initial biological clone C-S8c1 [44] was subjected to three parallel series of cytolytic infections, either
in the presence of 5-fluorouracil (FU) or 5-azacytidine (AZC) or with no drug. B) C-S8c1 was subjected to 213 passages, and
then MARLS clone was isolated as a mAb SD6 resistant mutant [45] (thin arrow). RA populations originated from serial cyto-
lytic infections of MARLS in the presence of the indicated concentrations of ribavirin (R). The concentration of R was increased
from 200 M to 800 M in the first 30 passages and from 800 M to 5000 M between passages 45 and 60. A bifurcation was
established at passage 30 and the populations were subjected to 5 additional passages in the absence of R to yield the popula-
tion RA0p35. CAp35 is the population obtained after 35 parallel passages of MARLS in the absence of drug.
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hood gain, in comparison with the null hypothesis that
involves collapsing the branch under study but leaving the
rest of the tree topology unaffected [64].
Characterization of mutant spectra
The complexity of mutant spectra was quantified by min-
imum and maximum mutation frequencies. Minimum
mutation frequency is the number of different mutations
present in the molecular clones divided by the total
number of nucleotides sequenced, and maximum muta-
tion frequency is expressed as the total number of muta-
tions present in the molecular clones divided by the total
number of nucleotides sequenced. The normalized Shan-
non entropy (H), which is a measure of the proportion of
identical sequences in a distribution [65], was also calcu-
lated. It is given by the formula:
in which p
i
is the proportion of each sequence of the
mutant spectrum, and N is the total number of sequences
compared.
For the Partition Analysis of Quasispecies (PAQ) [18], the
clones of each viral population were grouped together
under the minimum possible radius, considering no par-
tition. Within each cluster, the average distance (AD)
value, with respect to the central sequence reported by
PAQ, was calculated as a measure of the intrapopulation
diversity, given by the formula:
in which n is the number of neighbors within the group
with centre variant c, and D
ic
is the genetic distance (Ham-
ming) between variants i and c. The populations are rep-
resented as spheres with the diameter proportional to the
AD value. Standard errors have also been calculated (see
additional file 3: Standard errors).
The nonsynonymous mutations corrected per nonsynon-
ymous site (dn) and the synonymous mutations corrected
per synonymous site (ds) were calculated using SNAP
[66,67]. Kn and Ks are the ratio of nonsynonymous and
synonymous mutations respectively, per nucleotide
(without any correction). The sliding-window software K-
Estimator [68] was used to infer the Ks and Kn in the
FMDV genome using 200 nucleotide windows and a shift
of 100 nucleotides per step, to cover all the polyprotein-
coding region. The software calculates the confidence
interval using Monte Carlo simulations.
Software for phylogenetic and sequence analyses were
retrieved from the corresponding references listed in the
different sections of Methods.
Statistical analysis
One Way ANOVA, Tukey post hoc tests for non equal n,
and standard errors were calculated using Statistica 6.0
software package (StatSoft 2001).
Results
Phylogenetic evaluation of the mutagenesis-induced
diversification of viral populations
The present study was aimed at analyzing retrospectively
sets of consensus and clonal nucleotide sequences deter-
mined in our laboratory from FMDV populations sub-
jected to serial cytolytic infections in BHK-21 cells, in the
absence or presence of the mutagenic nucleotide ana-
logues FU, R or AZC [32,33,39,40] (Figure 1).
A representation of the quasispecies was obtained by
determining the nucleotide sequences of 5 to 21 cDNA
clones from each population, and scoring mutation types,
mutation frequencies, and Shannon entropies. The FMDV
genomic region analyzed was the 3D (polymerase)-cod-
ing region (Table 1). Phylogenetic trees were derived from
the nucleotide clonal and consensus sequences from each
population. Sequences from some reference viruses were
also introduced as outgroups to establish minimal and
previously known relationships, as well as to define a gen-
eral structure of the tree. The distance-based NJ method
[15], under Kimura two parameter model [57], was ini-
tially used for phylogenetic reconstructions, as described
in Methods. In some cases the populations were analyzed
using ML and MP algorithms [69] (see additional files 1
and 2). The general topology of these trees was consistent
with that derived from the NJ analysis: the major clades
and the relationships among clonal and consensus
sequences were maintained.
Comparison of the phylogenetic trees derived from nucle-
otide sequences of the different FMDV clonal populations
passaged 1 and 25 times in the absence or the presence of
AZC or FU shows an expansion of genetic distances
among components of the mutant spectrum of the
mutated populations compared to the respective control
populations passaged in the absence of drug. The presence
of FU led to a higher expansion of the genetic distances
than the presence of AZC (Figure 2). This expansion was
not observed at passage 1 either with or without AZC or
FU. Tree branches radiate from the corresponding consen-
sus sequence with no discernible subclusters within each
population.
