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BIOLOGIA MOLECOLARE

LEZIONE 9 ricercando i satelliti con elettroforesi dopo aver digerito con enzimi di restrizione. L'enzima alu1 aveva evidenziato un satellite che noi vogliamo clonare. Sulla piastra ci saranno colonie blu e colonie bianche ma quali di queste colonie ha il frammento di nostro interesse? Cerco con una sonda

faccio IBRIDIZZAZIONE DELLA COLONIA


Tecnica impiegata per selezionare le colonie batteriche che contengono una specifica sequenza polinucleotidica. Una piastra viene esposta a una sonda oligonucleotidica marcata che possiede una sequenza complementare a una parte della sequenza ricercata. Il clone che possiede questa sequenza ibridizza con l'oligonucleotide marcato e viene quindi riconosciuto ho una piastra con delle colonie bianche che contengono il frammento : il 50% avranno il frammento da 100pb e il 50% il frammento da 1000pb . Prendo foglio di nitrocellulosa, taglio un disco della dimensione della mia piastra e lo appoggio sopra la piastra. Una volta che ha aderito, stacco il foglio di nitrocellulosa (peeling) e in questo modo rimarranno attaccate alla nitrocellulosa le colonie. Ora prendo un foglio di carta assorbente, lo imbevo di soda (ph basico) e ci appoggio il foglio di nitrocellulosa con le colonie rivolte verso l'alto. In questo modo la soda passa attraverso la membrana di nitrocellulosa andando a contatto con le colonie dove distrugge la parete cellulare e denatura il dna. Il contenuto cellulare esce dalle cellule, il dna denaturato rimane attaccato al foglio di nitrocellulosa rimanendo nella posizione in cui era collocata la colonia. Ora bisogna tornare al ph neutro quindi prendo disco di nitrocellulosa e lo posizione su un foglio di carta assorbente su un sistema tampone. In questo modo il dna si rinatura molto velocemente. La parte a doppio filamento rimane ancorata alla membrana mentre quella a singolo filamento sporge dal filtro. A questo punto prendo il filtro e lo metto in stufa a 200C in questo modo fisso il dna alla membrana stabilizzando la sua posizione sul filtro. Poi metto in frigorifero x nn essere attaccato da batteri. A questo punto prendo il frammento radioattivo lo denaturo e lo metto in ghiaccio. Siccome la rinaturazione molto veloce nella provetta avr sia frammenti a singolo filamento sia frammenti rinaturati,. Prendo il filtro di nitrocellulosa che avevo messo in frigo, lo appoggio in una vaschetta con colonie verso l'alto e ci verso sopra il frammento radioattivo. In questo modo i frammenti complementari andranno a legarsi. A questo punto prendo una lastra fotografica, metto sopra il filtro e la radioattivit andr a impressionare la lastra.