UNIVERSIDAD NACIONA EXPERIMENTAL FRANCISCO DE MIRANDA PROGRAMA DE CIENCIAS VETERINARIAS UNIDAD CURRICULAR: NUTRICIO ANIMAL PROFESORA; M.V.

TERANA ZABALA PRACTICAS DE LABORATORIO

PRACTICAS DE LABORATORIO: Rumiantes 1. Generalidades del trabajo en el laboratorio y seguridad. 2. Obtencin de ncleo protenas e identificacin de purinas. 3. Identificacin de sustancias antinutritivas. 4. Cuantificacin de cidos Grasos Voltiles totales. PRACTICAS DE LABORATORIO: Monogstricos 1. Generalidades del trabajo en el laboratorio y seguridad. 2. Actividad enzimtica. 3. Identificacin de sustancias antinutritivas. 4. Extraccin de lpidos en tejidos biolgicos. CONTENIDO DE LAS PRCTICAS DE LABORATORIO PRACTICA : Generalidades del trabajo en el laboratorio y seguridad. INTRODUCCIN La incorporacin de los estudiantes al laboratorio tiene como objetivo fundamental la comprobacin de procesos tratados en el desarrollo de las conferencias, as como, la adquisicin de nuevos hbitos de conducta, habilidades y destrezas, que le permitirn enfrentar con una mayor preparacin, situaciones que se le presentaran en su vida profesional. Por ello, el objetivo de esta practica antes de iniciar los trabajos prcticos propiamente dichos, es el de poseer un mnimo de conocimiento, equipos y cristalera de uso ms comn, as como las medidas de control y de proteccin e higiene que de deben observarse en el laboratorio. Al trabajar en el laboratorio se hace imprescindible tomar ciertas precauciones para evitar los accidentes que en su inmensa mayora son causados por la no observancia de las reglamentaciones establecidas.

En general el experimentador debe ser extremadamente cuidadoso, estar atento al trabajo que realiza, dominar la tcnica a desarrollar, el funcionamiento manipulacin de los equipos y las propiedades de los reactivos que se utiliza y ante de cualquier duda no obrar por su cuenta sin previa consulta al instructor que lo atiende. Es conveniente sealar que: a) Los lquidos inflamables no se deben calentar directamente con la llama sino mediante baos de agua, aceite, arena, etc. Estos lquidos deben mantenerse lejos de los dems. b) Los recipientes en los que puedan haber productos con desprendimiento gaseoso no se debern cerrar hermticamente, pues debido a la presin interior explotara. c) Al trabajar con vaco se usan vasijas de paredes redondas y consistentes. d) Los tubos de ensayo no se deben calentar por el fondo sino por la parte superior del lquido, deben estar inclinados y no apuntar al operador o a los que lo rodean. e) Nunca se deben gustar los productos qumicos pues pueden ser causas de envenenamiento. f) Nunca se deben pipetear cidos o bases fuertes sin emplear pipetas con peras extraccin. g) Para percibir olores no es necesario poner el rostro sobre el tubo; para que el olor llegue al olfato basta agitar un poco el aire con las manos. h) Al trabajar con sustancias venenosas, la limpieza de las manos, del sitio de trabajo y el material debe ser esmerada. i) Los gases dainos se trabajaran en la campana de extraccin de gases. j) No debe abrirse nunca el paso de gas del quemador sin colocar antes el fsforo encendido a la boca del mismo. La observacin de estas reglas le proporciona al alumno los hbitos de seguridad y disciplina que le sern de inestimable valor no solo en el laboratorio sino en cualquier sitio. Por otra parte durante el desarrollo de los diferentes trabajos prcticos en este laboratorio podremos observar que en el mismo se usan una gran variedad de equipos, utensilios, cristalera y otros accesorios. Los materiales y utensilios de laboratorio constituyen un heterogneo grupo de objetos cuyo estudio es difcil de sistematizar. No obstante, en el nimo de hacer mas comprensible el estudio de los mismos, le ofrecemos la siguiente clasificacin.

