UNIVERSIDADE DE SO PAULO INSTITUTO DE QUMICA

QBQ116 Estrutura de Biomolculas e Metabolismo Aulas de Laboratrio

Professores: Marisa H.G. Medeiros Paolo Di Mascio Mario J. Politi

Monitor: Jos Carlos Bozzeli

2012
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NORMAS E RECOMEDAES NO LABORATRIO

USO DE AVENTAL NAS AULAS PRTICAS OBRIGATRIO. COMER, BEBER E FUMAR NO RECINTO DO LABORATRIO NO PERMITIDO. - Leia cuidadosamente os procedimentos experimentais (protocolos) e atente para as instrues fornecidas antes de iniciar o experimento. - Familiarize-se com o ambiente do laboratrio, particularmente, com os reagentes, vidraria e equipamentos disponveis, procurando utiliz-los com propriedade para evitar erros experimentais, desperdcios de material e acidentes. - Mantenha sua bancada de trabalho organizada e livre de objetos e uso pessoal. Ao terminar o experimento passe gua na vidraria utilizada e a coloque no local indicado. - Qualquer dvida ou acidente pea auxlio aos monitores, aos professores ou tcnica do laboratrio.

GUIA PARA RELATRIO DE LABORATRIO INTRODUO: Deve conter os fundamentos bioqumicos da metodologia empregada (aspectos tericos da aula prtica encontrados na literatura). OBJETIVOS: Colocar o(s) objetivo(s) da aula prtica de forma clara e concisa. MATERIAIS E MTODOS: Descrever os procedimentos executados em laboratrio incluindo todos os reagentes, materiais e equipamentos utilizados. RESULTADOS E DISCUSSO: Colocar todos os dados obtidos (utilizar tabelas, caso julgue necessrio). Os grficos sero aceitos em papel milimetrado ou no Excel. Comentar os resultados, discutir possveis diferenas obtidas comparando com dados da literatura. CONCLUSO: Comentar quais as concluses da aula prtica. Ser claro e objetivo nas concluses. Esclarecer se os objetivos propostos foram atingidos ou no. BIBLIOGRAFIA: Colocar todos os livros e artigos consultados.

LABORATRIO 1: CINTICA DA INVERTASE I. FUNDAMENTOS A Cintica Enzimtica estuda os mecanismos de reaes qumicas catalisadas por enzimas. H na estrutura da enzima, uma determinada regio diretamente responsvel pela ao cataltica. Essa regio denominada stio ativo e a sua conformao correta fundamental para a atividade enzimtica. Ali se localizam diversos resduos de aminocidos que podem desempenhar funes de orientao do substrato e de direta interao com este, permitindo que a reao ocorra. Em 1913, L. Michaelis e M. L. Menten, desenvolveram estudos considerando as principais propriedades das enzimas e aplicando as teorias conhecidas de Cintica Qumica para um modelo simplificado, o qual envolvia a enzima livre (E), o substrato (S), o complexo enzima-substrato (ES) e o produto (P). Esse modelo pode ser expresso pela equao qumica:

E + S

k1 k-1

ES

k2

E + P

Michaelis e Menten, com essas consideraes, desenvolveram a expresso de velocidade para uma reao catalisada enzimaticamente, onde V funo de [S] e Vmax e Km so constantes:

Vmx . [S] v = Km + [S]

Na figura 1 est apresentada a curva de velocidade inicial de reao em funo da concentrao de substrato para uma enzima que siga o modelo proposto por Michaelis e Menten. Essa enzima dita de caractersticas michaelianas e obedece expresso de velocidade apresentada acima.

