TCNICAS LABORATORIAIS EM FITOTECNIA

1- NORMAS GERAIS PARA LABORATRIO

1.1- INTRODUO Normas de segurana e de gerenciamento devem ser afixadas prximo entrada do laboratrio. Elas tm de ser do domnio do grupo de trabalho e so o primeiro ensinamento a ser ministrado aos novatos. A segurana individual e coletiva vai alm da mera preveno de acidentes substncias txicas, de efeito cumulativo, estaro sendo manuseadas com certa freqncia, requerendo a devida preocupao. A observncia das normas crucial para a organizao e eficiente conduo dos trabalhos. Cada laboratrio possui particularidades que geram diferentes demandas normativas. As presentes regras propostas talvez se apliquem maioria dos casos. 1.2- NORMAS DE SEGURANA 1.2.1- REGRAS GERAIS Habitue-se com a localizao dos extintores de incndio, mangueiras de gua, alarmes, chuveiros de segurana, lavatrios para olhos, estojo de primeiros socorros, listagem dos nmeros telefnicos para emergncia e sadas do prdio mais prxima; Evite obstruir os corredores entre bancadas com utenslios, tais como cadeiras ou caixas. Esses locais so reas de circulao de pessoal e devem ficar desempedidos; No coloquem alimentos nos refrigeradores ou nas estufas do No prepare alimentos no forno de microondas do laboratrio; No fume, no beba e no faa refeies dentro do laboratrio; Abra a autoclave devagar, posicionando-se lateralmente com relao laboratrio;

porta, para evitar queimaduras pelo vapor residual. Lembre-se de usar luvas apropriadas para remover seu material.

Evitem entornar substncias que deixem o piso escorregadio (cera ou

parafina derretida). Ao trabalhar com esse tipo de material, forre o piso em sua rea de ao; Arranje seu ensaio de forma prtica, para que possa alcanar torneiras, Evite molhar o piso. Caso isso ocorra, coloque um aviso de alerta, de Tenha muito cuidado ao manusear substncias inflamveis. Caso suas tomadas e interruptores pelo lado de fora de sua montagem experimental; fcil visualizao, at que o problema seja sanado; roupas peguem fogo, IMEDIATAMENTE deite-se e role no cho, para As chamas. Se perceber que as roupas de um colega esto em chamas, jogue o colega no cho e role-o, para abafa-las. Muito freqentemente a pessoa tende a entrar em pnico, nessas situaes, e correr, resultando em queimaduras dolorosas e, s vezes, graves; Manipule o nitrognio lquido em garrafa apropriada, usando luvas Tome os seguintes cuidados quando for o ultimo a deixar o laboratrio: adequadas; verifique se os registros de gases esto fechados, desligue aparelhos que no estejam em uso, tranque janelas e portas e apague as luzes. 1.2.2- MANIPULAO DE REAGENTES Mantenha reagentes incompatveis nas respectivas reas, para prevenir Segure o frasco pelo lado onde est localizado o rtulo; No pipete com a boca. Use acessrio apropriado; Faa a diluio de cidos tendo a precauo de derramar o cido na No aquea lquidos inflamveis em chapa eltrica. Use manta de Manipule substncias volteis SOMENTE na capela para exausto de Use luvas e culos de segurana para manipular substncias txicas. situaes de risco;

gua e no vice-versa; aquecimento ou banho de vapor; gases, para prevenir a inalao de toxinas; Use mscara respiratria para volteis, mesmo operando na capela;

No coloque o cido perclrico ou seus gases em contato com madeira

ou outros materiais orgnicos. 1.2.3- DERRAMAMENTOS E VAZAMENTOS Tome as seguintes providncias, quando houver derramamentos ou Desligue o fornecimento de energia eltrica rea ou ao equipamento, para eliminar riscos de ignio; Aumente a ventilao abrindo portas e janelas; Chame o pessoal de segurana e manuteno. 1.2.4- PREPARO DOS REAGENTES Tome a seguinte precauo ao preparar um reagente: rotule o frasco IMEDIATAMENTE, colocando o nome do reagente, a concentrao, a data, as inciais de seu nome e a identificao do laboaratrio; Mantenha os estoques dos reagentes em estado virgem, na medida do possvel. Exceto quando o reagente for muito caro, evite inserir colheres, medidas, esptulas, bastes ou pipetas diretamente nos estoques; No confie em solues que voc mesmo no tenha preparado, exceto aquelas de uso comunitrio. Nunca teste um reagente pelo odor ou sabor. Praticamente todos os compostos qumicos, em maior ou menor grau, so venenosos; No confie em vidraria que voc mesmo no tenha lavado; Limpe pequenos derramamentos imediatamente, desde que no haja Prepare novo estoque, ao verificar que um reagente de uso comunitrio vazamentos de substncias inflamveis, txicas ou corrosivas:

risco sua integridade fsica; est acabando. Caso sinta que est preparando reagentes comunitrios mais do que deveria, fale com o lder do laboratrio; Enfatize, no respectivo rtulo, a vida til dos reagentes instveis, de Verifique se o reagente requer condies especiais de estocagem (ex. curta validade; vidro mbar, baixa temperatura, dessecador, etc.), antes de fazer a preparao;

 anlises.

Devolva sempre o estoque do reagente ao seu local de origem; Uso obrigatrio do jaleco (avental). Ver as condies laboratoriais necessrias para a execuo das Relacionar e colocar todo o material necessrio ao desenvolvimento da Fazer a limpeza da ponta da pipeta, antes de transferir o volume para o Diluio das amostras (mtodos espectrofotomtricos): testar

1.3- USO GERAL DO LABORATRIO

anlise disposio no balco, antes de iniciar o trabalho. recipiente. Usar a forma correta de pipetar. previamente. Deve ser feita de acordo com o material analisado. Usa-se sempre um volume x pr-estabelecido, partindo-se do princpio de que o material a ser analisado apresente concentraes da faixa de cor do padro. Vidrarias: aps o uso, devem ser recolhidas, descartando-se o material usado. Lavar com gua, com detergente, enxaguar com gua destilada e deixar nas cubas ao lado da pia de lavagem. Bancadas de laboratrio devem ficar limpas aps o uso. Deve-se verificar a voltagem dos aparelhos antes de ligar a tomada.

1.4-

PROCEDIMENTOS

SUGERIDOS

PARA

INSTALAO

DE

EXPERIMENTOS EM CMARA FRIGORFICA Programe o experimento com 1 ano de antecedncia; Limpeza completa da cmara com soluo de Hipoclorito de Sdio a

1%, lavagem com gua destilada (se houver disponibilidade) e enxugar as paredes da cmara; Verificar nvel do leo do compressor: colocar espelho no visor do leo do compressor e verificar se h agitao de leo. Caso contrrio, chame um tcnico. H necessidade de recolher o gs do sistema antes de completar o nvel do leo; Certifique-se de que h fusveis de reserva (no mnimo 3 de cada tipo);

Ajustar a temperatura da cmara: utilizar um termmetro de polpa de

fruto, colocar alguns frutos dentro da cmara em caixas apropriadas e verificar a intervalos regulares ( 3 horas) a temperatura da polpa de cada fruto (utilizar frutos diferentes para cada observao); Ajustar a umidade da cmara; Armazenar os frutos (sorteados, numerados e separados por

tratamento), de preferncia, em caixas apropriadas (mercado externo ou interno); Abrir a porta da cmara o mnimo necessrio; Verificar, pelo menos 3 vezes ao dia, as condies de funcionamento Ao terminar o experimento, repetir a operao 2.

da cmara;

1.5- PROCEDIMENTOS SUGERIDOS PARA A OCUPAO DE FREEZERS material; No coloque recipientes de gelo sobre as amostras; A desocupao do freezer deve ser o mais rpido possvel, evitando Solicite a limpeza do freezer quando houver acmulo de gelo; No obstrua a parte inferior interna do freezer com forraes; Evite a colocao de bandejas dentro do freezer; Evitar o uso de frascos grandes contendo pouco material (exemplo: O congelamento das amostras deve ser feito com N2 lquido e vcuo, Colocar as amostras em sacos plsticos apropriados contendo espao A identificao deve ser feita com caneta apropriada; Colocar o material, separado por tratamento, em sacos plsticos Colocar na porta do freezer etiqueta quantificando e identificando o vidro usado para maionese); no colocando amostras quentes no freezer; apropriado para o rtulo;

grandes, identificando cada saco contendo o grupo de amostras;

ocupa-lo com material desnecessrios;

1.6-

PROCEDIMENTOS

SUGERIDOS

PARA

INSTALAO

DE

EXPERIMENTOS NA REA DE PS-COLHEITA DE FRUTOS E HORTALIAS Elaborao do projeto de pesquisa e testar as tcnicas a serem usadas Contactar o produtor (de preferncia organizado e que apresente boa Fazer visitas tcnicas ao produtor e incentiva-lo a formar parceria para Fazer fluxograma detalhado das operaes de colheita e ps-colheita Elaborar planilhas de laboratrio e pastas apropriadas para coloca-las; Verificar o material necessrio para a execuo de cada etapa do Verificar condio de funcionamento dos aparelhos a serem utilizados Preparar quantidades suficientes de reagentes e solues a serem Providenciar pessoas treinadas para a execuo das anlises Aps cada anlise de laboratrio, fazer cpias dos resultados em com frutos comuns (obtidos no comrcio local); receptividade) pelo menos 6 meses antes da instalao do experimento; a execuo do experimento; at a chegada no laboratrio;

fluxograma (exemplo: caixas de colheita, caixas de embalagem, transporte, etc.); durante as anlises; utilizadas, lembrando-se de verificar o prazo de validade; laboratoriais; disquete e protege-lo.

2- SLIDOS SOLVEIS TOTAIS (SST)

Para fins de controle de qualidade usualmente o valor obtido pelo uso de um refratmetro convertido para uma escala de slidos solveis, assumindo-se que os slidos solveis consistem inteiramente de sacarose. A determinao dos slidos solveis quando feita com o uso de um refratmetro tipo Abb ou manual um excelente exemplo de como devem ser as anlises de controle de qualidade. O procedimento completo consiste nada mais do que misturar e homogeneizar completamente a amostra, colocar uma ou duas gotas da mistura no refratmetro e ler o resultado. Para produtos que no contm grande quantidade de slidos suspensos os resultados so altamente precisos e muito significativos. Na maioria dos casos, eles refletem a doura do produto que, assim, indica maturidade ou amadurecimento. Para praticamente todos os frutos, quanto mais elevado o teor de slidos solveis, mais maduro e mais doce a amostra. Para hortalias amilceas, tais como: ervilha, vagens ou milho, o teor mais elevado de slidos solveis indica um produto menos maduro to bem quanto mais doce. As mudanas que ocorrem durante o armazenamento de frutos e hortalias podem ser monitoradas por esse mtodo. Algumas variedades de ma no incio do armazenamento apresentam um ndice refrativo de 11%. Depois de armazenadas por diversos meses tais testes refratomtricos podem indicar 14 15% de slidos solveis. Isto devido hidrlise de polissacardeos insolveis, principalmente amido, a acares solveis. Apesar desta mudana indicar melhoria na qualidade, as mesmas mas armazenadas podem estar mais pobres em qualidade ps-colheita do que quando frescas devido a outros atributos de qualidade, tais como textura e aparncia. As hortalias, por outro lado, tendem a perder slidos solveis, ou doura, sob armazenamento. Por exemplo, o molho doce mantido temperatura ambiente por apenas 1 dia pode perder 75% do seu contedo de acar.

Os frutos e hortalias no armazenamento podem perder peso sem necessariamente mostrar reduo no contedo de umidade. Esta situao causada pela perda de slidos no processo de respirao. Apesar dos acares redutores serem a fonte primria de energia para a respirao, o nvel de acares redutores pode ser mantido atravs da hidrlise gradual e contnua de dissacardeos. Estes podem permanecer constantes atravs da hidrlise gradual de polissacardeos maiores. Tudo isto de considervel interesse para o fisiologista de planta. Para o departamento de controle de qualidade, no entanto, isto significa simplesmente perda de peso com pouca ou nenhuma mudana na percentagem de umidade ou flavor. A degradao dos polissacardeos que mantm a estrutura do produto, pode resultar em perda da qualidade textural, e se a perda alcanar o ponto de enrugamento da superfcie do fruto ou hortalia, ocorre perda na aparncia.

