Traduccion Articulos VCD Thomas R. Rizzo

Spectroscopic studies of cold, gas-phase biomolecular ions
Thomas R. Rizzo*, Jaime A. Stearns and Oleg V. Boyarkin

Laboratoire de Chimie Physique Moleculaire, Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, CH-1015 Lausanne, Switzerland (Received 13 April 2009; final version received 20 May 2009) While the marriage of mass spectrometry and laser spectroscopy is not new, developments over the last few years in this relationship have opened up new horizons for the spectroscopic study of biological molecules. The combination of electrospray ionisation for producing large biological molecules in the gas phase together with cooled ion traps and multiple-resonance laser schemes are allowing spectroscopic investigation of individual conformations of peptides with more than a dozen amino acids. Highly resolved infrared spectra of single conformations of such species provide important benchmarks for testing the accuracy of theoretical calculations. This review presents a number of techniques employed in our laboratory and in others for measuring the spectroscopy of cold, gas-phase protonated peptides. We show examples that demonstrate the power of these techniques and evaluate their extension to still larger biological molecules. Keywords: gas-phase biological molecules; cooled ion traps; electrospray; infrared spectroscopy
Contents page 1. Introduction 482 2. Experimental and computational approach 484 2.1 Overview 484 2.2 Ion generation 485 2.3 Cooling and trapping 485 2.4 Spectroscopic interrogation 486 2.5 Computational methods 487 3. Spectroscopy of protonated aromatic amino acids 488 4. The scaling of spectral complexity with increasing molecular size 494 5. Spectroscopy of helical peptides 495 6. Toward still larger molecules 503
*Corresponding author. Email: thomas.rizzo@epfl.ch
ISSN 0144235X print/ISSN 1366591X online _ 2009 Taylor & Francis DOI: 10.1080/01442350903069931 http://www.informaworld.com
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7. Limitations and future directions 507 8. State of comparison with theory 509 9. Conclusions 511 Acknowledgements 512 References 512 1. Introduction Because the functions of biological molecules are intimately connected to their threedimensional structure, an enormous amount of effort is expended to determine the latter with the hope of understanding, and perhaps intervening in, the former. While biomolecular structure is determined primarily by x-ray crystallography and NMR, theory is playing an increasingly important role. As available computational power continues its exponential rise, increasingly large molecules become amenable to theoretical treatment. In addition to its potential predictive power, an accurate theoretical description of biological molecules allows one to dissect and analyse the counterbalancing forces that control their structure as well as to examine the properties of individual stable conformers. To make sure that theoretical treatments properly describe the underlying physics and are capable of reliably predicting structures, comparison with benchmark experiments is essential. Perhaps the most rigorous test is to compare theory and experiment on isolated biological molecules, free from the complicating effects of solvent. In the mid-1980s molecular spectroscopists began to remove biological molecules from their natural environment to interrogate them in the cold, isolated environment of supersonic molecular beams [19]. Early experiments used electronic spectroscopy to investigate the amino acid tryptophan with the goal of determining the number of stable conformations that it could adopt in vacuo [14]. This was driven by observations that the fluorescence decay rate of tryptophan in solution, which is used as a monitor of protein
folding, is non-exponential [1012], and one of the models to explain these observations postulated the existence of different conformers having different fluorescence quenching rates[12]. Electronic spectra of isolated tryptophan did indeed identify a number of stable conformations[4], although at the time theoretical methods were not able to make reasonable predictions for these structures. Today the conformations of isolated amino acids can be easily and reliably calculated. The earliest experiments on isolated amino acids [14] and their derivatives [8,13,14] used simple heating to put them in the gas phase. With the advent of laser desorption techniques, larger, more complex molecules could be volatilised without decomposition [57, 15], and this helped ignite an explosion in spectroscopic studies of neutral peptides with up to 15 amino acid residues [5,6,9, 1629]. The increasing complexity of these molecules require more sophisticated spectroscopic techniques to extract structural information, and this has been achieved by employing IRUV [1821,23,24,26, 3040], UVUV [30,33,36,41] and even IRIRUV multiple-resonance methods [42] together with cooling in supersonic expansions. 482 T. R. Rizzo et al.
Still larger biological molecules become increasingly difficult to produce in the gas phase via thermal techniques without decomposition. The advent of MALDI [43,44] and electrospray [45,46] in mass spectrometry has allowed intact biological molecules of virtually any size to be put into the gas phase in the form of closed-shell molecular ions and opened up new avenues of investigation. Bowers and co-workers used these techniques together with ion mobility to characterise the average cross section of such species [47,48]. Wang and co-workers measured photoelectron spectra of multiply-charged, non-biological anions generated by electrospray [49], and Parks and co-workers observed fluorescence from cytochrome C in an electrospray plume [50] and later from small proteins in a quadrupole ion trap [51]. However it was Andersen et al. [52,53] who first used absorption/ action spectra to characterise closed-shell biomolecular ions produced by electrospray. These groundbreaking experiments measured electronic absorption spectra of green fluorescent protein chromophore in an electrostatic ion storage ring by detecting the neutral products subsequent to either photodetachment (in the case of anions) or photofragmentation (in the case of cations). The spectra they obtained exhibited only broad structure, although this is likely due to the warm internal temperatures of the ions in the storage ring. At about the same time, McLafferty et al. [54,55] demonstrated that one could do infrared multiphoton dissociation (IRMPD) of electrosprayed peptides and proteins in a Fourier transform ion-cyclotron resonance (FT-ICR) mass spectrometer using an optical parametric oscillator (OPO) operating in the light-atom stretch region. Tuning the frequency of their IR OPO produced photofragment excitation spectra that reflect the infrared absorption of OH and NH stretch vibrations. Even though the ions in their trap were at room temperature, the observed bands were about 30 cm _1 wide, which is sufficiently narrow to distinguish many light atom stretch bands. Von Helden et al. [56] extended IRMPD spectroscopy into the amide I and II regions of the infrared using a free electron laser to measure infrared spectra of potassiated cytochrome C ions formed by electrospray, where detection of infrared absorption was monitored by the loss of the potassium adduct. Although the individual bands in these spectra were rather broad (3050 cm_1), the overall vibrational pattern in this region suggests a large degree of _-helical content. Shortly thereafter, Kamariotis et al. [57] measured infrared spectra of solvated amino acid ions to look for evidence of zwitterion formation by detecting solvent loss subsequent to IR absorption. These spectra were used to test the claim that after adding 34 water molecules a cationised amino acid exists in a salt-bridge arrangement with the amino acid in a zwitterionic form [58]. While all these studies broke new ground in providing spectroscopic data to help characterise the conformational properties of closed-shell biomolecular ions, the spectral complexity was substantially greater and the resolution correspondingly lower than studies of neutrals cooled in supersonic expansions. Simons et al. [5961] developed a photochemical method for producing protonated biological molecules in a supersonic expansion, and while perhaps not the most widely applicable, this approach demonstrated that the spectra of closed-shell ions are inherently no more complex than their corresponding neutrals. As the size and spectral complexity of the molecules increase, cooling the molecules is simply necessary to facilitate spectroscopic analysis. In a major step toward spectroscopic studies of cold, biomolecular ions, Weinkauf
et al. [62] measured the electronic excitation spectrum of protonated tryptophan produced by electrospray and stored in a liquid-nitrogen-cooled quadrupole ion trap. While the International Reviews in Physical Chemistry 483
electronic spectrum they obtained showed some structure, the spectral features were orders of magnitude broader than molecules cooled in a supersonic expansion, leading one to question the cooling efficiency in their trap. It was later discovered that the spectrum of protonated tryptophan is inherently broad due to fast excited state dynamics [63]. Nevertheless, Weinkaufs [62] experiments served as a major stimulus to study electrosprayed ions in cold traps. This present article reviews the work currently being done in the authors laboratory combining electrospray ionisation for producing gas-phase biomolecules together with collisional cooling in a cold 22-pole ion trap and IRUV double-resonance techniques to simplify the spectra. The primary goals of this work have been to understand the intrinsic properties of biological molecules and provide critical benchmark tests of theory, and for this we look at bare, isolated molecules in the gas phase. While as a test of theory, the spectroscopy of gas-phase biomolecules has relevance completely apart from their condensed phase analogs, the closed-shell molecular ions produced by electrospray are the same species found in solution, where most biomolecules carry a net charge. Moreover, by examining partially solvated molecules in the gas phase, we can begin to understand the role of solvent on those properties. 2. Experimental and computational approach 2.1. Overview We perform our experiments in a home-built ion-trap mass spectrometer, shown schematically in Figure 1. Rather than give a detailed description of this apparatus, which can be found in recent publications [6470], we provide a brief overview of the experimental approach followed by an explanation of key aspects of the experimental design.
Figure 1. [Colour online] Schematic of tandem mass spectrometer with a cooled, 22-pole ion trap. Adapted with permission from [86]. Copyright 2006 American Chemical Society.
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We use a nanospray source to produce the protonated peptides from an acidified water/methanol solution directly into the atmosphere, where they are drawn into vacuum by a metal-coated glass capillary. The expansion that occurs at the exit of the capillary passes through a 1mm diameter skimmer and into a hexapole ion trap, where the ions are collected for _50 ms. Once released from the hexapole, the resulting ion packet passes through a quadrupole mass filter to select those of a particular m/z. The transmitted ions are then turned 90_ by a static quadrupole deflector, decelerated by a series of lenses and guided by an octopole ion guide into a 22-pole ion trap, which is cooled to _6K by a closed-cycle refrigerator. Before the ion packet arrives in the trap, we inject a pulse of helium, giving it sufficient time to equilibrate to the temperature of the trap housing. The ions collide with the cold helium and fall in to the effective potential well of the trap. We give the ions approximately 10 ms to cool and then wait an additional 30 ms to pump out the helium before we interrogate them spectroscopically. We pass a UV laser pulse from a frequency-doubled dye laser down the axis of the 22-pole ion trap, promoting the molecules to an excited electronic state from which some fraction of them dissociate. We then release both the parent and fragment ions from the trap, turn them 90_ in a second static quadrupole and pass them through an analysing quadrupole to select an m/z of either a particular fragment or of the parent ions. The transmitted ions are then detected by a channeltron electron multiplier. An electronic spectrum is obtained by recording the ion signal of a particular fragment as a function of the frequency of the UV laser. As is described more fully below, we measure infrared spectra of the trapped biomolecular ions using IRUV double resonance. The trapping cycle of the ions is repeated at 20 Hz. We switch the analysing quadrupole to transmit either the fragment or the parent on alternate trapping cycles and use the parent signal from one shot to normalise the fragment signal from the subsequent one, which removes long-term fluctuations in the nanospray source. 2.2. Ion generation Putting biological molecules into the gas-phase via electrospray has many advantages for spectroscopic studies. Because they are produced near room temperature and at
atmospheric pressure, there is essentially no fragmentation. There seems to be no limit to the size of molecules that can be produced those ranging from individual amino acids to entire viruses [7173] have been successfully injected into mass spectrometers by electrospray. Because we are working with charged biomolecules as opposed to neutrals, we can select their mass and control their trajectories, allowing us to guide and/or trap them. Electrospray generates closed-shell molecular ions, either protonated or deprotonated, which is precisely what is found in solution. The disadvantage of studying biomolecular ions is the relatively low number density, which is a function both of the electrospray process itself as well as space charge effects inside the ion trap. 2.3. Cooling and trapping The linear, 22-pole ion trap is the key element of our experimental apparatus, allowing us to store the molecules and cool them through collisions with cold helium. Gerlich et al. [7476] pioneered the use of cold, RF ion traps and applied them principally to study the International Reviews in Physical Chemistry 485
spectroscopy and chemical reaction kinetics of small ions of astrophysical importance. There is nothing particularly special about the choice of 22 poles it is simply important to have a sufficiently large number of them so that the effective radial potential is flat for a substantial fraction of the trap diameter [76]. As the ions ride up the radial potential wall when they approach the poles, they undergo oscillatory motion driven by the RF field, and collisions with helium at this point could warm the ions as opposed to cooling them. Thus a flat radial potential with steeper walls should facilitate collisional cooling of ions, since in this case the oscillatory motion and hence warming collisions, will be limited to a small fraction of the trap volume. The drawbacks to using a larger number of poles is that the ions spread over a larger volume resulting in a lower ion density on the axis of the trap, and optical access to the trapped ions in the radial direction is limited. 2.4. Spectroscopic interrogation We typically inject 10,000 ions into the 22-pole trap, which has an active volume of _5 cm. Given the ion density of _2_103 cm_3, it is clear that any kind of direct absorption spectroscopy would be difficult if not impossible. Moreover, this ion density is at the limit of what can be detected by laser-induced fluorescence (LIF), a problem that is compounded by the unfavourable geometry of the 22-pole ion trap for photon detection. We thus need a more sensitive means of spectroscopic detection, and for this we use photofragmentation. After UV excitation of an aromatic chromophore in a protonated peptide, some fraction of the ions will fragment, since quantum yields for fluorescence are rarely unity. This can occur either following internal conversion to highly excited vibrational levels of the ground electronic state or by crossing to other electronic states that are dissociative in some coordinate. We thus use mass-resolved detection of photofragments as a sensitive spectroscopic tool. As shown schematically in Figure 2a, we measure electronic spectra of the cold ions in the trap by detecting a particular charged photofragment as a function of the UV wavelength. Our ultimate goal is to measure infrared spectra of biomolecular ions, since such spectra can provide information on the conformation of the molecule. Using an IRUV double-resonance scheme, illustrated schematically in Figure 2b, we can measure an IR spectrum of individual conformers of the trapped ions. To do this, we fire an infrared pulse from an OPO 200 ns before the UV pulse, depleting the ground state population each time the infrared frequency coincides with a vibrational transition of the parent molecule. The IR transition is then detected as a dip in the UV photofragmentation signal as the IR frequency is scanned through a vibrational band. For this approach to work, the molecules promoted to a vibrationally excited state must not absorb a UV laser photon of the same frequency as that of the ground state and produce fragments, or if they do, it must be with reduced efficiency. Because the IR-excited molecules will be internally warm, we observe their UV absorption spectrum is substantially broadened and the peak absorption at the UV wavelength is greatly reduced, leading to a dip in the IR spectrum. While this double-resonance approach imposes the requirement that the molecule of interest have a UV chromophore, it has the great advantage that the UV spectrum can be used to select a particular conformer, since different conformers often have slightly different UV spectra that can be resolved if the molecules are internally cold. Thus, the IR 486 T. R. Rizzo et al.
Los estudios espectroscpicos de los iones de fro, biomolecular en fase gaseosa Thomas R. Rizzo *, Jaime A. Stearns y Oleg V. Boyarkin Laboratoire de Chimie Physique Mole'culaire, E'cole Fe'de'rale Polytechnique de Lausanne, CH-1015 Lausanne, Suiza (Recibido el 13 de abril de 2009, versin final recibi el 20 mayo de 2009) Si bien el matrimonio de la espectrometra de masas y la espectroscopia lser no es nueva, los acontecimientos de los ltimos aos en esta relacin se han abierto nuevas horizontes para el estudio espectroscpico de molculas biolgicas. La combinacin de ionizacin de electrospray para la produccin de grandes molculas biolgicas en el gas fase, junto con las trampas de iones enfriados y mltiples esquemas de resonancia lser que permita una investigacin espectroscpica de conformaciones individuales de los pptidos con los cidos ms de una docena de aminocidos. Espectros de infrarrojo altamente resuelto de una sola conformaciones de estas especies constituyen puntos de referencia importantes para las pruebas de la exactitud de los clculos tericos. Esta revisin presenta una serie de tcnicas empleadas en nuestro laboratorio y en otros para medir la espectroscopia de fro, en fase gaseosa pptidos protonada. Se muestran ejemplos que demostrar el poder de estas tcnicas y evaluar su extensin a los todava grandes molculas biolgicas. Palabras clave: fase gaseosa las molculas biolgicas, las trampas de iones enfriados; electrospray; espectroscopia de infrarrojo Contenido de la pgina 1. Introduccin 482 2. Enfoque experimental y computacional 484 2.1 Resumen 484 2.2 Ion generacin de 485 2.3 Refrigeracin y captura 485 2.4 espectroscpicos interrogatorios 486 2.5 Mtodos computacionales 487 3. Espectroscopia de protonadas aminocidos aromticos 488 4. La escala de la complejidad del espectro con el aumento del tamao molecular 494 5. Espectroscopia de pptidos helicoidales 495 6. Hacia las molculas an mayores 503 * Autor para la correspondencia. Correo electrnico: @ thomas.rizzo epfl.ch ISSN 0144-235X de impresin / ISSN 1366-591X en lnea _ 2009 Taylor & Francis DOI: 10.1080/01442350903069931 http://www.informaworld.com Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 7. Limitaciones y las direcciones futuras 507 8. Estado de comparacin con la teora 509 9. Conclusiones 511 Agradecimientos 512 Referencias 512 1. Introduccin Dado que las funciones de las molculas biolgicas estn ntimamente conectados con sus tres dimensiones estructura, una enorme cantidad de esfuerzo se realiza para determinar la ltima con la esperanza de entender, y quizs intervenir en la primera. Mientras que estructura biomolecular est determinada principalmente por cristalografa de rayos X y RMN, La teora est desempeando un papel cada vez ms importante. Como la potencia de clculo disponible
contina con su crecimiento exponencial, cada vez ms grandes molculas susceptibles de ser tericas el tratamiento. Adems de su potencial poder de prediccin, una descripcin terica precisa de las molculas biolgicas permite diseccionar y analizar las fuerzas de contrapeso que el control de su estructura, as como para examinar las propiedades de los distintos confrmeros estables. Para asegurarse de que los tratamientos tericos adecuadamente describir la fsica subyacente y se capaz de predecir de forma fiable las estructuras, la comparacin con los experimentos de referencia es esenciales. Quizs la prueba ms rigurosa es la comparacin de la teora y la experimentacin en aislados las molculas biolgicas, libre de los efectos que complica de disolvente. En el espectroscopistas mediados de 1980 comenz molecular para eliminar las molculas biolgicas de su medio ambiente natural para interrogarlos en el ambiente fro, aislado de supersnico haces moleculares [1-9]. Los primeros experimentos utiliz la espectroscopia electrnica investigar el aminocido triptfano, con el objetivo de determinar el nmero de estable conformaciones que puede adoptar en el vaco [1-4]. Esto fue impulsado por las observaciones que el tasa de decaimiento de fluorescencia de triptfano en la solucin, que se utiliza como un monitor de la protena plegado, no es exponencial [10-12], y uno de los modelos para explicar estas observaciones postul la existencia de diferentes confrmeros "con extincin de fluorescencia diferentes las tasas [12]. Los espectros electrnicos de triptfano aislados, efectivamente, identificar una serie de estable conformaciones [4], aunque en el momento de mtodos tericos no fueron capaces de hacer predicciones razonables para estas estructuras. Hoy en da la conformacin de aminocidos aislados Los cidos pueden ser fcil y confiablemente calculado. Los primeros experimentos en aminocidos aislados [1-4] y sus derivados [8,13,14] utiliza calentamiento simple para ponerlos en la fase gaseosa. Con la llegada de desorcin por lser tcnicas, molculas ms grandes y complejas pueden ser volatilizados sin descomposicin [15 5-7], y esto ayud a encender una explosin en los estudios espectroscpicos de pptidos neutral con hasta 15 residuos de aminocidos [5,6,9, 16-29]. La creciente complejidad de estas molculas requieren tcnicas espectroscpicas ms sofisticados para extraer estructurales , la informacin, y esto se ha logrado mediante el empleo de IR-UV [18-21,23,24,26, 30-40] UV UV-[30,33,36,41], e incluso IR-IR-UV de mltiples mtodos de resonancia [42], junto con de enfriamiento en las expansiones supersnicas. 482 T. R. Rizzo et al. Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 An ms grande de molculas biolgicas cada vez ms difcil de producir en el gas fase a travs de tcnicas termales sin descomposicin. El advenimiento de MALDI [43,44] y electrospray [45,46] en la espectrometra de masas ha permitido intactas las molculas biolgicas de prcticamente cualquier tamao que se pondrn en la fase de gas en forma de capa cerrada iones moleculares y abri nuevas vas de investigacin. Bowers y colaboradores utilizan estas tcnicas junto con la movilidad de iones para caracterizar la seccin transversal media de estas especies
[47,48]. Wang y sus colaboradores midieron los espectros de fotoelectrones de multiplicar cargado, no biolgicos aniones generados por electrospray [49], y Parques y compaeros de trabajo observ fluorescencia de citocromo C en un penacho de electrospray [50] y ms tarde a partir de pequeas protenas en un cuadrupolo trampa de iones [51]. Sin embargo, fue Andersen et al. [52,53], quien utiliz por primera vez la absorcin / espectros de accin para caracterizar con cscara cerrada iones biomoleculares producido por electrospray. Estos experimentos innovadores medir los espectros de absorcin electrnica de color verde cromforo protena fluorescente en un anillo de iones de almacenamiento electrosttico mediante la deteccin de la productos neutros o con posterioridad a photodetachment (en el caso de aniones) o photofragmentation (en el caso de cationes). Los espectros obtenidos se exhiben slo estructura general, aunque esto es probablemente debido a las altas temperaturas internas de los iones en el anillo de almacenamiento. Al mismo tiempo, McLafferty et al. [54,55] demostraron que una poda hacer por infrarrojos disociacin multifotnica (IRMPD) de los pptidos y electrosprayed las protenas de una transformada de Fourier de iones de resonancia ciclotrn (FT-ICR) espectrmetro de masas utilizando un oscilador ptico paramtrico (OPO) que operan en la regin se extienden la luztomo. Sintonizacin de la frecuencia de su IR OPO producido photofragment espectros de excitacin que reflejan la absorcin infrarroja de las vibraciones se extienden OH y NH. A pesar de que los iones en la trampa estaban a temperatura ambiente, las bandas se observaron alrededor de 30 cm_1 de ancho, que es lo suficientemente estrecha para distinguir la luz muchas bandas elsticas tomo. Von Helden et al. [56] espectroscopia extendido IRMPD en la amida I y II regiones del infrarrojo utilizando una libre lser de electrones para medir los espectros infrarrojos de potassiated citocromo C formado por iones electrospray, que se monitoriz la deteccin de absorcin infrarroja por la prdida de el aducto de potasio. A pesar de las bandas individuales en esos espectros fueron bastante amplio (30-50 cm_1), el patrn general de vibracin en la regin sugiere un alto grado de _-Helicoidal contenido. Poco despus, Kamariotis et al. [57] midieron los espectros infrarrojos de solvatados iones de aminocidos para buscar evidencia de la formacin de zwitterion mediante la deteccin de disolventes consecuente prdida de absorcin de infrarrojos. Estos espectros se utilizaron para probar la afirmacin de que despus de la adicin de molculas de agua 3-4 un aminocido cationised existe en un acuerdo de salpuente con el aminocido en forma de iones hbridos [58]. Aunque todos estos estudios abri un nuevo camino en el suministro de los datos espectroscpicos para ayudar a caracterizar las propiedades conformacionales de iones biomoleculares con cscara cerrada, el espectro
complejidad era mucho mayor y la resolucin proporcionalmente menor que en los estudios de los neutrales se enfri en expansiones supersnicas. Simons et al. [59-61] desarrollaron un mtodo fotoqumico para la produccin de molculas biolgicas protonado en un supersnico de expansin, y aunque quiz no el ms ampliamente aplicable, este enfoque ha demostrado que los espectros de capa cerrada iones no son inherentemente ms complejos que sus neutrales correspondientes. A medida que el tamao y la complejidad del espectro del aumento de las molculas, enfriamiento de las molculas no es ms que necesaria para facilitar el anlisis espectroscpico. En un gran paso hacia los estudios espectroscpicos de iones de fro, biomolecular, Weinkauf et al. [62] midieron el espectro de excitacin electrnica de triptfano producido protonadas por electrospray y se almacena en una trampa de iones de nitrgeno lquido refrigerado cuadrupolo. Mientras que el Comentarios Internacional de Qumica Fsica 483 Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 espectro electrnico que obtuvieron mostraron algn tipo de estructura, las caractersticas espectrales eran rdenes de magnitud mayor que las molculas de refrigeracin en una expansin supersnica, lo que lleva a un tela de juicio la eficacia de la refrigeracin en su trampa. Ms tarde se descubri que el espectro de triptfano protonada es de por s amplio debido a la rpida dinmica de estado excitado [63]. Sin embargo, [62] Weinkauf los experimentos fue un importante estmulo para el estudio electrosprayed iones en trampas fras. Este trabajo revisa el trabajo que se est realizando en el laboratorio de los autores la combinacin de ionizacin electrospray para la produccin de biomolculas en fase gaseosa con refrigeracin de colisin en un fro de 22 polos de trampa de iones y IR-UV resonancia doble tcnicas para simplificar los espectros. Los objetivos principales de este trabajo ha sido comprender el valor intrnseco propiedades de las molculas biolgicas y proporcionar pruebas de referencia fundamental de la teora, y para esto nos fijamos en las molculas de desnudo, aislado en la fase gaseosa. Mientras que como una prueba de la teora, la espectroscopia de biomolculas en fase gaseosa tiene una importancia completamente al margen de su anlogos de la fase condensada, los iones moleculares de capa cerrada producida por electrospray son los misma especie se encuentra en solucin, donde la mayora de las biomolculas tienen una carga neta. Por otra parte, por el examen de molculas parcialmente solvatado en la fase de gas, podemos empezar a entender el papel de disolvente en esas propiedades. 2. Enfoque experimental y computacional 2.1. Informacin general Llevamos a cabo nuestros experimentos en un espectrmetro de masas de iones de fabricacin casera-trampa, que se muestra esquemticamente en la figura 1. En lugar de dar una descripcin detallada de este aparato, que se puede encontrar en las publicaciones recientes [64-70], ofrecemos una breve descripcin de la enfoque experimental seguida de una explicacin de los aspectos clave de la experimentacin
diseo. Figura 1. [Color en lnea] Esquema del espectrmetro de masas en tndem con un refrigerado, 22 polos de trampa de iones. Adaptado con permiso de [86]. Copyright 2006 Sociedad Americana de Qumica. 484 T. R. Rizzo et al. Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 Utilizamos una fuente nanospray para producir los pptidos protonadas de un acidificados agua / metanol directamente en la atmsfera, donde se dibujan en el vaco por un vaso de metal con recubrimiento capilar. La expansin que se produce a la salida del capilar pasa a travs de un skimmer de 1 mm de dimetro y en una trampa de iones hexapole, donde los iones son recogidos para _50 ms. Una vez liberado de la hexapole, el paquete de iones resultante pasa a travs de un filtro de masas cuadrupolar para seleccionar a los de un determinado m / z. Los iones de transmisin Luego se convirti 90_ por un deflector cuadrupolo esttica, se desaceler por una serie de lentes y guiado por un gua de iones octopolar en una trampa de iones de 22 polos, que se enfra a _6K por un refrigerador de ciclo cerrado. Antes de que el paquete de iones llega a la trampa, se inyecta un pulso de helio, dndole tiempo suficiente para equilibrarse con la temperatura de la caja trampa. La iones colisionan con el fro de helio y la cada en el potencial efectivo y de la trampa. Nosotros dar a los iones de aproximadamente 10 ms para enfriar y luego esperar otros 30 ms para bombear el helio antes de interrogarlos espectroscpicamente. Pasamos por un pulso de lser UV a partir de una doble frecuencia lser de colorante por el eje de la 22 polos trampa de iones, la promocin de las molculas de un estado electrnico excitado de que algunos parte de ellos se disocian. A continuacin, suelte ambos el padre y los fragmentos de iones de la trampa, a su vez les 90_ en un cuadrupolo esttica segundo y pasar a travs de un anlisis de cuadrupolo para seleccionar una m / z de cualquiera de un fragmento en particular o de los iones de los padres. La iones de transmisin son detectados por un multiplicador de electrones channeltron. Un sistema electrnico espectro se obtiene mediante el registro de la seal de iones de un fragmento en particular en funcin de la la frecuencia del lser UV. Como se describe ms detalladamente a continuacin, se mide por infrarrojos espectros de los iones atrapados biomolecular con IR-UV de doble resonancia. El ciclo de captura de los iones se repite en 20 Hz. Cambiamos el cuadrupolo analizar ya sea para transmitir el fragmento o el padre de los ciclos alternos de captura y el uso de la seal de los padres de un disparo a normalizar la seal fragmento de la siguiente, que elimina fluctuaciones a largo plazo en la fuente nanospray. 2.2. Ion generacin Poner las molculas biolgicas en la fase de gas a travs de electrospray tiene muchas ventajas para estudios espectroscpicos. Porque se producen a temperatura ambiente y en presin atmosfrica, esencialmente no hay fragmentacin. Parece no haber lmite con el tamao de las molculas que se pueden producir - que van desde los aminocidos
individuales a los virus de todo [71-73] han sido exitosamente inyecta en los espectrmetros de masas por electrospray. Porque estamos trabajando con las biomolculas cargadas y no a los neutrales, podemos seleccionar su masa y el control de sus trayectorias, lo que nos permite orientar y / o trampa ellos. Electrospray genera con cscara cerrada iones moleculares, ya sea protonadas o desprotonada, que es precisamente lo que se encuentra en solucin. La desventaja de estudiar iones biomoleculares es la densidad del nmero relativamente bajo, lo cual es una funcin tanto de la electrospray proceso en s mismo, as como los efectos de carga espacial dentro de la trampa de iones. 2.3. De enfriamiento y captura El lineal, 22 polos de trampa de iones es el elemento clave de nuestro aparato experimental, lo que permite nos para almacenar las molculas y fresco a travs de colisiones con el fro de helio. Gerlich et al. [74-76] fue pionero en el uso de trampas de fro, de iones de radiofrecuencia y las ha aplicado principalmente para estudiar la Comentarios Internacional de Qumica Fsica 485 Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 espectroscopia y cintica de la reaccin qumica de los iones pequeos de la importancia astrofsica. No hay nada particularmente especial en la eleccin de 22 polos - es simplemente importante tener un nmero suficiente de ellos para que el potencial radial efectivo se fija por un parte sustancial de la trampa de dimetro [76]. Como los iones de subir la barrera de potencial radial cuando se acercan a los polos, se someten a un movimiento oscilatorio impulsado por el campo de RF, y colisin con helio a este punto podra calentar los iones en lugar de enfriarlos. As un potencial plano radial con las paredes ms verticales deben facilitar el enfriamiento de colisiones de iones, ya que en este caso, el movimiento oscilatorio y por lo tanto las colisiones calentamiento, se limitar a una pequea fraccin del volumen de la trampa. Las desventajas de utilizar un mayor nmero de polos es que el iones, repartidas en un mayor volumen que resulta en una densidad de iones de baja en el eje de la trampa, y de acceso ptico a los iones atrapados en la direccin radial es limitado. 2.4. Interrogatorio espectroscpicas Por lo general se inyectan 10.000 iones en la trampa de 22 polos, que tiene un volumen de activos de _5 cm. Dada la densidad de iones de _2_103 cm_3, est claro que cualquier tipo de absorcin directa espectroscopia sera difcil si no imposible. Adems, esta densidad de iones est en el lmite de lo que puede ser detectado por fluorescencia inducida por lser (LIF), un problema que es agravada por la geometra desfavorable de la trampa de iones de 22 polos para la deteccin de fotones. Necesitamos por lo tanto un medio ms sensibles de deteccin espectroscpica, y para ello se utilizan photofragmentation. Despus de la excitacin UV de un cromforo aromtico en un pptido protonadas, algunos fraccin de los iones fragmento, ya que los rendimientos cunticos de fluorescencia son rara
vez la unidad. Esto puede ocurrir despus de la conversin interna a niveles de vibracin muy emocionados de la electrnica del estado fundamental o cruzando a otros estados electrnicos que son disociativos en alguna coordenada. De este modo, el uso masivo resuelto deteccin de photofragments como sensibles herramienta espectroscpica. Como se muestra esquemticamente en la figura 2a, medimos los espectros electrnicos de los iones de fro en la trampa mediante la deteccin de un determinado photofragment carga en funcin de la longitud de onda UV. Nuestro objetivo final es la medicin de los espectros infrarrojos de los iones biomoleculares, ya que tal espectros pueden proporcionar informacin sobre la conformacin de la molcula. El uso de un IR-UV doble sistema de resonancia, se ilustra esquemticamente en la figura 2b, podemos medir una IR espectro de confrmeros individuales de los iones atrapados. Para ello, despedir a un pulso de infrarrojos de una OPO 200 ns antes del pulso ultravioleta, el agotamiento de la poblacin del estado del suelo cada vez que la frecuencia infrarroja coincide con una transicin de vibracin de la molcula original. La Transicin IR es detectado como un chapuzn en la seal photofragmentation UV como el IR frecuencia se explora a travs de una banda vibracional. Para que este mtodo de trabajo, las molculas promovido a un estado vibracional excitado no debe absorber un fotn lser UV de la misma frecuencia que la de los fragmentos de suelo estatal y producir, y si lo hacen, debe ser con reduccin de la eficiencia. Debido a que las molculas de IR-excitado se caliente el interior, se observa su espectro de absorcin UV es mucho ms amplia y el pico de absorcin en el Longitud de onda de UV se reduce considerablemente, lo que lleva a una cada en el espectro IR. Si bien este enfoque de doble resonancia impone el requisito de que la molcula de inters tienen un cromforo UV, tiene la gran ventaja de que el espectro UV puede utiliza para seleccionar una conformacin particular, ya que a menudo tienen diferentes confrmeros ligeramente espectros UV diferentes que se pueden resolver si las molculas son internamente fro. Por lo tanto, el IR 486 T. R. Rizzo et al. Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010
spectra that we obtain are those of single conformations of molecule of interest, which greatly facilitates the assignment of the spectra as well as their comparison with the predictions of theory. There is one potential limitation to photofragment-based spectroscopic approaches using UV excitation. In the case where fast internal conversion after UV excitation creates a highly vibrationally excited molecule in the ground electronic state, one expects that the unimolecular dissociation rate will decrease with the increasing size of molecule to the point that it may become comparable to the rate of infrared radiation or collisional deactivation with residual helium in the trap, both of which will compete with dissociation. Thus, we expect that spectroscopic detection by single-photon photofragmentation may become more difficult with increasing molecular size, although it is not clear where this limit will be. In Section 6, we will give an example of how we are overcoming this limitation.
2.5. Computational methods Our computational approach begins with a conformational search using the AMBER force field [77] within the Macromodel package [78]. The procedure generates 50,000
Dissociation threshold Internal conversion
MH+
MH A+ + B +* MH++
Fragment ion signal
37500 37550 37600 37650
UV dissociation wavenumber/cm 1 Scan UV dissociation laser (a) Fix UV dissociation laser Scan IR laser
Dissociation threshold Internal conversion
MH+ A+ MH + B +* MH++
Fragment ion signal
3200 3300 3400 3500 3600
IR depletion wavenumber/cm
1
(b)
++
Figure 2. [Colour online] Spectroscopic schemes applied to cold biomolecular ions for measuring (a) electronic spectra of cold biomolecular ions via photofragment detection and (b) conformationspecific infrared spectra by detecting the depletion of the UV-induced photofragment signal.
International Reviews in Physical Chemistry 487