A more complex pattern of intrapopulation genetic dis-
tances was observed with FMDV passaged in the presence
of R (Figure 3). These populations originated from the
high fitness FMDV clone MARLS [45]. The overall topol-
ogy of the populations subjected to continuous muta-
genic treatment (RAp35, RAp45 and RAp60; passage
H p p N
i
N
i i
= [ ( ln )] / ln
(1)
AD average distance = =
=
( / ) ( ) 1
1
n D
i
n
ic

(2)
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history depicted in Figure 1) shows the absence of signifi-
cant subclusters. In turn, in all cases, a set of clones cen-
trifugally diverge from the consensus sequence located at
the basis of the group. As the number of passages in the
presence of R increases, the genetic distance between the
consensus sequence of each population and its parental
MARLS clone increases substantially (about 11-fold from
passage 35 to passage 60; Figure 3A).
Interestingly, the population that underwent 30 passages
in the presence of R and then 5 passages in the absence of
R, showed a more compact topology, and subclusters of
clones were distinguished (RA0p35* in Figure 3B). It
must be noted that, due to the close relatedness among
the nucleotide sequences analyzed (see Background and
Methods), the bootstrap values associated with the
derived NJ trees suggest limited robustness of the derived
clusterings. Nevertheless, the same general topological
features are also observed when MP and ML were used
(see additional file 1: neighbour-joining, maximum like-
lihood and maximum parsimony analysis of populations
RAp35 and RA0p35) (see also statistical evaluation of
PAQ, below).
The control population CAp35, obtained after 35 serial
cytolytic infections of clone MARLS in cell culture in the
absence of mutagen, shows a characteristic tree with evi-
dent lower diversity than the populations treated with
mutagen (Figure 3), as documented by the very low muta-
tion frequency value (12-fold smaller than population
RAp35, see Table 1), and the average shortness of all the
branches.
Partition analysis of quasispecies (PAQ) applied to the
clonal analysis of mutagenized FMDV populations
To further characterize the clonal structure of muta-
genized FMDV populations, PAQ was applied to the same
FMDV populations (Figure 1) studied by phylogeny. The
sequences determined from the set of molecular clones
derived from each viral population were treated as sepa-
rate populations. A radius that grouped all sequences was
chosen, and then the AD value was calculated (see Meth-
ods), as a measure of intrapopulation diversity (Figure 4).
We considered the absence of intrapopulation partition as
a priori realistic assumption because each viral population
derives from a well defined ancestor and evolution took
place under controlled conditions, supported also by phy-
logenetic data (Figure 3A).
PAQ analysis of the populations derived from clone C-
S8c1 subjected to 25 passages either in the presence of FU
or AZC or in the absence of mutagen, showed a 1.5-fold
expansion of intrapopulation diversity as a result of virus
propagation in the absence of mutagen, and 13.50-fold
and 9.24-fold expansions as a result of passages in the
presence of FU or AZC, respectively (Figure 4A). These val-
ues illustrate again the higher mutagenic potential of FU
than AZC (Tukey post hoc test, p = 0.004) on FMDV rep-
licating in BHK-21 cells [39].
Table 1: Number and type of mutations scored, and resulting mutation frequencies, calculated for the mutant spectra of the FMDV
populations analyzed in the present study
Population
a
Genomic
residues
b
Number
of clones
Total nt.
sequenced
Drug
treatment
c
Mutations
d
Transitions
e
Transversions
e
Minimum
mutation
frequency
(10
-3
)
f
Maximum
mutation
frequency
(10
-3
)
g
Min/max
ratio
H
h
AD
i
No Drug p1 66098013 5 7025 None 2/2 0.50 0.50 0.28 0.28 1 0.58 0.50
AZCp1 66098013 5 7025 [10 g/ml]
AZC
1/1 0 1 0.14 0.14 1 0.31 0.25
FUp1 66098013 5 7025 [200 g/ml]
FU
2/2 1 0 0.28 0.28 1 0.58 0.50
No drug p25 66098013 5 7025 None 1/3 1 0 0.14 0.42 0.33 0.61 0.75
AZCp25 66098013 18 25290 [10 g/
ml]AZC
13/19 0.21 0.79 0.51 0.75 0.68 0.73 2.31
FUp25 66098013 5 7025 [200 g/ml]
FU
14/19 1 0 1.99 2.7 0.74 1 6.75
CAp35 66677997 21 27951 None 17/17 0.88 0.12 0.61 0.61 1 0.69 0.85
RA0p35 71508020 21 18291 [800 M] R,
No drug
17/68 0.75 0.25 0.93 3.71 0.25 1 3.62
RAp35 66677997 14 18634 [500800
M] R
55/139 0.91 0.09 2.95 7.46 0.39 1 13.15
(7.85)
RAp45 66677997 12 15972 [800 M] R 31/49 0.76 0.24 1.96 3.07 0.64 1 6.91
RAp60 66677997 14 18634 [8005000
M] R
55/80 0.97 0.02 2.95 4.29 0.69 1 7.62
a
The origin of the FMDV populations is detailed in Methods and depicted schematically in Figure 1.