3- ACIDEZ TOTAL TITULVEL (ATT)

Os dois mtodos comumente usados para medir a acidez de frutos e hortalias so a percentagem de cido orgnico (Tabela 1) e a concentrao de on hidrognio ou pH. Pode ser generalizado que, para propsitos de indicar o parmetro do sabor cido ou azedo, a acidez total titulvel o mtodo mais vivel, enquanto que para propsitos de determinar a qualidade dos produtos processados, o pH o mtodo mais til. Detalhes de um mtodo simplificado para determinar a percentagem de acidez total titulvel com suficiente exatido so apresentados. 3.1- PROCEDIMENTO Tomar uma amostra de 10 a 20 g (ml) do tecido comestvel homogeneizada num frasco Erlenmeyer de boca larga. Acrescentar gua destilada at o volume final de 50 ou 100 ml (para amostras de 10 g (ml) completar o volume final para 50 ml). A titulao volumtrica pode ser usada se a amostra no for totalmente colorida, ou o procedimento eletromtrico se for altamente colorida. 3.1.1- PROCEDIMENTO VOLUMTRICO Encher a bureta com NaOH 0,1 N e acrescentar amostra diversas gotas de fenolfatelena (3 a 4). Agitar o erlenmeyer, adicionando-se cuidadosamente o NaOH da bureta at a mudana de cor da soluo para levemente rseo. 3.1.2- PROCEDIMENTO ELETROMTRICO Colocar os eletrodos do medidor de pH na amostra e acrescentar gua destilada, se necessrio, para cobrir os eletrodos completamente. Acrescentar NaOH 0,1 N da bureta, agitando a amostra continuamente at alcanar o pH de 8,1. 9

3.1.3- CLCULO ATT (%) = (V x f x F x 100)/P Onde: V = volume de NaOH gasto na titulao; f = fator de correo da soluo de NaOH; F = fator do cido predominante no fruto (conforme Tabela 1); P = peso ou volume da amostra (g ou mL). Tabela 1- Fatores para lcali 0,1 N de cidos orgnicos. CIDO Ctrico (anidro) Ctrico (hidratado) Actico Ltico Mlico Tartrico PESO MOLECULAR 128,08 210,14 60,05 90,08 134,09 150,09 FATOR LCALI 0,1 N 0,06404 0,07005 0,06005 0,09008 0,06705 0,07505

So numerosos os compostos cidos, com natureza qumica variada. Dentre eles, os mais abundantes em frutos so o cido ctrico e o mlico, havendo predominncia desses ou de outros, de acordo com a espcie (Tabela 2).

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Tabela 2- cidos orgnicos predominantes em algumas espcies de frutos e hortalias. CIDO ORGNICO cido ctrico FRUTOS Abacaxi Bagas Ctricos Goiaba Manga Pra Pssego Carambola Fruta-do-conde Mamo Maracuj Melo Ameixa Banana Cereja Ma Caju HORTALIAS Batata Beterraba Hortalias folhosas Tomate

cido mlico

Alfafa Aipo Brcolis Cenoura Espinafre Cebola e alho

cido oxlico cido pirvico cido tartrico

Uva Tamarindo

4- DETERMINAO DO POTENCIAL HIDROGENINICO

4.1- CONSIDERAES GERAIS 11

Os dois mtodos comumente empregados para medir a acidez de produtos hortcolas (frutos e hortalias) so a percentagem de cido orgnico e a concentrao de ons hidrognios (H+) ou comumente conhecido por pH. O pH considerado o mtodo mais til quando se objetiva determinar a qualidade de produtos processados. O potencial hidrogeninico ou pH um termo que expressa a intensidade da condio cida ou bsica de um determinado meio. definido como o cologartmo decimal da concentrao efetiva ou atividade dos ons hidrognio: pH = - log [H+]. Geralmente se utiliza o pHmetro de eletrodo combinado. O eletrodo de vidro combinado um eletrodo compacto no qual o eletrodo de vidro acha-se envolvido pelo eletrodo de referncia de prata/cloreto de prata. um eletrodo adequado para a maioria das aplicaes de laboratrio sendo mais fcil de manusear que o par de eletrodos separados. Os eletrodos combinados mais recentes tm tambm um sensor de temperatura integrado, til na compensao automtica de leituras de temperatura de diferentes amostras. 4.2- CALIBRAO DO POTENCIETRO Um sistema de determinao de pH deve ser calibrado com a utilizao de solues tampo de pH. Estas so facilmente deterioradas pelo crescimento de fungos e outros microrganismos ou pela contaminao com espcies qumicas, particularmente gases, surgindo da a necessidade de sua renovao peridica (mensalmente). Na preparao destas solues deve ser usada gua destilada com condutividade menor que 2 mhos/cm, fervida e resfriada temperatura de 25 C 30 C, estando o seu pH entre 6 e 7. Acham-se disponveis no comrcio solues j prontas, cuja preparao (ou no, no caso de j vir pronta) deve ser feita conforme recomendao do fabricante. Dos reagentes especificados para preparao dos tampes mais comuns, recomenda-se a secagem, em estufa a 110 - 130C por duas horas, antes da pesagem (no caso do fosfato monobsico de potssio - KH 2PO4). Os outros sais, mesmo os hidratados, embora no haja recomendao expressa, podem ser mantidos em dessecador desde a noite anterior preparao dos padres. Na calibragem do potencimetro geralmente utiliza-se os tampes a pH 4 e pH 6,86, geralmente. No procedimento de calibragem usa-se primeiro o tampo 12

de menor pH e, depois, o tampo de pH maior. O procedimento para padronizao deve ser feito de acordo com as recomendaes do fabricante do aparelho. Entre uma leitura e outra o eletrodo deve ser lavado com gua destilada e seco com papel higinico macio. No caso de no se dispor de tampo preparado por empresas, pode-se preparar os tampes no prprio laboratrio: Soluo tampo pH 4,00 (25 C 30 C) - Padro primrio: Pesar 10,12 g de biftalato cido de potssio (KHC8H4O4) e dissolver em gua destilada, de qualidade j especificada, ambientada a 25 C 30 C e diluir para 1000ml. Observao: O KHC8H4O4 deve ser secado em estufa a 100 C 110 C por 1 hora e resfriado, antes de seu uso. Soluo tampo pH 6,86 (25 C 30 C) - Padro primrio: Os sais anidros so melhores; cada um pode ser secado por 2 horas a 120 C e esfriado em um dessecador porque eles so muito pouco higroscpico. Pesar 3,387g de fosfato monobsico de potssio (KH2PO4) e 3,533g de fosfato de bsico de sdio (Na2HPO4), solubilizar em gua destilada prpria para a preparao de tampo, a 25 C 30 C, e diluir para 1000ml. Soluo tampo pH 9,18 (25 C 30 C) - Padro primrio: Usar 3,80g de borato de sdio decahidratado [Na2B4.10H2O (borax)] para preparar 1000ml desta soluo a 25 C 30 C. Soluo tampo pH 10,01 (25 C 30 C) - Padro primrio: Pesar 2,092g de bicarbonato de sdio (NaHCO3) e 2,640g de carbonato de sdio (Na2CO3), dissolver em gua destilada especificada para tampo, a 25 C - 30 C, e diluir para 1000ml. Observao: recomendado preparar nova soluo a cada ms; O Na2CO3 com grau padro primrio secado a 250 C por 90 minutos e estocado sobre CaCl2 e Drierite. No aquecer o NaHCO3 ou ele se decompor para Na2CO3.

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 de fundamental importncia que a temperatura dos padres e da amostra estejam na faixa de 25 C 30 C. 4.3- SOLUES AUXILIARES Os eletrodos devem ser limpos periodicamente. Segue-se algumas solues usadas na limpeza dos eletrodos. Hidrxido de sdio (NaOH) 0, 1N: dissolver 4,00 g de NaOH em gua destilada e completar para 1 litro; cido clordrico (HCl) 0,1 N: diluir 8,3ml de HCl concentrado (12 N) em gua destilada e completar para 1 litro; Acetona: o eletrodo deve ser imerso em acetona. Observao: O eletrodo deve ficar imerso nessas solues por um perodo de 24 horas.

5- DETERMINAO DE ENZIMAS: CONSIDERAES GERAIS

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5.1- PREPARO DE TAMPES PARA DETERMINAES ENZIMTICAS (PARA PEROXIDSE E POLIFENOLOXIDASE) Uma soluo tampo formada por uma mistura de um cido fraco (ou base fraca) e seu sal em quantidades apropriadas, cujo pH pouco se altera por adies de cido ou base. A finalidade dos tampes manter ou estabilizar o pH num valor que voc deseja trabalhar (fazer sua determinao qumica). Cada enzima tem uma faixa de pH onde sua atividade tima. Pequenas alteraes acarretam grandes modificaes na atividade da enzima. Chama-se zona tampo do cido, o segmento da curva, onde adies significativas de base forte produzem variaes relativamente pequenas no pH da soluo. 5.2- CARACTERSTICAS DOS TAMPES Ter alta solubilidade; No deve reagir com membranas; No pode ter efeito salino (reduzir presso osmtica); Deve ser estvel a alteraes de temperatura; Deve no absorver luz entre 240 nm e 700 nm; Dever ser facilmente encontrado na forma pura.

5.3- MODO DE PREPARO DE ALGUNS TAMPES UTILIZADOS EM EXPERIMENTOS PARA VERIFICAO DA ATIVIDADE ENZIMTICA pH 3,00 e 4,00: Prepara-se soluo de cido ctrico 100 mmol/L (19,2 g/L) e ajustar o pH com NaOH 1 mol/L (40 g/L) at pH desejado (3 e 4). Observao: A soluo de cido ctrico tem pH prximo de 2,50. pH 5,00, 6,00 e 7,00: Prepara-se soluo de K2HPO4 100 mmol/L (17,4 g/L) e ajusta-se o pH KH2PO4 100 mmol/L (13,6 g/L);

Observao:

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 A soluo de K2HPO4 100 mmol/L (17,4 g/L) tem pH prximo de 5,00, justificando ajuste do pH com KH2PO4 100 mmol/L (13,6 g/L) com conseqente elevao de pH; O Na2HPO4 pode substituir o K2HPO4, tendo essa soluo pH prximo de 8,00; pH 8,00 e 9,00: Prepara-se soluo de TRIS 100 mmol/L (12,11 g/L), tendo esta soluo pH prximo de 10,00. O ajuste deve ser feito com HCl 1 N (83,3 mL de HCl concentrado dissolvido em 1.000 mL de soluo final). 5.4- UM POUCO SOBRE FRACIONAMENTO CELULAR Trata-se da homogeneizao de tecidos que leva ruptura da parede celular, bem como, dos vacolos (estes representam mais de 90% do volume celular), geralmente exigindo pH em torno de 7,00 durante esse processo. Nos vacolos h diversos componentes qumicos que podem interferir nas determinaes qumicas como os taninos, alcalides, flavonides, proteases, etc, que so liberados aps a homogeneizao. As proteases atuam degradando protenas que leva subestimao de uma atividade enzimtica. Essas proteases, bem como outros componentes, precisam ser neutralizadas por ocasio da homogeneizao. Para impedir a ao das proteases usa-se o BSA que serve de substrato para as proteases, evitando que essas atuem desativando as enzimas que se pretende determinar. Os compostos fenlicos formam pontes de hidrognio com protenas, causando sua complexao e reduzindo sua atividade no meio homogeneizado. As quinonas podem causar precipitao das protenas. Neste caso h necessidade de se colocar adsorvedores ao meio de homogeneizao como o PVP insolvel que carrega todos os fenlicos para o fundo do tubo aps centrifugao. Pode-se tambm usar o PVP solvel que inativa os fenlicos impedindo sua ao com protenas. J o bissulfito de sdio (NaHSO3 ) interage com as polifenoloxidases (PPOs) impedindo a ao dessas enzimas com os fenlicos. O BSA tambm reage com fenlicos impedindo complexao com protenas.

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Durante a etapa de homogeneizao h tambm adio de agentes redutores que iro atuar impedindo a formao de pontes dissulfetos nas protenas, o que reduziria sua atividade. Pode-se usar como agente redutor o 2mercaptoetanol, DTT e cistena. 5.5- UM POUCO SOBRE MEIOS DE HOMOGENEIZAO A homogeneizao pode ser feita com uso de politron, multiprocessador de frutas ou almofariz + areia. Neste ultimo caso, deve-se peneirar a areia, deixar em contato com H2SO4 concentrado (degradar matria orgnica) por um perodo de 24 H e depois lavar vrias vazes com gua destilada. Todo processo de homogeneizao deve ser feito a 4 C (em gelo). Quanto aos meios de homogeneizao h trs tipos classificados com base no controle do potencial osmtico. Hipoosmtico: durante a homogeneizao dos tecidos no h necessidade de se controlar o potencial osmtico do material que se est trabalhando (no h adio de sal, a exemplo do NaCl). Isoosmtico: quando se trabalha com controle do potencial osmtico Agente quelante: ao meio de homogeneizao h acrscimo de EDTA durante a homogeneizao do tecido. H adio de 150 mM de NaCl. ou EGTA que servem para remover ons Ca2+ ou Mg2+ do meio. Isso se faz necessrio porque as proteases geralmente precisam desses ons para sua atividade. Com a remoo do Ca2+ ou Mg2+ h reduo da atividade dessas proteases.