structures in the initial search but retains only those unique conformations under 50 kJ/ mol relative energy. For molecules with one or two amino acids, we re-optimise all of the structures found with Macromodel using Gaussian 03 [79] at the B3LYP/6-31G** level of theory [80,81] and carry out harmonic frequency calculations at the same level. Because more than one thousand conformations may be found in the initial search, we first calculate single-point energies of all the structures using Gaussian at the B3LYP/6-31G** level of theory, and use these energies to decide which structures merit full optimisations and frequency calculations using B3LYP/6-31G**. In addition, all of the conformations are classified according to the major degrees of freedom (number and type of hydrogen bonds, aromatic ring orientation, etc.), and representative structures of each class are also optimised. The energies we report are zero-point corrected, and harmonic frequencies are scaled by 0.954 for amino acids and 0.952 for helical peptides. 3. Spectroscopy of protonated aromatic amino acids The three aromatic amino acids, tryptophan, tyrosine and phenylalanine, are naturally occurring candidates for probe chromophores, and it is important to understand their spectroscopy and photophysics before using them in more complex molecules. Extensive work has been done on these aromatic amino acids in their neutral form [2,3,31,34, 8284], but as we are investigating closed-shell ions, one must understand the effect of the charge on the photophysics. At the same time, protonated amino acids are relatively simple systems with which to determine the degree of cooling, and hence residual thermal inhomogeneous broadening, in our cold ion trap. Finally, spectroscopic studies of protonated amino acids can be used to investigate whether IRUV double resonance can be combined with photofragment-based detection techniques. The amino acid tryptophan has clearly been the chromophore of choice for spectroscopic studies of peptides and proteins in solution since it has a strong UV absorption and relatively high fluorescence quantum yield. Much of the gas-phase work on neutral amino acids and peptides have also focussed on tryptophan as a chromophore in an effort to better understand its behaviour in solution in particular its nonexponential fluorescence decay [1012]. Despite its wide use, it is not obvious that tryptophan would be the chromophore of choice for the spectroscopic approach taken here. The requirements for a good probe chromophore for photofragmentation-based techniques represent a balance between competing factors. On the one hand, one needs non-radiative processes to occur in the excited electronic state leading to fragmentation, allowing us to detect the absorption of radiation via the appearance of fragments. Having a high fluorescence quantum yield means that the fraction of molecules in the electronically excited state that fragment will be correspondingly lower and, in this
sense, it might be an advantage to use phenylalanine, with the lowest fluorescence quantum yield, even though it has a lower oscillator strength [85]. On the other hand, if the non-radiative processes are too fast, this will tend to broaden the electronic spectrum and inhibit our ability to resolve individual conformations. Our first goal, then, was to examine the electronic spectra of the protonated amino acids tryptophan, tyrosine and phenylalanine. Given the extensive work done on neutral, gas-phase tryptophan [14], we began our studies by examining protonated tryptophan in our cold ion trap. 488 T. R. Rizzo et al.
As in all the aromatic amino acids, protonation of the isolated molecule is expected to occur on the amino group, forming an ammonium (NH 3 ) on the backbone. This is supported by relatively high level calculations [62] and as demonstrated below, is consistent with the spectrum, which is little shifted from the neutral molecule. One would expect protonation on the aromatic ring to cause a substantial shift of the electronic band origin. Figure 3 shows the photofragment excitation spectrum of TrpH in our cold ion trap obtained by collecting the fragment ions at m/z 188 (which corresponds to loss of NH3) as a function of the wavenumber of the UV laser [86]. As a first test of our new spectroscopic approach, these results were at first rather disappointing. While the broad, primary peak in the spectrum is close to that of the neutral molecule, confirming that protonation does not occur on the indole ring, its breadth suggested that the cooling in the ion trap might not be complete. The spectrum is slightly narrower than that measured by Weinkauf in a quadrupole ion trap cooled to liquid nitrogen temperature [62] as well as that measured by Talbot et al. [87] at room temperature, but is far broader than the electronic spectrum of the neutral molecule measured in a supersonic expansion [3]. This initially caused us to question the vibrational temperature of the ions in our 22-pole ion trap and led us to perform a number of diagnostics to verify the degree of cooling. The observation that we could form clusters of protonated amino acids with one or two helium atoms in the trap [68] suggested that the internal temperatures should be on the order of 15 K, assuming the binding energy of helium to a protonated amino acid is similar that that of NH 4 _ He [88]. A series of papers by Kang et al. [63, 8991] helped provide insight into the reasons for the broad TrpH spectrum. The authors used femtosecond laser pulses at 266nm to excite protonated tryptophan and tyrosine generated by electrospray but not cooled, and then probed the population of the excited state using an 800nm photon, which can excite the molecule to higher states and change the fragmentation pattern. Their results reveal drastically different excited-state lifetimes for protonated tryptophan and tyrosine.
Relative fragment ion signal 35,000 35,500 36,000 36,500 Wavenumber/cm1 347 cm1
Figure 3. [Colour online] Electronic photofragment excitation spectrum of cold TrpH obtained by collecting the fragment ions at m/z 188 as a function of the UV laser wavenumber. Adapted with permission from [86]. Copyright 2006 American Chemical Society.

The decay of the __* state in TrpH exhibits a rapid drop on a timescale of 380 fs followed by a more complicated behaviour at later times. In contrast, protonated tyrosine exhibits a simple exponential decay of 22 ps. The observation of fast excited state decay in protonated tryptophan suggested that the broad spectrum that we observed may not be the result of incomplete cooling in the ion trap but could be inherently limited by the short lifetime of the excited state. While the overall width of the main feature of TrpH (347 cm_1) would imply a much shorter lifetime than that measured by Kang et al. [63], it is likely that the spectrum contains contributions from a few stable conformers that may exhibit low frequency vibrational progressions as in the case of the neutral molecule [3]. If each spectral feature were broadened by 13 cm _1, as implied by the 380 fs lifetime measured by Kang et al. [63], it could give rise to a broad feature with an overall width on the order of what we observe. Moreover, one should note that the lifetimes determined by Kang et al. are upper limits they cannot rule out even faster excited-state decay. Thus, our ability to form weakly bound helium clusters [68], together with the time-resolved data of Kang et al. [63], suggests that the broad feature in the electronic spectrum of TrpH is
not the result of incomplete cooling but results in large measure from lifetime broadening. If this were the case, then one would expect that spectral features of the other protonated amino acids should be significantly narrower than that of TrpH. Figures 4 and 5 show electronic spectra of TyrH and PheH cooled in our 22-pole ion trap [68], both of which exhibit resolved vibronic features that reflect a significantly longer lifetime than that of protonated tryptophan, consistent with the time-resolved work of Kang et al. [63]. These well-resolved spectra can be used as a diagnostic for the internal temperatures of the molecules in our ion trap, demonstrated here for the case of PheH. As will be shown below, the two most prominent features in the spectrum, which occur at 37,530 cm_1 and 37,541 cm_1, correspond to the electronic band origins of two stable conformations of the molecule, and we label these band origins A0 0 and B00 respectively. The inset of Figure 5 shows a blow-up of the region of the spectrum to the red of these
Relative fragment ion signal 35,050 35,100 35,150 35,200 35,250 35,300 35,350 2.7 cm1 A0
0
B0 C0
0
D0
0
Wavenumber (cm1)
Figure 4. [Colour online] Electronic photofragment excitation spectrum of cold TyrH recorded by detecting the fragment at m/z 136. The labels A0 0D0 0 indicate the electronic band origins of four distinct conformers.Adapted with permission from [86]. Copyright 2006 American Chemical Society.

band origins where one would expect hot-bands of low-frequency vibrational modes to occur. One can see two features separated from A0 0 and B0 0 by approximately _43 cm _1, which is almost identical to the spacing of the first two small peaks to the high frequency side of the band origins. This suggests that protonated phenylalanine has a low frequency mode of _43 cm_1 in both the ground and excited electronic state. The intensity of the hot bands relative to the band origins gives us an estimate of the vibrational temperature of the molecule, although this requires us to assume a particular oscillator strength for the hotband transitions. If we assume that the band strength of the hot-bands, X0 1, is similar to that of its corresponding vibronic band X1 0, we arrive at a vibrational temperature between 11 and 16 K. This is consistent with the rotational temperature determined from a rough simulation of the band contours. While this might not seem particularly cold, at these internal temperatures the populations of even the lowest frequency vibrational modes do not contribute to spectral congestion in a significant way. With well-resolved electronic spectra such as those of Figures 4 and 5, we can use IRUV double resonance to further identify features corresponding to different stable conformations of the parent molecule by measuring an IR spectrum of each conformer. Figure 6 shows IRUV double-resonance spectra of PheH with the UV laser set on one of the two band origins, A0 0 or B00 , in Figure 5. It is evident that these IR spectra are different, confirming that the two features in the electronic spectrum correspond to different stable conformations of the molecule. Even before measuring an IR spectrum, the electronic spectrum of PheH suggests the presence of at least two stable conformers. The observation of two strong features near the band origin spaced by 10.6 cm _1 without a further progression of peaks at roughly the same spacing suggests that these two features are not members of a FranckCondon progression, since by their very nature such progressions rarely terminate abruptly. Calculated spectra and the corresponding structures for the two lowest-energy conformers of protonated phenylalanine are also
Relative fragment ion signal
37,500 37,550 37,600 37,650 37,700 Wavenumber (cm1)

x100
41.6 cm1 43.7 cm1 42.9 cm1 43.6 cm1
A0
0
B0
0
Figure 5. [Colour online] Electronic photofragment excitation spectrum of cold PheH recorded by detecting the fragment at m/z 74. The labels A0 0 and B0 0 indicate the electronic band origins of two distinct conformers. To the low energy side of these band origins, a blow up of the spectrum shows two low frequency hot bands that help determine the vibrational temperature.

shown in Figure 6. While the calculations do not reproduce the IR spectra exactly, they recover the important qualitative features two of the ammonium NH stretches are strongly shifted to the red, one by interaction with the benzene ring and the other through interaction with the backbone carbonyl, while the third NH stretch is relatively unperturbed. The calculated structures differ primarily by a rotation of the side-chain about the C_C_ bond. A similar treatment of TyrH reveals four rather than two conformers and a correspondingly more complex electronic spectrum. The doubling of the number of conformers in TyrH comes from the two possible positions of the phenol OH, which differ in energy by about 120 cm _1. Before moving on to larger peptides containing one of these chromophores, it is worth returning to the question of protonated tryptophan. The work of Kang et al. [89] identified the reason for the fast decay from the excited electronic state compared to PheH and TyrH it comes from a low crossing barrier from the __* state to a __* state that is dissociative in the NH coordinate. The difference between TrpH in the gas phase and tryptophan in solution is nevertheless curious, in that the latter has a significant fluorescence quantum yield, implying a substantially longer lifetime. One usually expects that excited-state lifetimes will be longer in the isolated molecule compared to solution because the possibility of quenching by the solvent is removed. We investigated this difference by producing complexes of TrpH with water in the gas phase to observe the effect of solvent in a stepwise manner [64]. Figure 7 shows the primary band in the electronic spectrum of bare protonated tryptophan together with that of the singly- and doubly-solvated species. One can clearly see a narrowing of the main band even with the addition of a single water molecule. Upon complexation with a second water molecule, the spectral features become as narrow as those of PheH and TyrH, implying a change in lifetime of up to two orders of magnitude. As has been described in detail, this dramatic
3000 3100 3200 3300 3400 3500 3600 Wavenumber (cm1) A0
0
B0
0
Figure 6. [Colour online] Infrared spectra of two conformers of cold of PheH obtained with the UV laser set on the band origins A0 0 and B0 0 in the electronic spectrum of Figure 5. Calculated spectra (B3LYP/6-31G**) are shown below the experimental spectra. The structures shown are those derived from the corresponding calculation. Adapted with permission from [67]. Copyright 2006 American Chemical Society.

change comes from shifting the __* state relative to the __* state upon solvation [64]. While the short excited state lifetime is caused by the charge on the ammonium, we have shown that it does not depend upon the charge being close to the chromophore in terms of the number of bonds, but rather by its proximity in space. This may have important implications for studies using tryptophan as a spectroscopic probe in solution when the indole ring is close to a charged group [92]. From the point of view of the development of the experimental technique, the conclusions that we can draw from these studies of protonated, aromatic amino acids are
as follows: . It is possible to cool electrosprayed ions in a 22-pole ion trap to between 11 and 16 K, which is low enough that low-frequency vibrational bands are not populated. This essentially eliminates vibrational hot-bands from the spectra. . There is a fast decay of the indole chromophore of tryptophan in the presence of a charge. This suggests that tyrosine or phenylalanine might be better suited as spectroscopic probes of charged, gas-phase peptides. . IRUV double-resonance can be combined with photofragment spectroscopy to measure conformation-specific IR spectra. We now describe the application of the same techniques to larger, more complex molecules.
34,800 35,000 35,200 35,400 Wavenumber (cm1) Wavenumber (cm1) Wavenumber (cm1) 35,150 35,200 35,250 35,300 34,800 35,000 35,200 35,400
(a) TrpH+ (b) TrpH+(H2O)1 (c) TrpH+(H2O)2

Figure 7. [Colour online] Electronic photofragment excitation spectra of TrpH with 0, 1 and 2 attached water molecules. Reprinted with permission from [64]. Copyright 2006 American Chemical Society.