Para verter volumtricos

Pipetas Buretas

Para contener De vidrio Tubos de ensayos Beakers Erlemeyer Balones Agitadores Placas de petri Morteros Embudos

Matraces Probetas

De usos varios

Porcelana

Crisoles Esptulas Morteros

Miscelnea

Gradillas Soportes universales Trpodes Malla con amianto Papel de filtro Tapones de goma Quemadores Hisopos

Los equipos ms usados son: fotocolormetro, las centrifugas y los pHmetros. Los principios fsicos de estos equipos han sido estudiados en la asignatura de Biofsica y deben ser repasados. Muy usadas en nuestras prcticas son el manejo de la pipeta, la centrifugacin y las tcnicas de volumetra. En el desarrollo de esta prctica efectuaremos algunos ejercicios relacionados con estas tcnicas. Materiales Necesarios Varios ejemplares de los materiales y utensilios dados en la introduccin. Pipetas de todas las graduaciones. Tubos de ensayos Agua destilada Acido tricloroactico al 10 % Suero sanguneo Disolucin de carbonato de sodio 0,1N Disolucin de indicador de pH ( solucin alcohlica de fenolftalena). Disolucin de HCl 0,1 N.

Desarrollo de la parte experimental. Ensayo # 1 . Empleo de Pipetas Al comenzar a trabajar se debe endulzar la pipeta con pequeas porciones del lquido a pipetear, las cuales se desecharn. Las pipetas se llenan succionando con la boca y mediante una pera de goma cuando se trabaja con lquidos voltiles, venenosos o custicos hasta que el nivel del lquido est por encima del aforo, se seca la punta con un papel de filtro y luego se enrasa dejando que el mismo descienda lentamente para evitar errores de escurrimiento. La punta de la pipeta se aproxima a la pared del recipiente que ha de recibir su contenido para que el lquido retenido en la misma fluya. No se debe sacudir ni soplar la pipeta para tratar de expulsar todo todo el lquido contenido en la misma.Cuando se descarga en un recipiente que ya contiene lquido, la punta de la pipeta no debe entrar en contacto con el mismo.

El instructor debe indicar la forma adecuada de tomar la pipeta. Al trabajar con disoluciones de una misma sustancia y distinta concentracin se puede usar la misma pipeta, en estos casos no es necesario lavar la pipeta con agua destilada al pasar de una solucin a otra, adems se debe comenzar pipeteando por la ms diluda siguiendo en orden creciente de concentracin. Utilizando la pipeta adecuada pipetear las cantidades siguientes de H2O destilada. a) 5,2 mL d) 2,75 mL b) 0,1mL e) 1,0mL c) 3,5mL f) 0,3mL.

Ensayo # 2. Centrifugacin Es nuestro propsito dar algunos principios de operacin de la centrfuga y sus posibilidades en la forma ms breve posible. Nosotros estamos familiarizados con el fenmeno de la sedimentacin: si es un lquido hay suspendidas partculas relativamente pesadas, al cabo de un tiempo se puede notar que estas partculas se acumulan en el fondo del recipiente. El peso de una partcula depende de dos factores: su masa y la aceleracin de la gravedad. Si quisiramos hacer ms rpido el proceso de sedimentacin, slo necesitaramos aumentar la aceleracin de la gravedad, que es precisamente lo que se hace cuando giramos rpidamente nuestra disolucin. Este incremento de la aceleracin de la gravedad produce un aumento del peso real de las partculas, por tanto su ms rpida sedimentacin. La frmula que mide el campo gravitacional creado por una centrfuga es: G= (rpm)2. R/g. 104 1rpm= 0,104720 rad/s 0,104720 rad/s= 6,283200 rad/min. Donde G es el nmero de veces que el campo gravitacional de la tierra aumenta rpm es la velocidad de la centrfuga R es el radio de rotacin en cm. Una centrfuga corriente de laboratorio es capaz de desarrollar de 3 000 a 5 000 rpm y su nico propsito es separar por sedimentacin partculas realmente grandes. Ej.: clulas, paredes celulares, bacterias de una suspensin. Pero tambin es posible disear centrfugas que alcancen valores tambin es posible disear centrfugas que alcancen valores superiores a