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6- DETERMINAO DE PEROXIDASES (POD)

6.1- CONGELAMENTO DAS AMOSTRAS Deve ser feito primeiramente com nitrognio lquido. A amostra deve ser triturada em pequenos pedaos antes de ser submetida ao tratamento com nitrognio lquido. Aps o tratamento, a amostra deve ser envolvida em papel alumnio ou em sacos de polietileno de baixa densidade (27 cm 31 cm) com fecho hermtico e devidamente identificada. Posteriormente, deve-se guard-la em freezer a 20C. Pode-se optar pela liofilizao das amostras congeladas em nitrognio lquido para posterior determinao enzimtica, ao invs de se trabalhar com amostras congeladas. O material liofilizado pode at ser guardado temperatura ambiente, se estiver hermeticamente fechado. 6.2- PREPARO DO TAMPO EXTRATOR (pH 6,50) Deve-se preparar inicialmente uma soluo de KH2PO4 50 mmol/L. Para se preparar 1000 mL de soluo, deve-se pesar 6,8000 g de KH2PO4 e ajustar o pH com K2HPO4 50 mmol/L: prepara-se 1000 mL de soluo de K2HPO4 50 mmol/L (pode-se usar Na2HPO4 50 mmol/L), pesando 8,7000 g de K2HPO4 e completando o volume para 1000 mL. Essa soluo deve ser adicionada, aos poucos, soluo anterior para ajustar o pH at 6,50 (essa mistura pode ser feita em bquer de 1000 mL, devendo-se tomar uns 500 mL da soluo de KH2PO4 50 mmol/L, adicionando K2HPO4 50 mmol/L, para obter aproximadamente 1000 mL de soluo tampo - fosfato); Observao: Se for utilizar o Na2HPO4 50 mmol/L deve-se pesar 7,100 g e dissolver em gua suficiente para 1000 mL; Pesar 1 g de NaHSO3, 8,7660 g de NaCl e 10 g de PVP (esses Adicionar aproximadamente 80 mL da soluo tampo fosfato com reagentes podem ser pesados em um nico bquer de 100 mL); pH ajustado (pH 6,50) para dissolver os reagentes anteriores;

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Transferir o contedo do bquer para um balo volumtrico de 1000 mL

(usar funil e basto de vidro), com lavagens sucessivas do bquer com a soluo de pH ajustado; Observao: A soluo resultante ter: 0,1% de Bissulfito de sdio, 150 mM de NaCl e 1% de PVP. Ajustar novamente o pH para 6,50 com NaOH 0,5 mol/L. Observaes: Durante o ajuste do pH a soluo deve ser agitada constantemente com agitador magntico, se o mesmo estiver disponvel; IMPORTANTE: essa soluo de extrao deve ser mantida a 4 C (na geladeira, no no congelador). 6.3- FRACIONAMENTO DA AMOSTRA Como a expresso dos resultados da atividade enzimtica ser feita em funo da protena total (ver determinao pelo mtodo de BRADFORD) no h necessidade de pesar a amostra antes do fracionamento. No entanto, se a atividade enzimtica no for expressa em funo da protena total deve-se pesar quantidade conveniente e dissolver em volume apropriado (casca de melo: 100 mg para 30 mL de tampo). Para realizar o fracionamento da amostra toma-se um pouco da amostra congelada (100 mg de casca de melo) e tritura-se em homogeneizador de tecido por 1 minuto (a massa de tecido a ser fracionada pode ser aumentada ou diminuda dependendo do tecido vegetal que se est trabalhando). Observaes: Deve-se atentar para o cuidado de que todo o material a ser usado na triturao (o tampo extrator, o tubo da centrfuga que receber o filtrado, a gua usada na lavagem do homogeneizador de tecidos, etc.) esteja a 4 C, o que possvel com todos postos na geladeira; O fracionamento ou triturao pode ser feito com 30 mL de tampo extrator adicionado a uma certa quantidade de amostra (100 mg de casca de melo), triturando-se bem at completa homogeneizao (por 1 minuto);

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6.4- CENTRIFUGAO DA AMOSTRA Aps a triturao, deve-se filtrar o material homogeneizado em papel de filtro (o tubo no qual o filtrado ser recolhido deve estar imerso em gelo). A prxima etapa a centrifugao do filtrado. A centrfuga deve ser ajustada para uma temperatura de 4 C e 9.000 rpm por um perodo de 15 minutos (tempo de centrifugao). Observaes: recomendado que as amostras sejam processadas em nmero suficiente para que seja possvel sua anlise imediatamente. Os tubos opostos que sero colocados na centrfuga devero conter mesmo volume para um melhor desempenho da centrfuga. 6.5- PREPARO DA MISTURA DE REAO 1.950 L de tampo (conforme verificao da atividade em pH desejado 500 L de GUAIACOL (diluio: 500 L de guaiacol/40 mL de H2O deve estar a temperatura ambiente); pode-se guardar em geladeira por 24 horas - deve estar a temperatura ambiente); 500 L de H2O2 (diluio: 500 L de H2O2 29% - 32%/40 mL de H2O Incubar a 30 C por 5 minutos, quando houver necessidade de 50 L de extrato (aps centrifugao) e adicionado sempre aps a Observaes: H tecidos em que no h necessidade de INCUBAO (isso ocorre quando a atividade elevada); No caso de no haver necessidade de INCUBAO os regentes devem ser acrescentados na ordem anterior (o extrato enzimtico por ltimo) e deve-se fazer a leitura espectrofotomtrica (absorbncia) imediatamente aps acrescentar o extrato enzimtico; esse reagente sempre preparado na hora - deve estar a temperatura ambiente); incubao (esse tempo tambm pode ser alterado); incubao;

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 Se houver incubao a leitura da absorbncia tambm deve ser feita imediatamente aps acrescentar o extrato enzimtico. Fazer leituras espectrofotomtricas a intervalos de 10 segundos (podeA atividade enzimtica ser expressa como um aumento da Observaes: Se a leitura espectrofotomtrica no for adequada (no houver linearidade ou as leituras espectrofotomtricas forem baixas), pode-se modificar a quantidade de extrato a ser utilizado, diminuindo ou reduzindo seu volume alm de se modificar o pH do tampo extrator (sugere-se reduo para pH 5,00, por exemplo) e verificar a atividade da enzima neste pH; Para maiores informaes ver Zhou et al., (2003). Dados reais em casca de melo (no houve a necessidade de INCUBAO): Tempo (seg) Absorbncia (470 nm) 0 0,0197 10 0,0841 20 0,2222 30 0,4098 40 0,6243 50 0,8485 60 1,0714 dA/min = 1,0898 (fornecido pelo espectrofotmetro) Observao: Se o espectrofotmetro no fornecer diretamente o valor da taxa de aumento da absorbncia (dA/min), deve-se, com os dados anteriores, determinar uma equao de regresso (reta: Y = a + bX) e determinar a inclinao da reta ( Y/ X) sendo o X expresso em minutos; Os X e os Y usados no clculo para Y/ X devem ser os ajustados (obtidos atravs da reta ajustada). se modificar o intervalo) a 470 nm. absorbncia a 470 nm por min/mg de protena ou por min/g de tecido fresco;

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6.6- CLCULO DA ATIVIDADE ENZIMTICA Diluio da amostra: 0,1028 g (amostra)/30 mL (tampo); Mistura de reao:

1.950 L (tampo) + 500 L (guaiacol) + 500 L (H2O2) + 50 L (extrato enzimtico - alquota) linear); Clculos: 0,1028 g (amostra) 30.000 L (tampo) X 50 L (tampo) X = 1,7133 10 4 g 0,0010 D. O./min 1 UAE 1,7567 D. O./min Y Y = 1756,7 UAE/min 1.756,7 UAE/min 1,7133 10 4 g Z 1g Z = 10,25 10 6 UAE/min/g
UAE/min/g = dA/min 1.000/{[amostra (g) alquota ( L)/ V L (tampo amostra)]}

dA/min = 1,7567 (obtida em espectrofotmetro ou por regresso

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7- DETERMINAO DE POLIFENOLOXIDASES (PPO)

7.1- CONGELAMENTO DAS AMOSTRAS Idem para PEROXIDASES. 7.2- PREPARO DO TAMPO EXTRATOR (pH 6,50) Deve-se preparar inicialmente uma soluo de KH2PO4 50 mmol/L. Para se preparar 1000 mL de soluo, deve-se pesar 6,8000 g de KH2PO4 e ajustar o pH com K2HPO4 50 mmol/L: prepara-se 1000 mL de soluo de K2HPO4 50 mmol/L (pode-se usar Na2HPO4 50 mmol/L), pesando 8,7000 g de K2HPO4 e completando o volume para 1000 mL. Essa soluo deve ser adicionada, aos poucos, soluo anterior para ajustar o pH at 6,50 (essa mistura pode ser feita em bquer de 1000 mL, devendo-se tomar uns 500 mL da soluo de KH2PO4 50 mmol/L, adicionando K2HPO4 50 mmol/L, para obter aproximadamente 1000 mL de soluo tampo - fosfato); Observao: Se for utilizar o Na2HPO4 50 mmol/L deve-se pesar 7,100 g e dissolver em gua suficiente para 1000 mL; Pesar 10 g de PVP e 0,0186 g de EDTA (esses reagentes podem ser Adicionar aproximadamente 80 mL da soluo tampo fosfato com Transferir o contedo do bquer para um balo volumtrico de 1000 mL pesados em um nico bquer de 100 mL); pH ajustado (pH 6,50) para dissolver os reagentes anteriores; (usar funil e basto de vidro), com lavagens sucessivas do bquer com a soluo de pH ajustado; Observao: A soluo resultante ter: 1% de PVP e 0,1 mM de EDTA. Ajustar novamente o pH para 6,50 com NaOH 0,5 mol/L. Observaes: Durante o ajuste do pH a soluo deve ser agitada constantemente com agitador magntico, se o mesmo estiver disponvel; 23

 IMPORTANTE: essa soluo de extrao deve ser mantida a 4 C (na geladeira, no no congelador). 7.3- FRACIONAMENTO DA AMOSTRA Idem fracionamento para PEROXIDASE (a massa de tecido a ser fracionada pode ser aumentada ou diminuda dependendo do tecido vegetal que se est trabalhando). 7.4- CENTRIFUGAO DA AMOSTRA Idem para PEROXIDASE. 7.5- PREPARO DA MISTURA DE REAO Atentar para a seqncia: 2.000 L de tampo fosfato 50 mM pH 6,50 (deve estar a 500 L de CATECOL 10 mM (este sempre RECEM PREPARADO: Incuba-se por 30 minutos a 30 C (se houver necessidade); 500 L de extrato enzimtico (aps centrifugao); Fazer leituras espectrofotomtricas a intervalos de 10 segundos (podeA atividade enzimtica ser expressa como um aumento da Observao: As observaes feitas para PEROXIDASES tambm so levadas em considerao para POLIFENOLOXIDASES (incremento ou reduo de extrato enzimtico e uso ou no da incubao), inclusive CLCULOS DE ATIVIDADE ENZIMTICA e reduo do pH do tampo extrator para 5,00, por exemplo. 7.6- CLCULO DA ATIVIDADE ENZIMTICA Procede-se da mesma forma como para POD. temperatura ambiente); 1,1010 g para 1000 mL de gua destilada - deve estar a temperatura ambiente);

se modificar o intervalo) a 420 nm; absorbncia a 420 nm por min/mg de protena ou por min/g de tecido fresco.