b
The genomic residues analyzed correspond to the 3D-coding region of the FMDV genome; residue numbering is according to [47].
c
Drug treatment (AZC, azacytidine; FU, 5-fluorouracil; R, ribavirin), and concentrations are as described in Figure 1.
d
The first number indicates the total amount of different mutations found in all the clones analyzed; when repeated mutations were found the second number refers to the total number of mutations.
e
Expressed per 1 in each population.
f
Minimum mutation frequency is the number of different mutations divided by the total number of nucleotides sequenced.
g
Maximum mutation frequency is the total number of mutations (including repeated mutations) divided by the total number of nucleotides sequenced.
h
H is the normalized Shannon entropy [65].
i
AD is the average genetic distance, calculated as detailed in Methods. The value in brackets was calculated with residues 71508020 (to compare with population RA0p35) of the FMDV genome.
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A dramatic effect of R treatment was unveiled by PAQ
through the comparison of MARLS populations passaged
in the presence or absence of R (Figure 4B). Remarkably,
multiple passages in the presence of up to 800 M R,
resulted in populations with significant differences in AD
values by means of analysis of variance (One-way
ANOVA: F = 85.5, df = 65, p < 0.001). RAp35 showed a
15.47-fold larger AD value (Tukey post hoc test, p <
phylogenetic analysis of individual molecular clones of FMDV populations passaged in the absence or presence of mutagens Figure 2
phylogenetic analysis of individual molecular clones of FMDV populations passaged in the absence or presence
of mutagens. The trees were constructed with sequences from the 3D (polymerase)-coding region (nucleotide residues 6609
to 8013; numbering of residues as in [47]) of molecular clones obtained from populations at passage 1 (left) or passage 25
(right) of FMDV C-S8c1in BHK-21 cells. The populations analyzed correspond to those depicted in Figure 1A. Each dot repre-
sents the sequence of an individual clone as follows: red, clones from the populations passaged in the absence of drug (no
drug); green, clones from the populations passaged in the presence of 5-fluorouracil (FU); blue, clones from the populations
passaged in the presence of 5-azacytidine (AZC). The central Sequence according to PAQ is indicated by an arrow. The NJ
method, with the Kimura 2 parameter algorithm, and 1000 bootstrap resamplings were used. Bootstrap values were below 75,
and values higher than 60 are indicated in parenthesis. The position of the consensus sequence of the corresponding popula-
tions is indicated with an asterisk. MARLS was included as an outgroup of the tree. The origin of the viruses, and procedures
for clonal analysis and nucleotide sequence determination are detailed in Methods.
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phylogenetic analysis of individual molecular clones of MARLS populations passaged in the absence or presence of ribavirin Figure 3
phylogenetic analysis of individual molecular clones of MARLS populations passaged in the absence or pres-
ence of ribavirin. Trees were constructed using the NJ method under Kimura 2-parameter model, with 1000 bootstrap resa-
mplings. Bootstrap values higher than 75 are indicated with numbers; values between 60 and 74 are indicated in parenthesis.
Each tree represents the analysis of one individual population from the MARLS lineage depicted in Figure 1B. Each population
can be identified by the name of the corresponding consensus sequence indicated with an asterisk. Each dot represents the
sequence of an individual molecular clone; red indicates absence of drug and black presence of ribavirin. The central Sequence
according to PAQ is indicated by an arrow. A) Trees constructed with sequences from the 3D (polymerase)-coding region,
residues 66677997, of FMDV. B) Comparison of the phylogenetic position of clones derived from populations RAp35 and
RA0p35 (depicted in Figure 1); residues 71507997 from the 3D (polymerase)-coding were used. Procedures for clonal analy-
sis and nucleotide sequencing are detailed in Methods.
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0.001) than the population CAp35, the parallel control in
the absence of the drug (Figure 4B).
The 3D of RAp35 and its derived populations harbours
the substitution M296I which decreases its sensitivity to R
[40]. Further passages in the presence of 800 M R led to
a reduction of diversity of population RAp45 (1.90-fold
reduction in AD value, Tukey post hoc test, p < 0.001;
Table 1). Once the diversity decreased in RAp45, it did not
further increase significantly after 15 additional passages
under higher (up to 5000 M) concentrations of R
(RAp60) (1.10 fold, Tukey post hoc test, p = 0.9).
Population RAp30 (depicted in Figure 1B) was subjected
in parallel to 5 further passages either in the absence
(RA0p35) or the presence (RAp35) of R. The intrapopula-
tion diversity in RA0p35 was 2.15-fold smaller than
RAp35 (Tukey post hoc test, p < 0.001) (see Discussion).