5 000 rpm y crear campos gravitacionales de 100 000 G o ms. Estas se llaman ultracentrfugas y con los campos gravitacionales alcanzados se pueden sedimentar partculas tan pequeas como molculas de protenas, cidos nucleicos, etc. Una precaucin general en el uso de todo tipo de centrfuga es que los tubos deben estar muy bien balanceados, ya que como hemos dicho, las altas velocidades que se obtienen producen grandes aumentos del peso del material que estamos centrifugando, una diferencia de un gramo va a significar una diferencia de ms de 1 kilo cuando lo hagamos girar a 3 000 revoluciones. Tenemos que tener en cuenta que la velocidad que empleamos debe estar en proporcin al peso del material que queremos centrifugar, de este mismo factor va a depender el tiempo que necesitemos. A continuacin realice las siguientes operaciones: 1. 2. 3. 4. Pipetear 4 mL de cido tricloroactico al 10 % y verterlos en un tubo de centrfuga. Aadir agitando constantemente 2 ml de suero sanguneo. Dejar en reposo durante 5 minutos. Centrifugar durante 5 minutos a 3 000 rpm.

Ensayo # 3. Aplicacin de la volumetra Uno de los mtodos ms generales, teniendo en cuenta el grado de aplicacin en los laboratorios, es la volumetra. El campo de aplicacin de este mtodo abarca las reacciones de neutralizacin, red-ox, precipitacin y formacin de complejos entre otros. De nuestros estudios en Qumica General sabemos que las reacciones qumicas se verifican de forma tal, que reaccionan nmeros de equivalentes iguales de las sustancias en cuestin.Esto conduce a la ley fundamentadle la volumetra que a los efectos prcticos la formulamos como sigue: V1 . N1 = V2 . N2 C( X/Z ) . V = C (X/Z) . V En la cual existen tres variantes conocidas en el desarrollo del trabajo y la cuarta se determina experimentalmente con la ayuda de cualquier artificio que regularmente es un indicador escogido segn la naturaleza de la reaccin. El instrumental utilizado consta de beakers, pipetas, frascos volumtricos y buretas fundamentalmente. Ejemplo: En la determinacin de la concentracin exacta de un HCl podemos utilizar una disolucin patrn ( concentracin exactamente conocida ) de carbonato de sodio, sal que produce una

hidrlisis bsica , empleando un indicador cido-base con zona de viraje cida o bsica en dependencia de la colocacin de los reactivos en el Erlenmeyer y la bureta, de esta forma conocemos V1 N1 , V2 lo hallamos por el volumen que marca la bureta una vez establecido el cambio del indicador y N2 normal del HCl mediante despeje. A continuacin realice las siguientes operaciones: 1. Pipetear (por duplicado) 25 mL de la disolucin patrn 0,1000 N de carbonato de sodio , agregndole en dos erlenmeyers de 250 mL de capacidad 2. Agregue 2 gotas del indicador a cada erlenmeyer. 3. Proceda al llenado y enrase de la bureta con HCl. 4. Valore agregando lentamente el HCl sobre la disolucin de carbonato de sodio, agitando constantemente hasta el cambio de coloracin del indicador, (siga las instrucciones del instructor en este proceso. 5. Lea el volumen en cada determinacin, En estos dos proceso se han realizado con el cuidado requerido, la diferencia no excede de 0,1 mL. Sustituya los datos en la frmula dada y calcule la concentracin del HCl. Conclusiones Los aspectos fundamentales que el alumno debe concluir son: A. El uso adecuado de la pipeta. B. La tcnica de la centrifugacin C. La metodologa del trabajo en el laboratorio de Bioqumica FACTORES QUE AFECTAN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA INTRODUCCION Segn pudimos observar en el tema correspondiente al estudio de las enzimas y las vitaminas, son las enzimas importantes compuestos de estructura protica con actividad cataltica que participan destacadamente en todo el metabolismo, donde tienen funcin de catalizadores. Es decir las enzimas actan como catalizadores en las reacciones que ocurren en la materia viva, rigiendo las reacciones bioqumicas y determinando, en gran medida, la existencia del metabolismo. Vimos que las enzimas tienen estructura protica y por tanto, las propiedades de las protenas eran extensivas a estos compuestos. Presentan estructura primaria, secundaria y terciaria, son posibles de desnaturalizar y su accin se ve modificada por la temperatura, el pH y otros factores ya sealados. Es importante asistir a esta prctica con los conceptos antes mencionados bien claros. En primer lugar del mecanismo de accin de las enzimas y adems del efecto de la temperatura,