espectros que se obtienen son los de la conformacin de una sola molcula de inters, que facilita en gran medida la asignacin de los espectros, as como su comparacin con los predicciones de la teora. Hay una limitacin potencial de photofragment enfoques basados en espectroscopia con excitacin UV. En el caso de que la conversin rpida interna despus de la excitacin UV crea una molcula altamente vibracionalmente excitados en el estado fundamental, se espera que el unimolecular tasa de disociacin disminuye con el aumento del tamao de la molcula a la punto que puede llegar a ser comparable a la tasa de radiacin infrarroja o colisin desactivacin con helio residual en la trampa, los cuales van a competir con la disociacin. Por lo tanto, esperamos que la deteccin espectroscpica de un solo fotn puede photofragmentation cada vez ms difcil con el aumento de tamao molecular, aunque no est claro donde esta lmite ser. En la Seccin 6, vamos a dar un ejemplo de cmo estamos superando esta limitacin. 2.5. Mtodos de clculo Nuestro mtodo de clculo comienza con una bsqueda de la conformacin con el AMBER campo de fuerza [77] dentro del paquete macromodelo [78]. El procedimiento genera 50.000 La disociacin del umbral Interno conversin MH + MH A + + B + * MH + + Fragmento de la seal de iones 37500 37550 37600 37650 UV disociacin wavenumber/cm-1 Escaneo lser UV disociacin (A) Fix UV disociacin lser Escaneo lser IR La disociacin del umbral
Interno conversin MH + A + B + MH MH + * + + Fragmento de la seal de iones 3200 3300 3400 3500 3600 IR agotamiento del nmero de onda / cm -1 (B) ++ Figura 2. [Color en lnea] espectroscpicas aplicadas a planes de iones biomoleculares fro para medir (a) espectros electrnicos de iones biomoleculares fro a travs de la deteccin y photofragment conformationspecific (b) espectros infrarrojos mediante la deteccin de la disminucin de la seal de photofragment inducidos por UV. Comentarios internacional en Fsica 487 Qumica Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 estructuras en la bsqueda inicial, pero conserva slo las conformaciones nicas de menos de 50 kJ / mol relativos de la energa. Para molculas con uno o dos aminocidos, que volver a optimizar todos los estructuras que se encuentran con macromodelo utilizando Gauss 03 [79] en el nivel B3LYP/631G ** de la teora [80,81] y llevar a cabo los clculos de armnicos de frecuencia en el mismo nivel. Porque ms de un millar de conformaciones se puede encontrar en la bsqueda inicial, en primer lugar calcular un solo punto las energas de todas las estructuras con Gauss en el B3LYP/6-31G ** nivel de la teora, y el uso de estas energas para decidir qu estructuras mrito optimizacin completa y los clculos de frecuencia usando B3LYP/6-31G **. Adems, todas las conformaciones se clasifican de acuerdo a los grados mayores de libertad (nmero y tipo de enlaces de hidrgeno, la orientacin de anillos aromticos, etc), y las estructuras representativas de cada clase tambin estn optimizados. Las energas que se informe de punto cero corregido y armnica frecuencias se ajustan en 0.954 de los aminocidos y pptidos de 0.952 helicoidal. 3. Espectroscopia de protonadas aminocidos aromticos Los tres aminocidos aromticos, triptfano, tirosina y fenilalanina, son, naturalmente, ocurren los candidatos a los cromforos de la sonda, y es importante para entender su espectroscopia y fotofsica antes de usarlos en molculas ms complejas. Extenso trabajo se ha hecho en estos aminocidos aromticos en su forma neutral [2,3,31,34, 82-84], pero como estamos investigando con cscara cerrada iones, uno debe entender el efecto de la carga en el fotofsica. Al mismo tiempo, protonadas aminocidos son relativamente simples sistemas que permitan determinar el grado de enfriamiento, y por lo tanto trmica residual homognea posible ampliacin, en nuestra trampa de iones fro. Finalmente, los estudios espectroscpicos de protonadas aminocidos se pueden utilizar para investigar si IR-UV de doble resonancia puede combinarse con tcnicas de deteccin basadas en photofragment. El aminocido triptfano ha sido claramente el cromforo de eleccin para Los estudios espectroscpicos de pptidos y protenas en solucin, ya que tiene un fuerte UV
absorcin y rendimiento de fluorescencia relativamente alto cuntica. Gran parte del trabajo en fase gaseosa neutral en aminocidos y pptidos tambin se centr en triptfano como un cromforo en un esfuerzo por entender mejor su comportamiento en la solucin - en particular, su nonexponential decaimiento de fluorescencia [10-12]. A pesar de su amplio uso, no es obvio que triptfano sera el cromforo de eleccin para el enfoque espectroscpicas tomadas aqu. Los requisitos para un cromforo sonda bueno para photofragmentation basado en tcnicas representan un equilibrio entre los factores de la competencia. Por un lado, se necesita no radiativa los procesos que se produzcan en el estado electrnico excitado que conduce a la fragmentacin, lo que nos permite detectar la absorcin de la radiacin a travs de la aparicin de fragmentos. Despus de haber un alto rendimiento cuntico de fluorescencia significa que la fraccin de molculas en el estado electrnicamente excitado ese fragmento ser proporcionalmente inferior y, en este sentido, podra ser una ventaja para el uso de fenilalanina, con el menor fluorescencia rendimiento cuntico, a pesar de que tiene una fuerza de oscilador de baja [85]. Por otro lado, si el no radiativa procesos son demasiado rpidos, lo que tender a ampliar el espectro electrnico y inhiben nuestra capacidad para resolver conformaciones individuales. Nuestro primer objetivo era, pues, a examinar los espectros electrnicos de los aminocidos protonadas triptfano, tirosina y fenilalanina. Dado el amplio trabajo realizado en el neutro, en fase gaseosa triptfano [1-4], comenzamos nuestros estudios mediante el examen de triptfano protonadas en la trampa de iones fro. 488 T. R. Rizzo et al. Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 Como en todos los aminocidos aromticos, la protonacin de la molcula aislada se espera que ocurren en el grupo amino, formando una de amonio (NH 3) en la columna vertebral. Es con el apoyo de los clculos de nivel relativamente alto [62] y como se demuestra a continuacin, se consistente con el espectro, que es un poco pasado de la molcula neutra. Uno Esperamos protonacin en el anillo aromtico para causar un cambio sustancial de la banda electrnica origen. La Figura 3 muestra el espectro de excitacin photofragment de TrpH en nuestra trampa de iones fro obtenida por la recogida de los fragmentos de iones de m / z 188 (que corresponde a la prdida de NH3), como en funcin del nmero de onda del lser UV [86]. Como primera prueba de nuestro nuevo espectroscpicas enfoque, los resultados fueron al principio ms bien decepcionante. Mientras que el pico ancho, en primaria el espectro es similar a la de la molcula neutra, lo que confirma que la protonacin no se producen en el anillo de indol, su amplitud sugiri que el enfriamiento en la trampa de iones podra no ser completa. El espectro es ligeramente ms estrecho que el medido por Weinkauf en un cuadrupolo de trampa de iones se enfra a temperatura de nitrgeno lquido [62], as como la
medida por Talbot et al. [87] a temperatura ambiente, pero es mucho ms amplio que el espectro electrnico de la molcula neutra se mide en una expansin supersnica [3]. Este principio nos hizo cuestin de la temperatura de vibracin de los iones en la trampa de iones de 22 polos y nos llev a realizar una serie de pruebas para verificar el grado de enfriamiento. La observacin de que nos podran formar grupos de protonadas aminocidos con uno o dos tomos de helio en la trampa [68] sugiere que la temperatura interna debe ser del orden de 15 K, suponiendo que el energa de enlace de helio a un cido amino protonado es similar que la de NH 4 _ El [88]. Una serie de documentos por Kang et al. [63, 89-91] ayud a dar una idea de las razones por las el espectro TrpH amplio. Los autores usaron pulsos de lser de femtosegundo en 266 nm para excitar triptfano y la tirosina protonadas generada por electrospray, pero no se enfra, y luego probaron la poblacin del estado excitado con un fotn de 800 nm, lo que puede excitar a los molcula a estados superiores y cambiar el patrn de fragmentacin. Sus resultados revelan drsticamente diferente en estado excitado vida para el triptfano y la tirosina protonada. Fragmento de seal relativa de iones 35.000 35.500 36.000 36.500 Wavenumber/cm-1 347 cm-1 Figura 3. [En lnea Color] espectro electrnico de excitacin photofragment de fro TrpH obtenidos por recoger los fragmentos de iones de m / z 188 en funcin del nmero de onda lser UV. Adaptado con permiso de [86]. Copyright 2006 Sociedad Americana de Qumica. Comentarios Internacional de Qumica Fsica 489 Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 La decadencia de la _-_ * Estado en TrpH exhibe una rpida cada en un plazo de 380 fs seguido por un comportamiento ms complicado en los ltimos tiempos. Por el contrario, la tirosina protonadas muestra un decaimiento exponencial simple de 22 ps. La observacin de la descomposicin rpida en estado excitado triptfano protonadas sugiri que el amplio espectro que hemos observado no puede ser el resultado del enfriamiento incompleta en la trampa de iones, pero podra ser inherentemente limitada por el corto tiempo de vida del estado excitado. Mientras que el ancho total de la caracterstica principal de TrpH (347 cm_1) implicara una vida til mucho ms corta que la medida por Kang et al. [63], que Es probable que el espectro contiene contribuciones de algunos conformistas estable que puede presentan las progresiones de baja frecuencia vibratoria como en el caso de la molcula neutra [3]. Si cada caracterstica espectral se ampliaron en un 13 cm_1, como se deduce de la vida fs 380 medida por Kang et al. [63], podra dar lugar a una caracterstica general con una anchura total de el orden de lo que observamos. Por otra parte, cabe sealar que el tiempo de vida determinado por
Kang et al. son los lmites superiores - que no se puede descartar an ms rpido en estado excitado decadencia. Por lo tanto, nuestra capacidad para formar grupos dbilmente helio [68], junto con los datos de tiempo resuelto de Kang et al. [63], sugiere que la funcin amplia en el espectro electrnico de TrpH es no el resultado del enfriamiento incompleto, pero la ampliacin de los resultados en gran medida de toda la vida. Si este fuera el caso, entonces uno podra esperar que las caractersticas espectrales de los otros protonadas aminocidos debe ser significativamente menor que el de TrpH. Las figuras 4 y 5 muestran los espectros electrnicos de TyrH y PheH enfra en nuestros 22 polos de iones trampa [68], los cuales presentan caractersticas resuelto vibronic que reflejan una significativamente mayor vida que la de triptfano protonadas, de conformidad con la resolucin temporal de trabajo Kang et al. [63]. Estos espectros bien resueltos se puede utilizar como un diagnstico para el mercado interior temperaturas de las molculas en nuestra trampa de iones, ha demostrado aqu en el caso de PheH. Como se ver ms adelante, las dos caractersticas ms importantes en el espectro, que se producen en 37.530 y 37.541 cm_1 cm_1, corresponden a los orgenes de la banda electrnica de dos estables conformaciones de la molcula, y la etiqueta de estos orgenes banda A0 0 y B00 , respectivamente. El recuadro de la Figura 5 se muestra un blow-up de la regin del espectro hacia el rojo de estos Fragmento de seal relativa de iones 35.050 35.100 35.150 35.200 35.250 35.300 35.350 2,7 cm-1 A0 0 B0 C0 0 D0 0 Nmero de onda (cm-1) Figura 4. [En lnea Color] espectro electrnico de excitacin photofragment de fro TyrH registrados por detectar el fragmento de m / z 136. Las etiquetas A0 0-D0 0 indican los orgenes de la banda electrnica de cuatro distintas conformers.Adapted con permiso de [86]. Copyright 2006 Sociedad Americana de Qumica. 490 T. R. Rizzo et al. Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 orgenes la banda donde se podra esperar en caliente bandas de baja frecuencia para los modos de vibracin ocurrir. Uno puede ver dos caractersticas separadas de A0 0 y B0
0 en aproximadamente _43 cm_1, que es casi idntica a la separacin de los dos primeros picos pequeos a la alta frecuencia lado de los orgenes de la banda. Esto sugiere que la fenilalanina protonadas tiene una frecuencia baja modo de _43 cm_1 tanto en el suelo y el estado electrnico excitado. La intensidad del calor bandas en relacin con los orgenes de banda nos da una estimacin de la temperatura de vibracin de la molcula, aunque esto nos obliga a asumir una fuerza particular para el oscilador hotband transiciones. Si asumimos que la fuerza de la banda de las bandas en caliente, X0 1, es similar a la de su correspondiente banda X1 vibronic 0, se llega a una temperatura de vibracin entre 11 y 16 K. Esto es consistente con la temperatura de rotacin determina a partir de un duro simulacin de los contornos de la banda. Aunque esto puede no parecer particularmente fro, en estos la temperatura interna de las poblaciones de incluso los modos de menor frecuencia de vibracin se no contribuyen a la congestin del espectro de una manera significativa. Con los espectros bien resueltos electrnicos, tales como las de las figuras 4 y 5, se puede utilizar IR-UV de doble resonancia para determinar con ms precisin las caractersticas correspondientes a las distintas estable conformaciones de la molcula mediante la medicin de un espectro IR de cada conformacin. La figura 6 muestra IR-UV de doble resonancia espectros de PheH con el lser UV encuentra en una de los dos orgenes de la banda, A0 0 o B00 , En la Figura 5. Es evidente que estos espectros IR se diferentes, lo que confirma que las dos caractersticas en el espectro electrnico corresponden a diferentes conformaciones estables de la molcula. Incluso antes de la medicin de un espectro de IR, el espectro electrnico de PheH sugiere la presencia de al menos dos confrmeros estables. La observacin de dos caractersticas fuertes cerca de la banda de origen separados por 10,6 cm_1 sin progresin de los picos en aproximadamente la misma distancia sugiere que estas dos caractersticas que no son miembros de una progresin de Franck-Condon, ya que por su naturaleza, muy progresiones rara vez terminado abruptamente. Espectros calculados y la correspondiente estructuras de los dos confrmeros de menor energa de la fenilalanina protonadas tambin Fragmento de seal relativa de iones 37.500 37.550 37.600 37.650 37.700 Nmero de onda (cm-1) x100 41,6 cm-1 43,7 cm-1 42,9 cm-1 43,6 cm-1 A0 0 B0 0
Figura 5. [En lnea Color] espectro electrnico de excitacin photofragment de fro PheH registrados por detectar el fragmento de m / z 74. Las etiquetas A0 0 y B0 0 indican los orgenes de la banda electrnica de dos confrmeros distintos. Para el lado de baja energa de estos orgenes la banda, un golpe arriba del espectro muestra dos bandas de frecuencia baja caliente que ayudan a determinar la temperatura de vibracin. Comentarios Internacional de Qumica Fsica 491 Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 muestra en la Figura 6. Mientras que los clculos no se reproducen los espectros IR exactamente, recuperar las caractersticas cualitativas importantes - dos de los tramos de amonio NH fuertemente desplazado hacia el rojo, uno por la interaccin con el anillo de benceno y la otra a travs de interaccin con el carbonilo columna vertebral, mientras que el tercer tramo de NH es relativamente imperturbable. Las estructuras calculadas difieren principalmente por una rotacin de la cadena lateral sobre el vnculo C_-C_. Un tratamiento similar de TyrH revela cuatro en lugar de dos confrmeros y un espectro electrnico correspondientemente ms complejas. La duplicacin del nmero de confrmeros en TyrH proviene de las dos posiciones posibles de la OH fenol, que difieren en la energa de unos 120 cm_1. Antes de pasar a los grandes pptidos que contienen uno de estos cromforos, vale la pena Volviendo a la pregunta de triptfano protonada. La obra de Kang et al. [89] identific la razn de la descomposicin rpida del estado electrnico excitado en comparacin con PheH y TyrH - se trata de una barrera de baja cruce de la _-_ * Estado a una _-_ * estado que se disociativos en la coordinacin de NH. La diferencia entre TrpH en la fase gaseosa y triptfano en la solucin es, sin embargo curioso, en que este ltimo tiene un impacto significativo rendimiento cuntico de fluorescencia, lo que implica una vida mucho ms tiempo. Por lo general se espera que que en estado excitado vida ser ms larga de la molcula aislada en comparacin con solucin porque la posibilidad de extincin por el disolvente se ha eliminado. Hemos investigado esta diferencia mediante la produccin de los complejos de TrpH con agua en la fase gaseosa para observar el efecto del disolvente en una forma gradual [64]. La figura 7 muestra la banda principal en el espectro electrnico de triptfano protonadas desnudo junto a la de los mono-y doblemente solvatados especies. Uno puede ver claramente un estrechamiento de la banda principal, incluso con la Adems de una sola molcula de agua. Tras la formacin de complejos con una molcula de agua en segundo lugar, la caractersticas espectrales a ser tan estrechas como las de PheH y TyrH, lo que implica un cambio en la vida til de hasta dos rdenes de magnitud. Como se ha descrito en detalle, esta espectacular 3000 3100 3200 3300 3400 3500 3600 Nmero de onda (cm-1) A0 0
B0 0 Figura 6. [Color en lnea] infrarrojos espectros de dos confrmeros de fro de PheH obtenidos con el Lser UV conjunto sobre los orgenes de banda A0 0 y B0 0 en el espectro electrnico de la figura 5. Espectros calculados (B3LYP/6-31G **) A continuacin se muestran los espectros experimentales. Las estructuras se muestran son las derivados de los clculos correspondientes. Adaptado con permiso de [67]. Copyright 2006 American Chemical Society. 492 T. R. Rizzo et al. Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 el cambio viene de cambiar el _-_ * Estado en relacin con el _-_ * en estado de solvatacin [64]. Mientras que el corto tiempo de vida del estado excitado es causada por la carga de amonio, hemos demostrado que no depende de la carga de estar cerca de los cromforos en trminos de el nmero de enlaces, sino ms bien por su proximidad en el espacio. Esto puede tener importantes implicaciones para los estudios de uso de triptfano como sonda espectroscpica en una solucin cuando el anillo de indol est cerca de un grupo encargado de [92]. Desde el punto de vista del desarrollo de la tcnica experimental, la conclusiones que podemos extraer de estos estudios de los cidos protonados, aminocidos aromticos son de la siguiente manera: . Es posible enfriar los iones electrosprayed en una trampa de iones de 22 polos de entre 11 y 16 K, que es suficientemente bajo para que las bandas de baja frecuencia de vibracin no son pobladas. Esto esencialmente elimina la vibracin en caliente las bandas de los espectros. . Hay un decaimiento rpido del cromforo indol de triptfano en la presencia de un de carga. Esto sugiere que la tirosina o fenilalanina podra ser ms adecuada como sondas espectroscpicas de carga, en fase gaseosa pptidos. . IR-UV de doble resonancia puede ser combinada con la espectrometra de photofragment medida de la conformacin especfica de los espectros IR. Ahora describir la aplicacin de las mismas tcnicas para grandes, ms complejos molculas. 34.800 35.000 35.200 35.400 Nmero de onda (cm-1) Nmero de onda (cm-1) Nmero de onda (cm-1) 35.150 35.200 35.250 35.300 34.800 35.000 35.200 35.400 (A) TrpH + (B) TrpH + (H2O) 1 (C) TrpH + (H2O) 2 Figura 7. [Color en lnea] electrnica photofragment espectros de excitacin de TrpH con 0, 1 y2 las molculas de agua adjunto. Reproducido con permiso del [64]. Copyright 2006 American Chemical La sociedad.
Comentarios Internacional de Qumica Fsica 493 Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010
4. The scaling of spectral complexity with increasing molecular size The electronic spectra of the protonated amino acids TyrH and PheH, while complex compared to those of small molecules typically studied by gas-phase spectroscopy, are still rather simple in that the region near the vibronic band origin is well-resolved, allowing the selection of individual conformers for measuring conformer-specific IR spectra. If one applies these techniques to molecules of increasing size, the question arises as to whether the electronic spectra will be too complex to resolve individual features. Consider the factors that could potentially contribute to the complexity of the electronic spectrum of a large molecule: (1) thermal inhomogeneous broadening; (2) spectral broadening from short excited state lifetimes; (3) a large number of FranckCondon active low-frequency vibrations; (4) conformational heterogeneity. We have demonstrated that for protonated amino acids we can eliminate thermal inhomogeneous broadening through collisions with cold helium in an ion trap and that the cooling process is complete within the first 57 ms, after which the spectra no longer change [68]. Given that a significant number of cooling collisions continue to occur over the first 3040 ms, it seems that the trap still has considerable unused cooling capacity. Moreover, while larger molecules contain more internal energy, the collision cross section (and hence the collision rate) with cold helium in the trap also increases, as does the number of low frequency modes through which it is easy to lose vibrational energy. Thus for fixed helium density the ultimate temperature achieved should only increase slowly with increasing molecular size. The second factor is related the specific dynamics of the probe chromophore. We have shown that the indole chromophore of tryptophan exhibits fast excited-state decay and broadened spectra when in proximity to a charged group. While this will remain a problem, we can simply choose to use other chromophores, such as tyrosine or phenylalanine, when this factor becomes limiting. The third factor may be an important one. The number of vibrational modes increases rapidly with the number of amino acid residues in a peptide. The question that we need to address is how many of these modes will have strong FranckCondon activity, particularly those of low frequency that could give rise to vibrational progressions near the band origin that will prevent the resolution of individual conformers. There is some reason to believe that not all modes will appear in the spectrum. The vibrational modes that have strong FranckCondon factors will be those for which the bond lengths and angles associated with the vibrational motion change in geometry upon excitation to the excited electronic state. Because we are using the aromatic side chains of amino acids as chromophores, one expects that most of the change in electron density in the excited state will be centred around these chromophores, and thus those bond lengths and angles near to or associated with the aromatic moiety are the ones most likely to change. Thus vibrational modes involving coordinates remote from the chromophore are unlikely to feel the change in electronic excitation and hence may not appear as a vibrational progression in the electronic spectrum. The last factor that one has to consider is conformational heterogeneity that is, the fact that as molecules become larger the number of possible stable 494 T. R. Rizzo et al.
conformations increases. As we cool molecules and freeze out different conformations in our ion trap, the electronic spectrum of the molecule may be extremely congested, since the precise frequency of the vibronic band origin depends upon the conformation. There is little we can argue on this point in terms of a priori expectations we are simply left to try the experiment and observe the degree of complexity. Ultimately we can reduce the number of stable conformations in our ion trap by pre-selecting the ions according to their mobility in a helium buffer gas before we trap them. This work is currently being pursued in our laboratory. To test the degree of spectral complexity in a series of molecules of increasing size, we chose peptides containing a single tyrosine chromophore and increasing numbers of alanine residues. The electronic spectra of this series of molecules are shown in Figure 8.
As one can see from this progression, although the number of vibrational modes of the molecules increases by more than a factor of three, the electronic spectrum does not become significantly more complex, and the vibrational band origin seems to remain well resolved. We can draw several conclusions from this simple series of spectra, although one must be careful about generalising them. First, while there is increasing complexity with increasing size, it seems in this case not to be monotonic, and the number of Franck Condon active vibrational modes does not seem to track the total number of vibrational modes directly. Second, the fact that the band origin remains well resolved seems to reflect the lack of extremely low frequency modes that couple to the electronic transition. While such modes certainly exist, they would have to involve the overall motion of the peptide backbone in such a way as to change the interaction with the chromophore upon vibration. The relative sparsity of the spectrum in the first 20 cm _1 after the electronic band origin may simply mean that the lowest frequency modes do not couple to the chromophore. Finally, the simplicity of the spectrum near the band origin also implies that there are not large numbers of different stable conformers present in the ion trap. While infrared spectra of TyrH revealed that four conformers contributed to the electronic spectrum [67], the electronic spectrum of HAlaTyr appears simpler, and we believe that this is due to a reduced number of stable conformations [66]. Because the molecule is more flexible, the protonated ammonium group can more easily be in contact with the aromatic ring of the tyrosine and maximise this stabilising interaction. A conformer-selected infrared spectrum of this dipeptide is shown in Figure 9, together with a calculated spectrum and the conformation giving rise to it. The close proximity of the ammonium group to the aromatic ring, which is not possible in the bare amino acid, verifies the importance of the cation_ interaction in stabilising certain conformations. Even for the larger members of this series, the band origin does not seem to be overly congested by the presence of a large number of conformers. Whether this behaviour can be generalised to molecules of even larger size remains to be seen, but the results presented above suggests that our spectroscopic techniques can be applied to molecules at least the size of pentapeptides. 5. Spectroscopy of helical peptides Having demonstrated that our experimental approach can generate well-resolved electronic and vibrational spectra of small peptides, we now show the results of International Reviews in Physical Chemistry 495
applying the same techniques to a series of molecules that we expect to be helical in the gas phase [65,69,93]. The goal of this study was to identify spectroscopic signatures of helices and to test the ability of theory to predict them. The basis of this work comes from the ion mobility studies of Jarrold et al. [94,95], who examined a series of alanine-containing peptides, Ac-(Ala)n-LysH, Ac-LysH-(Ala)n,
35,050 35,100 35,150 35,200 35,250 Wavenumber (cm1) 34,500 34,550 34,600 34,650 34,700 Wavenumber (cm1) 35,850 35,900 35,950 36,000 36,050 Wavenumber (cm1) 35,050 35,100 35,150 35,200 35,250 Wavenumber (cm1)
(a) TyrH+ (b) H+AlaTyr (c) H+AlaAlaTyr (d) H+AlaAlaTyrAlaAla
Figure 8. [Colour online] Electronic photofragment excitation spectra of a series of tyrosinecontaining peptides; (a) TyrH; (b) HAlaTyr; (c) HAlaAlaTyr; (d) HAlaAlaTyrAlaAla.

and (Ala)nH, as a function of the number of alanine residues, n. By measuring the relative drift times through helium, they determine the average cross section of each of these species, and in comparison with molecular dynamics calculations they can detect the difference between helical and non-helical structures. With the N-terminus protected they find that helix formation occurs only when the lysine is at the C-terminus. Putting it at the N-terminus or eliminating it altogether gives rise to non-helical structures. The protonated side-chain of the lysine plays two roles: it is involved in hydrogen bonding with three carbonyl groups on the backbone in such a way as to induce helix formation, and it stabilises the helical structure through a favourable electrostatic interaction with the helix
macro-dipole. For us to measure conformer-specific IR spectra of these alanine-based peptides we need to introduce a UV chromophore in a way that does not interfere with the formation of secondary structure, and we do this by substituting a phenylalanine for the N-terminal alanine reside. Figure 10 shows the electronic spectrum of two such peptides with lysine at the C-terminus: Ac-Phe-(Ala)5-LysH and Ac-Phe-(Ala)10-LysH, which according to the ion mobility studies should form a helix [95], and one with lysine at the N-terminus, Ac-LysH-Phe-(Ala)10, which should not form a helix. The first thing to notice is the relative simplicity of the UV spectra in all cases. Despite the fact that these are larger than the tyrosine-containing peptides shown in Figure 8, the electronic spectra seem, if anything, even simpler. It is clear that at most a small fraction of the low-frequency vibrational modes carry strong FranckCondon activity. Figure 11 shows conformer-specific infrared spectra obtained by setting the UV laser at a particular band in the electronic spectrum and detecting the dips while scanning the IR OPO. The spectra of Figure 11a and b result from monitoring the two major features,
3000 3200 3400 3600 0 10 20 30 Wavenumber (cm1) Percent depletion
Phenol OH amide NH Free ammonium NH Bound ammonium NH Caboxyllic acid OH
Figure 9. [Colour online] Conformer-specific IR spectrum of HAlaTyr recorded with the UV laser set to the electronic band origin at 34525.2 cm _1 together with the calculated spectrum (B3LYP/ 6-31G**) and corresponding molecular structure for the lowest energy conformer.

marked A and B in Figure 10a, for Ac-Phe-(Ala)5-LysH; Figure 11c is recorded with the UV laser frequency fixed on peak A in Figure 10b for Ac-Phe-(Ala)10-LysH, and Figure 11d is obtained with the UV frequency set on the major peak in the spectrum of Ac-LysH-Phe-(Ala)10 shown in Figure 10c. There are several important features to notice in the infrared spectra of Figure 11a and b. First, the simple fact that these spectra are different indicates that the features in the electronic spectra used to obtain them correspond to different stable conformers. One can thus distinguish conformers relatively easily using such IR spectra, even in molecules of this size.
Fragment depletion 3200 3300 3400 3500 3600 Wavenumber (cm1) (b) (a) (c) (d)
Figure 11. [Colour online] Infrared spectra of (a) conformer A of Ac-Phe-(Ala)5-Lys-H, (b) conformer B of Ac-Phe-(Ala)5-Lys-H, (c) conformer A of Ac-Phe-(Ala)10-Lys-H and (d) Ac-LysH-Phe-(Ala)10.
Relative fragmentation yield 37,500 37,550 37,600 Wavenumber (cm1) (a) (b) (c) AB A CD B
Figure 10. [Colour online] Electronic photofragment excitation spectra of (a) Ac-Phe-(Ala)5-LysH, (b) Ac-Phe-(Ala)10-Lys-H, and (c) Ac-LysH-Phe-(Ala)10. The labels in (a) and (b) denote band origins of different conformers.

The peak near 3575 cm_1 can be assigned to the free carboxylic OH stretch of the lysine at the C-terminus. The presence of a free OH stretch band is already evidence that the molecule may be helical, since if it were to adopt a globular structure, it is likely that the carboxylic OH would find itself in a hydrogen-bonding interaction that would shift the corresponding band to lower wavenumber by an amount depending upon the strength of the interaction. The bands in the region 33003500 cm_1 arise from amide NH stretch vibrations. The appearance of seven bands in this region is consistent with fact that there are seven amide stretches and indicates that we are able to see all of them. These bands vary in both their position and their width those shifted further to the red seem to be broader. The narrowest bands are only 2 cm _1 in width (before deconvolution of the OPO linewidth, which is _1cm_1), while the wider amide bands approach 6 cm _1. If the molecule is indeed helical, the narrow, higher frequency amide NH stretch bands are likely to be those that reside at the ends of the molecule and which do not participate in hydrogen bonding along the helix axis, whereas the red-shifted bands should come from the NH residues in the middle of the helix. This is confirmed by the observation that adding five additional alanines results in additional features in this red-shifted region, as shown in the IR spectrum of Ac-Phe-(Ala)10-LysH (Figure 11c). Notice also that this larger molecule still exhibits a free carboxylic acid OH stretch band, consistent with a helical structure. The three ammonium NH bands are shifted much further to the red of the spectrum shown here and are broadened by their strong interaction with the carbonyls; we typically observe them in the region of 30003200 cm_1. The infrared spectrum of Ac-LysH-Phe-(Ala)10 shown in Figure 11d, while not entirely different from that of the molecules that we expect to be helical, exhibits some important differences. The free carboxylic OH stretch band is missing, and a new broad band appears near 3270 cm _1, which we interpret to be a strongly hydrogen-bonded carboxylic acid OH stretch. The amide NH stretch bands in this molecule appear in the same general region of those for the previous molecules and in themselves do not allow us to distinguish between a helical and non-helical structure. However, the strong shift of the OH stretch suggests a completely different structure, since it would be difficult to construct a helix with the carboxylic OH involved in a strong hydrogen bonding interaction. Up to this point, our interpretation of the infrared spectra of these alanine-containing peptides has been based largely on spectroscopic intuition. To be able to connect the spectra we observe to the structure of the molecule, we need to compare the positions of the spectral bands with the results of calculations. We concentrate here on the smaller of the two helical peptides, Ac-Phe-(Ala)5-LysH, since it is more tractable theoretically. Figure 12 shows measured spectra of four different conformers of Ac-Phe-(Ala)5LysH together with calculated spectra for four of the lowest energy conformers of this molecule at the B3LYP/6-31G** level. The vibrational bands in the calculated spectra are labelled to indicate which amino acid residue they are associated with. While an attempt has been made to compare the spectrum of each conformer with the correct calculation, this can be somewhat arbitrary, since the measured spectra do not automatically come with assignments as do the calculated spectra. When there are peaks spaced on the order of the expected accuracy of the calculations, which is the case International Reviews in Physical Chemistry 499
here, there is no guarantee that the peaks we measure are ordered in the same way as the calculations. In this case a simple resemblance between the measured and calculated spectra is not sufficient to associate the calculations with the measurement and assign a structure to the conformer. The problem of assigning the measured vibrational bands to the correct amide stretches can be resolved by systematic isotopic substitution of the amide nitrogen on the different residues of the peptide. In a simple diatomic description of an amide NH stretch, substituting nitrogen-15 for nitrogen-14 would lower the NH stretch frequency by approximately 8 cm_1. Figure 13 shows the spectrum of conformer B of Ac-Phe-(Ala)5LysH without isotopic substitution together with the spectra with substitutions at the 2, 4 and 6 positions, counting from the N-terminus. Although we substituted only three of the seven amide nitrogens, we have measured the shifts in the spectrum of each of the four conformers, and we find that the calculated spectra do remarkably well in assigning the
various vibrational bands. Of the twelve shifted bands (i.e., three in each of the four conformers), in only one case did the calculated spectrum lead to a wrong assignment, and
3300 3350 3400 3450 Wavenumber (cm1) Fragment depletion Ala2 Ala4 Ala5 Ala6 Ala3 Phe1 Lys7 Ala3 Ala4 Ala5 Ala6 PheLys 1 7 Ala2 (a) (b) Ala3 Ala5Ala6 Ala4 Phe1 Lys7 Ala2 (c) (d) Ala3 Ala5 Ala6 Ala4 Lys7 Phe1 Ala2 6.8 kJ/mol 2.6 kJ/mol 0.0 kJ/mol 4.2 kJ/mol
Figure 12. [Colour online] Comparison between experimental and calculated infrared spectra for conformers A-D of Ac-Phe-(Ala)5-Lys-H respectively in the amide NH stretch region. The bestmatching calculated spectra are presented directly under each experimental spectrum together with the assignments of each peak to a specific amino acid residue.

this was the reversal of Phe1 and Ala2 in conformer C (Figure 12c), which are less than 6 cm_1 apart. Overall, the verification of the calculated spectral assignments by isotopic substitution gives us confidence in attributing a particular spectrum to a specific, calculated conformer, as we have done in Figure 12. Assuming that the comparison between the observed and calculated spectra is sufficient to allow us to assign the geometry of the conformer, we can gain insight into the interactions giving rise to a particular spectral signature. We have identified four conformers in total from the electronic spectra of Figure 10a, which we label AD, all of which are helical, as shown in Figure 14. These conformers fall into two groups A and B have a very similar conformation (and IR spectrum) and differ mostly by the orientation of the phenylalanine side chain, and C and D, which differ from each other in the same way. The two groups differ from each other by the hydrogen-bonding pattern of the backbone. Beside each pair of conformers in Figure 14, we show schematically the connectivity of the hydrogen bonds implied by each structure. As one can see, the difference between the two groups of structures is the tightness of the coil in A and B there is a series of interactions of the type C10C10C10C13 while in C and D it appears to be C10C10C13 C13. The difference between the two is simply the placement of one of the hydrogen bonds, which in the case of C and D raps the helix a bit tighter. These hydrogen-bonding patterns allow us to rationalise some of the overall features of the infrared spectra. Indeed as we speculated earlier, the calculated geometries seem to confirm that the highest frequency NH stretch bands belong to terminal amino acid Fragment
depletion 3250 3300 3350 3400 3450 Wavenumber (cm1)
15N-Ala2 15N-Ala4 15N-Ala6 14N
Figure 13. [Colour online] Conformer-specific IR spectra of Ac-Phe-(Ala)5-Lys-H with nitrogen-15 substitution at specific amino acid residues, numbered from the N-terminus. The unsubstituted
peptide spectrum is shown at the top, with the singly substituted peptides shown underneath. The shifted peaks are circled, while a dashed line shows the position of those transitions in the unsubstituted peptide.

residues that are not directly involved in the hydrogen bonding network associated with the helical backbone; namely the lysine, the phenylalanine and the first alanine from the N-terminus. The remaining amide NH bands are significantly red-shifted, although not all to the same degree. The difference between them is likely to reflect details in the CONH distance, the alignment of the CO and NH within the hydrogen bond and perhaps effects of cooperativity among hydrogen bonds along the helical axis. We can also see that in a helical configuration the C-terminal OH seems not to be involved in any strong hydrogen bonding interactions and should produce a free OH stretch band, which is consistent with the measured spectra. We can also get some qualitative information about the relative energies of the different conformers. The relative intensities of the different conformer band origins in the electronic spectrum of Figure 10a carry some information on the relative energies of the conformers, but one must be careful in making a direct correlation. The intensities depend both on the conformer population and the oscillator strength for the UV transitions, and the latter can differ from one conformer to the next. Even if the band origins of different conformers were to have the same oscillator strengths, it is unlikely that the relative conformer populations (as determined by the intensities) would be related to the relative energies of the conformers in a simple way. As the molecules cool by collisions with cold helium, some will get trapped in local potential wells with barriers that divide one conformer well from another. The relative conformer populations will thus depend more on the height of the barriers to interconversion and the collisional cooling rate than on their relative energies. If this were not the case, all four conformers
Figure 14. Calculated structures for conformers AD of Ac-Phe-(Ala)5-Lys-H with the relative zero-point-corrected energies in kilojoules per mole indicated. The hydrogen bonding schemes for each pair of conformers is shown to the right.