Vmx

Vel. Inicial Reaomol / min.l) (

Vmx / 2

Km

Concentrao de Substrato (M)

Figura 1 Velocidade de reao em funo da concentrao de substrato para uma enzima michaeliana. 3

Nesta curva pode-se facilmente identificar o efeito de saturao do substrato. Nestas circunstncias, o sistema tende a adquirir velocidade de reao mxima (Vmx), grandeza que funo da concentrao inicial da enzima livre (E). Podemos tambm definir uma concentrao de substrato na qual se obtm metade de Vmx. Esse valor de [S] numericamente igual ao Km, parmetro que dentro de certos limites mede a afinidade da enzima pelo substrato. O mtodo mais preciso para determinao grfica dessas grandezas num experimento de Cintica Enzimtica atravs do grfico de duplo-recproco ou de Lineweaver-Burk. Para tanto se deve plotar 1/V em funo de 1/[S]. A enzima escolhida para este estudo a invertase de levedura que catalisa a hidrlise da sacarose para produzir glicose e frutose:

C12H22O11 + H 2O
Sacarose

C 6H12O6 + C 6H12O6
Glicose Frutose

A determinao da velocidade da reao (ou da atividade enzimtica) pode ser feita atravs da dosagem dos acares redutores formados (frutose e glicose). A dosagem baseia-se na reao entre o cido 3,5-dinitro-saliclico (DNS) e os acares redutores. Estes monossacardeos reduzem o DNS fornecendo um produto de cor caracterstica, cuja formao pode ser acompanhada a 540 nm. Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (mols) de acares redutores formada, por um clculo estequiomtrico simples, pode-se determinar a quantidade correspondente (mols) de sacarose hidrolisada. Nestas experincias as velocidades da reao sero expressas em mols de sacarose hidrolisada por minuto. Para estudos de velocidade, o tempo de reao deve ser medido com a maior exatido possvel. Para isso, o grupo dever organizar-se de maneira a no permitir que a reao se inicie em tempos diferentes nos vrios tubos. Para tal, importante manter os tubos em gelo durante a adio dos reagentes. Esses devem ser adicionados na ordem em que aparecem nos protocolos, com a enzima sendo adicionada por ltimo. Leva-se ento os tubos, todos juntos, ao banho a 37C para reagir. Transcorrido o tempo determinado, os tubos devem voltar, todos juntos e simultaneamente, para o gelo. Neste ponto a reao pra. A atividade enzimtica medida em unidade (U), sendo que 1 U a quantidade de enzima necessria para a formao de 1 mol de produto por minuto. II. OBJETIVOS Estudar as influncias das concentraes de enzima e substrato nas velocidades de uma reao enzimtica, examinar as curvas obtidas experimentalmente, calcular os parmetros cinticos e discutir seus valores e importncia.

III. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1) Construo da curva padro (Experimento A) Adicionar a seis tubos (180 X 20 mm) volumes crescentes de soluo padro redutora (glicose 6 mM + frutose 6 mM), conforme indicado na Tabela 1. Complete o volume em cada tubo para 2,0 mL com tampo. Adicione em seguida 2 mL do reagente DNS em todos os tubos. Tabela 1 Curva padro da soluo redutora. sacarose tubos soluo padro redutora (mL) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 soluo tampo (mL) 2,0 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 reagente DNS (mL) absorbncia (540 nm) 0,000 hidrolisada(mols) * branco 1 2 3 4 5 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 0,00

*Calcule a quantidade de sacarose hidrolisada baseado na concentrao dos produtos de hidrlise (glicose e frutose). Preste ateno na estequiometria da reao para fazer o clculo. Aps a adio do DNS (cido 3,5-dinitro-saliclico), colocar os tubos em banho-maria fervente por 10 min ( prestar ateno na temperatura do banho, se ela no estiver a fervente a reao poder levar mais tempo para ocorrer). Aps este tempo, esfriar em gua corrente e adicionar 16 mL de gua destilada. Agitar com inverso da posio na vertical (3x). Ler as absorbncias a 540 nm contra o branco. Construir o grfico absorbncia versus concentrao de sacarose hidrolisada. Este grfico ser a curva padro.