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8- DETERMINAO DE CATALASE (CAT)

8.1- CONGELAMENTO DAS AMOSTRAS Idem para PEROXIDASES. 8.2- PREPARO DO TAMPO EXTRATOR (pH 6,50) dem preparo do tampo extrator para PEROXIDASES (o tampo extrator o mesmo para POD). 8.3- FRACIONAMENTO DA AMOSTRA Idem fracionamento para PEROXIDASE (a massa de tecido a ser fracionada pode ser aumentada ou diminuda dependendo do tecido vegetal que se est trabalhando). 8.4- CENTRIFUGAO DA AMOSTRA Idem para PEROXIDASE. No entanto, a velocidade de rotao da centrfuga deve ser de 12.500 rpm por um perodo de 15 minutos. 8.5- PREPARO DA MISTURA DE REAO (MTODO 1) Atentar para a seqncia: 2,0 mL de tampo fosfato 50 mM pH 6,50 (deve estar a temperatura 500 L de H2O2 a 340 mM (este sempre RECEM PREPARADO e deve Incuba-se por 30 minutos a 30 C (se houver necessidade o tempo 500 L de extrato enzimtico (aps centrifugao); Fazer leituras espectrofotomtricas a intervalos de 10 segundos (podeA atividade enzimtica ser expressa como uma reduo da ambiente); estar a temperatura ambiente ver quantidade de reagente a ser diludo); pode ser modificado);

se modificar o intervalo) a 240 nm; absorbncia a 240 nm/min/mg de protena;

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Observao: As observaes feitas para PEROXIDASES tambm so levadas em considerao para CATALASES (incremento ou reduo de extrato enzimtico e uso ou no da incubao), inclusive CLCULOS DE ATIVIDADE ENZIMTICA; Para maiores informaes ver Zhou et al., (2003). 8.5.1- CLCULO DA ATIVIDADE ENZIMTICA Procede-se da mesma forma como para POD. 8.6- PREPARO DA MISTURA DE REAO (MTODO 2) A determinao da atividade da catalase feita pelo mtodo de KAR e MISHRA (1976), consiste no seguinte: 2,5 mL de tampo - fosfato 100 mM e pH 6,80 (deve estar a 110 L de H2O2 a 0,1 mM (este sempre RECEM PREPARADO e deve 1,89 mL de gua destilada; 500 L do extrato enzimtico; Encubar a 25 C por 1 minuto e interromper a reao adicionando 10 O H2O2 residual deve ser titulado com KMnO4 a 0.01 N (ver quantidade temperatura ambiente); estar a temperatura ambiente ver quantidade de reagente a ser diludo);

mL de H2SO4 a 2% (v/v); conveniente para preparar a soluo), at uma colorao prpura fraca persistir por, no mnimo, 15 segundos; protena). Observao: Para informaes adicionais ver Ludimila (2003). Uma amostra controle deve ser preparada da mesma forma, mas, a A atividade da catalase ser expressa em quantidade de H2O2 atividade da enzima foi interrompida no tempo zero de reao;

consumida por minuto por mg de protena (moles de H2O2 .min-1mg-1 de

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9- DETERMINAO DE ASCORBATO PEROXIDASE (ASP)

9.1 CONGELAMENTO DAS AMOSTRAS Idem para PEROXIDASES. 9.2 PREPARO DO TAMPO EXTRATOR (pH 7,00) Idem para CATALASE, atentando para adicionar 1 mM de ascorbato. 9.3 FRACIONAMENTO DA AMOSTRA Idem fracionamento para PEROXIDASE (a massa de tecido a ser fracionada pode ser aumentada ou diminuda dependendo do tecido vegetal que se est trabalhando). 9.4 CENTRIFUGAO DA AMOSTRA Idem para CATALASE. 9.5 PREPARO DA MISTURA DE REAO Atentar para a seqncia: 2,0 mL de tampo fosfato 50 mM pH 7,00 (deve estar a temperatura 200 L de CIDO ASCRBICO 1 mM (este sempre RECM Incuba-se por 30 minutos a 30 C (se houver necessidade); 300 L de H2O2 0,3 mM (fazer clculos para preparo dessa soluo); 500 L de extrato enzimtico (aps centrifugao); Fazer leituras espectrofotomtricas a intervalos de 10 segundos (podeA atividade enzimtica ser expressa como uma reduo da Observaes: 27 ambiente); PREPARADO - deve estar a temperatura ambiente);

se modificar o intervalo) a 290 nm; absorbncia a 290 nm/min/mg de protena.

 As observaes feitas para PEROXIDASES tambm so levadas em considerao para ASCORBATO PEROXIDASE (incremento ou reduo de extrato enzimtico e uso ou no da incubao), inclusive CLCULOS DE ATIVIDADE ENZIMTICA. Os volumes do tampo 50 mM pH 7,00 e de cido ascrbico 1 mM podem ser alterados, bem como do extrato enzimtico (atentar para volume final de 3 mL); Deve-se testar se h realmente necessidade de acrescentar cido ascrbico 1 mM ao tampo extrator ( provvel que seja possvel acrescentar o cido ascrbico apenas na mistura de reao); Para maiores informaes ver Zhou et al., (2003). 9.6- CLCULO DA ATIVIDADE ENZIMTICA Procede-se da mesma forma como para POD.

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10- DETERMINAO DE FENILALANINA AMONIALIASE (PAL)

10.1 CONGELAMENTO DAS AMOSTRAS Idem para PEROXIDASES. 10.2 PREPARO DO TAMPO EXTRATOR (pH 8,80) Pesar quantidade adequada de cido brico suficiente para preparar 500 mL (ou outro volume conforme a necessidade) da soluo com pH 1 % de PVP: dissolver 5 g de PVP nos 500 mL da soluo tampo 2 mM de EDTA: pesar 0,3720 g de EDTA e dissolver nos 500 mL de 5 mM de -mercaptoetanol: pesar quantidade adequada e dissolver Observaes: Aps a adio dos reagentes soluo de NaOH a 1 mol/L); Durante o ajuste do pH a soluo deve ser agitada constantemente com agitador magntico, se o mesmo estiver disponvel; IMPORTANTE: essa soluo de extrao deve ser mantida a 4 C (na geladeira, no no congelador). 10.3 FRACIONAMENTO DA AMOSTRA Idem fracionamento para PEROXIDASE (a massa de tecido a ser fracionada pode ser aumentada ou diminuda dependendo do tecido vegetal que se est trabalhando). PVP e EDTA e o mercaptoetanol o pH deve ser ajustado novamente para 8,80 (pode-se usar soluo a 100 mM, ajustando o pH para 8,80 com NaOH 0,5 M. ajustado (8,80) devem ser tomados e a ela adicionado os reagentes posteriores; borato pH 8,80; soluo tampo; nos 500 mL.

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10.4 CENTRIFUGAO DA AMOSTRA Idem para CATALASE. 10.5 PREPARO DA MISTURA DE REAO Atentar para a seqncia: 2.000 L de tampo borato 100 mM pH 8,80 (deve estar a 500 L de L-Fenilalanina 60 mM recm preparada e dissolvida no temperatura ambiente); prprio tampo-borato temperatura ambiente (ver quantidade adequada para se preparar essa soluo); Incuba-se por 15 minutos a 40 C (se houver necessidade); 400 L de extrato enzimtico (aps centrifugao); Deixar a mistura de reao a 40 C por 1 hora; Adicionar 100 L de HCl a 6N para encerrar a reao; A mudana na atividade tica a 290 nm foi medida contra uma amostra

em branco (sem o substrato L-fenilalanina: apenas 500 Lde tampo-borato); A atividade da PAL ser expressa como um aumento da absorbncia Observaes: As observaes feitas para PEROXIDASES tambm so levadas em considerao para FENILALANINA AMONIALIASE (incremento ou reduo do extrato enzimtico e uso ou no da incubao), inclusive CLCULOS DE ATIVIDADE ENZIMTICA. 10.6- CLCULO DA ATIVIDADE ENZIMTICA Procede-se da mesma forma como para POD. a 290 nm/h/mg de protena.

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11- CURVAS DE CALIBRAO

Uma curva de calibrao mostra resposta de um mtodo analtico para quantidades conhecidas de constituinte. A Tabela 1 fornece dados reais de uma anlise de protenas que produz um produto colorido. Um instrumento chamado espectrofotmetro mede a absorvncia da luz, a qual proporcional quantidade de protenas. Solues contendo concentraes conhecidas de constituinte so chamadas de solues padro. Solues contendo todos os reagentes e solventes usados na anlise, mas sem considerar a adio de constituinte, so chamadas de solues em branco. O branco mede a resposta do procedimento analtico para impurezas ou espcies interferentes nos reagentes. Tabela 1- Dados espectrofotomtricos utilizaados para a construo da curva de calibrao. Protena ( g) 0 5 10 15 20 25 Absorbncias (amostras independentes) 0,099 0,099 0,100 0185 0,187 0,188 0282 0,272 0,272 0345 0,347 (0,392) 0,425 0,425 0,430 0,483 0,488 0,496 Absorbncias corrigidas 0,000 0,085 0182 0,245 0,325 0,383 0,000 0,087 0,172 0,247 0,325 0,388 0,000 0,088 0,172 0,330 0,96

Varrendo atravs de trs valores de absorbncia de cada linha da Tabela 1, vemos que o nmero 0,392 parece fora da linha: ele inconsistente com os outros valores para 15 g, e a faixa dos valores para as amostras de 15 g muito maior que a faixa para as outras amostras. A relao linear entre o valor mdio de absorbncia acima da amostra de 20 g tambm indica que o valor 0,392 est em erro (Figura no mostrada). Escolhemos, portanto, omitir o valor de todos os clculos subseqentes.

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Adotamos o procedimento a seguir para construir uma curva de calibrao: Prepare amostras conhecidas do constituinte, cobrindo uma faixa conveniente de concentrao, e mea a resposta do procedimento analtico para esses padres. Esse procedimento gera os dados na metade esquerda da Tabela 1. Subtraia a mdia das absorbncias (0,099) das trs amostras em branco de cada absorbncia medida para obter a absorbncia corrigida (o branco mede a resposta do procedimento quando no h protena presente). Encontre uma equao matemtica (mtodo dos mnimos quadrados) Se voc, futuramente, analisar uma soluo desconhecida, faa um da absorbncia corrigida versus a quantidade de protena analisada. branco ao mesmo tempo. Subtraia a absorbncia do novo branco da absorbncia da amostra desconhecida para obter a absorbncia corrigida. Observao: A absorbncia do branco pode resultar da cor dos reagentes iniciais, de reaes de impurezas e de reaes de espcies de interferentes. Os valores do branco podem variar de um conjunto de reagentes para outro, mas absorbncia corrigida no. A equao determina a seguinte: Protena ( g ) = - 0,4936 + 63,7640 Abs (R2 = 0,9963) Exemplo: Uma amostra desconhecida de uma protena fornece uma absorbncia de 0,406, e um branco possui uma absorbncia de 0,104. Quantos microgramas de protena a amostra desconhecida possui? Soluo: A absorbncia corrigida 0,406 0,104 = 0,302. Portanto, torna-se: Protena (g) = - 0,4936 + 63,7640 0,302 = 18,76 g

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12- DETERMINAO DE INVERTASE SOLVEL

12.1- EXTRAO 12.1.1- PREPARO DO TAMPO EXTRATOR Deve-se preparar inicialmente uma soluo contendo 50 mM de tampo Na2HPO4 cido ctrico pH 7,00 (soluo de Na2HPO4 50 mmol/L: o cido ctrico serve para ajustar o pH do tampo). Para se preparar 1000 mL de soluo tampo, deve-se pesar 7,1000 g de Na2HPO4 e dissolver em quantidade suficiente para 1.000 mL. 500 mL (ou outro volume conforme a necessidade) da soluo com pH EDTA 1 mM: para isso, deve-se pesar 0,1861 g de EDTA e dissolve-lo 5 mM de Na2SO3: deve-se pesar 0,3150 g de Na2SO3 e dissolve-lo nos 5 mM de MgCl2: deve-se pesar 0,2375 g de MgCl2 e dissolve-lo nos 500 1 % de PVP: dissolver 5 g de PVP nos 500 mL da soluo tampo 1 mM de 2 - mercaptoetanol: tomar 35 L de 2 mercaptoetanol e Observaes: Aps a adio dos reagentes o pH deve ser ajustado novamente para 7,0 (pode-se usar soluo de NaOH a 1 mol/L); Durante o ajuste do pH a soluo deve ser agitada constantemente com agitador magntico, se o mesmo estiver disponvel; IMPORTANTE: essa soluo de extrao deve ser mantida a 4 C (na geladeira, no no congelador). 12.2- CONGELAMENTO DA AMOSTRA Deve ser feito primeiramente com nitrognio lquido. A amostra deve ser triturada em pequenos pedaos antes de ser submetida ao tratamento com ajustado devem ser tomados e a ela adicionado os reagentes posteriores; nos 500 mL da soluo tampo fosfato pH 7,00; 500 mL da soluo tampo fosfato pH 7, 00; mL da soluo tampo fosfato pH 7, 00; fosfato pH 7,00; dissolver nos 500 mL da soluo tampo fosfato pH 7,00;