The modification of the relationship among components
of the mutant spectrum is not reflected in Shannon
entropy (which is saturated in the highest value, 1, for all
the populations from the RA lineage tested) (see Table 1).
Also maximum mutation frequency varies within a nar-
row range of 1.7-fold to 2.4-fold when the different pop-
ulations are compared with RAp35 (table 1). There are no
statistically significant differences in the minimum/maxi-
mum mutation frequency of population RAp35 and
RA0p35 (one-way ANOVA: F = 2.57, df = 1.33, p = 0.118).
This ratio is larger (higher diversity) in populations
RAp45 and RAp60, than in population RAp35 (Tukey
post-hoc test, p = 0.0073 and p = 0.013, respectively),
despite having lower AD values and, therefore lower intra-
partition analysis of quasispecies (PAQ) applied to sequences derived from mutagenized FMDV populations Figure 4
partition analysis of quasispecies (PAQ) applied to sequences derived from mutagenized FMDV populations.
The initial biological clone of each passage series is depicted as a dot, with an initial intrapopulation average distance given arbi-
trarily the value AD = 0.0. The populations analyzed in A and B are those described in Figure 1A and Figure 1B, respectively.
For simplicity, only the drug treatment (FU, 5-fluorouracil, green; AZC, azacytidine, blue; R, ribavirin, black; no drug, red), and
the populations analyzed are depicted. The AD value was measured for each population considering no partition. Values are
based on nucleotide sequences of the 3D(polymerase)-coding region, genomic residues 6609 to 8013 for A), and 6667 to 7997
for B), except for population RA0p35 for which residues 71507997 were used. For comparison, population RAp35 was also
analyzed using residues 71507997; in that case the sphere is represented with a dotted line inside the large sphere. The diam-
eter of each sphere is proportional to the AD value which is indicated next to each sphere. Procedures for nucleotide
sequencing and PAQ analysis are described in Methods.
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population diversity. These comparisons support that the
AD values derived from PAQ are a more sensitive and real-
istic descriptor of intrapopulation diversity than mutation
frequencies.
Mutational bias and rate of fixation of mutations
The mutation profile in the components of the mutant
spectrum of each population analyzed indicated that a
specific pattern of mutations was associated with each
mutagen (Figure 5). FU-treated populations accumulated
an excess of U C transitions [39], while -RA popula-
tions preferentially fixed transitions C U and G A
[42]. The mutational bias associated with AZC was mainly
due to transversions G C, C G.
The NJ tree derived from consensus nucleotide sequences
of the entire FMDV genome of R treated populations dis-
closed an unusually rapid fixation of mutations in the
consensus sequence of RAp45 (Figure 6A). In the course
of serial cytolytic passages of C-S8c1, mutations accumu-
lated at a rate of approximately 0.20 mutations per pas-
sage [48], with MARLS displaying a similar rate of 0.24
proportion of the different mutation types scored among molecular clones of FMDV populations Figure 5
proportion of the different mutation types scored among molecular clones of FMDV populations. Each mutation
type (abscissa) was counted for the indicated populations by comparing the nucleotide sequence from each individual molecu-
lar clone with the consensus sequence of the corresponding population. The populations analyzed are those derived from
FMDV MARLS (top left panel), from populations passaged in the absence of drug and derived either from C-S8c1 or MARLS
(top right panel), or from FMDV C-S8c1 (bottom panels). The populations correspond to those depicted in Figure 1, and can
be identified according to the drug treatment (AZC, azacytidine; FU, 5-fluorouracil; R, ribavirin; no drug and C populations,
control populations passaged in the absence of drug). Note the difference scale in ordinate of the top versus bottom panels.
The genomic regions and number of nucleotides analyzed for each population are described in Table 1. Procedures for nucle-
otide sequence determination and bioinformatic analysis of sequences are detailed in Methods.
M
u
t
a
t
i
o
n
p
e
r
c
e
n
t
a
g
e
MARLS
RAp35
RAp45
RAp60
RAp035
No Drugp25 (C-S8c1)
CAp35 (MARLS)
A
/
C
A
/
G
A
/
U
C
/
A
C
/
G
C
/
U
G
/
A
G
/
C
G
/
U
U
/
A
U
/
C
U
/
G
C-S8c1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
FUp1
FUp25
C-S8c1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
A
/
C
A
/
G
A
/
U
C
/
A
C
/
G
C
/
U
G
/
A
G
/
C
G
/
U
U
/
A
U
/
C
U
/
G
AZCp1
AZCp25
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
A
/
C
A
/
G
A
/
U
C
/
A
C
/
G
C
/
U
G
/
A
G
/
C
G
/
U
U
/
A
U
/
C
U
/
G
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
A
/
C
A
/
G
A
/
U
C
/
A
C
/
G
C
/
U
G
/
A
G
/
C
G
/
U
U
/
A
U
/
C
U
/
G
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quantification of the genotypic divergence of FMDV MARLS populations passaged in the presence of ribavirin Figure 6
quantification of the genotypic divergence of FMDV MARLS populations passaged in the presence of ribavirin.