2. Efeito da concentrao da enzima (Experimento B) Numerar sete tubos de ensaio (180 X 20 mm) e adicionar os reagentes conforme tabela 2. Manter todos os tubos no gelo!!. Tabela 2 Estudo da concentrao de enzima x velocidade de reao. sacarose tampo soluo Concentrao 5% em tubos pH 4,77 enzima tampo enzima (M) (mL) (mL) (mL) 1,0 1,0 0,00 branco 1,0 0,9 1 0,1 1,0 0,7 2 0,3 1,0 0,5 3 0,5 1,0 0,3 4 0,7 1,0 0,1 5 0,9 1,0 6 1,0 Concentrao da soluo estoque da enzima: _________ Peso Molecular da Invertase: Abs. 540 nm 0,000 sacarose hidrolisada por min. (mol/min) 0,00

Aps a adio da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos do gelo e coloc-los imediatamente (e simultaneamente) em banho-maria a 37C por 5 min. Transcorrido este tempo, os tubos devem retornar imediatamente para o gelo. Assume-se que nesse instante a reao para. Ainda no gelo, adicionar a cada tubo 2 mL de DNS. Na presena de DNS, devido alcalinidade do reagente, a enzima para de funcionar. Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar 10 min. Findo este tempo, esfriar em gua corrente e adicionar 16 mL de gua destilada em cada tubo. Agitar com inverso da posio na vertical (3x). Ler as absorbncias a 540 nm. Fazer o grfico colocando a concentrao da enzima (M) nas abscissas e a velocidade de hidrlise expressa em mols de sacarose hidrolisada por minuto nas ordenadas. Durante a aula de laboratrio ser fornecido o valor da concentrao da enzima na soluo estoque.

3. Efeito da concentrao de substrato (Experimento C) Numerar sete tubos de ensaio (180 X 20 mm) e adicionar os reagentes segundo a tabela 3. Manter todos os tubos no gelo!!. Tabela 3 Estudo da concentrao de substrato x velocidade de reao. sacarose tampo soluo concentrao 5% em tubos pH 4,77 enzima tampo sacarose (M) (mL) (mL) (mL) 1,0 1,0 branco 0,05 1,45 0,5 1 0,1 1,4 0,5 2 0,3 1,2 0,5 3 0,5 1,0 0,5 4 0,7 0,8 0,5 5 1,0 0,5 0,5 6 Concentrao da soluo estoque da enzima: _________ Abs. 540 nm 0,000 sacarose hidrolisada por min. (mol/min) 0,00

Proceder exatamente como no caso do estudo da concentrao da enzima (item anterior). Aps a adio da enzima, agitar suavemente. Retirar os tubos do gelo e coloc-los imediatamente (e simultaneamente) em banho-maria a 37C por 5 min. Transcorrido este tempo, os tubos devem retornar imediatamente para o gelo. Assume-se que nesse instante a reao para. Ainda no gelo, adicionar a cada tubo 2 mL de DNS. Na presena de DNS, devido alcalinidade do reagente, a enzima (valor elevado de pH) pra de funcionar. Transferir os tubos para banho-maria fervente e esperar 10 min. Findo este tempo, esfriar em gua corrente e adicionar 16 mL de gua destilada em cada tubo. Agitar com inverso da posio na vertical (3x). Ler as absorbncias a 540nm. Fazer um grfico da velocidade versus concentrao inicial do substrato. Estimar os valores de Vmx e Km. Fazer o grfico de Lineweaver-Burk e calcular os valores de Vmx e Km. Comparar o valor de Km com o encontrado na literatura cientfica.

IV. QUESTES COMPLEMENTARES 1. Qual o substrato utilizado nesta prtica? Qual a reao catalisada pela enzima a partir deste substrato? Qual(is) o(s) produto(s) da reao catalisada pela enzima a partir deste substrato? 2. Foi utilizado algum tubo controle? Qual a funo de um tubo controle? D exemplos. 3. Por que os tubos devem ser mantidos em banho de gelo? E porque os tubos devem ser transferidos ao mesmo tempo para o banho a 30C? 4. Por que a leitura da absorbncia feita a 540 nm? 5. Discutir as curvas obtidas para o efeito da concentrao da enzima e do substrato e elaborar um protocolo para estudar o efeito do pH sobre a atividade. 6. No item 2 do protocolo dito que, devido alcalinidade do reagente DNS, sua adio faz a reao parar (enzima perde atividade). Justifique essa afirmao.