would have to be extremely close in energy to have appreciable populations at a temperature of 15 K. Despite the lack of quantitative connection between the spectral intensities for the different conformers (and hence their populations) and the conformer energy, we can deduce the relative energy ordering, since the lower energy conformers should be more highly populated. Barring any dramatic difference in oscillator strength for the relative band origins, the electronic spectrum of Figure 10a would predict that conformers A and B are the lowest in energy followed by C and D. This is different than our calculations, which predicts energies of 6.8, 2.6, 4.2, and 0 kJ/mol for conformers AD, respectively (Figure 12). A detailed systematic study of computational methods is needed to resolve this discrepancy between theory and experiment. It seems clear that conformer-specific infrared spectra are able to distinguish the two classes of conformers A and B compared to C and D. This is enabled largely by the high resolution afforded by the cooling in our ion trap since much of this structure would be hidden in room temperature spectra. While the comparison here between experiment and theory is far from perfect, the high-resolution spectra that can be obtained using this approach provide an important benchmark for theory, particularly since the complicating effects of solvent are eliminated. 6. Toward still larger molecules We have demonstrated the ability to measure highly resolved infrared spectra of small gas-phase peptides, which provide a benchmark for theoretical calculations. Even though high-resolution spectra of molecules of this size may push the limits of theory, there are reasons for us to want to apply these techniques to still larger molecules. Peptides of up to 1012 amino-acids described above are at the lower limit of what is required to fully develop secondary structure moving to still larger molecules would perhaps further stabilise such structural features and allow us to observe elements of tertiary structure such as interacting helices. Moreover, it is more likely that larger molecules will retain something that resembles their condensed-phase structure in the gas phase since the accumulation of many non-covalent interactions will make a considerable contribution to the overall stabilisation energy. Our ultimate goal is to be able to extract useful
structural information, even if it is only qualitative, on naturally occurring peptides and proteins. The first question that arises is whether the spectra of still larger molecules will be simple enough to extract any information. The UV spectrum of Ac-Phe-(Ala)10-LysH, the largest of the molecules discussed above, is uncongested and allows us to measure conformer-specific IR spectra without difficulty. While not fully resolved under the conditions that we employ, these IR spectra could be further resolved with improvements in our IR laser resolution. As we move to larger molecules, at some point a large distribution of stable conformers, which we have not observed until now, might become the major source of spectral congestion. Once conformational heterogeneity becomes the limiting factor, combining our techniques with other experimental methods, such as ion mobility, might help reduce the problem. For the moment, our goal is to explore the limits of our current techniques. International Reviews in Physical Chemistry 503
Putting aside for the moment questions of spectral complexity, if we wish to push these techniques to still larger molecules, there are two questions that must be addressed from an experimental point of view: . Will we be able to dissociate larger molecules with a single UV photon for photofragment-based detection? . Will infrared depletion spectroscopy work on larger molecules? We present here some of our most recent experimental developments that allow us to address these questions [70]. The use of spectroscopic techniques based on UV photofragmentation requires that the molecules initially promoted to an excited electronic state will dissociate on a short enough timescale compared to competing processes. If the molecules dissociate directly from an excited electronic state, the process is typically fast, and the lifetime should not scale with molecular size. In this case, the techniques described above might work perfectly well on larger molecules. However, if the dissociation occurs first by internal conversion to the ground electronic state followed by statistical vibrational energy redistribution and unimolecular dissociation, the lifetime of the molecule could scale strongly with the number of vibrational modes. If this were the case, processes that compete with unimolecular dissociation, such as collisional relaxation by residual helium in the ion trap or infrared fluorescence, might reduce the fraction of molecules that dissociate, rendering photofragment spectroscopy of large species difficult if not impossible. In the experiments described thus far, the cadence of the experiment was determined by the laser repetition rate. The trapping cycle is repeated every 50 ms, and depending upon the specific experiment, the lasers operate at either 10 or 20 Hz. During a typical trapping cycle, the molecules cool in collisions with helium during the first 10 ms, and then we leave up to 30 ms for the helium to be pumped away. Since we excite the molecules with a UV laser pulse 40 ms into the trapping cycle, this leaves at most 10 ms for them to dissociate. To extend this time, we could run the lasers and the trapping cycle at half the repetition rate or less, and this would allow up to 100 ms for the molecules to dissociate, albeit at the expense of the duty cycle of the experiment. Unfortunately, on this timescale, radiative cooling can become significant and may compete with dissociation. To deal with this problem we apply a technique similar to one we used in the past for photofragment spectroscopy of weak vibrational overtone transitions, which we called infrared laser-assisted photofragment spectroscopy (IRLAPS) [9698]. The basic idea as applied to the current experiments is illustrated in Figure 15 [70]. Suppose that after UV excitation of a large, gas-phase peptide, unimolecular dissociation is slow, and only a small fraction of the molecules produce fragments in the time before the trap is emptied. By introducing a CO2 laser pulse subsequent to the UV pulse, we can induce infrared multiphoton excitation of the pre-excited peptide molecules, increasing their vibrational energy and hence their dissociation rate. This should cause a significantly larger fraction of molecules to dissociate during the fixed time before the trap is emptied. For this approach to work, the CO2 laser pulse must selectively excite only those molecules that are first promoted to the excited electronic state and not those that remain in the ground electronic state. If this is achieved, an electronic spectrum can be recorded in the same way as before by observing the fragment ion signal as a function of the UV laser frequency. There are two factors that may allow us to selectively dissociate only those 504 T. R. Rizzo et al.
molecules that have first undergone UV pre-excitation, similar to the situation in our previous work on small, vibrationally-excited polyatomic molecules [96,97]. First, since the pre-excited molecules already have on the order of 37000 cm _1 of internal energy, they need to absorb fewer photons from the CO2 laser (compared to those not receiving the UV excitation) to reach an energy at which the dissociation rate becomes sufficiently fast. We can therefore use the CO2 laser fluence as a parameter to discriminate against dissociating unexcited molecules, since at sufficiently low fluence they will not gain enough energy. The second factor relates to the CO2 laser frequency used. Because the ions in our trap are cold, their infrared absorption in the CO2 laser region should be sharp, whereas those that have first been excited with the UV laser and undergone internal conversion are internally warm. If we tune the CO2 laser away from a resonant frequency of the cold, ground state molecules, excitation of these molecules by the CO 2 laser alone should be inefficient, while the internally warm pre-excited molecules should have broad infrared absorption and be preferentially pumped by the CO2 laser. As a demonstration of this technique, we show in Figure 16 electronic photofragment excitation spectra of a seventeen amino acid peptide, Ac-Phe-(Ala)7-LysH-(Pro)2-(Ala)5Lys H, obtained with only the UV excitation laser and with the addition of the CO2 laser [70]. In the former case we observe less that one fragment ion per laser pulse, even on the strongest peaks, but as shown in the figure, this increases by over two orders of magnitude when assisted by the CO2 laser. Having demonstrated the effectiveness of this approach for electronic spectroscopy, we now consider whether we can use it to measure conformer-selective infrared spectra. In this case, an IR spectroscopic laser would precede the UV laser in the same way as for the smaller systems described above, and the infrared absorption would be detected as a dip on the fragment ion signal. There are two questions related to the successful implementation of this approach that need to be addressed. First, can the CO2 laser dissociate selectively only those molecules promoted to the excited electronic state and not those first excited with infrared radiation? After absorption of the IR photon for the spectroscopic
S0 S1
D0 MH+ *MH+ MH+ A + B+ A + B+ UV
Fast Slow
IRMPE
Figure 15. [Colour online] Excitation scheme for the application of IRLAPS for measuring the electronic spectrum of large, protonated biomolecular ions.

excitation, the molecule becomes internally warm, and the absorption spectrum in the region of the CO2 laser will no longer be sharp. This simply leaves the possibility to discriminate only on the basis of the CO2 laser fluence and not its frequency. The second question is whether in such a large molecule the infrared absorption will cause a dip in the UV-induced fragmentation. As the molecule becomes larger with more vibrational modes, the degree of internal warming caused by the IR excitation and the accompanying spectral broadening responsible for the dip in the UV spectrum, should decrease. Figure 17 shows two infrared spectra of the seventeen amino acid peptide Ac-Phe(Ala)7-LysH-(Pro)2-(Ala)5-Lys H recorded with the UV laser set on the peaks labelled A and B in the electronic spectrum of Figure 16 [70]. The degree of depletion achieved by the IR spectroscopic laser is as much as 62%, which clearly indicates that the CO 2 laser can selectively dissociate the electronically excited molecules. Moreover for a molecule this size, adding on the order of 3400 cm _1 of vibrational excitation is still sufficient to broaden and shift the electronic spectrum to result in a dip at the UV probe frequency, allowing us to measure an infrared spectrum. Although these spectra are not completely resolved, one can clearly see that they are distinctly different, indicating that the features in the UV spectrum arise from different stable conformers. The application of IRLAPS to UV photofragment spectroscopy of larger biological molecules is still in its infancy and there are many questions about the mechanism that still need to be addressed. While we expected that dissociation of UV-excited ions would normally proceed on the ground electronic potential energy surface in a statistical manner,
there are two observations that suggest that this may not be the case. The first is the fact that the fragmentation channel that seems always to be most enhanced by infrared multiphoton excitation in the IRLAPS scheme is the loss of the neutral aromatic side chain by cleavage of the C__C_ bond, despite the fact that it is not the weakest bond in the molecule. We deduce the latter from our observation that in collision-induced dissociation and in IRMPD of the parent molecules, both of which should proceed on the ground
Relative fragment ion signal 37,500 37,520 37,540 37,560 37,580 37,600 Wavenumber (cm1) A B
Figure 16. [Colour online] Electronic spectrum of Ac-Phe-(Ala)7-LysH-(Pro)2-(Ala)5-LysH obtained (a) by UV photofragment spectroscopy (blue line), and (b) by IRLAPS in which the UV excitation is assisted by infrared multiphoton excitation by a CO2 laser (red line). In both cases the fragment with m/z of 710 is monitored. The CO2 laser was tuned to the 9P(16) line at 1050.1 cm_1.

electronic surface, breakage of the C__C_ bond is a minor channel. Secondly, the fragmentation appears to occur promptly after CO2 laser excitation, since the dissociation yield does not drop when we shorten the time allowed for dissociation. We would expect that if dissociation occurred in a statistical manner from highly excited levels of the ground electronic state, the rate would get progressively slower with increasing size of the molecule. Our observations suggest that the dissociation induced by the CO 2 laser may occur on an excited electronic surface or in an intermediate species that is promptly formed after UV excitation. While the dissociation mechanism in the IRLAPS scheme continues to be a subject of study in our laboratory, the open questions might be best addressed by the powerful coincidence techniques of Jouvet et al. [99101]. 7. Limitations and future directions In this section we consider potential limitations to our present technique, methods that might be used to overcome such limitations as well as possible extensions to the technique that we can envisage for the future that would provide even more detailed information. It is clear that as we push to larger molecules, both the electronic and vibrational spectra will eventually become more complex. Complexity in the electronic spectra will limit our ability to measure conformer-specific infrared spectra. If the infrared spectra themselves are too congested, they may still serve as a fingerprint of the molecule, but the comparison with theory will be difficult, and hence it will be difficult to extract detailed information about the nature of the forces that drive a molecule to adopt a particular conformation. The factors that limit these two types of spectra are slightly different. For electronic spectra, if we assume that we can continue to cool larger molecules efficiently, which eliminates thermal inhomogeneous broadening, the remaining possible sources of spectral congestion are a larger number of FranckCondon active low-frequency vibrations and a large number of stable conformers with slightly different electronic spectra. As discussed previously, the first of these factors is difficult to estimate a priori.
Relative fragment depletion 3200 3300 3400 3500 3600 Wavenumber (cm1) (a) Conformer A (b) Conformer B
Figure 17. Conformer-specific IR spectra of Ac-Phe-(Ala)7-LysH-(Pro)2-(Ala)5-LysH+ obtained by depleting the IRLAPS signal with the UV laser set on the features marked A and B in Figure 16. Adapted with permission from [70]. Copyright 2006 American Chemical Society.

While one can estimate the number of low frequency vibrations, it is difficult to predict which ones will have strong FranckCondon activity. However, there is reason to believe that this problem will remain manageable, since the vibrational modes that change geometry in the excited state should only be those near the chromophore. The problem of conformational heterogeneity will likely become a serious problem for molecules significantly larger than those presented here. The use of multi-dimensional techniques in spectroscopy has proven to be a powerful way to remove heterogeneous broadening. In the work described above, we used IRUV double-resonance to allow conformer specific IR spectra. Using higher orders of multiple resonance such as IRIR UV schemes [42] should allow extensions to more complex systems. However, one could imagine other dimensions in which to distinguish the spectra of different conformers. For
example, the combination of ion mobility techniques, which can first select a certain family of conformations by their mobility in drifting through a finite pressure of bath gas, with the kind of ion-trap spectroscopy described here should be able to reduce the number of features in an electronic spectrum by physically separating the conformers before injection into the trap. An additional source of spectral complexity in electronic spectra will arise as we begin to examine naturally occurring peptides and proteins, which are likely to contain multiple aromatic amino acids. The transitions centred on these distinct chromophores may overlap and interact, particularly when the chromophores are of the same type. Interactions between different chromophores do not in themselves pose a problem, as the electronic spectrum is simply used to perform conformer selection, however the overlap of spectra may inhibit conformer selection. This is clearly an inherent limitation of using naturally occurring chromophores, which is no different from problems experienced in solution, where some studies have concentrated on proteins with a single tryptophan residue. One solution would be to introduce non-natural chromophores into a peptide or protein in such a way that does not perturb the overall structure of the molecule. These could be chosen to have electronic absorptions distinct from the aromatic amino acids. The question of complexity in the infrared spectra is closely tied to our ability to select single conformations via an electronic excitation and then use IRUV double resonance; hence the two types of spectra are not completely independent. However, even if electronic spectra are simple enough to allow the selection of a single stable conformation, it does not guarantee that the vibrational spectrum will be simple, since large molecules, particularly those with repeating units such as peptides, will have a large number of vibrational bands in similar environments that will overlap. Exactly how many vibrational bands appear in a spectrum depends upon the mechanism of IRUV double resonance. As described in much of the work on neutral molecules, the dip in a fluorescence or ion signal upon IR excitation comes from depopulation of the initial state that is tagged by a UV transition. The language commonly used to describe this process assumes that once vibrationally excited, the molecules no longer absorb the UV laser at the same frequency, and this causes a dip in the signal. However it is important to understand why the UV absorption frequency shifts once a molecule is vibrationally excited. If the shift comes from a coupling between the vibrational and electronic excitations, then the vibrational bands that cause a dip in the UV signal will be those that have strong FranckCondon factors for Dv 60 transitions in the electronic transition. In other words, if the molecules are excited to a particular v1 vibrational level and that mode has a strong FranckCondon factor for a Dv0 508 T. R. Rizzo et al.
transition, the electronic absorption will not be very different from the ground state molecules, and the IR absorption will not result in a depletion of the photofragmentation signal. If, on the other hand, the molecules are excited to the v1 level of a vibrational mode with a weak Dv0 FranckCondon factor, the electronic absorption will be weaker than that for unexcited molecules, and the photofragment signal will dip. If this is the correct interpretation, then one might expect that only a small subset of vibrational modes will contribute to the infrared spectrum that is, modes in the vicinity of the UV probe chromophore for which one might expect a geometry change upon electronic excitation. However, this interpretation implicitly assumes that there is no intramolecular vibrational energy redistribution on the timescale of the delay between the IR pump and UV probe lasers. Since the delay is typically 200 ns, this prospect seems unlikely. A more likely scenario is that after IR excitation, the vibrational energy redistributes among the vibrational modes of the molecule, putting it in states of mixed vibrational character. Such states will have components of their wave functions that represent population in many low frequency vibrational modes since the density of states of this type is the highest. The UV spectrum of a molecule in such states will be broadened by what is sometimes referred to as statistical inhomogeneous broadening [102,103], which comes about because the different components of the mixed wave function will give rise to slightly different UV absorption frequencies. Because the UV spectrum is broadened compared to the cold, unexcited molecule, the intensity of UV absorption will be lower at the resonant frequency of the cold molecule, and thus one observes a dip. While the result may appear the same as if we simply removed population from the ground state and assumed no intramolecular vibrational energy redistribution, the scaling of the complexity of the infrared spectrum with molecular size will depend on the mechanism responsible for the IR-induced dip.
If the vibrational energy is statistically distributed after IR excitation, then all vibrational modes of the molecule will appear in the IR dip spectrum. This means that the complexity of the vibrational spectrum will continue to increase with the size of the molecule and that the IR spectrum will not be a local probe of the chromophore region. Moreover, as the molecule gets larger, the excited vibrational state will consist of a wider mixture of states involving modes further from the chromophore. Because these modes will tend to have strong FranckCondon factors for Dv0 transitions, the degree of broadening will decrease roughly in proportion to 1/(SQRT(S)), where S is the number of mixed states. This implies that with increasing molecular size the degree of dip in the spectrum will decrease, making it increasingly difficult to measure IR spectra. Exactly what size molecule is required to put us in that regime is not completely clear. At least for peptides of seventeen amino acids, the amide NH stretch bands appear with significant intensity. While one of the primary goals of these experiments is to test theory, the need for theory to provide the connection between the measured vibrational spectrum and molecular structure is perhaps one of our ultimate limitations to using the data. The connection between theory and experiment is discussed in more detail below. 8. State of comparison with theory We have presented the results of reasonably complete DFT calculations at the B3LYP/ 6-31G** level for the protonated amino acids and B3LYP/6-31G** for Ac-Phe-(Ala)5LysH. Although these calculations, with assistance from isotopic labelling, allowed us to International Reviews in Physical Chemistry 509
assign individual transitions to particular oscillators and to connect the spectra to specific conformations, we still found disagreements between theory and experiment. Moreover, we were unable to apply these same methods to the larger molecules discussed in this review. This section outlines the strengths and weaknesses of our chosen procedures, suggests methods that might improve on the current results, and discusses the difficulties encountered as we move to larger molecules. The first step in obtaining a set of calculated geometries and frequencies is to use a low level of theory to identify candidate structures for further analysis. We employ a random search method for conformational searching using the AMBER force field. In the case of Ac-Phe-(Ala)5-LysH we generated 50,000 structures, of which just over 1000 were unique and within 50 kJ/mol of the most stable structure. When we calculated the energies of these conformations using B3LYP/6-31G**, the energy ordering changed considerably. For example, the global minimum conformation of Ac-Phe-(Ala)5-LysH, according to DFT (assigned as conformer D) was the 35th lowest energy conformation according to AMBER. However, when the conformations were fully optimised with DFT, further reordering was minimal. Thus, while the AMBER force field calculates geometries that do not change much at higher levels of theory, the energy ordering is not as reliable. The problem of correctly selecting low-energy conformations with force field methods likely becomes more difficult in systems other than these helices, which seem to be particularly stable [94]. Because the random search procedure uses low-energy structures to generate new structures during the search, and because the helices are so much lower in energy than other types of structures, the search procedure will stay mostly within the helical regime, allowing it to fully explore that small region of conformation-space that accounts for all of the low-energy conformations. By contrast, a potential energy surface with a wider variety of structures within a smaller energy window may not be as thoroughly explored within the same number of iterations. Once a set of candidate structures have been identified by force field searches, we then employ higher-level calculations to find the very lowest minima, and to calculate harmonic vibrational frequencies. We employ the B3LYP functional with a 6-31G** basis for smaller systems and 6-31G** for larger ones. In previous sections, we have identified two weaknesses with our DFT calculations: the energy ordering for Ac-Phe-(Ala)5-LysH does not match the apparent conformational populations seen in the spectra; and there is still substantial error in the calculated frequencies compared to the experiment. We look at these factors in turn. As discussed above, one should use caution when assuming conformer populations based on UV spectra because of possible differences in transition strengths for the different conformers. If we assume that the UV spectrum reflects the actual populations, the precise ordering of the lowest energy conformations in Ac-Phe-(Ala)5-LysH does not appear correct. We should emphasise, however, that the four observed conformations are among
the five lowest calculated, implying that DFT does recover the overall energetics reasonably well. The detailed differences may be due to the well-known lack of dispersion in DFT. In smaller molecules containing aromatic rings and amide groups, the interaction between the two can be an important stabilising factor that determines the lowest energy conformations [24]. In helices, this type of interaction is much less important than hydrogen bonding, but the complete omission of dispersion interactions may account for differences of several kilojoules per mole. 510 T. R. Rizzo et al.
On the whole, the scaled DFT harmonic frequency calculations are good enough to allow us to relate a structure to the measured spectra for the protonated aromatic amino acids and for Ac-Phe-(Ala)5-LysH, and to identify particular weaknesses in the theory. The IR spectra of PheH (Figure 6) point out a recurring weakness the poor calculation of hydrogen-bonded ammonium NH stretches. Calculations using MP2 provided no improvement to these frequencies, ruling out dispersion as the source of the problem. Anharmonic frequencies, on the other hand, improved the agreement substantially with the added advantage of requiring no scale factor. We thus concluded that anharmonicity in hydrogen-bonded ammonium NH stretches is so large that normal harmonic methods, even when scaled, were insufficient to determine accurate frequencies. The calculation of conformations A and B of Ac-Phe-(Ala)5-LysH point to a second flaw in this level of theory the coupling between the NH stretches of Ala5 and Ala6 [65,69]. The calculations suggest vibrations that are the symmetric and antisymmetric combinations of the two local oscillators, with nearly equal intensity and a substantial spacing between them, while the experiment shows two vibrations with markedly unequal intensity and only a slight splitting. Larger molecules are likely to have many coupled oscillators, and thus correct prediction of this interaction is crucial. In general, the mismatch between the calculated and experimental frequencies will become problematic for larger molecules with congested spectra and smaller differences between conformations. There are several options for improvements to the calculations we have discussed here. The shape of the potential energy surface is, of course, the primary factor in the accuracy of the energies and the frequencies, so improvements in DFT and inclusion of dispersion in future calculations will ameliorate this to some degree [104109]. Moving to higher levels of theory than DFT may also be a necessary step. The computational expense of MP2 has precluded its general use in the size of molecules we study, but the development of the resolution-of-the-identity (RI) approximation offers a less expensive route to MP2 energies [110]. Finally, it is clearly necessary to include anharmonicity in the frequency calculations, but this remains quite expensive. The methods outlined here that worked well for Ac-Phe-(Ala)5-LysH were too computationally expensive for application to Ac-Phe-(Ala)10-LysH. The use of the RI approximation with DFT offers an order-of-magnitude reduction in computation time for optimisations and frequency calculations of molecules the size of Ac-Phe-(Ala)10-LysH. For example, we have found that frequencies can be calculated for Ac-Phe-(Ala)10-LysH at the RI-BP86/SVP level of theory in approximately the same time as a frequency calculation of Ac-Phe-(Ala)5-LysH at the B3LYP/6-31G** level. However, we used Ac-Phe-(Ala)5LysH to test the accuracy of RI-BP86/SVP frequencies, and found a worse match to our experimental frequencies than with B3LYP/6-31G**. Employing a larger basis set gave better frequencies, but even RI-BP86/TZVP was prohibitively expensive for Ac-Phe(Ala)10-LysH. Continued refinement of basis sets, functionals, and time-saving approximations will aid the field of large-molecule high-resolution spectroscopy immensely. 9. Conclusions In this review we have tried to demonstrate the potential of the techniques that we have developed for obtaining conformation-specific IR spectra of cold biomolecular ions. The combination of electrospray ionisation for producing gas-phase peptides, ion-trapping International Reviews in Physical Chemistry 511
techniques to cool and confine them and multiple-laser spectroscopic schemes enable the measurement of highly resolved electronic spectra of these species. Using such spectra to identify electronic transitions from different conformers permits the measurement of conformer-specific IR spectra, which, in comparison with calculations, allows us to identify the geometry of the molecules. The particular class of molecules discussed here was chosen because of their propensity to form gas-phase helices, allowing us to
investigate the spectral signatures of this secondary structural element. The highly resolved spectra for such species provide stringent benchmarks for theory. If one is to have confidence in theoretical calculations on molecules even larger than these in more complex environments, such calculations must be able to reproduce the spectra obtained here in the well-defined and controlled environment of a cold ion trap. It is our hope that such benchmark experiments can help provide the means to improve theoretical approaches. The continued development of these techniques requires a detailed understanding of the sources of complexity in the electronic spectra of large molecules, the photophysics of biological chromophores in their excited electronic states and the dynamics of intramolecular vibrational energy distribution in the ground electronic state, and these are subjects that are currently under investigation in our laboratory. Acknowledgements
We gratefully acknowledge and thank the E cole Polytechnique Federale de Lausanne and the Fond National Suisse (grant no. 200020-112071) for their generous support of this work. The studies discussed in this article are the result of the work of many talented group members: Sebastien Mercier, Monia Guidi, Caroline Seaiby, Ulrich Lorenz and Georgios Papadopoulos.
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Modelos de clculo terico:
Los espectros de DOR y DC de los dos enantimeros de una molcula quiral son de igual magnitud y signo opuesto: es decir, la imagen de espejo enantimeros dar imagen especular espectros de DOR y DC. En consecuencia, el aire acondicionado de una molcula quiral puede, en principio, se determina a partir de la ORD y / o espectro de CD. AC - propiedades Chiroptical: Luz polarizada suma de dos componentes de polarizacin circular de la misma magnitud y fase opuesta. ORD slo componentes de transmisin se mantendr la misma intensidad (EL = ER), pero la fase cambiar. Los fenmenos de refraccin se produce desde ndices de izquierda y derecha circularmente la luz polarizada son diferentes. medimos el ngulo de rotacin: a (grados) CD slo EL y ER se absorbe de forma diferente. Se lleva a cabo cuando los componentes arriba se absorbe de forma diferente. medimos elipticidad ngulo: Q o en el rango IR = VCD diferencia de absorcin: D A para ngulos pequeos: A D @ Q / 32.98 Para las muestras de CD y activa ORD tendremos a Q y al mismo tiempo
New ab initio, density functional and semiempirical calculation methods New desorption methods and their combination with storage techniques allow the production of high densities of large molecules New double resonance spectroscopy techniques allow selection of isomers Spectroscopic methods applied to electrosprayed molecules New lasers and new IR generation technique extend the conventional wavelength range and increase laser power and stability of laser intensity
Nueva ab initio, la densidad de los mtodos de clculo funcional y semiempricos Nuevos mtodos de desorcin y su combinacin con las tcnicas de almacenamiento permiten la produccin de alta densidad de molculas de gran tamao Nuevas tcnicas de espectroscopia de resonancia doble permite la seleccin de los ismeros Los mtodos espectroscpicos se aplica a molculas electrosprayed nuevos lseres de nueva generacin y la tcnica de infrarrojos ampliar la gama de longitudes de onda convencional y aumentar la potencia de lser y la estabilidad de la intensidad del lser
9.
Conclusiones: En esta revisin se ha tratado de demostrar el potencial de las tcnicas que hemos desarrollados para la obtencin de la conformacin especfica de espectros IR de los iones biomoleculares fro. La combinacin de ionizacin electrospray para la produccin de pptidos en fase gaseosa, de iones que atrapan Comentarios Internacional de Qumica Fsica 511 Descargado por: [Universidad Pablo de Olavide] En: 08:33 09 de enero 2010 tcnicas que se enfre y las confinan y permitir que mltiples sistemas de espectroscopia lser de la medicin de los espectros de una alta resolucin electrnica de estas especies. El uso de tales espectros de identificar las transiciones electrnicas de diferentes confrmeros permite la medicin de conformacin especfica de espectros IR, que, en comparacin con los clculos, nos permite identificar la geometra de las molculas. La clase particular de molculas discutido aqu fue elegido debido a su propensin a formar la fase gaseosa-hlices, lo que nos permite investigar las firmas espectrales de este elemento estructural secundaria. La resuelto muy espectros de estas especies constituyen puntos de referencia estrictos para la teora. Si uno va a tener la confianza en los clculos tericos sobre las molculas an mayores que estas, en ms complejo entornos, estos clculos deben ser capaces de reproducir los espectros obtenidos aqu en el bien definido y controlado por medio de una trampa de iones de fro. Es nuestra esperanza de que tal experimentos de referencia puede ayudar a proporcionar los medios para mejorar los enfoques tericos.
El continuo desarrollo de estas tcnicas requiere una comprensin detallada de las fuentes de la complejidad de los espectros electrnicos de molculas de gran tamao, el fotofsica de cromforos biolgicos en sus estados excitados electrnicos y la dinmica de la distribucin intramolecular de energa vibracional en el estado fundamental, y estas son temas que estn actualmente bajo investigacin en nuestro laboratorio. El anlisis de vibracin de los aminocidos y pptidos cortos en los medios de comunicacin hidratada. VIII. amino Los cidos con cadenas laterales aromticas: L-fenilalanina, Ltirosina y L-triptfano.
Vibrational Analysis of Amino Acids and Short Peptides in Hydrated Media. VIII. Amino Acids with Aromatic Side Chains: L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and LTryptophan
Belen Hernandez, Fernando Pflu ger, Alain Adenier, Sergei G. Kruglik, and Mahmoud Ghomi*,
Groupe de Biophysique Moleculaire, UFR SMBH, UniVersite Paris 13, 74 rue Marcel Cachin, 93017 Bobigny cedex, France; Laboratoire ITODYS, UMR 7086, UniVersite Paris Diderot, Batiment LaVoisier, 15, rue Jean-Antoine de Baf, 75205 Paris cedex 13, France; and Laboratoire Acides Nucleiques et Biophotonique (FRE 3207), UniVersite Pierre et Marie Curie Paris 06, 75252 Paris, France ReceiVed: July 21, 2010; ReVised Manuscript ReceiVed: October 4, 2010
IV. Concluding Remarks Our main conclusions can be summarized as follows: (i) Despite the very low water solubility of tyrosine, we could finally record for the first time its Raman and FT-IR spectra in aqueous solutions (Figure 3). This was only made possible at a minimal concentration of 2.3 mM (0.42 mg/ mL), just below the saturation condition of Tyr in aqueous solution. (ii) Phe and Trp give rise to intense Raman bands (Figure 2 and 5), originating from the in-plane vibrations of aromatic side
chains. These modes serve as useful vibrational markers in peptides and proteins. For instance, we can mention that the Raman spectra obtained from somatostatin, a 14-mer peptide hormone containing three Phe and one Trp residues in its chain, reported in paper V of this series,48 are dominated by the intense bands arising from these AAs. (iii) The common feature of all the AAs with an aromatic ring, i.e., His,32 Phe, Tyr, and Trp, is their side-chain conformational flexibility thanks to the variation of _1 and _2 torsion angles (Figure 1). As evidenced by quantum mechanical calculations, their side chain can sweep a large space, rendering possible their interactions with the environment. Especially, water molecules, through their interactions with these AAs, seemIV. Concluding Remarks Our main conclusions can be summarized as follows: (i) Despite the very low water solubility of tyrosine, we could finally record for the first time its Raman and FT-IR spectra in aqueous solutions (Figure 3). This was only made possible at a minimal concentration of 2.3 mM (0.42 mg/ mL), just below the saturation condition of Tyr in aqueous solution. (ii) Phe and Trp give rise to intense Raman bands (Figure 2 and 5), originating from the in-plane vibrations of aromatic side chains. These modes serve as useful vibrational markers in peptides and proteins. For instance, we can mention that the Raman spectra obtained from somatostatin, a 14-mer peptide hormone containing three Phe and one Trp residues in its chain, reported in paper V of this series,48 are dominated by the intense bands arising from these AAs. (iii) The common feature of all the AAs with an aromatic ring, i.e., His,32 Phe, Tyr, and Trp, is their side-chain conformational flexibility thanks to the variation of _1 and _2 torsion angles (Figure 1). As evidenced by quantum mechanical calculations, their side chain can sweep a large space, rendering possible their interactions with the environment. Especially, water molecules, through their interactions with these AAs, seem
IV. Concluding Remarks Our main conclusions can be summarized as follows:
(i) Despite the very low water solubility of tyrosine, we could finally record for the first time its Raman and FT-IR spectra in aqueous solutions (Figure 3). This was only made possible at a minimal concentration of 2.3 mM (0.42 mg/ mL), just below the saturation condition of Tyr in aqueous solution. (ii) Phe and Trp give rise to intense Raman bands (Figure 2 and 5), originating from the in-plane vibrations of aromatic side chains. These modes serve as useful vibrational markers in peptides and proteins. For instance, we can mention that the Raman spectra obtained from somatostatin, a 14-mer peptide hormone containing three Phe and one Trp residues in its chain, reported in paper V of this series,48 are dominated by the intense bands arising from these AAs. (iii) The common feature of all the AAs with an aromatic ring, i.e., His,32 Phe, Tyr, and Trp, is their side-chain conformational flexibility thanks to the variation of _1 and _2 torsion angles (Figure 1). As evidenced by quantum mechanical calculations, their side chain can sweep a large space, rendering possible their interactions with the environment. Especially, water molecules, through their interactions with these AAs, seem to facilitate the side-chain conformational transitions by lowering the energy barriers separating different conformers. (iv) Theoretical calculations could also help us to better understand the interaction of water molecules with these AAs. Especially, solvent molecules can stabilize their interactions by pointing one of their hydrogens toward the aromatic ring; see, for instance, graphic representations of g-g+ conformers in Phe + 5H2O (Figure 7), g-g- and g-g+ conformers in Tyr + 7H2O (Figure 8), as well as g+g- conformer in Trp + 6H2O (Figure 9). This special manner of interaction of a proton with an aromatic ring seems to be interesting and leads us to emphasize, for instance, the previously published results on helical stabilization observed upon lowering pH in the peptide chains containing Trp and His residues located at i and i + 4 positions, respectively.49 In fact, by decreasing pH toward acidic values, where His ring is protonated on both of its nitrogens, 32 one could expect a better interaction of the protonated His with the Trp aromatic ring found in its proximity due to the helical conformation of a peptide chain. Acknowledgment. This work was granted access to the HPC resources of CINES (Montpellier, France) under the allocation 2010-c2010075065 made by GENCI (Grand Equipement National de Calcul Intensif). Numerical calculations on geometrical and vibrational properties of aromatic amino acids were realized on the Jade (SGI) supercomputing network installed in CINES. Supporting Information Available: Vibrational spectra of tyrosine in solid and heterogeneous phases (Figure S1), as well as atomic Cartesian coordinates of the 12 low-energy conformers displayed in Figures 7-9 (see also Table 4), obtained by full geometry optimization in the presence of explicit solvent, are provided. This material is available free of charge via the Internet at http://pubs.acs.org.
IV. Observaciones finales Las conclusiones principales se pueden resumir de la siguiente manera: (i) A pesar de la baja solubilidad en agua de la tirosina, que finalmente podra registrar por primera vez su Raman y FT-IR espectros en soluciones acuosas (Figura 3). Esto slo se hizo
posible a una concentracin mnima de 2,3 mm (0,42 mg / mL), justo debajo de la condicin de saturacin de Tyr en disolucin acuosa solucin. (ii) Phe y Trp dar lugar a intensas bandas de Raman (Figura 2 y 5), procedentes de las vibraciones en el plano de laterales aromticas cadenas. Estos modos de servir como marcadores de vibracin til pptidos y protenas. Por ejemplo, podemos mencionar que la Espectros Raman obtenidos a partir de la somatostatina, un pptido de 14-mer la hormona que contiene tres residuos de Phe y Trp uno en su cadena, inform en V de papel de esta serie, 48 estn dominados por la intensa bandas que surgen de estos AA. (iii) La caracterstica comn de todos los miembros de AA con un aromtico anillo, es decir, Su, de 32 aos Phe, Tyr, Trp y, es su lado de la cadena de conformacin flexibilidad gracias a la variacin de la torsin y _1 _2 ngulos (Figura 1). Como se evidencia por la mecnica cuntica clculos, su cadena lateral puede barrer un gran espacio, lo que hace posible su interaccin con el medio ambiente. sobre todo, las molculas de agua, a travs de sus interacciones con los miembros de AA, parece para facilitar las transiciones conformacionales de cadena lateral mediante la reduccin de las barreras de energa que separa confrmeros diferentes. (iv) Los clculos tericos tambin nos puede ayudar a una mejor comprender la interaccin de las molculas de agua con estos miembros de AA. En especial, las molculas del disolvente puede estabilizar sus interacciones sealando uno de sus tomos de hidrgeno hacia el anillo aromtico; ver, por ejemplo, representaciones grficas de g-g + confrmeros en Phe + 5H2O (Figura 7), gg-y g-g + confrmeros en Tyr + 7H2O (Figura 8), as como g + g-conformacin de Trp + 6H2O (Figura 9). Esta forma especial de interaccin de un protn con un anillo aromtico parece ser interesante y nos lleva a destacar, por ejemplo, los resultados publicados anteriormente en la hlice de estabilizacin observ a bajar el pH en las cadenas peptdicas que contienen Trp y sus residuos ubicado en la I y la I + posiciones 4, respectively.49 De hecho, por la disminucin del pH hacia valores cidos, donde Su anillo es protonado en sus dos tomos de nitrgeno, de 32 aos se podra esperar una mejor interaccin del haz de His protonadas con el PRT anillo aromtico se encuentran en su proximidad, debido a la hlice conformacin de una cadena de pptidos. Acuse de recibo. Este trabajo ha sido concedido el acceso a la HPC recursos de CINES (Montpellier, Francia) en la asignacin 2010-c2010075065 hecha por Genci (Grand Equipement Nacional de Calcul Intensif). Clculos numricos en geometra y las propiedades vibracionales de los aminocidos aromticos se realizaron en la red de supercomputacin Jade (SGI) instalado en CINES. Informacin de apoyo disponible: los espectros de vibracin de tirosina en las fases slida y heterognea (Figura S1), as como atmicas coordenadas cartesianas de los 12 bajo consumo de energa confrmeros muestra en las figuras 7.9 (vase cuadro 4), obtenido por completo optimizacin de la geometra en la presencia explcita de solvente, se
proporcionado. Este material est disponible de forma gratuita a travs de la Internet en http://pubs.acs.org.
Prasad L. Polavarapu Chunxia Zhao
Vibrational circular dichroism: a new spectroscopic tool for biomolecular structural determination
Fresenius J Anal Chem (2000) 366 :727734 Springer-Verlag 2000 Received: 31 August 1999 / Revised: 2 November 1999 / Accepted: 14 November 1999
6 Conclusions
Distinct spectra-structure correlations have been found betwen the observed VCD spectra and molecular structures of a variety of biomolecular systems. These correlations make the VCD spectroscopy a powerful structural tool. The commercial developments of VCD instruments, and of software for quantum mechanical VCD predictions, made it much easier now, for synthetic chemists, pharmaceutical chemists and structural biologists, to practise the VCD spectroscopy routinely.
Acknowledgments We are grateful to NSF (CHE9707773) and Vanderbilt University for grant support. We thank James R. McBride for recording the spectrum of poly(L-lysine) and Dr. P. K. Bose for recording the spectra of oligosaccharides.
Prasad L. Polavarapu Chunxia Zhao Dicrosmo circular vibracional: un instrumento espectroscpico nuevo para la determinacin estructural de biomolculas Fresenius anal J Chem (2000) 366 :727-734 Springer-Verlag 2000 Recibido: 31 agosto 1999 / Revisado: 02 de noviembre 1999 / Aceptado el 14 de noviembre 1999
6 Conclusiones Distinta estructura de los espectros de las correlaciones se han encontrado Transcurrir los espectros observados VCD y las estructuras moleculares de una variedad de sistemas biomoleculares. estas correlaciones realizar la espectroscopia VCD un potente estructurales herramienta. El desarrollo comercial de los instrumentos de VCD, y de software para las predicciones de la mecnica cuntica VCD, hizo mucho ms fcil ahora, para los qumicos sintticos, productos farmacuticos qumicos y bilogos estructurales, para practicar el VCD espectroscopia de forma rutinaria. Agradecimientos Agradecemos a NSF (CHE9707773) y La Universidad de Vanderbilt de apoyo financiero. Damos las gracias a James R. McBride para el registro del espectro de poli (L-lisina) y el Dr. PK Bose para registro de los espectros de oligosacridos.
Vibrational circular dichroism: Chiroptical analysis of biomolecules