The FMDV populations analyzed are those derived from C-S8c1 or MARLS, as displayed in Figure 1B. A) Phylogenetic tree
based on consensus nucleotide sequences of populations derived from biological clone C-S8c1 (p50, p100, p143, p200) and
from MARLS (RAp35, RAp45); p260p3d derives from C-S8c1 after 260 passages at high m.o.i. in BHK-21 cells, followed by 3
low m.o.i. infections, as described in [46]. C
10
280
a is a clone of C-S8c1 subjected to 280 serial bottleneck (plaque-to-plaque)
transfers in BHK-21 cells [47,48]. FMDV C-Oberbayern is a natural isolate whose sequence [26] has been used as outgroup.
The tree is based on the nucleotide sequence of entire genomes, using the NJ method with 1000 bootstrap resamplings (nodes
scoring values higher than 75 per 100 are indicated in the tree), following the procedures described in Methods. B) Absolute
number of mutations including reversions, relative to the sequence of C-S8c1, as a function of passage number in the C-S8c1
lineage (depicted in Figure 1B). Values are based on the nucleotide sequence of entire genomes. A linear regression con-
structed with C-S8c1 and successive passages (C-S8c1 lineage) is shown (y = 0.1987x-1.6922; R
2
= 0.9882). The position of
MARLS and RAp45 is indicated. Procedures are detailed in Methods.
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mutations per passage. In contrast, RA deviated to 1.13
mutations per passage, suggesting a very fast evolution
associated with the presence of R (Figure 6B).
Evidence of purifying selection during enhanced
mutagenesis
We have examined whether the highly mutated RA
genomes resulted from random fixation of mutations
along the genome, or from their preferential accumula-
tion at specific genomic sites. Using the sliding-window-
based software K-estimator [68] (described in Methods)
we measured the distribution of mutations (Ka, Ks, non-
synonymous and synonymous mutations per nucleotide,
respectively) along the open-reading frame (polyprotein-
coding region) of MARLS, RAp35 and RAp45 popula-
tions. At certain genome regions, Ka and Ks for RAp35 and
RAp45 displayed values that were statistically significantly
higher than the average (Figure 7). The asymmetric distri-
bution of mutations suggests that despite the high muta-
tional pressure imposed by R treatment, some kind of
selection is still acting during the -passaging of the virus
with error-prone replication.
To distinguish whether the asymmetric distribution of
mutations along the genome was mainly due to positive
or negative (or purifying) selection, the dn/ds ratios were
calculated (see Methods and Table 2). -RA populations
included 6- to 14- fold excess of synonymous mutations,
both in the analysis of the mutant spectrum and the con-
sensus sequence. In contrast, the dn/ds ratio of the con-
sensus sequence of C-S8c1 at passage 263 (C-S8p260p3d)
was 0.62, that is, 6-to 8-fold higher than the value for -RA
populations. Also, a set of MARLS-derived clones scored a
dn/ds ratio of 1.21, 7- to 17-fold higher value than
obtained in the clonal analysis of -RA populations (Table
2). These data, together with the non-random accumula-
tion of mutations along the viral genome (Figure 7),
strongly suggest that purifying selection operates on
FMDV in the course of replication under enhanced muta-
genesis.
Virus extinction without a large excess of mutations
To investigate whether FMDV extinction by enhanced
mutagenesis was associated with unusual intrapopulation
divergence [29,30,70,71], a PAQ analysis was performed
on populations FMDV C-S8p3, C-S8p3-FUG and RAp35
[72] (Figure 8A). Preextinction population C-S8p3-FUG
manifested a very modest increase in mutant spectrum
complexity relative to the control population C-S8p3 (Fig-
ure 8C). Furthermore, the complexity of C-S8p3-FUG was
much lower than the complexity of RAp35 (AD value
comparison: T student, t = 12.19, p < 0.001), included in
the phylogenetic and PAQ analyses (Figure 8B and 8C).
Therefore, viral extinction can be achieved without any
salient increase of the average genetic distances among
components of the quasispecies (see Discussion).
Discussion
Several remarkable modifications in the mutant spec-
trum occur when viral populations replicate in the pres-
ence of mutagenic agents such as base or nucleoside
analogues. The initial experiments by J.J. Holland and
colleagues documented very modest (1.1- to 2.8-fold)
increases of mutation frequency at single base sites of
poliovirus and vesicular stomatitis virus, associated with
severe decrease of infectivity, as a consequence of
enhanced mutagenesis by a variety of mutagenic agents
[73]. Subsequent work showed that replication of differ-
ent viruses in the presence of mutagenic base or nucleo-
side analogues could lead to virus extinction
accompanied of very modest (from barely measurable up
to 6.4-fold) increases of mutation frequency and mutant
spectrum complexity ([28,39,74]; reviews in [29,30,71]).