LABORATRIO 2: ANLISE DE LIPDEOS I. Fundamentos Lipdeos em amostras biolgicas Os lipdeos constituem uma classe heterognea de molculas que tem em comum o fato de serem pouco solveis em gua. A estrutura das principais classes de lipdeos encontrados em organismos vivos est mostrada na Figura 1.

Figura 1. Estrutura de lipdeos. Fonte: Fahy, E e col. (2005) A comprehensive classification system for lipids, J. Lipid Res., 46, 839-861. Estes podem ser classificados de acordo com a polaridade em lipdeos simples ou neutros e lipdeos complexos ou polares. Os lipdeos simples ou neutros incluem os cidos graxos, colesterol, steres de colesterol e triacilgliceris. Os lipdeos polares incluem os glicerofosfolipdeos, os esfingolipdeos e os glicolipdeos.

Extrao de Lipdeos Os lipdeos por definio constituem uma classe de compostos que se caracterizam pela alta solubilidade em solventes orgnicos. A baixa solubilidade dos lipdeos em gua torna possvel a sua separao das protenas, carboidratos, cidos nucleios e da gua nos tecidos. Existem diversos procedimentos para extrao de lipdeos, porm todos tm em comum a utilizao de solventes orgnicos. Os procedimentos mais utilizados incluem as metodologias de extrao em que se empregam misturas de solventes orgnicos apolares e polares. As misturas de solventes orgnicos mais utilizados para esta finalidade so: clorofrmio: metanol (Mtodos de Folch e Bligh & Dyer) ou hexano:isopropanol (Mtodo de Dole) ou hexano:ter. Atualmente, ambos os mtodos so bastante utilizados. No entanto, uma desvantagem das metodologia em que se utiliza o clorofrmio o fato dele ser mais denso e a fase orgnica estar localizada na parte inferior do tubo (Figura 2a). Isto torna a recuperao da fase orgnica propensa a contaminaes provenientes da fase aquosa o que pode comprometer a qualidade da anlise. Deste modo, metodologias de extrao utilizando solventes orgnicos menos densos do que gua, como o hexano mais vantajoso (Figura 2b). Porm a eficincia de extrao de alguns lipdeos menor utilizando-se este solvente. A extrao dos lipdeos de amostras biolgicas normalmente realizada seguindo-se os seguintes passos: a) preparo da amostra, no caso de tecidos animais, faz-se uma homogeneizao do material biolgico em soluo aquosa tamponada; b) homogeneizao da amostra na presena de um solvente orgnico miscvel com a gua, por exemplo, metanol ou etanol; c) separao das fases lquida (orgnica e aquosa) e slida, utilizando um solvente orgnico imiscvel com a gua, por exemplo, clorofrmio ou hexano; d) separao de contaminantes no lipdicos; e) remoo do solvente.

Aq. Resduo insolvel

Hexano Org.

Org. Clorofrmio

Aq.

Resduo insolvel (a) (b)

Figura 2. Esquema ilustrativo da extrao de lipdeos utilizando mistura de solventes orgnicos mais densos (a) e menos densos (b) do que a gua. Abreviatura: Aq., aquoso e Org., orgnico.

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II. Objetivos
Extrair lipdeos a partir de amostras biolgicas (gema de ovo, manteiga our margarina e homogenato de fgado) e analisar as diferentes classes de lipdeos presentes na amostra atravs da cromatografia em camada delgada (TLC, thin layer chromatography).

III. Procedimento Experimental 1. Extrao de lipdeos A.1 Gema de Ovo a. b. Pesar 1 g da gema em um tubo de ensaio. Acrescentar 1 ml de etanol e vortexar at obter uma soluo homognea

c. Adicionar 3 ml de hexano e 2 ml de isopropanol d. Vortexar vigorosamente por aproximadamente 1 minuto. e. Deixar o tubo na bancada at que haja a formao ntida de duas fases f. Transferir a fase superior orgnica para outro tubo A.2 Manteiga ou margarina a. Pesar 0,5 g de manteiga ou margarina em um tubo de ensaio. b. Extrair os lipdeos seguindo o procedimento descrito acima (a partir do item b at o e) c. Transferir a fase superior orgnica para outro tubo A.3 Fgado a. Pipetar 1 ml de homogenato de fgado em um tubo de ensaio b. Extrair os lipdeos seguindo o procedimento descrito acima (a partir do item b at o e) c. Transferir a fase superior orgnica para outro tubo