Tohru Taniguchi, Nobuaki Miura, Shin-Ichiro Nishimura and Kenji Monde
Division of Biological Sciences, Graduate School of Science, Frontier Research Center for Post-genomic Science and Technology, Hokkaido University, Kita-ku, Sapporo, Japan
Concluding remarks
VCD, a new chiroptical spectroscopy method, has recently undergone rapid instrumental and theoretical development to become one of the most efficient analytical tools available to study the chirality of small molecules aswell as macromolecules. As we have illustrated in the examples including plant metabolites, proteins, and carbohydrates, VCD is a useful technique for analyses of natural products. This paper highlights the application of VCD methods to the structural study of carbohydrates. The scope of applications for VCD has expanded to include analysis of biomacromolecules from proteins to nucleic acids. Although a requirement for relatively large sample quantity or long scannig time currently limit VCD studies, especially for rare or labile natural compounds, further development of VCD instrumentation, methods, and compound databases holds the potential to overcome current limitations in approaching some VCD analytical applications and will likely increase popular use and accessability to these techniques.
Dicrosmo circular vibracional: el anlisis de biomolculas Chiroptical Tohru Taniguchi, Miura Nobuaki, Nishimura Shin-Ichiro y Kenji Monde Divisin de Ciencias Biolgicas, Facultad de Ciencias, Centro de Investigacin de la Frontera post-genmica Ciencia y Tecnologa, La Universidad de Hokkaido, Kita-ku, Sapporo, Japn observaciones finales VCD, un nuevo mtodo de espectroscopia chiroptical, recientemente ha experimentado un rpido desarrollo instrumental y terica para convertirse en una de las herramientas disponibles ms eficientes de anlisis para estudiar la quiralidad de las molculas pequeas, as como macromolculas. Como hemos ilustrado en los ejemplos incluidos metabolitos vegetales, protenas y carbohidratos, VCD es un tcnica til para el anlisis de los productos naturales. En este documento destaca la aplicacin de los mtodos de VCD a los problemas estructurales estudio de los hidratos de carbono. El alcance de las solicitudes de VCD se ha ampliado para incluir el anlisis de biomacromolculas de las protenas con los cidos nucleicos. A pesar de la exigencia de muestra relativamente grande cantidad o el tiempo scannig tiempo actualmente lmite de los estudios VCD, especialmente para los naturales raros o lbiles compuestos, el desarrollo de la instrumentacin VCD, mtodos y bases de datos compuesto tiene el potencial de superar las limitaciones actuales para acercarse a algunos VCD
aplicaciones analticas y es probable que aumente el uso popular y accesibilidad a estas tcnicas.
PES calculated along the D6 (C8-C7-C4-C3) and d21 (o24-c10-c1-c2) dihedral angle at B3LYP/ 6-31G** and B3LYP/ cc-pVDZ level.
Keywords: Biomolecules / Carbohydrates / Secondary structure / Vibrational circular dichroism /
Received: March 1, 2004; accepted: April 13, 2004

Theory of VCD
Chiral molecules respond differently to left versus right circularly polarized radiation due to diastereomeric interaction. The measurements of this differential interaction relate to what is known as optical activity. The most familiar measurements are optical rotation, or optical rotatary dispersion when measured as a function of wavelength, and electronic circular dichroism (ECD). The electronic transitions of a chiral molecule give rise to circular dichroism (CD) in the visible ultraviolet (VIS-UV) spectral region. ECD spectrometers have been widely available for routine measurements since the early 1960s, whereas the measurement of CD in vibrational transitions, i. e., VCD, has been available only for a limited number of researchers until the late 1990s. The relationship between VCD and infrared (IR) absorption is the same as that between ECD and UV absorption (Fig. 1). VCD measures the differential absorption of left versus right circularly polarized IR incident light in the molecular vibrational transition.
i 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de
MNF Educcattiion

Correspondence: Kenji Monde, Division of Biological Sciences, Graduate School of Science, Frontier Research Center for Post-genomic Science and Technology, Hokkaido University, Kita-ku, Sapporo
001-0021, Japan E-mail: kmonde@glyco.sci.hokudai.ac.jp Fax: +81-11-706-9041 (or -9042) Abbreviations: ECD, electronic circular dichroism; IR, infrared; VCD, vibrational circular dichroism
246 T. Taniguchi et al. DOI 10.1002/mnfr.200400007 Mol. Nutr. Food Res. 2004, 48, 246 254 Mol. Nutr. Food Res. 2004, 48, 246 254 Vibrational CD: Chiroptical analysis of biomolecules
_A = AL AR (1) where AL and AR are absorbances for left and right circularly polarized radiation, respectively. The ordinary IR absorption, A, is given by the average of AL and AR, namely, A = 1/2 (AL + AR) (2) and A = log10 (I/I0) (3) where I and I0 are the average transmission with and without the sample. Assuming the Beer-Lambert law is valid and in the case when the pathlength and concentration are known, VCD can be expressed in terms of the difference in molar absorptivity as _e = eL eR =_A/cl (4) where c is the molar concentration and l is the pathlength in cm. In this paper, measured VCD and IR spectra are expressed by_e and e, respectively. The anisotropy ratio, g, the quotient of the intensity of VCD to that of IR, is another significant parameter which is also specified in publications. g =_e/e = _A/A (5) The anisotropy ratio g, which is meaningful between ~103 to 105, could be a criterion for judging whether a vibrational mode can cause large or small VCD absorption. For instance, C=C=C antisymmetric stretching of a chiral allene shows strong VCD at around 1945 cm1 in spite of relatively small corresponding IR absorbance (g = ~103) [6], while C=O stretching of 3-hydroxyoxindole at around 1730 cm1 has intense IR absorbance but small VCD (g =~105; see Fig. 3). The question of whether a vibrational mode exhibits large VCD or not is ultimately ascribed to the magnitude and direction of both electronic- and magneticdipole transition moments [7, 8]. The anisotropy ratio g is also important in terms of analytic calculations because it relates theoretical spectra to experimental ones by the following equation: g =_A/A = 4R/D (6) where R and D are called rotatory strength and dipole strength, respectively. For a small molecule, both R and D can be calculated using Gaussian 98 or 03 [9]. A more complicated theoretical background of VCD is not addressed here, but more detailed descriptions are offered in other publications [7, 8]. Teora de VCD
Las molculas quirales responden de manera diferente a la izquierda contra la derecha circularmente radiacin polarizada debido a la interaccin diastereoismeros. Las medidas de esta interaccin diferencial se relacionan con lo que se conoce como actividad ptica. Los ms conocidos medidas son la rotacin ptica, o la dispersin ptica rotatary cuando se mide en funcin de la longitud de onda, y dicrosmo circular electrnica (ECD). Las transiciones electrnicas de una molcula quiral dar lugar a dicrosmo circular (CD) en el ultravioleta-visible (VIS-UV) regin espectral. Espectrmetros de ECD han estado disponibles para la rutina
mediciones desde la dcada de 1960, mientras que la medicin de CD en las transiciones vibracionales, i. e., VCD, ha sido disponible slo para un nmero limitado de investigadores hasta que el finales de 1990. La relacin entre el VCD y la absorcin de infrarrojos (IR) es la misma que existe entre la absorcin de la primera infancia y UV (Fig. 1). VCD mide la absorcin diferencial de la izquierda contra la derecha polarizada circularmente IR luz incidente en el transicin de vibracin molecular. i 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de MNF Educcattiion Dicrosmo circular vibracional: el anlisis de biomolculas Chiroptical Tohru Taniguchi, Miura Nobuaki, Nishimura Shin-Ichiro y Kenji Monde Divisin de Ciencias Biolgicas, Facultad de Ciencias, Centro de Investigacin de la Frontera post-genmica Ciencia y Tecnologa, La Universidad de Hokkaido, Kita-ku, Sapporo, Japn Palabras clave: Biomolculas / carbohidratos / Secundaria estructura circular / vibracin dicrosmo / Recibido: 01 de marzo 2004; aceptado: 13 de abril 2004 Correspondencia: Kenji Monde, Divisin de Ciencias Biolgicas, Escuela de Graduados de Ciencias, Centro de Investigacin de la Frontera postgenmica Ciencia y Tecnologa, la Universidad de Hokkaido, Kita-ku, Sapporo 001-0021, Japn E-mail: kmonde@glyco.sci.hokudai.ac.jp Fax: +81-11-706-9041 (o -9042) Abreviaturas: ECD, electrnica dicrosmo circular, IR, infrarrojo; VCD, dicrosmo circular vibracional 246 T. Taniguchi et al. DOI 10.1002/mnfr.200400007 Mol. Nutr. Alimentos Res. 2004, 48, 246 a 254 Mol. Nutr. Alimentos Res. 2004, 48, 246 a 254 CD vibracin: el anlisis de biomolculas Chiroptical _A = AL - AR (1) en AL y AR son las absorbancias de izquierda y derecha circularmente radiacin polarizada, respectivamente. La corriente de absorcin de IR, A, est dada por el promedio de AL y AR, es decir, A = 1 / 2 (AL + AR) (2) y A = - log10 (I/I0) (3) y donde I0 es el medio de transmisin con y sin la muestra. Suponiendo que la ley de Beer-Lambert es vlida y en el caso de que el paso de luz y la concentracin son conocidos, VCD se pueden expresar en trminos de la diferencia en el molar
capacidad de absorcin como _e = EL - ER = _A / cl (4) donde c es la concentracin molar y l es el paso de luz en cm. En este trabajo, medida VCD y espectros IR se expresa by_e y E, respectivamente. La relacin de anisotropa, g, el cociente de la intensidad de VCD a la del IR, es otro parmetro importante que tambin se se especifica en las publicaciones. g = _e / e = _A / A (5) La anisotropa relacin de g, que es significativa entre 3.10 ~ a 5.10, podra ser un criterio para juzgar si una vibracin modo puede causar la absorcin de VCD grande o pequeo. Para ejemplo, C = C = C antisimtrica estiramiento de un quiral aleno muestra fuertes VCD en torno a 1945 cm-1 a pesar de absorbancia correspondiente relativamente pequeo IR (g = ~ 10.3) [6], mientras que C = O se extiende de 3-hydroxyoxindole en torno a 1730 cm-1 tiene una intensa absorcin de infrarrojos, pero pequeas VCD (G = ~ 10.5, ver Fig. 3).. La cuestin de si una vibracin muestra el modo de grandes VCD o no, es en ltima instancia, atribuye a la magnitud y direccin de ambas electrnicos y magnticos, momentos dipolares de transicin [7, 8]. La relacin de anisotropa g tambin es importante en trminos de clculos analticos, porque se relaciona con los espectros tericos a los experimentales por el texto siguiente ecuacin: g = _A / A = 4R / D (6) en I + D se llama fuerza rotatoria y el dipolo fuerza, respectivamente. Para que una molcula pequea, tanto en I y D se puede calcular utilizando Gauss 98 o 03 [9]. A ms complicado base terica de VCD no se trata aqu, pero las descripciones ms detalladas se ofrecen en otros publicaciones [7, 8].
Figure 5. IR absorption of simple carbohydrates and the measurement conditions. Detector: InSb detector and MCT detector have to be adopted for the measurement of the hydrogen stretching region and the fingerprint region, respectively. Cell: representative two cell windows are shown. The solid lines indicate the available spectral region but the cell windows have a little absorption in the dotted zones. If a data in the dotted region is required, a solvent absorption has to be reduced as far as possible. Solvent: representative three solvents, which are sufficiently polar to dissolve a carbohydrate sample, are shown. They have little or no absorption in the solid lines but an extension of pathlength may preclude VCD measurement in the dotted regions. Vibration: simple carbohydrates show IR absorption, therefore VCD signals, in the regions displayed by the solid line. Many complicated vibrations exist in the fingerprint regin
Figura 5. IR absorcin de hidratos de carbono simples y las condiciones de medida. Detector: InSb detector y detector MCT tienen que ser adoptadas para la medicin de la regin de hidrgeno de estiramiento y la regin de huellas digitales, respectivamente. Celular: representante dos ventanas de las celdas se muestran. Las lneas continuas indican la regin del espectro disponible, pero las ventanas de las celdas tienen un poco absorcin en las zonas de puntos. Si los datos de la regin se requiere de puntos, una absorcin de disolvente tiene que ser reducido tanto como sea posible. Solvente: el representante de tres solventes, que son lo suficientemente polar para disolver una muestra de hidratos de carbono, se muestran. ellos tienen poca o ninguna absorcin en las lneas continuas, sino una extensin de paso de luz puede impedir la medicin de puntos en el VCD.
Concluding remarks
VCD, a new chiroptical spectroscopy method, has recently undergone rapid instrumental and theoretical development to become one of the most efficient analytical tools available to study the chirality of small molecules aswell as macromolecules.
As we have illustrated in the examples including plant metabolites, proteins, and carbohydrates, VCD is a useful technique for analyses of natural products. This paper highlights the application of VCD methods to the structural study of carbohydrates. The scope of applications for VCD has expanded to include analysis of biomacromolecules from proteins to nucleic acids. Although a requirement for relatively large sample quantity or long scannig time currently limit VCD studies, especially for rare or labile natural compounds, further development of VCD instrumentation, methods, and compound databases holds the potential to overcome current limitations in approaching some VCD analytical applications and will likely increase popular use and accessability to these techniques.
observaciones finales
VCD, un nuevo mtodo de espectroscopia chiroptical, recientemente ha experimentado un rpido desarrollo instrumental y terica para convertirse en una de las herramientas disponibles ms eficientes de anlisis para estudiar la quiralidad de las molculas pequeas, as como macromolculas. Como hemos ilustrado en los ejemplos incluidos metabolitos vegetales, protenas y carbohidratos, VCD es un tcnica til para el anlisis de los productos naturales. En este documento destaca la aplicacin de los mtodos de VCD a los problemas estructurales estudio de los hidratos de carbono. El alcance de las solicitudes de VCD se ha ampliado para incluir el anlisis de biomacromolculas de las protenas con los cidos nucleicos. A pesar de la exigencia de muestra relativamente grande cantidad o el tiempo scannig tiempo actualmente lmite de los estudios VCD, especialmente para los naturales raros o lbiles compuestos, el desarrollo de la instrumentacin VCD, mtodos y bases de datos compuesto tiene el potencial de superar las limitaciones actuales para acercarse a algunos VCD aplicaciones analticas y es probable que aumente el uso popular y accesibilidad a estas tcnicas.
Experimental methods
There are currently a few commercially available factoryaligned Fourier transform (FT)-VCD instruments. Chiralir, released 1997 from Bomem/BioTools, Inc., is the most widespread of these. Also, JV-2001, provided by JASCO Co. since 2001, has been popular. Both VCD optical systems can be described by the same simple block diagram (Fig. 2). In both systems, IR radiation from a light source first directs through a Michelson interferometer and then passes through an optical filter to isolate the spectral region of interest. The IR beam continues through a linear polarizer that defines a single state of polarization and then on to a ZeSe photoelastic modulator (PEM) that modulates the polarization between left- and right-circularly polarized states. A chiral sample in an appropriate IR sample cell is placed directly after the PEM and the beam is focused with
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Figure 1. Type of radiation and corresponding CD. VCD is considered as an extended version of conventional ECD. The advantage of VCD comes from the spectroscopic detail of IR with the
stereochemical sensitivity of CD.