el pH, la concentracin y de los activadores e inhibidores, pues son necesarios para la comprensin de los aspectos relacionados con esta prctica; por ello debe revisarse en el texto todo lo antes sealado. Reactivos Necesarios: Extracto enzimtico (papas o rbano) Buffer 2, 6, 7 y 10 Agua destilada Perxido de hidrgeno 3% Solucin de hidroquinona 0,5 %

Si se encuba un extracto enzimtico que contenga peroxidaza con hidroquinona y perxido de hidrgeno en un tubo de ensayo, al cabo de cierto tiempo pude observarse la formacin de un compuesto coloreado. La hidroquinona (que es el sustrato de la reaccin) resulta oxidada a un compuesto de tipo quinnico de color rojizo producto de la reaccin. La intensidad de la coloracin es proporcional a la cantidad de producto formado, por lo cual es un ndice de la velocidad de la reaccin. Preparacin del extracto enzimtico: Se trituran en un mortero 5 gr. De papas, se trasladan a una probeta con ayuda de agua destilada de manera que no queden residuos en el mortero y se sigue agregando agua hasta completar 40 mL, se deja en reposo durante 10 min. Para la extraccin de la enzima y luego se centrifuga o se filtra. El filtrado claro se usa como extracto enzimtico.

Experimento # 1: Influencia del pH en la actividad enzimtica. Disponga 4 tubos de ensayo numerados en la gradilla y aada cada una de las soluciones como se indica en el siguiente cuadro: Tubos ( mL ) Extracto enzimtico Buffer 2, 6. 7 y 10 Agua destilada Agua oxigenada Sal de hidroquinona 1 1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 3 1 1 1 1 1 4 1 1 1 1 1

Hecho esto se espera de 30 a 40 min. Y se comparan las coloraciones obtenidas con ello se puede determinar el pH ptimo.

Experimento # 2: Influencia de la concentracin de la enzima en la velocidad de la reaccin. Disponga 5 tubos de ensayo en una gradilla. Agregue 2 mL de agua destilada a cada tubo a partir del # 2 ( el 1 no lleva agua ). Al tubo 1 se le agregan 2 mL del extracto enzimtico. Al 2 se le agrega 1 mL del extracto enzimtico, se mezcla y de este se pasa 1 mL al tubo # 3. Del tubo # 3 se pasa 1 mL al tubo 4 , se mezcla y se pasa 1 mL al tubo # 5. Despus de mezclado se extrae 1 mL de este ltimo tubo y se desecha. Las concentraciones de enzimas obtenidas en cada tubo son las siguientes: Tubo CONCENTRACION 1 C 2 1/3 3 1/9 4 1/27 5 1/81

Luego se aade a cada tubo 1 mL de agua oxigenada y 1 mL de solucin de hidroquinona. Observe la coloracin obtenida en cada tubo. Experimento # 3: Influencia de la temperatura en la actividad enzimtica. Se dispone de dos tubos de ensayo en una gradilla y a cada uno se le aade 1 mL de extracto enzimtico. El tubo # 1 se mantiene a la temperatura ambiente. El tubo # 2 se calienta 5 min. En bao de mara a ebullicin: a continuacin se enfra bajo el chorro de agua de la pila y se lleva nuevamente a la gradilla. A continuacin se le agrega a cada uno las soluciones segn indica el siguiente esquema:

Sol. Agua oxigenada Sol de hidroquinona

Tubo # 1 ( al ambiente ) 1 mL 1

Tubo # 2 (Calentado ) 1mL 1

Transcurridos 30 min se observan las coloraciones en cada tubo. Explique los resultados.