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2. Separao dos lipdeos por cromatografia em camada delgada (TLC) a. Preparar um total de 2 placas de acordo com as dimenses especificadas na Figura 3. Dimenses da placa 8 x 10 cm. b. Fazer as seguintes marcaes na placa com um LPIS tomando o cuidado para no remover a camada branca de slica que recobre o alumnio: -linha onde sero aplicadas as amostras -linha indicadora do final da corrida do solvente -pontos onde sero aplicadas as amostras: deixar um espao de 1 cm entre os pontos e identificar como mostrado na Figura 3. c. Aplicar 5 l dos padres e 15 l das amostras com o auxlio de uma pipeta (P20). Importante! Aplicar a amostra encostando a ponta da ponteira sob a placa. Cuidado para a amostra no se espalhar!
A. Lipdeos complexos ou polares 1 cm B. Lipdeos simples ou neutros 0,5 cm

1 cm

FC

FE A1

A2 A3

Col AG TG A1 A2 A3

1,5 cm

Figura 3. Esquema ilustrativo da placa de cromatografia em camada delgada. Abreviaturas: FC, fosfatidilcolina; FE, fosfatidiletanolamina; Col, colesterol; AG, cidos graxos; TG, triglicrides; A1, amostra 1; A2, amostra; A3, amostra 3.

d. Colocar 2 placas em cada bquer contendo a mistura de solventes. Utilizar: -Solvente A, Clorofrmio:Isopropanol:Acetato de Etila:Metanol:H2O (50:50:50:21:18, v/v/v/v/v), para a separao dos lipdeos complexos ou polares e - Solvente B, Hexano: ter etlico:cido Actico (70:30:1, v/v/v) para a separao dos lipdeos simples ou neutros. e. Vedar o bquer com um parafilme. f. Aguardar o solvente subir a placa por capilaridade at atingir a linha indicadora do final da corrida (Figura 4).

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Figura 4. Esquema ilustrativo da eluio de uma placa de TLC.

g. Retirar a placa do bquer e secar na capela por 1 a 2 min. h. Revelar a placa com cido sulfrico 50 %. i. Observar o aparecimento das bandas. j. Registrar o resultado utilizando cmeras digitais. k. Na revelao com iodo, circular com um lpis as bandas observadas, pois o iodo desaparece gradativamente. l. Calcular o Rf (fator de reteno) de cada uma das bandas observadas e comparar com os padres (Figura 5).

5.4cm 6cm

Rf=

Distncia Percorrida Distncia Total 5.4 cm 6 cm

S1 S2 P

Ex.

Rf=

= 0.90

Figura 5. Esquema ilustrativo do clculo do Rf.

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IV. Reagentes e Materiais Utilizados 1. Padres para TLC FC, Fosfatidilcolina de gema de ovo (Sigma): 5 mg/ml FE, Fosfatidiletanolamina de crebro bovino (Sigma): 5 mg/ml Col, Colesterol (Sigma): 10 mg/ml TG, Triglicrides: leo de soja 5 mg/ml AG, cido graxo: cido olico (Synth) 2,5 mg/ml

2. Placas de TLC de Slica (Cromatofolhas de alumnio, Silicagel 60, Merck) 3. Solventes orgnicos para extrao Etanol, Isopropanol, Hexano

4. Mistura de solventes orgnicos para a eluio da placa de TLC Solvente A para lipdeos polares - Clorofrmio:Isopropanol:Acetato de Etila:Metanol:H2O (50:50:50:21:18, v/v/v) Solvente B para lipdeos neutros Hexano: ter etlico:cido Actico (70:30:1, v/v/v)

5. Vidrarias: tubos de ensaio, pipetas Pasteur, cubas para TLC. 6. Cristais de iodo para a revelao da placa. 7. cido sulfrico 50 % 8. Spray e placa de aquecimento

Roteiro de Estudo e questes para o Relatrio 1. Desenhe a estrutura dos lipdeos identificados na aula prtica. 2. Quais so os lipdeos encontrados em cada uma das amostras? 3. Tanto o triacilglicerol como o fosfolipdeo contem cidos graxos esterificados em sua estrutura. Aponte as principais diferenas em termos de estrutura e de funo destes dois lipdeos? Os triacilgliceris poderiam formar micelas ou bicamadas? Por que?