In our previous studies with FMDV and lymphocytic cho-
riomeningitis virus we have observed that in the course of
the transition of the viruses towards extinction: i) there is
a 10
2
- to 10
3
-fold decrease in specific infectivity (number
Table 2: Corrected ratio of nonsynonymous to synonymous substitution in several FMDV populations
Viral population
a
dn/ds (Molecular clones)
b
dn/ds (Consensus sequences)
c
RAp35 0.16 N.D
RAp45 0.08 0.09 (MALRS)
RAp60 0.07 0.08 (MARLS)
RA0p35 0.12 N.D.
C-S8p260p3d N.D. 0.63 (C-S8c1)
MARLS 1.21
d
0.65 (C-S8c1)
N.D. not determined.
a
The viral populations analyzed are those described in Figure 1 and Methods.
b
dn/ds is the ratio of nonsynonymous mutations (corrected per nonsynonymous site) to synonymous mutation (corrected per synonymous site),
calculated as described in Methods [85,86]. Values correspond to calculations using nucleotide sequences from molecular clones (as described in
Table 1).
c
dn/ds calculated as in b, applied to consensus nucleotide sequences, compared with the corresponding parental clone (given in parenthesis).
d
This value was calculated with biological clones derived from MARLS, using the L (leader) protease-and capsid-coding regions.
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distribution of Ka and Ks ratio (non-synonymous mutations per nucleotide, and synonymous mutations per nucleotide, respec- tively) along the consensus sequence of the protein-coding region of the genomes of FMDV MARLS, RAp35 and RAp45 Figure 7
distribution of Ka and Ks ratio (non-synonymous mutations per nucleotide, and synonymous mutations per
nucleotide, respectively) along the consensus sequence of the protein-coding region of the genomes of FMDV
MARLS, RAp35 and RAp45. The origin of the populations analyzed is depicted in Figure 1B. The sequences have been com-
pared with that of C-S8c1. Ka and Ks were calculated with the software K-estimator [68]. The genomes were analyzed in win-
dows of 200 nt and a shift of the window of 100 nt in each step. The scaled protein-coding region of the FMDV genome is
indicated in the abscissa [23,24]. The confidence intervals (dotted horizontal line) were calculated by k-estimator using Monte
Carlo simulations [68]. A) Ka ratios. B) Ks ratios. C) Comparison of Ka and Ks ratios for RAp45.
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preextinction FMDV population, and phylogenetic and PAQ analysis of mutagenized populations Figure 8
preextinction FMDV population, and phylogenetic and PAQ analysis of mutagenized populations. A) Biological
clones are depicted as filled squares and uncloned populations as empty circles. Thick arrows indicate high m.o.i. passages (1 to
5 PFU/cell). Drug concentrations during the infections are indicated on the corresponding arrows). The circle with a cross rep-
resents an extinct population. * This is the last infectious population recovered. B) Phylogenetic analysis of individual molecular
clones from a MARLS population passaged in the presence of R, and clones from the C-S8c1 lineage passaged in the presence
or absence of FU and G. Black dots in the tree represent sequences of individual molecular clones from population RAp35. The
tree includes also clones derived from the population obtained after 3 passages of C-S8c1 in the presence of FU and G (green
asterisks), or in the absence of drugs (red dots). The central Sequence according to PAQ is indicated by an arrow. Populations
p200, p260p3d and clone C
10
280
, are derived from C-S8c1, as described in Figure 6. The tree is based on residues 6670 to 7871
of the 3D (polymerase)-coding region, using the neighbor-joining method (1000 bootstrap resamplings; values higher than 75
are indicated with numbers; values between 60 and 74 are indicated in parenthesis), as detailed in Figure 2 and Methods. C) AD
values and spheres corresponding to the PAQ analysis of populations RAp35, C-S8p3-FUG and C-S8p3. Procedures are
detailed in Methods.
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of infectious units divided by the total amount of viral
RNA); ii) low viral loads and low replication capacity (fit-
ness) favour extinction; and iii) internal, interfering inter-
actions among mutagenized components of the mutant
spectra play an important role in the extinction [32-
36,38,39,75].