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nitrognio lquido. Aps o tratamento, a amostra deve ser envolvida com papel alumnio e devidamente identificada. Posteriormente deve-se guard-la em freezer a 20C. 12.3- FRACIONAMENTO DA AMOSTRA Macerar 5 g de tecido (esse peso varivel e deve ser anotado COM PRECISO) em 10 mL de tampo extrator a 4C (a quantidade de tecido e de tampo a ser usado depende do material. Deve-se fazer testes [sugesto: 5 g (suco):10 mL (tampo)]; Observaes: Deve-se atentar para o cuidado de que todo o material a ser usado na triturao [almofariz e pistilo estes mantidos no freezer (trabalhar com 3 unidades), o tampo extrator, o tubo da centrfuga que receber o filtrado, a gua usada na lavagem do almofariz, etc.] esteja a 4 C, o que possvel com todos eles imersos em gelo. O fracionamento ou triturao pode ser feito com 10 mL de tampo extrator (conforme a quantidade do tecido) adicionado a uma certa quantidade de amostra, triturando-se bem at completa homogeneizao. Depois, acrescenta-se mais 10 mL do mesmo tampo e tritura-se novamente a mesma amostra (esse volumes so variveis conforme o tecido). Filtrar o macerado com 4 camadas de GASE e centrifugar a 17 000 g Dilise do sobrenadante contra o tampo extrator (SEM O PVP) a 4C Observaes: O sobrenadante colocado no TUBO DE DILISE e este colocado em um bquer com o tampo [os acares vo passar para o tampo e as protenas (enzimas) ficam no tubo]; Pode-se colocar para dilise apenas metade do volume utilizado como extrato (a outra metade do extrato enzimtico pode ser congelada); H necessidade de se preparar outro tampo pH 7,00 sem o PVP, preparado da mesma forma, apenas sem adio do PVP. por 15 minutos a 4 C; pelo perodo de uma noite (12 horas);

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12.4- ENSAIO ENZIMTICO 12.4.1- INVERTASE CIDA Utilizar 50 L (100 mM de acetato de sdio cido actico a pH = 5,00), 50 L de sacarose a 100 mM (esse volume varivel), 50 L do extrato (aps dilise) e 50 L de gua destilada; Observao: Essa mistura pode ser feita em EPENDORF (1,5 mL); Os volumes de extrato (50 L) e de gua destilada (50 L) so variveis [quando houver reduo no volume de gua (30 L) deve-se complementar com o volume de extrato (70 L) e vice versa: o volume final deve ser de 100 L]; A concentrao de sacarose (100 mM) pode ser alterada para mais ou para menos; Para preparar a soluo de acetato de sdio cido actico deve-se dissolver 9,8 g deste sal em gua e completar o volume para 1.000 mL (o cido actico serve para ajustar o pH para 5,00). Incubar a mistura de reao por 30 minutos (BANHO-MARIA) a 37 C Aps a incubao adicionar 200 L do REAGENTE 4 e agitar (o Incubar os tubos por 15 minutos (BANHO-MARIA); Resfriar os tubos em GELO; Adicionar 200 L do REAGENTE 5 e agitar; Adicionar 600 L de gua e agitar; Ler a absorbncia a 540 nm no espectrofotmetro. Observaes: A absorbncia est ideal quando a mesma estiver DENTRO da CURVA PADRO pelo mtodo de Somogy - Nelson; de fundamental importncia que todos os volume usados na metodologia sejam anotados para efeito de clculo da atividade enzimtica. por 12 horas. reagente 4 paralisa as reaes).

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12.4.2- INVERTASE ALCALINA Usar 50 L de MOPS a 50 mM (pH = 7,00) , 50 L de sacarose a 100 Observaes: Essa mistura pode ser feita em EPENDORF (1,5 mL); O volume final (acima) DEVE SER DE 200 L; Os volumes de extrato (50 L) e de gua destilada (50 L) so variveis [quando houver reduo no volume de gua (30 L) deve-se complementar com o volume de extrato (70 L) e vice versa: o volume final deve ser de 100 L]; A concentrao de sacarose (100 mM) pode ser alterada para mais ou para menos. MOPS a 50 mM (pH = 7,00): dissolver 10,4650 g de MOPS em 1.000 mL de gua e ajustar o pH para 7,00 com HCl ou NaOH 5N; Sacarose a 100 mM: dissolver 34,2000 g de sacarose em gua e completar o volume para 1.000 mL. Incubar a mistura da reao por 30 minutos a 37 C; Parar a reao pela adio de 200 L de REAGENTE 4 e agitar; Incubar os tubos em gua fervente por 15 minutos (BANHO MARIA); Resfriar os tubos em GELO; Adicionar 200 L do REAGENTE 5 e agitar; Adicionar 600 L de gua destilada e agitar; Ler a absorbncia a 540 nm; Observao: A absorbncia est ideal quando a mesma estiver DENTRO da CURVA PADRO pelo mtodo de Somogy - Nelson; de fundamental importncia que todos os volume usados na metodologia sejam anotados para efeito de clculo da atividade enzimtica. mM, 50 L de extrato (aps dilise) e 50 L de gua;

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12.4.3- DETERMINAO DE ACARES REDUTORES (MTODO DE SOMOGY NELSON) 12.4.3.1- PREPARO DOS REAGENTES REAGENTE 1 (ou REAGENTE A de Nelson): 15 g de tartarato de Separadamente dissolver 180 g de Na2SO4 (anidro) em 500 mL de gua fervente e resfriar; Misturar as duas solues e completar o volume para 1000 mL. REAGENTE 2 (ou REAGENTE B de Nelson): 5 g de CuSO4 5 H2O, REAGENTE 3 (ou soluo arseno-molbdica): 25 g de molibdato de 45 g de Na2SO4 (anidro) e completar para com gua destilada para 250 mL. amnio em 450 mL de gua destilada, adicionar 21 mL de H2SO4 concentrado com agitao. Separadamente dissolver 3 g de Na2HAsO4 7 H2O em 25 mL de gua, misturar com soluo de molibdato de amnio e incubar (BANHO MARIA) p 24 48 horas a 37C. REAGENTE 4 (ou REATIVO de Nelson): deve ser preparado na hora REAGENTE 5: deve ser preparado no momento da determinao dos da determinao dos acares: 8 mL do REAGENTE 1 + 2 mL do REAGENTE 2. acares: 7 mL de H2SO4 0,75 M (ou 8 mL do H2SO4 concentrado, diludo em 200 mL de gua) + 3,5 mL do REAGENTE 3. sdio e potssio, 30 g de Na2CO3 (anidro) em 300 mL de gua.

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12.4.3.2- PREPARO DA CURVA PADRO (atentar para adio dos reagentes na seqncia indicada) Tubos 0 1 2 3 4 5 Glicose (l) 0 25 50 75 100 200 H2O (l) 200 175 150 125 100 0 Reagente 4 Reagente 5 (l) 200 200 200 200 200 200 (l) 200 200 200 200 200 200 H2O (l) 600 600 600 600 600 600 Glicose (g) 0 4,5 9,0 13,5 18,0 36,0

SOLUO DE GLICOSE: preparar 1.000 mL de soluo de GLICOSE

180 mg/L (180 g/mL) para usar na curva - padro. Observaes: Preparar os tubos identificados (0 a 5); Acrescentar a glicose (l); Acrescentar gua (l); Acrescentar o REAGENTE 4 (l); Levar para BANHO - MARIA em GUA FERVENTE por 15 minutos. Resfriar em gelo e acrescentar o REAGENTE 5 e a gua (600 (l); Fazer a leitura a 540 nm. 12.4.3.3- CLCULO DE ATIVIDADE ENZIMTICA Observao: ver com o professor a forma de clculo para atividade enzimtica.

13- DETERMINAO DE PROTENAS

38

Ao se determinar enzimas pode-se expressar sua atividade em funo da matria seca ou em funo do teor de protena total: Taxa de produo/tempo/g de MS = atividade total; Taxa de produo/tempo/mg de protena total = atividade especfica.

Veremos alguns mtodos mais usados, mtodos espectrofotomtricos, que permitem a quantificao das protenas. 13.1- MTODO DE BRADFORD (Comassie Blue G 250) Trata-se de um mtodo bastante sensvel (2 g de protena/mL de extrato). Baseia-se na reao da protena com o corante Comassie Blue G 250. Quando h reao com a protena h mudana de cor de marrom para azul. 13.1.1- PREPARO DO REAGENTE DE BRADFORD Dissolver 100 mg de Comassie Blue G 250 em 50 mL de etanol a 90%. Deve-se solubilizar bem essa soluo em agitador automtico. A esta soluo adiciona-se 100 mL de cido fosfrico 85% (nunca o contrrio) ainda sob agitao. soluo resultante diluda para 1000 mL com gua destilada. Chamaremos a essa mistura de Reativo de Bradford. Aps o preparo do Reativo de Bradford deve-se fazer 3 filtraes com papel de filtro comum. Observaes: Esse reativo deve ser guardado em frasco escuro com papel alumnio e mantido em geladeira (por meses). Deve-se tomar 0,1 mL ou 100 L de soluo protica (extrato protico) para cada mL de Reativo de Bradford; Agitar e esperar 10 minutos e fazer leitura em espectrofotmetro a 595 nm. 13.2- MTODO DE LOWRI Trata-se de um mtodo menos sensvel que o anterior (mtodo de Bradford) j que conseque detectar at 0,1 mg de protena/mL de extrato. Esse mtodo no bastante utilizado pois baseia-se na reao dos reagentes com o aminocido fenilalanina, alm de outros compostos fenlicos. 13.2.1- PREPARO DOS REAGENTES 39

Reagente A: 0,5 g de CuSO4 5H2O e 1,0 g de Citrato de Sdio dissolvidos em 100 mL de soluo; Reagente B: 20,0 g de Na2CO3 e 4,0 g de NaOH dissolvidos em 1.000 mL de soluo; Reagente C: misturar 50 mL ~do Reagente B e 1,0 mL do reagente A; Reagente D: a 10 mL do reagente de Cicaltier adicionar 10 mL de gua. Na determinao protica, a 0,5 mL da soluo de protena adicionado 2,5 mL do Reagente C (esperar 10 minutos). Posteriormente adiciona-se 0,25 mL do Reagente D (esperar 30 minutos). A leitura da absorbncia deve ser feita a 600 nm. 13.3- MTODO DO BIURETO O mtodo se baseia na formao de uma colorao roxa com as protenas. um mtodo pouco sensvel j que o extrato protico deve ter no mnimo 3,0 mg de protenas/mL. 13.3.1- PREPARO DO REAGENTE DE BIURETO Toma-se 1,5 g de CuSO4 5H2O e dissolve-se em 100 mL de gua destilada. Depois, adiciona-se 6,0 g de tartarato duplo de sdio e potssio a essa soluo e completa-se o volume para 500 mL. A essa soluo deve-=se adiconar 300 mL de NaOH a 10% e o volume deve ser completado para 1.000 mL. Acrescentar 1,0 g de iodato de potssio. Esse o Reagente de Biureto. Na determinao protica, a 0,5 mL da soluo de protena adicionado 2,5 mL do Reagente de Biureto (esperar 30 minutos). A leitura da absorbncia deve ser feita a 540 nm. 13.4- PREPARO DA CURVA - PADRO DE PROTENA USANDO B. S. A. (pode ser usada no mtodo de Bradford) Preparar a soluo estoque de BSA a 100 mg/L ou 100 g/mL (essa soluo aps preparada deve ser guarda em congelador). A tabela abaixo pode ajudar a preparar a curva padro: N do tubo BSA (100 mg/L) H2O destilada 40 Conc. BSA Comassie Blue

1 2 3 4 5 6

L 20 L 40 L 60 L 80 L 100 L Observaes:

(L) 100 L 80 L 60 L 40 L 20 L -

(g/mL) 0 2 4 6 8 10

G 250 (L) 1000 1000 1000 1000 1000 1000

Essa mistura pode ser feita em (ependorf de 1,5 mL); Segue exemplo de dados espectrofotomtricos (dados reais) de uma curva padro usando-se BSA: Absorbncia 0,073 0,153 0,240 0,290 0,352 Curva Padro Ajustada: Y = 28,4782 * Abs 0,3108 R2= 0,9948 Onde: Y = Protena em g; Abs = Absorbncia. MUITO IMPORTANTE: Quando se determina protena por esse mtodo, a quantidade de protena determinada para uma quantidade de amostra (no h necessidade de se pesar a amostra inicialmente) presente numa quantidade de extrato usado na determinao (100 L de extrato); Para se dividir a atividade enzimtica (de PPO, POD e CAT) em UA/min pela quantidade de protenas em mg, h necessidade de se efetuar um clculo para transformar a quantidade de protenas do extrato presente nesses 100 L (ou outro volume usado dentro do intervalo de 0 a 100 L) para o volume 41

BSA (g) 2 4 6 8 10

final de extrato usado na determinao enzimtica (500 L no caso de PPO, por exemplo ver metodologia), bastando para isso multiplicar a quantidade de protenas em g por 5.