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TRANSAMINAO
OBJETIVO: Verificar a reao de transaminao em homogenato de fgado. INTRODUO A transaminao consiste na transferncia reversvel do grupo amino de um aminocido a um cetocido sem que o grupo -NH2 ou -NH+3 fique livre no meio aquoso. O aminocido perde o grupo amino e se converte no cetocido correspondente e o cetocido que ganha o grupo amino se converte no aminocido respectivo. As transaminases se econtram na maioria dos tecidos animais. Todos os aminocidos que fazem parte das protenas participam em transaminaes enzimticas, com exceo da lisina Nesta experincia se identificaro os produtos de uma reao de transaminao por meio de cromatografia em papel.

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MTODO Uma alquota de um homogenato de fgado ser incubada com um aminocido e um cetocido. A identificao dos produtos da reao ser feita por cromatografia em papel. PREPARAO DO HOMOGENATO DE FGADO DE RATO O Fgado de um rato picado e lavado 2 vezes com 20 ml de tampo fosfato 0,05 M, pH 7,4 e em seguida homogeneizado com 10 ml deste tampo fosfato. Este homogenato centrifugado a 800 x g por 15 minutos para eliminar clulas no destrudas e ncleos. O sobrenadante decantado em um tubo de ensaio mantido em gelo e esta frao consiste na preparao enzimtica. Notar que no necessria a enzima pura para que esta catalise a reao. REAO DE TRANSAMINAO O sistema completo de reao composto por um aminocido, um cetocido, a preparao enzimtica, arsenito de sdio (NaAsO2) e um tampo. O arsenito empregado com a finalidade de evitar a oxidao posterior dos cetocidos pelo sistema enzimtico presente no hepatcito. MISTURA DE REAO -cetoglutarato 0,2 M, pH 7,4 - 0,1 ml Alanina 0,2 M, pH 7,4 - 0,1 ml Prep. enzimtica - 0,2 ml Tampo fosfato 0,05 M, pH 7,4 - 0,2 ml Arsenito de Sdio 0,2 M - 0,2 ml Incubar a 37o C por 30 minutos. Em seguida colocar em banho-maria fervente por 3 minutos. Centrifugar por 10 minutos em centrfuga Eppendorf. Decantar o sobrenadante transferindo para um segundo tubo Eppendorf e fazer a cromatografia com os padres adequados. CROMATOGRAFIA Em um papel de filtro Whatman no 1 (10x20 cm) traar com lpis uma linha a 2,5 cm da origem e marcar pontos com 2,5 cm de distncia entre si. Colocar padres de alanina, glutamato, piruvato e cetoglutarato, mistura de reao, branco* e 2,4-dinitrofenilhidrazina. Sobre os pontos onde foram aplicados o -cetoglutarato, piruvato e mistura de reao, adicionar uma aplicao capilar de 2,4dinitrofenilhidrazina. O solvente utilizado para a cromatografia ser n-Butanol/Etanol/NH4OH (0,5N). (70:20:30).

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Aps o solvente chega a 1 cm do final do papel, marcar a frente do solvente, secar o papel, marcar as manchas amarelas dos produtos de reao da 2,4-dinitrofenilhidrazina e os -cetocidos, e revelar o cromatograma com ninhidrina.
*

branco: mistura de apenas alanina e -cetoglutarato.

Quanto mais apolar for o grupo R, maior a mobilidade do aminocido com a fase mvel. Conseqentemente a relao (RF) entre a distncia percorrida pelo aminocido no papel e a distncia percorrida pela fase mvel ser tambm maior.

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