T. Taniguchi et al. Mol. Nutr. Food Res. 2004, 48, 246 254
a lens to a liquid nitrogen-cooled detector. The detector signal is processed by subsequent electronics to yield IR and VCD spectra. In both spectrometers, detector sensitivity (or polarizer transmittance) prohibits measurements in the spectral region below 750 cm1. Besides these two VCD instruments, other companies (e. g., Bruker) provide VCD accessories to be used in conjugation with FT-IR spectrometers. To examine the accuracy of a VCD instrument, optically pure a-pinene or a CCl4 solution of camphor are widely used as standards because their VCD spectra can be obtained at high signal-to-noise (S/N) ratios in relatively short scan times. The latter is particularly a good standard for the hydrogen stretching and the carbonyl stretching region. If a pair of enantiomers does not adequately exhibit sufficiently opposite VCD spectral patterns, a raw VCD can be corrected by the VCD spectrum of its enantiomer. A halfdifference spectrum is also calculated simply to obtain a more accurate VCD spectrum: _A(S)corrected = 1/2 [_A(S)raw _A(R)raw] (7) However, enantiomer correction can be performed only in the case where both enantiomers are available. Therefore, most sugars and proteins are inaccessible by this approach. An alternative and general way to correct a spectrum is solvent correction where the solvent spectrum is subtracted from the raw sample spectrum: _Acorrected =_Asample _Asolvent (8) Unless the sample is neat liquid, an IR spectrum also has to be corrected for the IR spectrum of the solvent. To obtain a VCD spectrum with higher accuracy in the desired wavenumber region, a solvent should be carefully selected as well as concentration, sample cell, and instrumental conditions. CCl4 or CDCl3 have been widely used for small chiral molecules but they are not suitable for most biomolecules that are intrinsically hydrophilic. Instead, water, deuterium oxide or DMSO-d6 have been frequently chosen to analyze biomolecules. These solvents might form hydrogen bonds with the sample molecules and then affect the VCD shapes, in part, by altering sample conformation. Such solvent contribution is not always undesired and, in practice, many biological molecules have been measured using such solvents [10]. However, in case the solvent contribution must necessarily be supressed, VCD can be measured in the solid state. Thus, some solid state VCD spectra for peptides have been measured in halocarbon oil [11], and VCD spectra for carbohydrates in KBr were recently reported [12]. When water or deuterium oxide is selected as a solvent, which is uncommon in a normal IR measurement, an ordinary NaCl or KBr sample cell must be avoided. This is typically replaced by a CaF2 or BaF2 sample cell. Though a little expensive, these are used in almost all VCD measurements. CaF2 windows preclude measurement below 1000 cm1. However, BaF2 affords a wider spectrum up to ~750 cm1 (see Fig. 5) but care must be taken regarding storing and handling because of the slight deliquescence of BaF2. In fact, solubilities of NaCl, BaF2, and CaF2 in 100 g H2O at 08C are 35 g, ~0.2 g, and ~0.002 g, respectively. IR absorbance adjusted to around 0.4 is optimal for VCD measurement, which will need a sample on the mg order. The high sample requirement is unfavorable for the measurement of rare biomolecules. Another disadvantage of
VCD is, due to the small magnitude of VCD signals, the necessity for longer collection time, usually 1 h or more. The aforementioned a-pinene is an exception. It offers VCD spectra in sufficiently high S/N ratios even in only 5 min scanning time. The problem of low S/N is being improved through new instrumental developments [13].
Mtodos experimentales Actualmente hay un factoryaligned pocos disponibles en el mercado Transformada de Fourier (FT)-VCD instrumentos. Chiralir, 1997 Lanzamiento de Bomem / BioTools, Inc., es el ms generalizada de estos. Adems, JV-2001, proporcionada por JASCO Co. desde 2001, ha sido muy popular. Ambos VCD sistemas pticos puede ser descrito por el diagrama de bloques simples mismo (Fig. 2). En ambos sistemas, la radiacin IR de una fuente de luz primero dirige a travs de un interfermetro de Michelson y pasa a travs de un filtro ptico para aislar a la regin espectral de inters. El haz de infrarrojos sigue a travs de un polarizador lineal que define un solo estado de polarizacin y luego a un ZeSe fotoelstica modulador (PEM) que modula la polarizacin entre izquierda y derecha de polarizacin circular los estados. Una muestra quiral en una celda de muestra adecuado IR es colocan directamente despus del PEM y el haz se concentra en 247 i 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figura 1. Tipo de radiacin y el CD correspondiente. VCD es considerado como una versin extendida de ECD convencionales. La ventaja de VCD viene de los detalles de espectroscopia de infrarrojos con el sensibilidad estereoqumica de CD. T. Taniguchi et al. Mol. Nutr. Alimentos Res. 2004, 48, 246 a 254 una lente a un nitrgeno lquido refrigerado por detector. La seal del detector es procesada por la electrnica posterior al rendimiento de IR y VCD espectros. En ambos espectrmetros, analizadores de la sensibilidad del detector (o transmisin polarizador) prohbe las mediciones en el regin del espectro por debajo de 750 cm-1. Adems de estos dos VCD instrumentos, otras compaas (por ejemplo, Bruker) proporcionan VCD accesorios que se utilizan en la conjugacin con los espectrmetros FT-IR. Para examinar la precisin de un instrumento de VCD, pticamente puro a-pineno o una solucin de alcanfor CCl4 son ampliamente utilizados como patrones, porque sus espectros VCD puede ser obtenidos en una alta relacin seal-ruido (S / N) en relativamente cortos tiempos de anlisis. Esto ltimo es particularmente un buen nivel para el hidrgeno se extiende y se extiende el carbonilo regin. Si un par de enantimeros no muestra suficientemente adecuada
frente a los patrones espectrales VCD, VCD materia prima puede ser corregido por el espectro de VCD de su enantimero. A halfdifference espectro tambin se calcula simplemente para obtener una ms precisa VCD espectro: ? A (S) corregido = 1 / 2 [A (S) en bruto -? A (R) en bruto] (7) Sin embargo, la correccin de enantimero se puede realizar slo en el caso de que ambos enantimeros estn disponibles. Por lo tanto, la mayora de los azcares y las protenas son inaccesibles por este enfoque. Una forma alternativa y en general para corregir un espectro es solvente correccin que se resta del espectro solvente del espectro de la muestra en bruto: ? Acorrected = ASAMPLE - Asolvent (8) A menos que la muestra es lquido puro, un espectro de IR tambin tiene que ser corregida por el espectro IR del disolvente. Para obtener un espectro VCD con mayor precisin en la nmero de onda deseada regin, un solvente debe ser cuidadosamente seleccionada, as como la concentracin, la muestra de clulas, e instrumental condiciones. CCl4 CDCl3 o han sido ampliamente utilizados para las pequeas molculas quirales, pero no son adecuados para la mayora biomolculas que son intrnsecamente hidroflico. En su lugar, agua, xido de deuterio o DMSO-d6 han sido con frecuencia elegido para analizar las biomolculas. Estos disolventes pueden formar enlaces de hidrgeno con las molculas de la muestra y despus afectan las formas VCD, en parte, mediante la alteracin de la conformacin de la muestra. Contribucin solvente no siempre es no deseado y, en la prctica, muchas de las molculas biolgicas se han medido el uso de disolventes tales [10]. Sin embargo, en caso de que la contribucin de disolvente necesariamente debe ser suprimida, VCD se puede medir en estado slido. As, algunos en estado slido VCD espectros para los pptidos se han medido en aceite de halocarbonos [11], y Espectros de VCD de hidratos de carbono en KBr fueron recientemente reportado [12]. Cuando el xido de deuterio o de agua se ha seleccionado como solvente, cual es poco comn en una medicin normal IR, una ordinaria NaCl o KBr clulas de la muestra debe ser evitado. Normalmente, esto se sustituida por una clula de la muestra CaF2 o BaF2. Aunque un poco caros, estos se utilizan en casi todas las mediciones VCD. CaF2 ventanas impiden la medicin por debajo de 1000 cm-1. Sin embargo, BaF2 ofrece un espectro ms amplio de hasta ~ 750 cm-1 (Ver fig. 5), pero se debe tener cuidado en relacin con el almacenamiento y la manipulacin, debido a la delicuescencia ligera BaF2. En De hecho, la solubilidad de NaCl, BaF2, y CaF2 en 100 g H2O 08C es de 35 g, aproximadamente 0.2 g, y ~ 0.002 g, respectivamente. Absorcin IR ajustado a alrededor de 0,4 es ptimo para VCD medicin, que tendr una muestra en el orden mg.
El requisito de la muestra de alta es desfavorable para la medicin de biomolculas raro. Otra desventaja de los VCD es, debido a la pequea magnitud de las seales de VCD, de la necesidad de tiempo de recogida de ms tiempo, por lo general 1 hora o ms. Lo anterior, a-pineno es una excepcin. Ofrece VCD espectro lo suficientemente alto en S / N, incluso en un solo 5 minutos el tiempo de anlisis. El problema de la baja S / N se mejorado a travs de nuevos desarrollos instrumentales [13].
Las aplicaciones de los espectros de vibracin son numerosas, especialmente su aplicacin en el conocimiento de la estructura molecular. Una gran cantidad de obras que tratan de las aplicaciones de los espectros IR y Raman se encuentran en la literatura. Por el contrario, las aplicaciones de VCD y ROA son relativamente nuevos. En las dos ltimas dcadas, los esfuerzos se han centrado en el estudio de los espectros experimentales de estructura y relacin en el desarrollo de un marco terico que pueda explicar y predecir las caractersticas experimentales. Hoy en da, es bien sabido que cuando la informacin derivada de la absorcin de corriente vibracional Raman y estudios se complementan con la de los espectros de vibracin actividad ptica, los detalles estructurales derivados tienen mayor validez. Con el fin de obtener los espectros de VCD y el ROA de un sistema qumico, este sistema tiene que exhiben quiralidad molecular o supramolecular. Debido a esto, esta tcnica tiene su aplicacin ms importante en el campo de las biomolculas.
2. Aplicaciones de las espectroscopias sensibles a la quiralidad VCD y ROA. Proporcionar una breve descripcin de los fundamentos de las tcnicas VCD y ROA y la informacin que se puede obtener con su aplicacin. Comentar un par de ejemplos de su aplicacin al estudio de biomolculas, las ventajas y desventajas que estas tcnicas ofrecen.
Bibliografa. (1) Tohru Taniguchi, Nobuaki Miura, Shin-Ichiro Nishimura, Kenji Monde, Vibrational circular dichroism: Chiroptical analysis of biomolecules, Mol. Nutr. Food Res. 2004, 48, 246 254. (2) Prasad L. Polavarapu. Chunxia Zhao, Vibrational circular dichroism: a new spectroscopic tool for biomolecular structural determination, Fresenius J. Anal. Chem. 2000, 366, 727734. (3) Juan Ramn Avils Moreno, Francisco Partal Urea, Juan Jess Lpez Gonzlez, Conformational preference of a chiral terpene: vibrational circular dichroism (VCD), infrared and Raman study of S-(-)-limonene oxide, Phys. Chem. Chem. Phys. 2009, 11, 24592467.
(4) Sergio Abbate, France Lebon, Giovanna Longhi, Francesca Fontana, Tullio Caronna, David A. Lightner, Experimental and calculated vibrational and electronic circular dichroism spectra of 2-Br-hexahelicene, Phys. Chem. Chem. Phys. 2009, 11, 90399043. (5) E. Deplazes, W. van Bronswijk, F. Zhu, L. D. Barron, S. Ma, L. A. Nafie, K. J. Jalkanen, A combined theoretical and experimental study of the structure and vibrational absorption, vibrational circular dichroism, Raman and Raman optical activity spectra of the L-histidine zwitterions, Theor. Chem. Account 2008, 119, 155176. (6) Shi Qiu, Guanna Li, Peng Liu, Changhao Wang, Zhaochi Feng, Can Li, Chirality transition in the epoxidation of ()-pinene and successive hydrolysis studied by Raman optical activity and DFT, Phys. Chem. Chem. Phys. 2010, 12, 30053013. (7) K. J. Jalkanen, I. M. Degtyarenko, R. M. Nieminen, X. Cao, L. A. Nafie, F. Zhu, L. D. Barron, Role of hydration in determining the structure and vibrational spectra of L-alanine and N-acetyl L-alanine N-methylamide in aqueous solution: a combined theoretical and experimental approach, Theor. Chem. Account 2008, 119, 191210. (8) O. McConnell, Y. He, L. Nogle, A. Sarkahjan, Application of Chiral Technology in a Pharmaceutical Company. Enantiomeric Separation and Spectroscopic Studies of Key Asymmetric Intermediates Using a Combination of Techniques. Phenylglycidols, CHIRALITY 2007, 19, 716730. UNIVERSIDAD DE JAN Facultad de Ciencias Experimentales
Dpto. de Qumica Fsica y Analtica Campus
Las Lagunillas, E-23071 Jan (Espaa / Spain), Tlfno: +34-953 21 33 60, Fax: +34-953 21 29 40 e-mail:jraviles@ujaen.es
(7) Algunos autores importantes en este campo son: L. A. Nafie, L. D. Barron, T. A. Keiderling, P. L. Polavalapu, T. Buffeteau, S. Abbate, J. Kapitan, etc.
2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de
MNF Educcattiion

Correspondence: Kenji Monde, Division of Biological Sciences, Graduate School of Science, Frontier Research Center for Post-genomic Science and Technology, Hokkaido University, Kita-ku, Sapporo 001-0021, Japan E-mail: kmonde@glyco.sci.hokudai.ac.jp Fax: +81-11-706-9041 (or -9042) Abbreviations: ECD, electronic circular dichroism; IR, infrared; VCD, vibrational circular dichroism
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Introduction
General aspects Chirality is a fundamental feature of all living organisms at the molecular level as well as on the macroscopic scale. The high degree of preference for only one of two possible mirror images in nature, such as L-amino acids or D-sugars, often called biological homochirality, is a puzzling and not yet fully understood phenomenon [1]. The chirality of some known compounds can be felt by smelling or tasting small amounts of them. As often exemplified by the sodium salt of glutamic acid or the hydrocarbon limonene, many chiral odorants or flavor compounds cause different sensory properties depending on their stereochemistry. This is because the receptors are proteins, constituted of chiral amino acids, which interact with enantiomers to form diastereomeric molecular complexes that result in various smells and tastes [2]. Stereospecific differences have more serious consequences in pharmacology, as shown in studies on enantiomeric pharmaceuticals including thalidomide or ibuprofen [3, 4]. The use of a chiroptical technique, except for X-ray crystallography, comprise the sole method to non empirically determine the absolute configuration of a compound [5]. Xray scattering based on the Bijvoet method has been quite effective in determining chirality, but the requirement that samples be in crystalline form has frequently limited its applicability. On the other hand, the chiroptical methods have an advantage of an accessibility to the samples in a solution. Recently, a new chiroptical method, vibrational circular dichroism (VCD) spectroscopy was developed. VCD measures the circular dichroism in the infrared region usually between 4000 and 750 cm1. Since the advent of the first commercial VCD instrument in 1997, VCD is becoming one of the most powerful and convenient analytical tools for natural products and biomolecules due to the abundance of spectral information including some well-isolated peaks in the 18001500 cm 1 region. In this paper, we describe some fundamental VCD concepts, instruments, and applications.
Introduccin Aspectos generales La quiralidad es una caracterstica fundamental de todos los organismos vivos a nivel molecular, as como en la escala macroscpica. El alto grado de preferencia por slo una de las dos imgenes especulares posibles en la naturaleza, tales como Laminocidos o azcares D, a menudo llamado homoquiralidad biolgica, es un fenmeno desconcertante y todava no se entiende completamente [1]. La quiralidad de algunos compuestos conocidos se pueden "sentir" al oler o probar pequeas cantidades de ellos. Como suele ejemplificado por la sal sdica del cido glutmico o el limoneno hidrocarburo, muchos olores o sabores compuestos quirales causar diferentes propiedades sensoriales en funcin de su estereoqumica. Esto es porque los receptores son protenas, constituido por quiral aminocidos, los cuales interactan con los enantimeros para formar diastereomricas complejos moleculares que dan lugar a distintos olores y sabores [2]. Diferencias estereoespecficos tener consecuencias ms graves en la farmacologa,
como se muestra en los estudios sobre productos farmacuticos, incluyendo enantimeros talidomida o el ibuprofeno [3, 4]. El uso de una tcnica chiroptical, excepto por cristalografa de rayos X, comprenden el nico mtodo para determinar no empricamente la configuracin absoluta de un compuesto [5]. Dispersin Rayos X, basado en el mtodo Bijvoet ha sido bastante eficaces en la determinacin de la quiralidad, pero el requisito de que las muestras de estar en forma cristalina con frecuencia ha limitado su aplicabilidad. Por otro lado, los mtodos chiroptical tienen una ventaja de un acceso a las muestras en una solucin. Recientemente, un mtodo chiroptical nueva vibracin dicrosmo circular (VCD) se desarroll la espectroscopia. VCD mide el dicrosmo circular en la regin infrarroja por lo general entre 4000 y 750 cm-1. Desde la llegada del primer instrumento comercial de VCD en el ao 1997, VCD est convirtiendo en uno de las herramientas analticas ms potentes y prcticos de los productos naturales y biomolculas debido a la abundancia de la informacin espectral incluyendo algunos picos bien aisladas en el 1800-1500 cm1 regin. En este trabajo, se describen algunos de los conceptos fundamentales de VCD, instrumentos y aplicaciones.
Theory of VCD Chiral molecules respond differently to left versus right circularly polarized radiation due to diastereomeric interaction. The measurements of this differential interaction relate to what is known as optical activity. The most familiar measurements are optical rotation, or optical rotatary dispersion when measured as a function of wavelength, and electronic circular dichroism (ECD). The electronic transitions of a chiral molecule give rise to circular dichroism (CD) in the visible ultraviolet (VIS-UV) spectral region. ECD spectrometers have been widely available for routine measurements since the early 1960s, whereas the measurement of CD in vibrational transitions, i. e., VCD, has been available only for a limited number of researchers until the late 1990s. The relationship between VCD and infrared (IR) absorption is the same as that between ECD and UV absorption (Fig. 1). VCD measures the differential absorption of left versus right circularly polarized IR incident light in the molecular vibrational transition.
Figure 1. Type of radiation and corresponding CD. VCD is considered as an extended version of conventional ECD. The advantage of VCD comes from the spectroscopic detail of IR with the stereochemical sensitivity of CD.
Teora de VCD
Las molculas quirales responden de manera diferente a la izquierda contra la derecha la radiacin polarizada circularmente debido a la interaccin de diastereoismeros. Las mediciones de esta interaccin diferencial se refieren a lo que se conoce como actividad ptica. Las mediciones ms conocidos son la rotacin ptica, o dispersin giratoria situada ptica cuando se mide como una funcin de longitud de onda, y electrnicos dicrosmo circular (ECD). Las transiciones electrnicas de una molcula quiral dar lugar a dicrosmo circular (DC) en el ultravioleta visible (VIS-UV) regin espectral. Espectrmetros de DPI han sido ampliamente disponible para las mediciones de rutina desde la dcada de 1960, mientras que la medicin de la CD en las transiciones vibracionales, i. e., VCD, ha estado disponible slo para un nmero limitado de investigadores hasta que el finales de 1990. La relacin entre VCD y absorcin en el infrarrojo (IR) es la misma que entre ECD y absorcin UV (fig. 1). VCD mide la absorcin diferencial de la luz incidente izquierda contra derecha polarizada circularmente en el IR transicin vibracional molecular. _ A = AL AR (1) where AL and AR are absorbances for left and right circularly polarized radiation, respectively. The ordinary IR absorption, A, is given by the average of AL and AR, namely, A = 1/2 (AL + AR) (2) and A = log10 (I/I0) (3) where I and I0 are the average transmission with and without the sample. Assuming the Beer-Lambert law is valid and in the case when the pathlength and concentration are known, VCD can be expressed in terms of the difference in molar absorptivity as _e = eL eR =_A/cl (4) where c is the molar concentration and l is the pathlength in cm. In this paper, measured VCD and IR spectra are expressed by_e and e, respectively. The anisotropy ratio, g, the quotient of the intensity of VCD to that of IR, is another significant parameter which is also specified in publications. g =_e/e = _A/A (5) The anisotropy ratio g, which is meaningful between ~103 to 105, could be a criterion for judging whether a vibrational mode can cause large or small VCD absorption. For instance, C=C=C antisymmetric stretching of a chiral allene shows strong VCD at around 1945 cm1 in spite of relatively small corresponding IR absorbance (g = ~103) [6], while C=O stretching of 3hydroxyoxindole at around 1730 cm1 has intense IR absorbance but small VCD (g =~105; see Fig. 3). The question of whether a vibrational mode exhibits large VCD or not is ultimately ascribed to the magnitude and direction of both electronic- and magneticdipole transition moments [7, 8]. The anisotropy ratio g is also important in terms of analytic calculations because it relates theoretical spectra to experimental ones by the following equation: g =_A/A = 4R/D (6)
where R and D are called rotatory strength and dipole strength, respectively. For a small molecule, both R and D can be calculated using Gaussian 98 or 03 [9]. A more complicated theoretical background of VCD is not addressed here, but more detailed descriptions are offered in other publications [7, 8]. A = AL AR (1) en AL y AR son las absorbancias de la radiacin izquierda y la derecha polarizada circularmente, respectivamente. La corriente de absorcin IR, A, est dada por la media de AL y AR, a saber, A = 1/2 (AL + AR) (2) y A = - log10 (I/I0) (3) donde e I0 son la transmisin media con y sin la muestra. Suponiendo que la ley de Beer-Lambert es vlida y, en el caso cuando el paso de luz y la concentracin son conocidos, VCD puede ser expresada en trminos de la diferencia de absortividad molar como _e = EL - ER = _A / cl (4) donde c es la concentracin molar y L es la longitud de trayecto en cm. En este trabajo, medida VCD y espectros IR se expresan by_e y E, respectivamente. La relacin de anisotropa, g, el cociente de la intensidad de VCD a la de infrarrojos, es otro parmetro importante que tambin se especifica en las publicaciones. g = _e / e = _A / A (5) La relacin de anisotropa g, que es significativa entre ~ 10-3 a 10-5, podra ser un criterio para juzgar si un modo de vibracin puede causar la absorcin de VCD grande o pequeo. Por ejemplo, C = C = C antisimtrica estiramiento de un aleno quiral muestra fuerte VCD en torno a 1945 cm-1, a pesar de absorbancia correspondiente relativamente pequeo IR (g = ~ 10-3) [6], mientras que C = O estiramiento de 3 -hydroxyoxindole en torno a 1730 cm-1 tiene una intensa absorcin de infrarrojos, pero pequea VCD (g = ~ 10.5;. ver Fig. 3). La cuestin de si un modo de vibracin exhibe grandes VCD o en ltima instancia, no se atribuye a la magnitud y direccin de los dos momentos de transicin y electrnicos-dipolo magntico [7, 8]. La relacin g anisotropa es tambin importante en trminos de clculos analticos porque se refiere a los espectros terico los experimentales por la siguiente ecuacin: g = _A / A = 4R / D (6) donde R y D se denominan fuerza rotatoria y la fuerza dipolo, respectivamente. Para una molcula pequea, ambos R y D se puede calcular utilizando gaussiana 98 o 03 [9]. Un marco terico ms complicado de VCD no se menciona aqu, pero las descripciones ms detalladas se ofrecen en otras publicaciones [7, 8].
Los mtodos experimentales En este momento hay una factoryaligned unos pocos disponibles en el mercado Transformada de Fourier (FT)-VCD instrumentos. Chiralir, lanzado en 1997 Bomem / Biotools, Inc., es el ms generalizada de estos. Adems, JV-2001, proporcionada por JASCO Co. desde 2001, ha sido muy popular. Ambos sistemas pticos VCD puede ser descrito por el diagrama de bloques simples mismo (Fig. 2). En ambos sistemas, IR radiacin procedente de una fuente de luz primero dirige a travs de un interfermetro de Michelson y luego pasa a travs de un filtro ptico para aislar la regin espectral de inters. El haz de infrarrojos contina a travs de un polarizador lineal
que define un estado de polarizacin y luego a un ZeSe fotoelstico modulador (PEM) que modula la polarizacin entre izquierda y derecha polarizadas circularmente estados. Una muestra quiral en una celda de muestra adecuado IR es coloca directamente despus de la PEM y el haz es enfocado con 247 i 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figura 1. Tipo de radiacin y CD correspondiente. VCD se considera como una versin ampliada de ECD convencional. La ventaja de VCD viene del detalle espectroscpico de IR con el la sensibilidad estereoqumica de CD. T. Taniguchi y col. Mol. Nutr. Resolucin de alimentos. 2004, 48, 246 a 254 una lente a un lquido enfriado con nitrgeno detector. La seal del detector es procesada por la electrnica posteriores para dar IR y VCD espectros. En ambos espectrmetros, la sensibilidad del detector (o transmisin polarizador) prohbe las mediciones en el regin espectral por debajo de 750 cm-1. Adems de estos dos VCD instrumentos, otras compaas (por ejemplo, Bruker) proporcionan VCD accesorios para ser utilizados en conjugacin con FT-IR espectrmetros. Para examinar la precisin de un instrumento de VCD, pticamente pura a-pineno o una solucin de alcanfor CCl4 son ampliamente utilizados como patrones, ya que su espectro de VCD puede ser obtenidos en una alta relacin seal a ruido (S / N) en relativamente cortos tiempos de anlisis. Esto ltimo es particularmente un buen nivel para el estiramiento de hidrgeno y el estiramiento del carbonilo regin. Si un par de enantimeros no muestran lo suficientemente adecuada frente a los patrones espectrales VCD, VCD materia prima puede ser corregida por el espectro de VCD de su enantimero. Un halfdifference espectro tambin se calcula simplemente para obtener una ms precisa VCD espectro: ? A (S) corregida = 1/2 [A (S) en bruto -? A (R) en bruto] (7) Sin embargo, la correccin enantimero se puede realizar slo en el caso en que ambos enantimeros estn disponibles. Por lo tanto, la mayora de los azcares y protenas son inaccesibles por este enfoque. Una forma alternativa y en general para corregir un espectro es solvente correccin donde se resta del espectro disolvente del espectro de la muestra en bruto: ? Acorrected = ASAMPLE -? Asolvent (8) A menos que la muestra es un lquido limpio, un espectro de IR tambin tiene que ser corregido por el espectro IR del disolvente. Para obtener un espectro VCD con una mayor precisin en el deseado regin nmero de onda, un disolvente debe ser cuidadosamente seleccionada, as como la concentracin, la muestra de clulas, e instrumental condiciones. CCl4 o CDCl3 han sido ampliamente utilizados para pequeas molculas quirales pero no son adecuados para la mayora biomolculas que son intrnsecamente hidroflico. En su lugar, agua, xido de deuterio o DMSO-d6 han sido frecuentemente elegido para analizar las biomolculas. Estos disolventes pueden formar enlaces de hidrgeno con las molculas de la muestra y luego afecta
las formas VCD, en parte, por la alteracin de la conformacin de la muestra. Contribucin disolvente tal no siempre es indeseable y, en prctica, muchas molculas biolgicas se han medido el uso de disolventes tales [10]. Sin embargo, en caso de que la contribucin disolvente necesariamente debe ser suprimida, el VCD se puede medir en el estado slido. As, algunos de estado slido VCD espectros para los pptidos se han medido en aceite de halocarbono [11], y Espectros de VCD para los hidratos de carbono en KBr fueron recientemente reportado [12]. Cuando el xido de deuterio o agua se selecciona como un disolvente, cual es poco comn en un entorno normal de medicin de infrarrojos, una ordinaria NaCl o clulas KBr muestra debe ser evitado. Esto es tpicamente sustituye por una celda de muestra CaF2 o BaF2. Aunque un poco caro, stos se utilizan en casi todas las mediciones de VCD. CaF2 ventanas impide la medicin por debajo de 1000 cm-1. Sin embargo, BaF2 proporciona un espectro ms amplio hasta ~ 750 cm-1 (Ver fig. 5), pero se debe tener cuidado con respecto a almacenamiento y manipulacin debido a la delicuescencia ligera de BaF2. En De hecho, la solubilidad de NaCl, BaF2, y CaF2 en 100 g H2O a 08C son 35 g, 0,2 ~ g, y 0,002 ~ g, respectivamente. Absorbancia IR ajustado a alrededor de 0,4 es ptimo para VCD medida, que tendr una muestra en la orden de mg. El requisito de la muestra de alta es desfavorable para la medicin de biomolculas raras. Otra desventaja de los VCD es, debido a la pequea magnitud de las seales VCD, el necesidad de tiempo de recogida ms largo, por lo general h 1 o ms. La antes mencionada un-pineno es una excepcin. Ofrece VCD espectros suficientemente altas relaciones S / N, incluso en slo 5 min tiempo de exploracin. El problema de la baja S / N est siendo mejorado a travs de los nuevos desarrollos instrumentales [13]. 248 i 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figura 2. Diagrama de bloques del diseo ptico de un FTVCD espectrmetro. Cada componente de Chiralir y JV2001 se ha mencionado anteriormente. Mol. Nutr. Resolucin de alimentos. 2004, 48, 246 a 254 CD emocional: el anlisis de biomolculas Chiroptical Determinacin de la configuracin absoluta Desde las primeras mediciones de VCD inform cristalina muestras en el ao 1973 [14], y para lquidos limpios en el ao 1974 [15], VCD se ha aplicado en muchos campos. Configuracin absoluta determinacin de compuestos sintticos o naturales pueden ser la aplicacin ms comn. Del mismo modo, VCD puede predecir un exceso enantiomrico en muestras farmacuticas [16]. La Figura 3 muestra un ejemplo de la determinacin del configuracin absoluta de los productos naturales, donde dos crucferas fitoalexina relacionados con metabolitos, dioxibrassinin (1) y 3-cianometil-3-hydroxyoxindole (2), se estudiaron [17]. 3-hidroxi-3-methyloxindole (3) se prepar como un modelo compuesto. Ntese que los espectros de VCD de un par de
enantimeros son imgenes especulares entre s. Generalmente, para determinar la configuracin absoluta de un compuesto, una enantiomricamente pura de la muestra tiene que estar preparado y su espectro medido. Adems, el espectro terico de VCD tiene que ser calculado para una o ms confrmero de energa ms bajo ( s) derivados por anlisis conformacional. Si dos o ms confrmeros se consideran, el espectro final se crea por superposicin de las poblaciones de Boltzmann ponderados. Conformacional anlisis debe realizarse con sumo cuidado, y una estricta debe evitar pasar por alto o ignorar una confrmero con energa menor, ya que incluso las pequeas conformacional diferencias puede cambiar drsticamente las caractersticas de VCD. Con respecto a este punto, VCD ha sido utilizada para analizar no slo la configuracin, sino tambin la conformacin. A la inversa, el requisito para analizar varios confrmeros hace que sea difcil de calcular el espectro de un VCD conformacionalmente molcula flexible. En el caso de un flexible compuesto, el espectro superpuesto VCD de baja varias conformadores de la energa, la suma de pesos de Boltzmann de los cuales cubre ms del 95% de las personas de todos los confrmeros brindar una mejor acuerdo entre un espectro calculado y observado uno. La estereoqumica de una molcula calculado es arbitrariamente seleccionado como (R) o (S) antes de clculo. Finalmente, un calculado espectro VCD se compara con la observada uno. La correspondencia de la seal y el patrn de frecuencia entre un espectro observado y la terica o su imagen de espejo indica que la estereoqumica del compuesto medido es el mismo que el uno o terica es su opuesto, respectivamente. En el estudio de la figura. 3, todos los espectros fueron calculados en el B3LYP/6-31G (d, p) con nivel de Gaussian 98 arbitrariamente por los (S)-enantimeros. Los espectros observado la presencia de 1, 2, y 3 tienen tres bandas caractersticas cerca de 1730, 1620 y 1470 cm-1, que tambin son exhibidas por los espectros calculados. Los signos de estas tres bandas mostr un razonable acuerdo entre la observada y calculada VCD con ligera diferencia de las frecuencias de sus nmero de onda. Estas comparaciones permitir a la conclusin de que las configuraciones absolutas de 1 y 2 son ambos S. Este resultado indic que podra ser VCD til en la determinacin de la estereoqumica absoluta de terciaria alcoholes. El anlisis estereoqumico es muy til para la biosntesis estudios sobre las vas y las investigaciones de actividad biolgica. As, VCD se puede aplicar a estos estudios. La eficacia de VCD se demuestra por su aplicacin a las investigaciones de productos naturales como el gosipol, un terpenoide polifenlica aldehdo se encuentra en las plantas de algodn [18], o sinttica molculas como la mirtazapina, un frmaco bien conocido ingrediente con efecto antidepresivo teraputica [19].
Peptides and proteins