14- DETERMINAO DE ACARES SOLVEIS

14.1- CONSIDERAES Os carboidratos, lipdeos e protenas so os principais componentes celulares. Nas plantas ou carboidratos podem constituir at 75% de seu peso seco. Funcionam como fonte de energia, facilmente disponveis (acares), como

42

nutrientes de reserva energtica (amido, inulina e glicognio) e como material de estrutura (celulose, quitina, etc.). A metodologia usada para extrao de dos carboidratos solveis totais, conforme descriata no AOAC, manual que descreve os mtodos oficiais aceitos pela Associao dos Qumicos Analticos, pressupe uma extrao exaustiva com etanol 80% quente. Este extrator tem a vantagem de extrair todos os carboidratos solveis deixando o amido praticamente intacto no resduo de extrao. A frao carboidratos solveis totais compreende, pois, os carboidratos de baixo peso molecular, solveis em etanol 80%. Estes carboidratos em funo da presena de grupos aldedicos livres ou potencialmente livres podem se classificar em redutores e no-redutores. Nos acares redutores o grupo aldedico pode ser facilmente oxidado a cido carboxlico por agentes oxidantes fracos. Esta caracterstica tem sido utilizada por diversos mtodos analticos, como no caso do Mtodo de Nelson, para caracterizar a frao de acares redutores num extrato de carboidratos solveis totais. A frao de acares noredutores , por sua vez, determinada indiretamente pela diferena entre o teor de carboidratos totais de acares redutores. 14.2- DETERMINAO DE CARBOIDRATOS SOLVEIS TOTAIS 14.2.1- EXTRAO DOS CARBOIDRATOS SOLVEIS Transfira 5 g do material (varia conforme o produto: esse peso ou volume devem ser anotados) para um bquer de 250 mL contendo 30 mL de etanol 80% quente. Cubra-o com vidro de relgio e aquea em BANHO - MARIA a 80 C, por 30 minutos (este copo ser considerado COPO DE EXTRAO); Observao: Findo este prazo, o material pode ser armazenado em geladeira (ou temperatura ambiente) ou seguir logo o processo de extrao; Pode-se armazenar esse extrato em recipientes plsticos de 50 mL. Transfira o sobrenadante do copo de extrao para um copo de 250 mL, filtrando-o em funil de vidro com papel de filtro, com auxlio de bastonete

43

(este copo no o de EXTRAO: cuidado para no deixar cair material vegetal no papel de filtro); lembre-se Com que auxlio voc de s uma retirou pisseta o com etanol a 80% um transfira, almofariz, quantitativamente, o material vegetal (o resto que ficou no copo de extrao: sobrenadante) para desintegrando-o vigorosamente durante 2 minutos; Retorne o homogeneizado ao copo de extrao, cubra-o com vidro de relgio e aquea seu contedo em BANHO - MARIA a 80 C por 30 minutos com agitao ocasional; Decante o segundo extrato para o mesmo copo de 250 mL (aquele Adicione cerca de 40 mL de etanol 80% ao copo de extrao (com Filtre, com transferncia total do contedo do COPO DE EXTRAO com sobrenadante), evitando transferir material slido para o papel de filtro; resduo), aquecendo-o novamente em BANHO - MARIA por 30 minutos a 80 C; para o bquer de 250 mL (aquele com os dois sobrenadantes), lavando o resduo do papel de filtro e do COPO DE EXTRAO 3 vezes com pores de etanol a 80% (veja que teremos 3 filtrados ou sobrenadantes que contm os acares solveis); Observao: O resduo contido no papel de filtro (junto com o mesmo) pode ser colocado num dessecador temperatura ambiente para determinao posterior de amido. 14.2.2- CLARIFICAO DO EXTRATO Evapore o extrato alcolico em BANHO MARIA at eliminao completa dos odores de lcool (evite evaporao at secura, adicionando pequenos volumes de gua destilada, se necessrio); Junte a seguir cerca de 50 mL de gua e aquea o contedo do copo a 80 C em BANHO - MARIA durante 15 minutos, resfriando e transferindo, quantitativamente, o contedo do copo para balo volumtrico de 100 mL; Observao:

44

 Esse extrato ser usado para determinao dos carboidratos solveis TOTAIS e REDUTORES. Para determinao dos acares totais, esse extrato (no balo de 100 mL) deve ser diludo adequadamente conforme a amostra que se est trabalhando). 14.3- CARBOIDRATOS SOLVEIS TOTAIS (MTODO DA ANTRONA) um mtodo especfico para hexoses e consiste na hidrlise pelo cido sulfrico concentrado, que quando aquecido com hexoses sofre uma reao de condensao, formando um produto de colorao verde e lida no espectrofotmetro a 620 nm. 14.3.1- PREPARO DOS REAGENTES Soluo de GLICOSE 100 mg/L: pesar 100 mg de glicose e transferir com auxlio de funil de vidro e basto para um balo de 1.000 mL e completar o volume com gua destilada; Reativo de ANTRONA: Pesar 1 g de ANTRONA em bquer de 100 mL; Adicionar em torno de 50 mL de CIDO SULFRICO concentrado de boa qualidade e homogeneizar (CUIDADO: cido sulfrico queima a pele); Aps dissolver o cido, transferir o contedo para balo de 1.000 mL, fazendo lavagens sucessivas do bquer com o mesmo cido, completando o volume para 1.000 mL (utilize funil e basto de vidro) durante esta operao. 14.3.2- PREPARO DA CURVA - PADRO Preparar a soluo estoque de Glicose a 100 mg/L ou 100 g/mL e soluo de Antrona a 1g/L. A tabela abaixo pode ajudar a preparar a curva padro: N do tubo Glicose (100 g/mL) H2O destilada (L) Antrona (1 g/L) Glicose (g)

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Branco 1 1 2 3 4 5

50 100 200 300 400 500

1000 950 900 800 700 600 500

mL 2 2 2 2 2 2 2

0 5 10 20 30 40 50

Prepare uma curva padro pipetando, em tubos providos de tampa

rosquevel, os volumes de soluo de glicose 100 mg/L ou 100 g/mL completando com gua destilada para 1000 L (recomenda-se usar 3 replicatas); vortex); Aps adio do reagente de antrona coloque os tubos em BANHO Leia e anote as absorbncias das solues em espectrofotmetro Com as absorbncias e suas respectivas quantidades de glicose (5 MARIA (gua fervente) por 8 minutos e depois resfria-los em gua com gelo; num comprimento de onda de 620 nm; a 50 g) fazer uma curva padro. Observao: Nos tubos contendo a amostra (extrato clarificado) deve-se pipetar volume adequado (determinado em testes prvios) o volume final deve ser de 500 L. A esses tubos imersos em gelo adicione lentamente 2,0 mL de reagente de ANTRONA, misturando o contedo uniformemente (agitando em

14.4-

DETERMINAO

DE

CARBOIDRATOS

SOLVEIS

REDUTORES

(MTODO DE SOMOGY - NELSON) Os acares redutores aquecidos em meio alcalino trabsformam-se em enediis que reduzem os ons Cu2+ presentes a Cu+. O xido cuproso (Cu2O) assim formado, reduz o reativo arseno molbdico a xido de molibdnio

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(Mo3O8) de colorao azul cuja intensidade de cor proporcional quantidade acar redutor presente na amostra. As leituras de absorbncias so feitas a 540. 14.4.1- PREPARO DOS REAGENTES Reativo de Nelson A: dissolva 6,25 g de Na2CO3 anidro, 6,25 g de tartarato duplo de Na e K, 5 g de NaHCO3 e 50 g de Na2SO4 anidro em 200 mL de gua destilada, aquecendo se nescessrio, para favorecer a dissoluo; completar o volume dessa soluo para 250 mL (depois de fria) com gua destilada; Reativo de Nelson B: Dissolva 7,50 g de CuSO4 5H2O em 50 mL de Observao: O REATIVO CPRICO preparado no momento de sua adio: 24 mL do reativo A + 1 mL do reativo B); Soluo ARSENO MOLBDICA: Dissolva 25,00 g de (NH2)6Mo7 H2O (molibdato de amnio) em 450 mL de gua destilada e adicione 21 mL de H2SO4 concentrado (cuidado: o CIDO SULFRICO deve ser acrescentado com auxlio de uma BURETA I ou PIPETA de 25 mL); Observaes: Separadamente dissolva 3 g Na2HAsO4 7H2O em 25 mL de gua destilada e adicione soluo anterior e homogeneizar. A soluo ARSENO MOLBDICA deve ser guardada em frasco MBAR (de preferncia envolto com papel alumnio) e ao abrigo da luz (geladeira). Verificar sempre se a soluo arseno molbdica (de colorao amarelada) mudou de cor (preparar outra soluo caso isso se confirme); 14.4.2- PREPARO DA CURVA - PADRO Preparar a soluo estoque de Glicose a 100 mg/L ou 100 g/mL. A tabela abaixo pode ajudar a preparar a curva padro: gua destilada e adicione 1 gota de H2SO4 concentrado;

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Tubo Branc o 1 2 3 4 5

Glicose (L) 100 200 300 400 500

H2O dest. (L) 500 400 300 200 100 -

Reativo Cprico (L) 500 500 500 500 500 500

Sol. Arseno Molbdica (L) 500 500 500 500 500 500

Glicose (g) 0 10 20 30 40 50

Prepare uma curva padro pipetando, em tubos providos de tampa

rosquevel, os volumes de soluo de glicose 100 mg/L ou 100 g/mL completando com gua destilada para 500 L (recomenda-se usar 3 replicatas); A esses tubos adicione 500 L de gua destilada; Adicione 500 L de REATIVO CPRICO (24 mL do reativo A + 1 mL Leve os tubos ao BANHO MARIA em ebulio por 20 minutos e Adicione a esses tubos 500 L de reativo ARSENO MOLBDICO; Adicionar 3,5 mL de GUA DESTILADA (ultimo reagente a ser Leia e anote as absorbncias das solues em espectrofotmetro num Observao: Nos tubos contendo a amostra (extrato clarificado) deve-se pipetar volume adequado (determinado em testes prvios) o volume final deve ser de 500 L; Os acares NO-REDUTORES so determinados por diferena: AST AR = ANR, onde: AST = acares solveis totais, AR = acares redutores e ANR = acares no-redutores. 14.5DETERMINAO DE CARBOIDRATOS SOLVEIS REDUTORES

do reativo B); resfrie-os em gelo;

adicionado); coprimento de onda de 540 nm.

(MTODO DO DNS) 14.5.1- PREPARO DO REAGENTE - DNS

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(A)- Pesar 2,5 g de DNS ( cido 3,5 - dinitro - saliclico) e adicionar (B) - Pesar 75 g de tartarato de sdio e potssio (Sal de Rochelle), Observao: No preparo desta soluo adequado adicionar aos poucos o

50 ml de NaOH 2N ( deve ser realizado num becker de 500 ml ); adicionar 125 ml de gua destilada. Agitar sob aquecimento at dissoluo total.

reagente ao Becker com gua em agitao. Posteriormente, adicionar o reagente sobre (A), homogeneizando sob aquecimento at dissolver completamente depois de resfriada a mistura completar o volume da soluo para 250 ml; 14.5.2- PROCEDIMENTO PARA OBTENO DA CURVA PADRO tabela a seguir: Tubo Glicose 1,8 mg/L (L) Branco 1 2 3 200 400 600 H2O dest. (mL) 1,5 1,3 1,1 0,9 Glicose (g) 0 360 720 1080 *Reagente DNS (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 H2O dest. (mL) 7,5 7,5 7,5 7,5 Preparar um soluo de glicose a 1800 mg/L (1800 g/mL) e adicionar em tubos devidamente identificados, na seguinte ordem, conforme

* Aps adio do reagente de DNS, agita-se os tubos e leva-se os tubos para banho fervente em ebulio por 5 minutos. Deixa-se resfriar (banho de gelo). Completa-se o volume para 10 ml de gua destilada,( ou no conforme o caso), e fazer a leitura a 540 nm.