The critical participation of the mutant spectrum in viral
extinction led to the proposal of "lethal defection" as a
model of virus extinction by lethal mutagenesis [34,35],
and motivated the phylogenetic and partition analyses of
mutant spectra reported in the present study. The results
support our previous conclusions on the general increase
of mutant spectrum complexity -here documented by
average genetic distances in phylogenetic trees and quan-
tified by the AD parameter in PAQ- as a result of the var-
ious mutagenic treatments. Moreover, new insights into
the events associated with enhanced mutagenesis have
been unveiled by the comparison of phylogenetic and
PAQ analyses. The NJ tree topology of a population
evolved under enhanced mutagenesis conditions consists
of a basal consensus sequence, with the individual com-
ponents of the population radiating from it (the more
mutated the population the bigger the radiation of the
branches) and with no apparent population structure in
the form of subclusters. Trees constructed with FMDV
populations whose 3D (polymerase) included a substitu-
tion that decreased the sensitivity to R (RAp45 and
RAp60) [40] displayed a slight reduction of branch
length, but maintained the same general topology. This is
in sharp contrast with population RA0p35, which, after
only 5 passages in the absence of R, presents an internal
structure completely rearranged, as shown by the NJ tree,
and confirmed with ML and MP methods (Figure 3B, and
additional file 1: neighbour-joining, maximum likeli-
hood and maximum parsimony analysis of populations
RAp35 and RA0p35).
The average distance parameter AD of PAQ reflects the
fine detail of the intra population structure of diversity
better than the other estimators traditionally used, such
as mutation frequencies or Shannon entropy. Mutation
frequency does not capture the distribution of mutations
among the individual components of a mutant spectrum,
and the Shannon entropy reaches the maximum possible
value of 1 when all the sequences under study are differ-
ent, independently of the mutational load. This lack of
resolution is circumvented by PAQ due to the pairwise
comparison of all the clones with respect to the central
sequence. In this sense, any subtle variation in the spatial
distribution of mutation frequency may be amplified
yielding a more sensitive, accurate and non-saturating
description of the internal structure of the population.
The present analysis has documented striking expansions
of the average intrapopulation genetic distance associ-
ated with mutagenic treatments (Figure 4). Interestingly
the analysis of the RA lineage revealed that, after an initial
expansion of intrapopulation diversity, a remarkably fast
contraction of the average distance occurred in two situa-
tions. First, a 2.15-fold reduction in AD value was
observed when the drug treatment was discontinued for
only 5 passages. Second, populations with FMDV includ-
ing in its 3D (polymerase) replacement M296I -that
decreases the sensitivity to R [40] displayed a 1.90-fold
reduction in AD value (RAp45 and RAp60 populations,
Figure 4). The ratio of minimum over maximum muta-
tion frequency yielded higher values (indicative of higher
diversity), in populations RAp45 and RAp60 than in pop-
ulation RAp35 which is the most diverse. Therefore muta-
tion frequencies (both maximum, minimum or their
ratio) and Shannon entropy, are less definitory than PAQ
(when analyzing AD) to characterize the internal genetic
diversity of mutagenized viral populations.
A possible interpretation of intrapopulation contractions
is that in the course of the mutagenic treatment subsets of
genomes with better than average replication efficiency
are produced. However, their potential replicative advan-
tage can not be expressed due to the continuous muta-
tional input due to the presence of R. When R pressure is
removed, specific subsets of genomes showing higher
than average replication capacity, replenish the popula-
tion. A similar, albeit less pronounced, contraction
would occur as a consequence of the dominance of viral
mutants with decreased sensitivity to R.
The MARLS-derived populations that replicated in the
presence of R (the RA lineage, Figure 1B), showed unex-
pected high resistance to extinction at passage 35 and
subsequent passages, associated with a mutation that
decreased the sensitivity to R [40]. Despite such muta-
tion, the number of total mutations fixed in the consen-
sus sequence of population RAp35 was very high (1.13
mutations/passage, Figure 6) when compared with its
ancestor (0.2 mutation/passage). Also the molecular
clones derived from RAp35 presented a 12-fold increase
in mutation frequency with respect to the control popu-
lation, CAp35 (Table 1). The specific pattern of muta-
tions of FU-treated, AZC-treated and R-treated
populations (Figure 5), and the increase in mutant fre-
quency with respect control populations (Table 1) sug-
gest that the increase in mutation frequencies was
effectively produced by the action of mutagens, in agree-
ment with the mutational bias induced in the course of
polymerization assays in the presence of R-triphosphate
or FU-triphosphate using purified FMDV 3D (polymer-
ase) ([40], Agudo et al submitted for publication).
Despite the high error frequencies induced by mutagen,
mutations did not accumulate at random along the viral
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genome, but rather they accumulated at preferred
genomic regions (Figure 7). The non-random accumula-
tion of mutations and the excess of corrected synony-
mous mutations (Table 1) are consistent with purifying
selection operating in the evolution of mutagenized pop-
ulations. Viruses harbouring less deleterious mutations
might have a selective advantage in a landscape of highly
damaged viruses. In this view, the quasispecies would
display a mutagenesis buffering activity, accepting those
mutations that affect the more permissive regions of the
viral genome. This dynamics is strikingly parallel to that
observed in the course of bottleneck transfers carried out
with the same FMDV clones C-S8c1 ([47,48,76-78]
reviewed in [79]). In bottleneck transfers individual
clones are selected for replication. In this situation Mller
ratchet effect operates on the clones [80]. In clones that
resisted extinction, mutations accumulated preferentially
at some genomic regions and, again, an excess of synon-
ymous mutations was found [48,77].