VCD has also been used for the conformational analysis of peptides and proteins in an empirical manner. The secondary structure of a peptide or protein, such as a-helix, b249

Figure 3. Comparison of observed IR and VCD spectra of two phytoalexinrelated metabolites ()-1, ()-2 and a model compound ()-3 with their calculated spectra.
T. Taniguchi et al. Mol. Nutr. Food Res. 2004, 48, 246 254
sheet, or random coil, is reflected in the VCD shape of the amide I (C=O stretch) and the amide II (NH deformation and other vibration) regions (Fig. 4). AVCD spectrum of a right-handed a-helical structure was first reported for the polypeptide poly(benzyl-L-glutamate) in CHCl3 solution [20] exhibits a positive VCD couplet (a bisignate VCD couplet with a positive VCD and then a negative VCD with increasing wavenumber) in the amide I region and a small negative VCD in the amide II region. These VCD features of an a-helical structure can be observed in a protein containing a high fraction of a-helix such as hemoglobin [21]. A b-sheet structure exhibits distinctly different VCD features from an a-helix especially in the amide I region, where a b-sheet has a small negative VCD peak near 1600 cm1. In the amide II region, a VCD spectrum of a b-sheet often exhibits a negative VCD couplet (the opposite of a positive VCD couplet) with relatively small intensity. Concanavalin A, which has a high b-sheet content with almost no helical structure, exhibits a VCD band shape as shown in Fig. 4 [21, 22]. However, some of the b-sheet forming oligopeptides could assume a different spectral character particularly in the amide II region. A random coil is an interesting case for VCD studies. In the
amide I region the VCD spectrum has a negative VCD couplet in which a stronger negative peak appears at lower wavenumber and a positive one appears at higher wavenumber. Also, a weak negative peak is observed in the amide II region. The feature in the amide I region is opposite to that seen in a right-handed a-helix. Accordingly, a random coil is assumed to contain a substantial amount of local left-handed structure [23]. Although there are some differences in the frequency, it is noteworthy that VCD features observed in a random coil are similar to the VCD spectra calculated for a left handed poly-L-proline type helix [22]. Additionally, calculated VCD spectra for a-helix, b-sheet, and 310 helix reveal good agreement with observed ones. One problem in measurement of a peptide or a protein in aqueous solution is the solubility of the sample. Because of the strong IR absorption of the solvent (H2O around 1650 cm1), the pathlength must be reduced to ~6 lm. Therefore, the sample solution needs to be prepared at a high concentration. Also, in some cases, the solvent IR absorption itself may interfere with a highly accurate measurement in the amide I region. D2O provides an alternate possibility for measuring peptides or proteins at a lower concentration because a pathlength of 80 lm or more is acceptable. If D2O is used, a sample should be doubly lyophilized following dissolution in D2O before the VCD measurement to avoid expected noise caused by HD exchange during the measurement. Deuteration confers slightly different spectral shapes than those observed for a non-deuterated sample. For example, a deuterated a-helical structure exhibits a three peaked negative-positive-negative pattern in the amide I9 (C=O stretch of a deuterated sample) region. In many cases, a VCD spectrum in the amide II9 region of a deuterated peptide or protein exhibits characteristically weak features [24]. Conventional ECD has been a well-established and widespread technique for the analysis of the secondary structure of peptides or proteins in solution. In contrast, VCD data contain additional information relative to ECD data since the VCD is dominated by local chirality while ECD reflects global chirality for the sample of interest. In light of this, VCD plays a complementary role to ECD in peptide and protein conformational analyses.
Carbohydrates
Carbohydrates are important in synthetic research and industrial chemistry as chiral pools. Also, carbohydrates in the formof glycoproteins or glycolipids play a significant role in various biological phenomena investigated in the field of glycobiology [25]. However, in many cases, carbohydrate analysis is a laborious task due to the complex nature of carbohydrates. Therefore, several methods including NMR, MS and HPLC have been complementarily combined to study complex carbohydrate sequence, configura250