Observao: Para quantificar os acares redutores de um extrato de tecidos convenientemente preparado, pode-se usar at 1,5 ml do extrato e adiciona-se o reagente de DNS e, posteriormente, segue-se as mesmas recomendaes para a obteno da curva - padro. 14.6- DETERMINAO DE AMIDO EM TECIDO VEGETAL

49

Esta tcnica ter como objetivo extrair, purificar e determinar o teor de amido em tecido vegetal (aquele resduo guardado aps extrao dos carboidratos solveis) pelo Mtodo Colorimtrico da Antrona. 14.6.1- CONSIDERAES O amido o principal carboidrato de reserva nos vegetais. O seu teor em plantas varia amplamente com a espcie, tecido analisado, atividade metablica, etc. particularmente abundante em sementes, bulbos e tubrculos, onde pode atingir at 70% do peso seco total. O amido um polissacardeo constitudo unicamente por unidades de glicose. Compe-se de amilose (polmero linear de glicose) e amilopectina (polmero ramificado de glicose). praticamente insolvel em gua fria, mas SOLVEL EM GUA QUENTE. No se solubiliza em etanol a 80%. Existem numerosos mtodos para a determinao do amido. Os mtodos colorimtricos podem, em geral, ser reunidos em dois grupos: MTODOS COLORIMTRICOS SEM HIDRLISE DE AMIDO Esses mtodos baseiam-se na ligao do iodo com o amido. So, geralmente, bastante simples, mas apresentam pelo menos uma grande desvantagem que ter a intensidade da cor produzida dependente da relao amilose/amilopectina. Como esta relao varia com a espcie, idade da planta, etc, torna-se muito difcil estimar com preciso o seu teor. Na prtica, tm sido usados fatores de correo para amidos de diferentes espcies de vegetais, mas de qualquer modo necessrio preparar uma curva padro com amido isolado da espcie vegetal em estudo.

MTODOS COLORIMTRICOS COM HIDRLISE DE AMIDO Esses mtodos baseiam-se na extrao, purificao e hidrlise do

amido, o qual avaliado com base na glicose liberada. Um fator de correo (0,90) empregado para transformar o teor de glicose (composto que realmente determinado) em teor de amido. A tcnica , usualmente, bastante morosa, uma vez que os acares solveis tm que ser removidos previamente, geralmente, por extrao exaustiva em lcool a 80%. A hidrlise de amido pode 50

ser obtida pela utilizao de enzimas hidrolticas (amilase) ou por meio de cidos fortes. Na presente tcnica ser utilizada hidrlise cida seguida de quantificao da glicose liberada pela tcnica colorimtrica da antrona. 14.6.1.1- PREPARO DAS SOLUES Soluo de iodo iodeto de potssio: dissolver 3 g de I2 e 3 g de KI Soluo alcolica de NaCl: adicionar a 70 mL de lcool (etanol) 10 mL Soluo alcolica de NaOH 0,25 N: adicionar a 70 mL de lcool Soluo de NaCl a 20%: pesar 20 g de NaCl e dissolver em gua, Acetato de uranila a 5%: pesar 5 g de acetato de uranila e dissolver Reativo de antrona: pesar 100 mg de antrona e dissolver em 50 mL de em 60 mL de gua destilada, completando o volume para 100 mL; de NaCl a 20%, misture e complete o volume para 100 mL com gua destilada; (etanol) 25 mL de de NaOH 1 N, misturar e completar o volume para 100 mL; completando o volume para 100 mL; em gua, completando o volume para 100 mL; cido sulfrico 70%, completando volume para 100 mL (recomenda-se preparar 1 L de soluo). 14.6.1.2- REMOO DOS ACARES SOLVEIS Esta etapa foi realizada na etapa de determinao dos acares solveis (UTILIZAR O RESDUO). 14.6.1.3- SOLUBILIZAO DO AMIDO E REMOO DAS PROTENAS Transfira o resduo slido obtido durante a fase de extrao dos Lave o papel de filtro com 5 mL de gua destilada, coletando o lquido Junte cerca de 200 mg de areia lavada fina com o resduo e misture Aquea o tubo de ensaio em BANHO MARIA em ebulio por cerca carboidratos solveis, com auxlio de esptula pequena para um tubo de ensaio; no tubo de ensaio com o resduo; bem com bastonete para umedecer uniformemente o material; de 15 minutos para gelatinizar o amido;

51

Resfrie-o temperatura ambiente imergindo-o em banho de gua Adicione 5 mL de HClO4 a 60% rapidamente e sob constante agitao Triture o material slido com auxlio de um bastonete, por

temperatura ambiente; (vortex) para solubilizar (dispersar) o amido (temperatura de 22 C a 25 C); aproximadamente 1 minuto (repita esta operao algumas vezes por 30 minutos); A seguir, transfira o contedo do tubo, de forma quantitativa, para um Adicione 3 mL de acetato de uranila a 5% para precipitar as protenas, Transfira todo o contedo do balo (25 mL) para um tubo de centrfuga balo de 25 mL; complete o volume , complete o volume com gua destilada e misture bem; e centrifugue a 10.000 g por 10 minutos. 14.6.1.4- PRECIPITAO, PURIFICAO E SOLUBILIZAO DO AMIDO Transfira 20 mL do sobrenadante (aps centrifigao) para outro tubo de centrfuga, adicione cerca de 100 mg de celite, 5 mL de NaCl a 20%, 2 mL do reagente de I2 KI e misture bem (se a mistura concentrao de amido for excessivamente alta pode ser necessrio adicionar mais reagente de I2 KI); Deixe em repouso por pelo menos ( o ideal deixar em repouso pelo perodo de uma noite) e centrifugue o tubo a 10.000 g por 10 minutos; Com cuidado, para evitar perda de precipitado (complexo iodo amido), Ressuspenda o precipitado com 5 mL da soluo alcolica de NaCl, Adicione ao resduo no tubo de centrfuga 2 mL de soluo alcolica de remova e descarte o sobrenadante, to completamente quanto possvel; centrifugue novamente e decante, eliminando o sobrenadante; NaOH 0,25 N e agite suavemente a tubo at que seja removida toda a cor azul do precipitado de amido (no use o bastonete para agitar: espere o tempo necessrio para completar a remoo de cor); Lave as paredes do tubo com 5 mL de soluo alcolica de NaCl e Decante o sobrenadante, efetuando nova lavagem com soluo centrifugue o amido liberado do complexo; alcolica de NaCl; 52

Adicione 5 mL de gua quente (prxima da ebulio) ao tubo, agitando Transfira, quantitativamente, a soluo (suspenso) para balo de 25

seu contedo com bastonete de vidro at completa solubilizao do amido; mL e complete o volume com gua destilada. 14.6.1.5- DETERMINAO DO TEOR DE AMIDO com Pipete 3 alquotas de 0,5 mL da amostra obtida anteriormente em tubo rosquevel (essa quantidade pode ser alterada: fazer tampa

complementao com gua destilada); Prepare a partir de uma soluo 0,01% de glicose, uma curva de calibrao, tendo de 0 a 100 g de glicose em 0,5 mL de soluo, com trs repeties; Mergulhe-os em banho de gelo, adicione a cada um deles 2,5 mL do Resfrie-os em gua corrente e determine as absorbncias das solues reagente de antrona e agite vigorosamente; coloridas a 620 nm (considere que o teor de amido equivale a 0,9 vezes a quantidade de glicose encontrada;. 14.6.1.6- CLCULOS: ver com o professor.

15- DETERMINAO DO TEOR DE CLOROFILA

15.1- CONSIDERAES Os tecidos verdes apresentam dois tipos de clorofila, os quais so muito similares e ocorrem em mistura, juntamente com outros pigmentos carotenides:

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a clorofila a e a clorofila b. Um problema primrio nos estudos de pigmentao a determinao das concentraes de cada um deles. Existem diversos mtodos para a determinao do teor de clorofila total em amostras secadas em forno e modas em p fino. Todavia, esse tipo de extrao conduz a erro, devido as rpidas alteraes nos pigmentos durante o processo de secagem. Em decorrncia, o uso de amostras frescas tem predominado. A grande maioria dos mtodos e equaes disponveis (os quais variam em funo da concentrao da acetona usada para extrao) derivam do mtodo clssico para a estimativa das clorofilas a e b, desenvolvido por Arnon (1949). Esse mtodo ainda o de maior aceitao na atualidade. 15.2- MTODO I 15.2.1- EXTRAO Pese cerca de 1,00 g de tecido (anote o valor) e pique em pequenos Observao: Esse valor pode ser alterado conforme o tecido. Acrescente 10 mL de acetona 85% e macere com areia lavada at que Filtre o extrato, atravs de papel de filtro, diretamente num balo Lave o almofariz s vezes que for necessrio (sempre com acetona Complete o volume do balo de 50 mL com acetona 85%; Observao: Esse extrato pode ser diludo, se necessrio, caso a absorbncia no fique entre 0,600 e 0,800 no comprimento de onda de 663 nm; Caso haja diluio (por exemplo 3 mL de extrato e 2 mL de acetona 85%), o teor de clorofila encontrado deve ser multiplicado pelo fator 1,67 (3/2). 15.2.2- LEITURA ESPECTROFOTOMTRICA E DETERMINAO todo lquido seja incorporado massa verde; volumtrico de 50 mL. 85%), at que se verifique total extrao das clorofilas no tecido amostrado; pedaos em almofariz;

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15.2.2.1- TEOR DE CLOROFILA a Clor a (g/L) = 0,0127 Abs663 0,0027 Abs645 Observaes: Clor a (g/L): teor de clorofila no extrato (50 mL ou diludo) em g/L; Abs663 e Abs645: absorbncias nos respectivos comprimentos de onda. 15.2.2.2- TEOR DE CLOROFILA b Clor b (g/L) = 0,0229 Abs645 0,0047 Abs663 Observaes: Clor b (g/L): teor de clorofila no extrato (50 mL ou diludo) em g/L; Abs663 e Abs645: absorbncias nos respectivos comprimentos de onda. 15.2.2.3- TEOR DE CLOROFILA TOTAL Clor Total (g/L) = 0,0202 Abs645 + 0,0080 Abs663 Observaes: Clor Total (g/L): teor de clorofila total (a + b) no extrato (50 mL ou diludo) em g/L; Abs663 e Abs645: absorbncias nos respectivos comprimentos de onda. Importante: os teores de clorofila calculados pelas equaes anteriores so exclusivamente no extrato, indicando que clculos devem ser feitos para se determinar os teores na amostra fresca ou seca. 15.3- MTODO II determinado na casca (espessura de aproximadamente 1 mm). Utiliza-se para desintegrao um homogeneizador de tecidos onde 1 g do material contendo 10 ml de uma soluo de acetona a 80%. Na ausncia deste equipamento pode ser utilizado um gral (almofariz). Ao volume do extrato, aps a homogeneizao, 55

adiciona-se a acetona a 80% at completa descolorao, seguida de filtrao. O volume final do extrato ser de 50 ml. A leitura de absorbncia deve ser lida a 652 nm at meia hora e os extratos envolvidos em papel alumnio. Os nveis de clorofila total so determinados em mg/100g de casca. Clorofila Total = [( A652 x 1000 x v/1000w)/34,5] x 100 onde: v = volume final do extrato clorofila acetona; w = peso da casca em gramas.

16- DETERMINAO DO TEOR DE CAROTENIDES TOTAIS

Os teores de carotenides totais sero determinados com base nos teores de clorofila a e b. Nesse caso, recomenda-se utilizar as equaes abaixo para determinar os teores de clorofilas a e b.

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16.1- MTODO DE EXTRAO Seguir os mesmos procedimentos para extrao de clorofilas. 16.2- LEITURA ESPECTROFOTOMTRICA E DETERMINAO As absorbncias so determinadas a 470, 647 e 663 nm e os nveis de clorofilas (a e b) e carotenides totais so determinados segundo as equaes a seguir, em g/mL de extrato cetnico: Carotenides Totais ( g/mL) = [1000 Abs470 - (1,82 Clor a + 85,02 Clor b)]/198 Clor a ( g/mL) = 12,25 Abs663 2,79 Abs647 Clor b ( g/mL) = 21,50 Abs647 5,10 Abs663 Observao: Os resultados so multiplicados por 50 para quantificar o teor de pigmentos no extrato cetnico (50 mL) e divididos pela massa (g) de tecido, para que os resultados possam ser expressos em g de carotenides totais, clorofila a e clorofila b por grama de tecido.