The present study supports the "lethal defection" model
of viral extinction in that a limited number of mutations
per genome can be sufficient to drive a virus to extinction
[28,34,74]. Again, the comparison with FMDV clones
subjected up to 409 bottleneck transfers is highly signifi-
cant. In such clones extinction was not achieved despite
the genomes reaching average mutation frequencies
which are 5- to 37-fold higher than those associated with
viral extinction by lethal mutagenesis [32,39,41,48]. It
has been proposed that in successive bottleneck transfers,
the kinetics of mutation accumulation allows the fixation
of compensatory beneficial mutations that counteract the
Mller Ratchet effect [76-79].
Several theoretical models of lethal mutagenesis of
viruses have been proposed, either as a direct conse-
quence of quasispecies dynamics and its corollary con-
cept of error catastrophe, or independently of error
catastrophe [70,81-84]. All models converge in that lethal
mutagenesis is a feasible strategy to achieve virus extinc-
tion by mutagenic nucleotide analogues. What the mod-
els did not take into consideration is the key influence on
extinction of internal interactions exerted among compo-
nents of the mutant spectra. Lethal and interfering muta-
tions impede a substantial "evaporation" (or "diffusion")
of genomic sequences in sequence space [84], as it could
not be otherwise, considering that we are dealing with
loss of multiple biological functions compactly inte-
grated in a viral genome [70]. The phylogenetic and PAQ
approaches used here should be extremely helpful to
monitor in a quantitative fashion the evolution of muta-
genized viral populations both in cell culture and in vivo,
as they increase their mutational load and either suc-
cumb or escape extinction.
Conclusion
Phylogenetic and PAQ analyses have unveiled changes in
the internal population structure of FMDV viral quasispe-
cies subjected to mutagenesis by base and nucleoside ana-
logues. Expansions and compressions of mutant spectra
have been quantitated by comparing average genetic dis-
tances among components of mutant spectra. Compari-
sons of the types and distribution of mutations along the
viral genomes have shown that negative (or purifying
selection) acts in the course of enhanced mutagenesis.
Virus extinction can be achieved with modest increases of
population complexity. The average distance parameter
(AD) reflects the intrapopulation structure better than the
other estimators traditionally used, such as mutation fre-
quencies or Shannon entropy.
Authors' contributions
RA, MS, SS and CG-L determined nucleotide sequences.
SO, CB and JC applied phylogenetic and PAQ methods.
SO made the calculations. ED conceived the study, and
SO and ED wrote the manuscript. All authors reviewed
and approved the final manuscript.
Additional material
Additional file 1
Neighbour-joining, maximum likelihood and maximum parsimony
analysis of populations RAp35 and RA0p35. Strains in the tree are
shown by name. Consensus sequence of each population is indicated with
an asterisk. Bar at the bottom of the trees denote distance A) and D)
Neighbour joining trees with Kimura 2-parameter. Bootstrap resampling
values (1000 replicas) higher than 50 are shown in red in the tree. B)
and E) Maximum likelihood trees constructed with the Tamura-Nei sub-
stitution model and the Gamma distributed rates with eight parameters
(TN-8) as heterogeneity model. C) and F) Maximum parsimony trees,
confidence values higher than 50 are shown in red in the tree.
Click here for file
[http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-
2148-8-207-S1.tiff]
Additional file 2
Maximum likelihood phylogenetic analysis of mutagenized popula-
tions of FMDV. Strains in the tree are shown by name. Bar at the bottom
of the trees denote distance. Consensus sequence indicated by *. The
model used was GTR [61]. As a measure of the robustness of each node
an approximate Likelihood Ratio Test was used.
Click here for file
[http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-
2148-8-207-S2.tiff]
Additional file 3
Standard errors. Average Hamming distance of the components of each
population (with respect to the central sequence selected by PAQ). Stand-
ard errors are plotted with boxes around the mean, as depicted in the leg-
end.
Click here for file
[http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-
2148-8-207-S3.tiff]
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Acknowledgements
The authors wish to thank O.Gordo for critical review of the manuscript,
and C Escarms for important contributions to this project. Work at Cen-
tro de Biologa Molecular "Severo Ochoa" was supported by grants
BFU2006-00863 from MEC, 36558/06 from FIPSE, and Fundacin R.Areces.
Work at Centro de Astrobiologa was supported by INTA, MEC, CAM and
UE. CIBERehd is funded by Instituto de Salud Carlos III. S.O. was supported
by a predoctoral fellowship from the Ministerio de Educacion y Ciencia.
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