Figure 4. Model VCD shapes of a-helix, b-sheet, and random coil structure in the amide I and II regions depicted from hitherto reported data. According to the peptide sequence, some sample will have an additional peak or show weaker features. A deuterated sample exhibits different VCD patterns.
Mol. Nutr. Food Res. 2004, 48, 246 254 Vibrational CD: Chiroptical analysis of biomolecules
tion, conformation and composition. Yet, further development of analytical methods is still greatly desired. Irrespective of their chirality, most of carbohydrate analyses are
based on achiral theory, and chiral approaches have been of limited use. Optical rotation and optical rotatory dispersion provide indirect information about configuration and little
information about conformation. ECD would be more informative, but multistep chemical derivatization to add chromophores is required since the electronic transitions of most carbohydrates, excepting acid or amino derivatives, occur below 185 nm [26]. However, carbohydrates have well defined IR absorptions. Therefore, detailed stereochemical information can be extracted by VCD. Furthermore, VCD is very promising as an analytical tool because the parent IR spectra of various carbohydrates from monosaccharides to polysaccharides have already been measured to analyze their configuration and conformation.
Los pptidos y protenas VCD tambin se ha utilizado para el anlisis conformacional de pptidos y protenas en una forma emprica. El secundario estructura de un pptido o protena, tal como una hlice-, B249 i 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figura 3. Comparacin de IR observado y VCD espectros de phytoalexinrelated dos metabolitos (-) -1, (-) -2 y un modelo compuesto (-) -3 Con la calculada espectros. T. Taniguchi y col. Mol. Nutr. Resolucin de alimentos. 2004, 48, 246 a 254 bobina hoja, o al azar, se refleja en la forma de la VCD amida I (C = tramo O) y la amida II (N-H deformacin y otras regiones de vibracin) (Fig. 4). AVCD espectro de una mano derecha-una estructura helicoidal fue inform por primera vez para el polipptido poli (bencil-L-glutamato) en CHCl3 solucin [20] presenta un resultado positivo pareado VCD (un bisignate pareado VCD VCD con un resultado positivo y luego un negativos VCD con nmero de onda cada vez mayor) en la amida I regin y una pequea VCD negativo en la regin II amida. Estas caractersticas VCD de una estructura de una hlice puede ser observado en una protena que contiene una alta fraccin de una hlice como la hemoglobina [21]. Una estructura de hoja b presenta caractersticas muy diferentes VCD a partir de una una hlice especialmente en la amida I regin, donde a, b-hoja tiene un pequeo pico negativo VCD cerca de 1600 cm-1. En la amida II regin, un espectro de VCD de una hoja b menudo presenta un efecto negativo pareado VCD (lo contrario de un resultado positivo Pareado VCD) con una intensidad relativamente pequea. Concanavalina A, que tiene un alto contenido de B-hoja con casi ninguna helicoidal
estructura, exhibe una forma de banda VCD como se muestra en la fig. 4 [21, 22]. Sin embargo, algunos de los oligopptidos hoja B-formadoras puede asumir un carcter espectral diferente, especialmente en la amida regin II. Una bobina de azar es un caso interesante para los estudios de VCD. En el amida I regin del espectro VCD tiene un negativo pareado VCD en el que un pico ms negativo parece a un menor nmero de onda y una positiva aparece un mayor nmero de onda. Adems, un pico negativo dbil se observa en la amida II regin. La caracterstica de la regin I amida es opuesta a la que visto en un diestro una hlice. En consecuencia, un azar " bobina "se supone que contiene una cantidad sustancial de locales la mano izquierda la estructura [23]. Aunque hay algunas diferencias en la frecuencia, hay que destacar que las caractersticas de VCD observado en una "espiral aleatoria" son similares a los espectros VCD calculado para una hlice izquierda mano tipo poli-L-prolina [22]. Adicionalmente, calculado espectros VCD para una hlice-, B-hoja, y 310 de hlice revelan una buena concordancia con los observados. Un problema en la medicin de un pptido o una protena en solucin acuosa es la solubilidad de la muestra. Debido a la fuerte absorcin IR del disolvente (H2O alrededor 1650 cm-1), el paso de luz debe ser reducida a ~ 6 LM. Por lo tanto, la solucin de la muestra tiene que estar preparado en un alta concentracin. Tambin, en algunos casos, el disolvente de IR absorcin en s puede interferir con una medicin muy precisa en la regin I amida. D2O ofrece una alternativa posibilidad de que los pptidos o protenas de medicin a una menor concentracin porque un paso de luz de 80 lm o ms es aceptable. Si D2O se utiliza, una muestra debe ser doblemente liofilizado despus de la disolucin en D2O antes de que el VCD medicin para evitar el ruido causado por esperada H-D intercambio durante la medicin. Deuteracin confiere formas espectrales ligeramente diferentes a los observados para un no deuterado muestra. Por ejemplo, un deuterado una helicoidal estructura exhibe un pico tres negativa-positiva-negativa patrn en la amida i9 (C = O tramo de una muestra deuterado) regin. En muchos casos, un VCD espectro en la amida II9 regin de un pptido o protena deuterado exhibe caractersticamente caractersticas dbiles [24]. ECD convencional ha sido bien establecida y generalizada tcnica para el anlisis de la estructura secundaria de pptidos o protenas en solucin. En contraste, VCD datos contener informacin adicional en relacin con los datos de ECD, a partir el VCD est dominado por la quiralidad local, mientras que refleja ECD quiralidad global para la muestra de inters. En vista de esto, VCD desempea una funcin complementaria a la primera infancia en el pptido y conformacionales de protenas anlisis. Los hidratos de carbono Los carbohidratos son importantes en la investigacin y sinttico qumica industrial, como las piscinas "quirales". Asimismo, los hidratos de carbono en las glicoprotenas o glicolpidos formade jugar un importante papel en varios fenmenos biolgicos investigados en el
campo de la glicobiologa [25]. Sin embargo, en muchos casos, los hidratos de carbono anlisis es una tarea laboriosa debido a la naturaleza compleja de hidratos de carbono. Por lo tanto, varios mtodos, incluyendo RMN, MS y HPLC se han combinado de manera complementaria para estudiar la secuencia de hidratos de carbono complejos, confi250 i 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figura 4. Modelo VCD formas de una hlice, hoja B-, y estructura de bobina al azar en la amida I y II regiones representado a partir de los datos reportados hasta ahora. De acuerdo con el secuencia peptdica, algunos muestra tendr un adicional pico o muestran ms dbiles caractersticas. A muestra de ejemplo deuterados diferentes patrones de VCD. Mol. Nutr. Resolucin de alimentos. 2004, 48, 246 a 254 CD emocional: el anlisis de biomolculas Chiroptical cin, la conformacin y composicin. Sin embargo, un mayor desarrollo de mtodos de anlisis sigue siendo en gran medida deseada. Independientemente de su quiralidad, la mayora de los anlisis de hidratos de carbono son basado en la teora aquiral, y los enfoques han sido quirales de un uso limitado. La rotacin ptica y la dispersin ptica rotatoria proporcionar informacin indirecta acerca de la configuracin y poco informacin acerca de la conformacin. ECD sera ms qumica informativo, pero multipaso derivatizacin para aadir cromforos es necesaria ya que las transiciones electrnicas de la mayora de los hidratos de carbono, con la excepcin de cido o derivados de aminocidos, ocurrir por debajo de 185 nm [26]. Sin embargo, los carbohidratos tienen bien definida absorcin de rayos infrarrojos. Por lo tanto, estereoqumica detallada informacin se puede extraer por VCD. Adems, VCD es muy prometedor como herramienta de anlisis debido a que el padre espectros IR de los hidratos de carbono diferentes de monosacridos a los polisacridos ya se han medido a analizar su configuracin y conformacin.
So far, only a few VCD applications for carbohydrates have been reported in contrast to the more widely studied peptides and proteins. Most of the published papers deal with monosaccharides solely in the mid-IR region [12, 2730] or in the hydrogen stretching region [31, 32]. VCD spectra for some disaccharides in the mid-IR region appear in two publications including one review publication [33, 34]. The two publications also analyzed maltotriose and a-cyclodextrin. Observations of interactions between cyclodextrins and molecules or ions represent another area of interest [35, 36]. Nucleic acids and glycoproteins also contain a sugar moiety, but their VCD studies are not listed here. Except for such glycoconjugates, all these studies analyzed only simple sugars, and therefore available VCD peaks were concentrated at wavenumbers of 38002800 cm1 and below 1550 cm1 (Fig. 5). Actually, reported carbohydrate VCD spectra were restricted to 31002800 cm1 for stretching vibrations of single CH bond [31, 32], and restricted to 1550900 cm1 for stretching vibrations of single CO and CC bonds and for bending vibrations of various bonds [2729, 33, 34]. In particular, numerous absorptions were observed below 1550 cm1, but most of these showed weak and broad features. To amplify VCD intensity and to extend
the available spectral region, substitutions of hydroxyl groups could be effective. Polavarapu et al. [30] concluded that acetylated monosaccharides exhibited significant VCD peaks at ~1750 cm1 (C=O stretches) and ~1370 cm1 (bending of methyl groups). We also observed that benzoyl or other carbonyl-containing groups intensified the representative VCD signal about 10 times, but that other substituents such as benzyl groups did not result in a similar effect (unpublished data). Probably the introduction of carbonylcontaining groups constitute another possibility to analyze carbohydrates by VCD. Also, deuteration of hydroxyls by lyophilization from D2O can afford different useful VCD spectral features [28].
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Figure 5. IR absorption of simple carbohydrates and the measurement conditions. Detector: InSb detector and MCT detector have to be adopted for the measurement of the hydrogen stretching region and the fingerprint region, respectively. Cell: representative two cell windows are shown. The solid lines indicate the available spectral region but the cell windows have a little absorption in the dotted zones. If a data in the dotted region is required, a solvent absorption has to be reduced as far as possible. Solvent: representative three solvents, which are sufficiently polar to dissolve a carbohydrate sample, are shown. They have Little
Hasta el momento, slo unas pocas aplicaciones de VCD para los hidratos de carbono tienen han reportado en contraste con los pptidos ms ampliamente estudiados y protenas. La mayora de los trabajos publicados frente a monosacridos slo en la regin de infrarrojo medio [12, 27-30] o en la regin de hidrgeno estiramiento [31, 32]. VCD espectros para algunos disacridos en la regin media del IR aparecen en dos publicaciones, incluyendo la publicacin de revisin un [33, 34]. La dos publicaciones tambin analiz maltotriosa y una ciclodextrina. Las observaciones de las interacciones entre las ciclodextrinas y de molculas o iones representan otra rea de inters [35, 36]. Los cidos nucleicos y glicoprotenas tambin contienen un azcar fraccin, pero sus estudios de VCD no se mencionan aqu. Excepto glicoconjugados tales, todos estos estudios se analiza solamente sencilla azcares, y los picos de VCD por lo tanto, disponibles se concentraron en nmeros de onda de 3800-2800 cm-1 y por debajo 1550 cm-1 (Fig. 5). En realidad, inform carbohidratos VCD los espectros se restringe a 3100-2800 cm-1 para el estiramiento vibraciones de un solo enlace CH [31, 32], y se limita a 1550-900 cm-1 para las vibraciones de un solo C-O y C-C bonos y las vibraciones de flexin de varios bonos [27-29, 33, 34]. En particular, absorciones numerosos fueron observado por debajo de 1550 cm-1, pero la mayora de ellos mostr dbil y caractersticas generales. Para amplificar la intensidad de VCD y se extienden a la regin espectral disponible, las sustituciones de hidroxilo grupos podra ser eficaz. Polavarapu et al. [30] lleg a la conclusin monosacridos acetilados que present ms VCD picos a ~ 1750 cm-1 (C = O) se extiende y ~ 1370 cm-1 (flexin de grupos metilo). Tambin se observ que de benzoilo o otras que contienen grupos carbonilo intensificado el representante VCD seal unas 10 veces, pero que otros sustituyentes tales como grupos bencilo no dio lugar a un efecto similar
(Datos no publicados). Probablemente, la introduccin de carbonylcontaining grupos constituyen otra posibilidad de analizar hidratos de carbono por parte de VCD. Adems, deuteracin de hidroxilos por liofilizacin de D2O puede permitirse diferentes tiles VCD caractersticas espectrales [28]. 251 i 2004 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de Figura 5. IR absorcin de hidratos de carbono simples y las condiciones de medicin. Detector: detector de InSb y el detector MCT tienen que ser adoptadas para la medicin de la regin de hidrgeno de estiramiento y la regin de huellas dactilares, respectivamente. Celular: representante dos ventanas de las celdas se muestran. Las lneas continuas indican la regin espectral disponible, pero los ventanas de las celdas tienen un poco absorcin en las zonas punteadas. Si un conjunto de datos en la regin de puntos se requiere, una absorcin de disolvente tiene que ser reducido en la medida de lo posible. Disolvente: representativas tres disolventes, que son suficientemente polar para disolver una muestra de hidratos de carbono, se muestran. Ellos tienen poco
Prasad L. Polavarapu Chunxia Zhao
Vibrational circular dichroism: a new spectroscopic tool for biomolecular structural determination
Fresenius J Anal Chem (2000) 366 :727734 Springer-Verlag 2000 Received: 31 August 1999 / Revised: 2 November 1999 / Accepted: 14 November 1999
Abstract Vibrational circular dichroism (VCD) in the past two decades has developed into a powerful new structural tool. A concise review of the applications of VCD to determine the structures of various biological molecules, namely peptides and proteins, nucleic acids and carbohydrates, is provided.
Resumen dicrosmo circular vibracional (VCD) en el ltimas dos dcadas se ha convertido en una nueva y poderosa estructura herramienta. Una revisin breve de las aplicaciones de VCD a determinar las estructuras de varias molculas biolgicas, a saber, pptidos y protenas, cidos nucleicos y carbohidratos, se proporciona.
1 Introduccin Las estructuras de biomolculas en la fase de solucin se determinan, en la mayora de los casos, de resonancia magntica nuclear (RMN) o estudios de dicrosmo circular electrnicos (ECD). En una mayora de los estudios de ECD, las caractersticas dicrosmo circular asociado con uno o dos transiciones electrnicas que aparecen en el rango visible se utilizan para deducir las estructuras. Muy a menudo, en particular cuando la molcula de bajo consideracin no tiene cromforos que absorben en el visible regin, las transiciones electrnicas de la molcula de bajo cuenta aparecer en la regin del ultravioleta lejano. Este Es cierto en la mayora de pptidos y protenas. Es muy comn que los
estos sistemas para contener grupos aromticos y en tales casos las transiciones electrnicas de los residuos aromticos se superponen con los de los grupos de pptidos. Cuando esto sucede la estructura general del pptido / protena no es claramente revelado por las caractersticas de DIT observados. Aun cuando hay estn sin interferir residuos aromticos, el nmero de acceso transiciones electrnicas se limita por lo general, limitando as deducible de la informacin estructural de la primera infancia. A pesar de estos inconvenientes, la ECD en el siglo pasado tiene resultado [1] a ser un extremadamente til, y se practica ampliamente tcnica para la determinacin de la estructura biomolecular. Un mtodo alternativo que mantiene o mejora en, la sensibilidad estructural que tiene ECD, pero elimina la limitaciones antes mencionadas se saludaron con entusiasmo por la comunidad de la biologa estructural. Vibracional dicrosmo circular (VCD), donde dicrosmo circular es seguimiento en las transiciones vibracionales, es una de esas alternativas mtodo [2]. La ventaja de VCD proviene (A) la presencia de numerosos transiciones vibracionales (como oposicin a limitados transiciones electrnicas), (b) el natural separacin de la vibracin que se extiende desde el carbonilo aromtico vibraciones del grupo (a diferencia de la superposicin de electrnica transiciones de grupos de pptidos con los de aromtico residuos). Sin embargo, estas ventajas a expensas de (a) menor magnitud de las seales de VCD, que requieren ya la recopilacin de datos, (b) el aumento de concentraciones de la muestra necesario para medir el VCD y (c) el uso restringido de agua como disolvente. Estas desventajas, sin embargo, estn abrumados por la cantidad de informacin disponible estructurales partir de los espectros de VCD. En el presente manuscrito, se hace un intento para proporcionar un resumen de la utilidad de VCD para biomolecular estructura de determinacin. El nfasis est en dar una descripcin concisa resumen, en lugar de una una amplia, de modo que una recin llegado a esta zona se puede encontrar referencias apropiadas y cmodas.
2 Los mtodos experimentales Instrumentacin. Actualmente hay dos tipos de instrumentos en uso para los estudios de VCD. (A) dispersivo VCD instrumentos [2, 3], (b) la transformada de Fourier de infrarrojos (FTIR)-VCD instrumentos [4]. Instrumentos dispersivos se utilizan generalmente para medir VCD en el hidrgeno / deuterio estiramiento regin (3500-2000 cm-1). En esta regin, FTIR-VCD instrumentos Se han utilizado solamente para la demostracin de la viabilidad, pero no para las mediciones de rutina de VCD. En el Por otro lado, para las mediciones de VCD en los ~ 2000-600 cm-1 regin, los instrumentos de dispersin y FTIR-VCD tienen han utilizado, aunque en los ltimos aos FTIR-VCD instrumentos son ms comnmente utilizados. Todos los instrumentos dispersivo VCD utilizado hasta la fecha se han construido en la casa y
no se han comercializado a partir de ahora. El lector puede encontrar la informacin pertinente sobre estos instrumentos en [2] y [3]. Hasta hace poco, los instrumentos FTIR-VCD fueron Prasad L. Polavarapu Chunxia Zhao Dicrosmo circular vibracional: una herramienta espectroscpica nueva para la determinacin estructural biomolecular Fresenius J Anal Chem (2000) 366 :727-734 Springer-Verlag 2000 Recibido: 31 de agosto de 1999 / Revisado: 2 de noviembre de 1999 / Aceptado: 14 de noviembre 1999 EXAMEN P. L. Polavarapu (Y) Cap. Zhao Departamento de Qumica de la Universidad de Vanderbilt, Nashville, TN 37235, EE.UU. tambin construido en la casa, pero que ya estn disponibles comercialmente. Los detalles de FTIR-VCD instrumentacin puede ser encontrarse en [4], mientras que los de un comercial de FTIR-VCD instrumento puede obtenerse a partir de [5]. Todos los espectros se muestran en este manuscrito se midieron en nuestro laboratorio usando un instrumento comercial VCD CHIRALIR [5]. Preparacin de la muestra. Mediciones de VCD son comnmente cabo sobre muestras en el lquido (como puro o en solucin) o fases de gas. A pocas mediciones se han hecho para muestras en la fase slida (como mulls), pero los artefactos posibles aqu se limitan tales mediciones. Los disolventes orgnicos inertes tales como CCl4 y CS2 son buenos disolventes para los estudios de VCD en la regin del infrarrojo medio, como la absorcin de infrarrojos interferir a partir de estos disolventes se limita a la frecuencia pequea rangos. El agua tiene una fuerte absorcin en el infrarrojo a ~ 1650 cm-1, como consecuencia de la cual el agua puede ser utilizado como disolvente slo cuando la longitud de trayecto corto (~ 6 mm) y mayor concentracin de la muestra puede ser empleado. Diferentes rangos de frecuencia son accesibles en disolventes tales como D2O, DMSO-d6, CHCl3, CDCl3, trifluoroetanol, metanol y propanol-D4. A menos que caminos pticos muy pequeos se pueden utilizar, los rangos de frecuencia que no son accesibles en la regin 2000-700 cm-1 con estos disolventes son: por debajo de 970 cm-1 en CCl4, del ~ 1640-1350 cm-1 en CS2, del ~ 1260-1175 cm-1 en CHCl3, por debajo de 975 cm-1 en CDCl3, del ~ 1100-970 cm-1 en DMSO-d6, por debajo de 1300 cm-1 en D2O, por debajo de 1200 cm-1 en metanol-D4 y por debajo de 1500 cm-1 en propanol y trifluoroetanol. Las concentraciones de la muestra necesario para estudios VCD depender de la mencionada interferencia absorcin de disolvente y de la absorcin intensidades de la muestra. Generalmente es necesario para mantener la absorbancia (de disolvente + soluto) por debajo de ~ 1,0. Para el control de el VCD en la regin de carbonilo, la concentracin empleadas en la mayora de los pptidos es del orden de 4 mg / ml o superior. 3 Terminologa Algunos de los trminos utilizados en la literatura que es relevante para la presente discusin se resume a continuacin. (a) Bisignate VCD copla: Un par de bandas de VCD, con
signos opuestos, que aparecen uno junto al otro, los asociados con una banda de absorcin, (b) Positivo pareado VCD: Un bisignate pareado VCD VCD con positivo en la parte inferior frecuencia lado negativo y VCD en la frecuencia ms alta lado de una banda de absorcin, (c) Negativo pareado VCD: Un bisignate pareado VCD con negativos VCD en la parte inferior frecuencia lado positivo y VCD en la frecuencia ms alta lado de una banda de absorcin, (d) sesgo positivo: la intensidad VCD de componente positivo es mayor que la de negativo componente en un pareado VCD, (e) el sesgo negativo: el Intensidad VCD de componente negativo es mayor que el de componente positivo en un pareado VCD; (f) amida Una regin (3400-3200 cm-1): La regin donde se extiende el NH vibracin del grupo amida aparece; (g) amida I regin (1800-1600 cm-1): La regin en la que C = O se extiende vibracin del grupo amida aparece; (h) amida II regin (1600-1500 cm-1): La regin donde la mayor parte Vibracin NH flexin acoplado a la vibracin NC estiramiento del grupo amida aparece: (i) amida III regin (1300-1100 cm-1): La regin donde la mayor parte Vibracin NC estiramiento acoplado a la vibracin de flexin NH del grupo amida aparece, (j) amida regin A : La regin donde el ND estiramiento vibracin del grupo amida deuterado aparece; (k) amida regin de I (1800 1600 cm-1): La regin donde el C = O estiramiento vibracin del grupo amida, con N-H deuterado, aparece. (l). Amida II regin de (1500-1400 cm-1): La regin en la que predominantemente ND vibraciones de flexin, junto a la CN vibracin de tensin del grupo amida aparece
4 estructura de Spectra-correlaciones A pptidos y protenas Correlacin de los VCD con el pptido / protena de estructura secundaria: Las estructuras secundarias ms comunes de las protenas son una hlice, la bobina B-hoja y al azar. Adems, 310-hlices, b-vueltas, b-horquillas y p hlices tambin se encuentran en las estructuras de protenas. En esta seccin, un resumen de las correlaciones encontrado, a travs de observaciones experimentales, entre VCD y conocidas estructuras secundarias se da. una hlice. En solucin de cloroformo, poli (g-bencil-L-glutamato) Se considera que adoptar un diestro una helicoidal estructura. El espectro de VCD de poli (g-bencil-L-glutamato) en la amida Una regin tiene un efecto negativo pareado VCD [6] con sesgo positivo, asociado con la banda de absorcin a ~ 3290 cm-1. Un resultado positivo de copla VCD est presente en la amida I regin. En la amida regin II, la absorcin de banda a ~ 1550 cm-1 se asocia con el pequeo inconveniente de VCD. Pero en 1520 cm-1, donde la banda de absorcin tiene una leve intensidad, una seal negativa grande VCD est presente. El VCD caractersticas mencionadas en las tres regiones se consideran ser caracterstica de un diestro estructuras helicoidales,
como se evidencia por las caractersticas similares para otros pptidos que se sabe que tienen un diestro estructuras helicoidales. Estudios posteriores en una variedad de polipptidos indicado estos patrones para presentar las caractersticas de la mano derecha a-hlice. Cuando el protn amida se deuterados, VCD cambios desde un pareado negativa-positiva en la amida I regin a un negativo positivo-negativo triplete. El espectro de VCD de la hemoglobina, que se sabe que la mano derecha una helicoidal estructura, se muestra en la fig. 1. El poli (b-bencil-L-aspartato), que se sabe que tiene un zurdo una estructura helicoidal en solucin de cloroformo, da [6] signos opuestos para VCD. Aunque las caractersticas de VCD visto en la amida regin II no son bastante para reflejar imgenes polipptidos con derecha e izquierda, los zurdos estructuras helicoidales una clara diferencia est presente entre ellos. b-hoja. Poli (L-lisina) cuando se calienta en condiciones de pH alto adopta antiparalela b-hoja de estructura. El espectro de VCD de poli (L-lisina) en D2O a pH 11,5, se calienta a 65 C, muestra dos bandas separadas negativas en la regin I de amida [7]. Estos son considerados como rasgos caractersticos de 728 la antiparalela b-hoja de estructura. Para situaciones donde un una mezcla de estructuras de hlice y b-hoja estn presentes, el observ VCD en la amida I regin muestra una mezcla de a-hlice y b-VCD hoja de espectros, con una forma de W. La VCD espectro de citocromo-c, que se sabe que tiene una mezcla de estructuras a-hlice y b-hoja, se muestra en Fig. 2. Hlices al azar. Poli (tirosina) se conoce a someterse disolvente inducida transiciones estructurales. En dimetilsulfxido (DMSO) disolvente, la estructura de poli (L-tirosina) se considera a ser una bobina al azar, mientras que en disolvente mixto sistemas (vase ms adelante) es un diestro de una hlice. Un, bien ordenado pero que no se repite la conformacin generalmente se clasifica como la estructura de la bobina. Algunas veces esto tambin se refiere como espiral aleatoria (aunque esto no significa realmente aleatoria o estructura desordenada). Poli (L-tirosina) en sulfxido de dimetilo muestra solventes [6] un resultado positivo pareado VCD en la amida Una regin y una negativa pareado VCD en la regin I de amida. Dbiles seales VCD se ven en la amida regin II con un banda positiva a 1520 cm-1. Estos patrones de signos son opuestos a las observadas para la mano derecha una hlice las estructuras, pero son similares a los observados para zurdos una hlice estructuras. Cuando el disolvente se cambia de dimetilsulfxido puro a una mezcla 80:20 (en volumen) de dimetilsulfxido con cido dicloroactico, (o con cido trifluoroactico) el VCD firman los patrones en la amida regiones A y se invierten. En Adems, la amida regin II en este sistema disolvente mixto muestra dos bandas negativas VCD, uno en 1545 cm-1 y otro en 1520 cm-1. El espectro de VCD de poli (L-tirosina) en una mezcla 50:50 de sulfxido de dimetilo y trimetil fosfato es similar a la observada en el sulfoxidedichloroacetic dimetil
cido mezcla. Estos estudios son VCD en concurrencia con las conclusiones de la literatura que la poli (L-tirosina) adopta un diestro una estructura helicoidal en el disolvente mixto Los sistemas mencionados anteriormente. En dimetil sulfxido disolvente, la estructura de poli (L-tirosina) se sugiri a ser una bobina al azar, pero la similitud de VCD espectros obtenidos aqu a los obtenidos para un zurdo estructuras helicoidales sugiri que la estructura de bobina al azar aqu tiene algunos zurdo ordenamiento local. Poli (L-lisina) se sabe que existe en la estructura de bobina al azar a pH neutro. El espectro de VCD de poli (L-lisina) a un pH neutro en D2O muestra [7] un pareado negativa con sesgo negativo en la regin de amida de I (Ver fig. 3). As, un pareado negativa (con una polarizacin negativa) en el regin amida I (o amida I ) es un rasgo caracterstico de estructura de la bobina al azar con una izquierda ordenamiento local manos en la masa. Una estructura de bobina al azar sin ningn tipo de ordenamiento local podra ser denominado "desordenada espiral aleatoria" estructura. En tales casos, VCD en la regin I amida desaparece. Por ejemplo, poli (L-lisina) en condiciones de alta salinidad (en 5 M Solucin de NaCl) pierde toda la intensidad de VCD en la amida I regin [7]; gramicidina D en DMSO-d6 o solucin trifluoroetanol, donde se sabe que en la estructura de bobina al azar, no muestra VCD (ver fig. 4). 729 Fig. 1 La absorcin (parte inferior) y VCD (arriba) del espectro de la hemoglobina en H2O (concentracin: 254 mg / ml; paso de luz: ~ 7 mm) en La amida I y II regiones Fig. 2 La absorcin (parte inferior) y VCD (arriba) del espectro del citocromo C en H2O (concentracin: 252 mg / ml; paso de luz: 6 mm) en la amida I y II regiones 310-hlice. Las protenas que adoptan 310-hlice estructura son menos comn, pero la presencia de un dialquilado-amino isobutrico cido (AIB) de residuos en polipptidos aparentemente bloqueados favorece la formacin de esta estructura. Tales pptidos Se estudiaron [8] para establecer la caracterstica VCD caractersticas asociadas con las estructuras de 310-hlice. La amida Una pareado est positivamente sesgada para las estructuras de una hlice, pero es casi equilibradas para 310-hlice estructuras. En la amida II regin, sin embargo, 310-hlice estructuras dan negativo VCD que se asocia con la intensidad de absorcin sustancial en Del ~ 1520 cm-1. Esto es diferente de la observada en las estructuras de una hlice, donde la intensidad pico de absorcin es a ~ 1550 cm-1, y los picos negativos VCD intensidad a ~ 1520 cm-1. El diestro 310-hlice de la estructura se pueden distinguir de la mano derecha una hlice estructura basada en la relacin intensidades de las bandas de amida I y II, en lugar de en el patrn de seal. Amida I VCD est positivamente sesgada y es mucho ms dbil de amida II VCD para una estructura 310-hlice, mientras amida I VCD es negativamente sesgada y es mucho ms fuerte que amida II VCD para un diestro de una hlice. b-doble espiral de la cinta. Oligopptidos terminales bloqueados (Lproline-
Aib) N y Aib-(L-prolina-Aib) n, donde se encuentra Aib para un residuo de cido-aminoisobutrico, se sugiri que tienen b-doblar las estructuras de la cinta en espiral que se consideran un tipo de estructura sub-310-hlice. Los espectros obtenidos VCD para tales pptidos en solucin de cloroformo se indica [9] que la regin I de amida tiene una copla positiva, con un sesgo positivo, centrado en ~ 1641 cm-1. El algo ms alto amida I frecuencia aqu (en comparacin a la de la prolina oligmeros) se atribuye a la presencia tanto de secundaria y grupos amida terciaria. La amida regin II muestra una fuerte negativa VCD en 1535 cm-1, que es tambin la posicin de mxima absorcin fuerte. Estos son tambin el rasgos caractersticos asociados anteriormente con 310-helicoidal estructuras. Entonces uno puede apoyar la idea de que la curva de la cinta-b estructuras espirales se relacionan con 310 estructuras helicoidales. Sin embargo, esta observacin tambin puede ser visto como un reflejo la insuficiencia de la amida I en la diferenciacin de las caractersticas de VCD entre estos dos tipos de estructuras. La cadena dependencia de la longitud de las intensidades normalizadas VCD indica que el carcter de la cinta b-curva emerge tan pronto cuando n = 2 o 3 y se desarrolla por completo en n = 5 a 6. b-vuelta. As como una estructura de bobina representa una que no se repite conformacin de un "giro" tambin representa una conformacin que no se repite con al menos cuatro residuos de aminocidos que participan en un turno. En un giro comn (denominado de tipo I vuelta), los cuatro tomos de carbono a los que un ngulo diedro de 45 ~. A su vez glicina (referido como tipo A su vez II), el cuatro a-carbonos y el enlace de hidrgeno (entre el O = C de residuo 1 y NH del residuo 4) mantenerse aproximadamente en un avin. Un gsu vez, en contraste se estabiliza por 1-3 H-unin. El cristal estructura de un pentapptido cclico, ciclo-(-Gly-Pro-GlyD-Ala-Pro) revela un giro de tipo II y una vez g. El VCD espectro en la regin que mostr amida [10] una negativa 730 Fig. 3 La absorcin (parte inferior) y VCD (arriba) el espectro de poli (L-lisina) en D2O (concentracin: 50 mg / ml) en la amida I y en las regiones II Fig. 4 La absorcin (parte inferior) y VCD (arriba) del espectro de la gramicidina D en DMSO-d6 (concentracin: 4 mg / ml; paso de luz: 350 mm) en la amida I y II regiones positiva-negativa patrn. Estos picos estn bien separadas en comparacin con las observadas en VCD espectros asociado con unhlice, b hojas y las estructuras de la bobina. El espectro de VCD de ciclo-(Cys-Pro-Gly-Cys-) en sulfxido de dimetilo disolvente muestra un patrn similar, con mucho menos negativa de intensidad VCD para el enlace de baja frecuencia. El espectro de VCD este pptido cclico y el de ciclo-(Gly-Pro) 3 se encontraron para mostrar cambios significativos en funcin del disolvente. Lo Se sugiri que la movilidad conformacional de este pptido cclico puede ser convenientemente probaron utilizando VCD. La amida Un VCD de oligopptidos que contienen bloqueados prolina, en disolventes orgnicos, se encontraron [11] para exhibir
rasgos caractersticos de conformaciones que representan el g-y b-turnos. b-horquilla. Una variedad de pptidos que se sabe que adoptar horquilla b-estructuras han sido estudiados. En todos estos casos, la amida I VCD se encuentra que es claramente diferente y es caracterstico de estructuras de horquilla [12]. p-(doble) hlices. Gramicidina D diferentes tipos de forma doble hlice o de las estructuras p-helicoidales en diferentes ambientes. En presencia de iones Cs + en metanol-D4, que adopta un diestro doble hlice antiparalela. El VCD espectro de gramicidina D en la presencia de iones Cs + muestra dos coplas yuxtapuestos negativos [13] en la amida I regin, y un pareado positivo en la amida regin II. Este patrn, diferente de los observados para cualquier otra estructura, caracteriza de la mano derecha de doble hlice antiparalela (ver Fig. 5). En presencia de iones Ca2 +, la estructura de gramicidina D cambios en zurdos doble hlice paralela. Este reversin de uso de las manos muestra claramente en el espectro de VCD de gramicidina D en la presencia de iones Ca2 + (ver fig. 6), como dos coplas positivos yuxtapuestos se ven en la amida I regin, y una copla negativo en la amida II regin [13]. B cidos nucleicos Dos regiones espectrales diferentes fueron usados para investigar las estructuras de cidos nucleicos utilizando espectroscopa VCD [14-16]. Una regin es 1700-1600 cm-1 donde C = O, C = N y C = C modos de estiramiento de las bases de cidos nucleicos se espera a aparecer. Las bandas de absorcin que aparecen por encima de Del ~ 1650 cm-1 estn asociados con el C = O y apareciendo los por debajo, aproximadamente 1650 cm-1 se asocian con C = C los modos de tensin (con una cierta contribucin de C = N estirando as). La adenosina no tiene grupos C = O, pero citosina, inosina, guanosina y tienen un grupo C = O cada y uridina tiene dos grupos C = O. Esta diferencia en el composicin qumica bsica se puede esperar que influyen la naturaleza de VCD de cidos nucleicos con base diferente composiciones. El espectro de VCD de cido poliadenlico [Poli (A)], en la regin 1800-1400 cm-1, se muestra en la fig. 7. 731 Fig. 5 La absorcin (parte inferior) y VCD (arriba) del espectro de la gramicidina D en metanol-d4 (concentracin: 4 mg / ml; paso de luz: 325 mm) en la presencia de iones Cs + (concentracin: 40 mM) en el amida I y II regiones Fig. 6 La absorcin (parte inferior) y VCD (arriba) del espectro de la gramicidina D en metanol-d4 (concentracin: 4 mg / ml; paso de luz: 325 mm) en la presencia de iones Ca +2 (concentracin: 4,8 mM) en el amida I y II regiones La segunda regin es 1250-1000 cm-1, donde la simtrica antisimtricas y los modos de tensin de la PO2 - Grupo de y algunos modos de vibracin de la fraccin de azcar se espera a aparecer. Si estos modos no estn acoplados a los procedente de las bases, a continuacin, el VCD que aparece en
esta regin se puede esperar que sea independiente de la base composicin. Homopolmeros de ARN. En el 1700-1600 cm-1 regin, monoribonucleotides se encontr que tenan [14] muy poco VCD. Pero dmeros se encontraron para dar un positivo dbil VCD copla. El mismo patrn VCD signo tambin est presente para los homopolmeros de cidos ribonucleicos, pero con las magnitudes de las intensidades de VCD mejorado significativamente. Estos observaciones llevan a la sugerencia de que la positiva observada Pareado VCD es principalmente debido al acoplamiento base-base. Entre los homopolmeros de cidos ribonucleicos, poli (rI) se encontr para dar dos a tres veces ms grande VCD magnitudes que poli (rA) y poli (RC), y una orden de magnitud mayor que las magnitudes VCD poli (rG) y poli (RU). Si bien estas grandes diferencias en las magnitudes de VCD debe reflejar la intensidad de algunas diferencias en la conformacin detalles, la invariabilidad del patrn de seal de VCD entre estos cidos ribonucleicos poli proporcionado un comn factor para la investigacin estructural. Copolmeros de ARN. Los copolmeros de cidos ribonucleicos Tambin se encontraron [14], para dar un resultado positivo en la copla VCD 1700-1600 cm-1 de la regin. En el caso de poli (rC, RU), el normalizadas magnitudes VCD resultaron ser, aproximadamente, la media de las que se encuentran para el poli (RC) y poli (RU). Tal caracterstica aditivo no es aplicable en general, porque en el caso de poli (A, U) y poli (A, C), el observados magnitudes VCD no corresponden a los promedios de las magnitudes encontrados para el individuo polyribonucleic cidos. El espectro de VCD de poli (I, C) se encontr que ser bastante similar a la de poli (I), con una diferencia de ser que las posiciones de la banda de absorcin y VCD de poli (I, C) hacia arriba desplazado en la posicin de frecuencia. Dobles y triples polmeros hebra. Los espectros de VCD los polmeros de doble filamento de poli (I) poli (C) y poli (A) poli (U) se encontr que eran similares a las de la correspondiente copolmeros poli (I, C) y poli (A, U), respectivamente. Las aplicaciones ms tiles de las similitudes (Y diferencias) que se observa entre las caractersticas de los diferentes VCD Los cidos nucleicos se pueden encontrar en la deduccin de la estructural transiciones de un cido nucleico dado bajo experimental diferente condiciones. Una de tales aplicaciones se demostr [15] mediante la supervisin del VCD de poli (rA) poli (r) como una funcin de la temperatura. En el 1700-1600 cm-1 regin, el espectro de VCD de poli (rA) poli (r) en el 25 C rango de contenido (-, -, +, -, +) patrn de seal. Este cambios en el patrn de (-, +, +, -, +, -, +) cuando la temperatura se mantiene en el 54-60 C rango. La frecuencia la separacin entre las tres primeras bandas de frecuencias ms altas, considera que se originan en el C = O se extiende modos de los residuos de U, aumenta a medida que se aumenta la temperatura. Sin embargo, como la temperatura se incrementa an ms por encima de 65 C, VCD asociado con estas bandas se desvanece.
Las bandas que aparecen en el 1650-1660 cm-1 regin (Que se considera que se originan en el C = C modos de estiramiento de los residuos a) Sin embargo no se ven afectados por este aumento de temperatura. Un grfico de la intensidad de VCD cambios en la regin (1700-1650 cm-1) como un funcin de la temperatura revel que se producen cambios bruscos en el 52-54 C y 60-65 C vara. Temperatura similar dependientes de los estudios de VCD en triples cadena poli (A) poli (r) poli (r) no revel cambios abruptos para las bandas de 1700-1650 cm-1 en lugar de la regin; VCD cambios de intensidad como una funcin de la temperatura fueron encontrado para seguir una lnea suave. nico poli cadena (rA) y poli (r) tambin, que no presentan cambios abruptos en VCD intensidades como la temperatura se aumenta a 70 C. Por comparando las intensidades VCD observados en diferentes temperaturas de poli (rA), poli (r), poli (rA) poli (r) y poli (rA) poli (r) poli (r), se concluy que los dos bruscos cambios de intensidad VCD mencionados anteriormente para el poli (rA) poli (r) corresponden a la transicin estructural de doble cadena a la cadena de triples (52-54 en C) y solo filamento (a 60-65 C) formas. El ordinario posiciones de absorcin de infrarrojos de la banda (o intensidades) de ellos fueron incapaces de identificar el segundo estructural transicin (a 60-65 C), por lo que la importante funcin de las intensidades de VCD es subrayada por estas investigaciones. 732 Fig. 7 La absorcin (parte inferior) y VCD (arriba) el espectro de poli (A) (concentracin: 40 mg / ml, paso de luz: 50 mm) en D2O cacodilato de sodio que contiene (0,05 M) y NaCl (0,1 M) en el amida I y II amida regiones A-, B y Z-ADN forma. El B Z y B A estructurales transiciones en los cidos desoxirribonucleicos puede ser inducida [16] utilizando altas concentraciones de sal y las concentraciones de alcohol respectivamente. El B-y se forma de la mano derecha han helicoidal estructuras, pero la forma Z tiene a la izquierda helicoidal de mano estructura. El B-forma se caracteriza por la aparicin de un positivo pareado VCD en el 1700-1650 cm-1 regin y otro pareado del patrn mismo signo en 1087 cm-1. El pareado esta ltima se asocia con simtrica PO2 estiramiento modos. Los signos de coplas VCD en estos dos regiones se encontr que se invierte para el Z-forma. Aunque las posiciones de la banda de la O = C modos de estiramiento la forma Z se encontraron para pasar a frecuencias ms bajas en comparacin a los de la forma B, las posiciones de banda del simtrica PO2 - Modos de estiramiento son esencialmente los mismos para ambas formas. As, los pareados VCD asociado con simtrica PO2 - Los modos de tensin de los B-y Z-formas aparecen ms como imgenes especulares entre s y proporcionan una accin clara para su identificacin.
Los espectros de VCD de la B-A y formularios se encontr que ser cualitativamente similar. Sin embargo, hay diferencias entre ellas en la regin C = O estiramiento y estas diferencias dependen fuertemente de la secuencia o distribucin de las bases. Los estudios espectrales VCD se llevaron a cabo tambin en la interaccin desoxirribo de los oligonucletidos con iones metlicos y con daunorrubicina [16e-g]. Los hidratos de carbono C Los monosacridos. Estudios de VCD en hidratos de carbono son cuatro papeles en la regin del infrarrojo medio [17] y dos documentos en la regin de hidrgeno estiramiento [18]. VCD bandas caractersticas anmeros de puede ser utilizado para caracterizar el anmeros. Los azcares homomrficas se encuentran para dar lugar a patrones similares de signo VCD siempre que los sustituyentes no han interferir bandas VCD o interferir en los bandas pueden ser identificados. Los azcares epmeros tienen marcado diferente espectros VCD lo que indica que es sensible a VCD la quiralidad en los distintos centros quirales. Glicosdico. Espectros de dicrosmo circular vibracional de soluciones acuosas de disacridos seleccionados, maltosa, isomaltosa, una, una trehalosa-celobiosa, y gentiobiosa eran medido en la regin 2000-900 cm-1 [19]. Estos espectros, junto con los de D-glucosa, es un (1 4) vinculado maltotriosa trisacrido, y un (1 4 ) vinculado oligosacrido cclico, una ciclodextrina, en solucin acuosa, fueron utiliza para identificar los rasgos caractersticos asociados con glicosdico. Se encontr que una oligosacridos unidos de la glucosa tienen seales medibles VCD con caractersticas VCD patrones de los signos en el 1200-900 cm-1 de la regin. Por otro lado, los oligosacridos b-enlazados de la glucosa no mostraron importantes caractersticas de VCD en esta regin. Para ilustrar este punto, los espectros de VCD de 6-OaD-galactopiranosil D-glucosa y 4-galactopiranosil-DAB D-glucosa se muestra en la figura. 8. Estos resultados sugieren que VCD puede ser utilizado como una sonda para identificar el potente tipo de enlace glicosdico presentes en los oligosacridos.
5 enfoques tericos precisos para estructurar la determinacin La prediccin precisa de dicrosmo circular vibracional espectros requiere estimaciones fiables de las tres cantidades diferentes: vectores normales de coordenadas (que dependen de la fuerza constantes y la geometra molecular), atmicas tensores polares y atmicas tensores axiales. Varios acontecimientos importantes se han producido en los ltimos aos en el clculo de la tarde utilizando los mtodos de la mecnica cuntica. La cuanta mtodos tericos desarrollados para VCD tienen en general tenido xito en la reproduccin de los espectros experimentales de una variedad de sistemas moleculares, cuando se implementa ab
initio utilizando moderada a los conjuntos de base de gran tamao. Estos clculos Se han hecho uso de Hartree-Fock (HF), despus de HF y funcional de la densidad teoras (DFT). Los tensores axiales atmicas Se han evaluado en el nivel de HF, empleando el conjuntos de estndares bsicos, con la versin traducida de los orbitales moleculares (OVM) [20], la perturbacin del campo magntico (MFP) [21-24], vibrnica acoplamiento (VC) [25] y nuclear elctrica blindaje tensor [26] mtodos. Se evaluaron tambin con una aleatoria fase de aproximacin (RPA) [27], y con la inclusin de correlacin de electrones utilizando el mtodo de VC [28]. Uso de los invariantes de calibre orbitales atmicos (GIAOs), la MFP mtodo tambin se ha utilizado para calcular el atmica tensores axiales en el SCF [29], despus de la FEC [30] y la DFT [31] los niveles. El mtodo de impresora multifuncin utilizando GIAOs y DFT, que 733 Fig. 8 La absorcin (inferior) y VCD (arriba) el espectro de una ligada (a) yb vinculado-(b) oligosacridos de H2O en el 1200-900 cm-1 de la regin. (A) melibiosa (6-O-un-D-galactopiranosil D-glucosa, concentracin: 1,45 M, paso de luz: 6 mm), (b) de D-lactosa (4-O-b-Dgalactopyranosyl D-glucosa, concentracin: 0,39 M, paso de luz: 12 mm) parece ser el mtodo ms prometedor (tanto en trminos de practicidad y fiabilidad), ha sido implementado en una paquete comercial de software de la mecnica cuntica [32]. La determinacin estructural de uso de estos tericos cunticos enfoques consiste en la prediccin de los espectros de VCD para diferentes estructuras posibles y comparndolas con el espectro experimental. A partir de esta comparacin, la estructura predominante se puede deducir. Precisa cuntica predicciones mecnicas de VCD puede, en el presente tiempo, se realizarn para las molculas de tamao moderado. Tal aplicaciones todava no son posibles de biomolculas de gran tamao, tales como las protenas. 6 Conclusiones Distintos espectros de la estructura de las correlaciones se han encontrado cmo influye la observada espectros de VCD y de las estructuras moleculares de una variedad de sistemas biomoleculares. Estas correlaciones hacer que la espectroscopia de VCD una poderosa estructura herramienta. Los desarrollos comerciales de instrumentos, VCD y de software para las predicciones de la mecnica cuntica VCD, hecho mucho ms fcil ahora, para los qumicos sintticos, productos farmacuticos qumicos y bilogos estructurales, para practicar el VCD espectroscopia de forma rutinaria. Agradecimientos Agradecemos a la NSF (CHE9707773) y
La Universidad de Vanderbilt para el apoyo de subvencin. Damos las gracias a James R. McBride para registrar el espectro de poli (L-lisina) y el Dr. PK Bose para registrar los espectros de oligosacridos.

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Spectroscopic studies of cold, gas-phase biomolecular ions

Thomas R. Rizzo*, Jaime A. Stearns and Oleg V. Boyarkin

484 T. R. Rizzo et al.

International Reviews in Physical Chemistry 487

International Reviews in Physical Chemistry 489

490 T. R. Rizzo et al.

37,500 37,550 37,600 37,650 37,700 Wavenumber (cm1)

International Reviews in Physical Chemistry 491

492 T. R. Rizzo et al.

(a) TrpH+ (b) TrpH+(H2O)1 (c) TrpH+(H2O)2

International Reviews in Physical Chemistry 493

(a) TyrH+ (b) H+AlaTyr (c) H+AlaAlaTyr (d) H+AlaAlaTyrAlaAla

496 T. R. Rizzo et al.

International Reviews in Physical Chemistry 497

498 T. R. Rizzo et al.

500 T. R. Rizzo et al.

International Reviews in Physical Chemistry 501

502 T. R. Rizzo et al.

Downloaded By: [Universidad Pablo de Olavide] At: 08:33 9 January 2010

International Reviews in Physical Chemistry 505

506 T. R. Rizzo et al.

International Reviews in Physical Chemistry 507

512 T. R. Rizzo et al.

International Reviews in Physical Chemistry 513

514 T. R. Rizzo et al.

Modelos de clculo terico:

IV. Concluding Remarks Our main conclusions can be summarized as follows:

Prasad L. Polavarapu Chunxia Zhao

Vibrational circular dichroism: Chiroptical analysis of biomolecules

Received: March 1, 2004; accepted: April 13, 2004

Vibrational circular dichroism: Chiroptical analysis of biomolecules

i 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de

Received: March 1, 2004; accepted: April 13, 2004

i 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de

stereochemical sensitivity of CD.

2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de

Received: March 1, 2004; accepted: April 13, 2004

Peptides and proteins

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i 2004 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.mnf-journal.de

Prasad L. Polavarapu Chunxia Zhao

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