17- DETERMINAO DO TEOR DE VITAMINA C TOTAL

17.1- MTODO ESPECTROFOTOMTRICO O cido ascrbico pode ser facilmente oxidado a dehidroascrbico, que tambm apresenta atividade vitamnica. Este reage com 2,4 dinitrofenilhidrazina (2,4 DNPH) na presena de tiouria a quente, para formar 57

2,4 nitrofenilhidrazona. Este se dissolve em cido sulfrico (meio fortemente cido), originando colorao avermelhada. O mximo de absorbncia d-se entre 520 e 525 nm. O cido ascrbico deve, portanto, ser previamente oxidado a dehidroascrbico com agente oxidante suave (2,6 diclorofenol indofenol). A tiouria utilizada para evitar decomposio do cido dehidroascbico durante sua condensao com a 2,4 DNPH. Para incrementar a velocidade da reao de condensao, pode-se usar BANHO - MARIA fervente por 5 a 10 minutos ou condies normais de temperatura por 3 horas. Usualmente utiliza-se temperatura de 37 C por um perodo de tempo de 3 horas. Esse mtodo adequado para determinar vitamina C total em produtos vegetais e alimentos em geral. 17.1.1- PREPARO DAS SOLUES destilada; Soluo de 2,4 dinitrofenilhidrazina (2,4 DNPH) a 2%: pesar 2 g Observaes Deve-se levar em considerao a gua contida no reagente (2,4 DNPH): se o reagente tiver 33% de gua, deve-se pesar 2,99 g (ao invs de 2 g) e dissolver o volume para 100 mL com H2SO4 9 N; Essa soluo deve ser colocada em repouso por 24 horas e, depois, filtrada. Soluo de tiouria a 10%: dissolver 10 g em 50 mL de lcool absoluto Soluo de 2,4 diclorofenol indofenol (2,4 DFI) a 0,2%: dissolver H2SO4 9 N: diluir cido sulfrico concentrado (98% e 1,84 g/L de e completar o volume para 100 mL com gua destilada; 0,2 g e completar para 100 mL com gua destilada; densidade) na seguinte proporo: medir 250 mL de cido sulfrico e dissolver em gua destilada, completando o volume para 1.000 mL (no adicionar gua sobre o cido); 58 de 2,4 DNPH e completar o volume para 100 mL com H2SO4 9 N; Soluo de cido ascrbico (Vitamina C) a 100 mg/L ou 100 g/mL: pesar 100 mg de de cido ascrbico e completar o volume para 100 mL com gua

Soluo de cido oxlico a 0,5%: dissolver 0,5 g de cido oxlico em

50 mL de gua destilada, completando o volume para 100 mL. 17.1.2- EXTRAO DA AMOSTRA Pesar 2 g de material (essa quantidade depende do material Agitar durante 5 minutos; Filtrar ou centrifugar a 9.000 rpm por 10 minutos; Clarificar o filtrado ou centrifugado com KIESSELGUR para retirar os Colocar em tubo de ensaio com tampa 1 mL de filtrado e 3 mL da utilizado) previamente triturado e adicionar 98 mL de cido oxlico a 0,5%;

interferentes, realizando uma filtrao posterior; soluo de cido oxlico a 0,5% e proceder conforme curva padro (tabela a seguir) com os demais reagentes.
Vit. C Tubo Branco 1 2 3 4 5 Amostra (mL) 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,0 Ac. Oxlico (mL) 4,0 3,8 3,6 3,4 3,2 3,0 3,0 2,4 DFI (gotas) 3 3 3 3 3 3 3 2,4 DNPH (mL) 1 1 1 1 1 1 1 Tiouria (gotas) 1 1 1 1 1 1 1 H2SO4 (9 N) 5 5 5 5 5 5 5 Conc. ( g) 0 20 40 60 80 100 -

Observaes: Aps a colocao da tiouria (atentar para a seqncia) deixar em BANHO MARIA por 10 minutos (ou a 37 C por 3 horas) e resfriar em banho de gelo; O H2SO4 9 N deve ser acrescentado lentamente, agitando suavemente, com os tubos em banho de gelo para evitar carbonizao; Agitar vigorosamente e deixar em repouso por 10 minutos; Fazer leitura espectrofotomtrica a 520 nm. 17.1.3- CLCULOS Traar a curva padro usando a absorbncia concentrao ( g). Pela curva padro verificar a concentrao de cido ascrbico na tomada de ensaio. Calcular para 100 g do produto, levando em considerao a diluio da amostra. 59

17.2- MTODO TITULOMTRICO 17.2.1- PREPARO DAS SOLUES Iodeto de potssio a 10%: pesar 10 g de iodeto de potssio (KI) e Amido a 1% (no caso de se adicionar cido oxlico): pesar 1 g de Amido a 10% (no caso de se adicionar cido sulfrico 2 N): pesar 10 Observao: Manter na geladeira por at 7 dias. cido oxlico a 0,5%: pesar 5 g de cido oxlico e dissolver em gua Observao: Pode-se substituir o cido oxlico por cido sulfrico 2N: 53,3 mL do cido concentrado (37,5 N) devem ser diludos para 1.000 mL de soluo; Neste caso, usar 2 mL de cido sulfrico 2 N ao adicionar os reagentes no erlemeyer. Iodato de potssio (KIO3) 0,01 N: pesar 2,14 g de KIO3 e dissolver em Observao: O KIO3 deve ser seco em estufa a 100 C por um perodo de 2 dias. 17.2.2- PROCEDIMENTO Pipetar (ou pesar) quantidade conveniente de amostra em erlemeyer contendo 50 mL de soluo de cido oxlico a 0,5% (ou 2 mL de cido sulfrico 2 N). Homogeneizar, filtrar e receber o filtrado em erlemeyer de 250 mL ou 125 mL. Adicionar 1 mL de soluo de iodeto de potssio, 1 mL de soluo de amido e agitar. Titular com soluo de iodato de potssio at colorao azul. 17.2.3- CLCULO gua suficiente para 1000 mL; suficiente para 1000 mL; dissolver em gua suficiente para 100 mL; amido e dissolver em gua suficiente para 100 mL; g de amido e dissolver em gua suficiente para 100 mL;

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mg de vitamina C/100 mL = (100 V N t)/P Onde: V = Volume de iodato de potssio gasto na titulao; N = Normalidade da soluo de iodato de potssio; t = Equivalente grama do cido ascrbico (88); P = N de gramas ou volume de amostra.

18- DETERMINAO DO TEOR DE FENLICOS TOTAIS

A aceitabilidade e palatabilidade dos frutos e seus produtos dependem do tipo e da concentrao dos compostos adstringentes presentes. A adstringncia associada aos compostos fenlicos. A sensao de adstringncia ocorre devido coagulao das protenas da saliva e epitlio mucoso, por combinao com a substncia adstringente. Os adstringentes so divididos em duas categorias:

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a) Pseudo-adstringentes - substncias que embora adstringentes, no precipitam protenas. b) Adstringentes verdadeiros - quando precipitam protenas. Entre elas encontram-se os taninos vegetais, que so substncias derivadas dos compostos fenlicos. Por exemplo: catecol, antocianinas, etc. So classificadas em 2 grupos: taninos hidrolisveis e taninos condensados (polmeros). So considerados taninos ativos aqueles que apresentam adstringncia. Os frutos verdes (muito adstringentes) contm grande quantidade de fenlicos dmeros, ao contrrio dos frutos maduros, que possuem elevada percentagem de formas polimricas. Assim, as formas dmeras e oligomricas so tidas como responsveis pela adstringncia, principalmente as originrias do cido cinmico, catequina e antocianinas. As formas altamente polimerizadas no interagem com as papilas gustativas e da, provavelmente, a ausncia de adstringncia em frutos maduros. A extrao de taninos antes do doseamento, fundamenta-se na sua solubilizao em metanol e gua e o seu teor determinado segundo o Mtodo de Colorimtrico de Folin Denis. O princpio baseia-se na reduo de fosfotungatato fosfomolbdato em soluo alcalina pelos compostos benznicos polihidroxilados formando azul de molibdnio. 18.1- PREPARO DOS REAGENTES a) Soluo de Folin - Denis Homogeneizar em 750 mL de gua destilada, 100 g de tungstato de Aquecer sob refluxo durante 2 horas (haver mudana de cor: amarelo sdio, 20 g de cido fosfomolbdico e 50 mL de cido fosfrico a 85%; para verde escuro), esfriar e completar o volume para 1000 mL. b) Soluo de carbonato de sdio a 10% Pesar 10 g de carbonato de sdio anidro e diluir em 100 mL de gua destilada a 70 80 C (se necessrio). Deixar em repouso por 12 horas c) Soluo padro de pirocatequina Pesar 100 mg de pirocatequina e diluir para 1000 mL com gua destilada, o que resulta numa soluo a 100 g/mL. 18.2- ELABORAO DA CURVA - PADRO 62

Em bales volumtricos de 50 mL, pipetar alquotas de 0,5 (50 g), 1

(100 g), 1,5 (150 g), 2 (200 g), 2,5 (250g) e 3 (300 g) mL da soluo padro de pirocatequina; Observao: As concentraes devem ser tais que a concentrao mxima seja de uma unidade de absorbncia (1A) no espectrofotmetro; Pode-se usar tambm soluo de cido tnico ou catecol. Em seguida, adicionar a cada balo 25 mL de gua destilada e 2,5 mL da soluo de Folin Denis. Aps agitar, adicionar 5 mL da soluo de carbonato de sdio a 10%, completando-se o volume e aps 30 minutos de repouso proceder a leitura espectrofotomtrica a 700 nm, construindo a curva padro (ver tabela abaixo). Preparar a soluo estoque de pirocatequina a 100 mg/L ou 100 g/mL. A tabela abaixo pode ajudar a preparar a curva padro: Tubo Branc o 1 2 3 4 5 6 * Agitar; Sol. padro (mL) 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Fenlicos ( g) 0 50 100 150 200 250 300 gua (mL) 35 35 35 35 35 35 35 Sol. de Folin Denis (mL) * 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 Na2CO3 a 10% (mL) ** 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

* * Complete o volume com gua destilada, deixe em repouso por 30 minutos e faa a leitura espectrofotomtrica a 700 nm (observe mudana de cor para azul). As leituras espectrofotomtricas a 700 nm no preparo da curva padro foram: Fenlicos totais (g) 0 50 100 150 200 250 300 Absorbncia a 700 nm 0,0001 0,0867 0,2011 0,3450 0,4847 0,6371 0,7863

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 A equao matemtica : Y ( g) = 25,7399 + 357,8223 Abs (R2 = 0,9982) 18.3- OBTENO DO EXTRATO Aproximadamente 5 g de pericarpo externo (casca) ou outra quantidade conveniente devem ser colocados em um bquer contendo 20 mL de gua fervente e deixados sob fervura por 20 minutos; Aps o resfriamento, o material deve ser homogeneizado em Politron ou almofariz e o volume ajustado para 50 mL (ou outro volume conveniente) com gua destilada. 18.4- CENTRIFUGAO Uma alquota de 10 mL (ou quantidade conveniente) do homogenato deve ser retirada e centrifugada a 9000 rpm por 20 minutos. 18. 5- ANLISE DA AMOSTRA Adicionar 5 mL do extrato (ou quantidade conveniente) em balo de 50 Em seguida, adicionar 5 mL de soluo de carbonato de sdio Deixar em repouso por 30 minutos e, em seguida, proceder leituras Observao: Para mais informaes ver Kubota (1995). 18.6- EXEMPLO PRTICO Utilizou-se 1,0316 g de matria fresca (MF), utilizou-se casca de melo fragmentada, que foi submetido a 20 minutos de fervura em gua; Deixou-se esfriar e homogeneizou em politron; O material foi filtrado diretamente em balo volumtrico e seu volume completado para 25 mL ou 25.000 L; mL e em seguida 2,5 mL da soluo de Folin Denis com posterior agitao; saturada, completando-se o volume com gua destilada; espectrofotomtricas no comprimento de onda de 700 nm.

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 O filtrado foi centrifugado a 9.000 rpm por 20 minutos e uma alquota de 2.000 L foi adicionada a um balo de 50 mL contendo soluo de Folin Denis e carbonato de sdio, conforme preparo da curva padro; A absorbncia (abs) da amostra foi de 0,1255, o que implica em 70,65 g de fenlicos totais (substituir a abs na equao matemtica anterior); Os clculos so os seguintes: 1,0316 g 25.000 L X 2.000 L X = 0,0825 g Fenlicos Totais = 70,65 g/0,0825 g de MF = 856,36 g/g de MF

19- REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

HARRIS, D. C. Anlise Qumica Quantitativa. New York: W. H. Freeman and Company, 1999. 862p. KAR, M.; MISHRA, D. Catalase, peroxidase, and polyphenoloxidase activities during rice leaf senesce. Plant Physiology, v. 57, p. 315 319, 1976. KUBOTA, N. Phenolic content and L-phenyllalanine ammonia lyase activity in peach fruit. In: Modern methods of plant analysis-fruits analysis. New York: Springer-Verlag, p. 81 - 94, 1995. NEVES, L. L. de M. Envolvimento de enzimas oxidativas no escurecimento do quiabo [Abelmoschus esculentus (L.) Moench]. Viosa: UFV, 2003, 72p. (Tese de Doutorado). 65

ZHOU, Y.; DAHLER, J. M.; UNDERHILL, S. J. R.; WILL, R. B. H. Enxymes associated with blacheart development in pineapple fruit. Food Chemistry, v. 80, p. 565 572, 2003.

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