Objectivo: Separar uma protena das restantes no extracto celular
Estratgia: Existem in meras tcnicas de purificao disponveis. O
procedimento exacto e a ordem dos mtodos a aplicar dependem do tipo de protena e empregam-se de acordo com as caractersticas da mesma No Incio de uma Purificao... Temos clulas animais, de plantas, ou microbianas Torna-se necessrio: -Partir as Clulas: Fraccionamento Celular -Separar o Extracto: Centrifugao -Obter a Fraco Solvel (onde se encontram as protenas) Mtodos / Tcnicas aplicadas Suaves Moderados Vigorosos Exemplos Qumicos Detergentes Culturas de clulas Bioqumicos Lise enzimtica Tecidos Vegetais Cl. bacterianas Fungos Fsicos / Mecnicos 1 - Choque osmtico 2 - Arrefecimento / Aquecimento 3 - Potter - Elvjehem Homogeneizao por lminas 1 - French - Press 2 - Ultra-sons 3 - Moinho de esferas 4 - Homogeneizador de Manton-Gaulin 1 - Lise de clulas sanguneas e culturas de clulas 3 - Fgado Clulas e tecidos animais e vegetais Suspenses celulares e microorganismos com parede celular Exemplos Dependendo do tipo de tecido ou clula temos : Alguns exemplos de tcnicas de desintegrao: Centrifugao Diferencial : Centrifugao do material a separar a velocidades crescentes. 1-fraco: Nuclear 2- fraco: Mitocondrial 3- fraco: Microssomal / Sobrenadante Citoslica Centrifugao em Gradiente de Densidade : (meio suporte em gradiente de densidade) Centrifugao de Fluxo Contnuo : Isopicnca - Por Zonas de Velocidade - gradiente de densidade abrange as densidades das partculas a separar. Amostra adicionada a gradiente formado ou a formar. gradiente de densidade menos denso que partcula menos densa. Amostra adicionada no topo de gradiente formado. mistura de partculas introduzida continuamente no rotor em movimento. Partculas slidas depositam-se na parede do rotor e lquido livre de resduos abandona o rotor. Separao pelo Tamanho: Dilise usada para remover o excesso de sal ou mudar o tampo de uma protena. Ateno. No separa protenas ! Molculas grandes no atravessam a membrana Membrana semipermevel Molculas pequenas atravessam membrana Princpio da Cromatografia: Separao de molculas baseada nas suas mobilidades relativas atravs de uma matriz. diferentes i interac es s com a matriz. Interac es com base em propriedades fsico/qumicas das protenas Tamanho Filtrao em Gel Carga Troca Inica Hidrofobicidade Interaco Hidrofbica Especificidade para uma biomolcula Cromatografia de Afinidade Separao pelo Tamanho: Filtrao em Gel Esferas da resina com poros nas quais partculas pequenas podem entrar e as grandes no podem entrar. A coluna dever possuir a distncia necessria para uma boa separao Protenas eludas por ordem decrescente de tamanho Separao pela Carga: Cromatografia de Troca Inica pH > pI protena carregada negativamente Protena Desprotonada pH < pI protena carregada positivamente Protena Protonada A Matriz da Coluna A Matriz da Coluna (resina) um polmero contendo grupos ligados carregados Questes a Colocar antes da Separao por Carga Qual o Ponto Isoelctrico da Protena ? Qual o pH do Tamp o ? Se se pretende agarrar uma protena a uma resina Se se pretende agarrar uma protena a uma resina de troca de troca inica inica, esta deve possuir sinal contrrio , esta deve possuir sinal contrrio carga global da protena alvo mas grupos ligados carga global da protena alvo mas grupos ligados - - contra contra- -ies ies- - do mesmo sinal do mesmo sinal resinas apresentam cargas positivas e ligam protenas com carga global negativa. Protenas eludas da coluna de troca inica por por alterao da afinidade por: 1 Aumento du Foru Inicu {= uumento du concentruo de i es de um suI} E: i es Nu + competem com os grupos du protenu curregudos positivumente puru u Iiguo nu resinu 2 AIterundo o pH {provocu u vuriuo du curgu gIobuI du protenu} resinas apresentam cargas negativas e ligam protenas com carga global positiva. Troca Catinica Troca Aninica Separao pela Carga: Cromatografia de Troca Inica Separao pela Carga: Cromatografia de Troca Inica Protenas buiu ufinidude para a resina movem-se rupidumente, atravs da coluna. Protenas eIevudu ufinidude para a resina eludas lavando a coluna com um tumpo de muior foru inicu ou com um pH , Separao por Afinidade: Cromatografia de Afinidade No tem em conta propriedades fsicas ou qumicas especificidade biolgica Permite num spasso purificar uma protena/enzima de uma mistura complexa. Princpio da Separao: Ligando imobilizado na matriz/resina ao qual se liga a protena de que o ligando substrato. Ligando Brao espaador Matrix Princpio da Electroforese: Estudo do movimento de partculas carregadas sob aco de um campo elctrico Partcula migra na direco do elctrodo de carga oposta Migrao depende: Carga, Tamanho e forma Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE ou SDS-PAGE) Condies nativas: Protenu puru? Condies desnaturantes: MM? sub-unidudes? sepuruo s peIo tumunho {ruzo curgu/mussu cte} devido uo SDS utribui curgu gIobuI negutivu constunte mobilidade molculas pequenas > molculas grandes Electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE ou SDS-PAGE) C IcuIo du mussu moIecuIur Padres Amostra Focagem Isoelctrica ou Isoelectrofocagem Mobilidade de compostos em funo do pH Carga da protena depende : Ponto isoelctrico (pI), pH meio pH meio Abaixo pI Carga +move-se para Ctodo (-) Acima pI Carga - move-se para nodo (+) Igual pI Carga global Zero Separa protenas e determina pI numa s corrida Gradiente de pH : anflitos