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1) Resumen Página 3
a) English Página 4
2) Introducción Página 5
3) Parte Experimetntal Página 8
a) Amplificación de los Plásmidos Página 8
I) Digestión Enzimática Página 10
II) Electroforesis Página 10
b) Purificación Del Plásmido en Gran Escala Página 10
I) Midiprep Página 10
c) Cultivo Celular Página 11
I) Transfección de Células Página 11
4) Resultados Página 13
a) Transformación de las Bacterias con los Plásmidos YN-Ub y Jun-CC Página 13
b) Control de los Plásmidos Después de su Purificación Página 13
c) Cuantificación de la Cantidad de ADN Para Realizar las Transfecciones Página 14
d) Cultivo Celular Página 14
e) Transfecciones de los Plásmidos NY-Ub y Jun-CC Página 15
5) Conclusiones Página 16
a) Transformación de las Bacterias con los Plásmidos YN-Ub y Jun-CC Página 16
b) Electroforesis Página 16
c) Cuantificación por Absorbancia Página 16
d) Transfección Página 16
e) Conclusión final Página 17
6) Bibliografía Página 17
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Resumen
La Growth-Associated Protein (GAP-43) es una proteína específica del sistema
nervioso. Cuando se expresa en las neuronas durante el desarrollo promueve el
establecimiento y la remodelación de las conexiones neuronales. Trabajos de distintos
grupos de investigadores han demostrado que el nivel de esta proteína está controlado
por la estabilidad de su ARN mensajero. Sin embargo, no se sabía nada acerca del
control de la vida media de la proteína. Recientemente, De Moliner y col. han
demostrado que la GAP-43 se degrada por el sistema Ubicuitina-proteasoma, un sistema
de proteolítico caracterizado por su alta especificad. La GAP-43 es una proteína que se
ubica en la membrana plasmática y hasta el momento no se sabe cuáles son las señales
que la convierten en un blanco para este sistema proteolítico ni el lugar subcelular
donde se produce la conjugación con Ubicuitina para su posterior degradación por el
porteasoma. Con el objeto de realizar estudios in vivo en cultivos celulares para
determinar el sitio subcelular donde se lleva a cabo la conjugación, se decidió poner a
punto una técnica que se basa en la complementación de fluorescencia.
Para tal fin utilizaremos una línea de fibroblastos, NIH-3T3. Las células serán
transfectadas con dos plásmidos simultáneamente, el pFLAG-CMV2 que tiene la
secuencia de ubicuitina fusionada al fragmento N-terminal de la Yellow Fluorescent
Protein (YN-Ub) y el pECFP que tiene la secuencia de la proteína Jun (que es un
sustrato conocido del sistema Ubicuitina-proteasoma) fusionada al fragmento C-
terminal de la Cyan Fluorescent Protein (Jun-CC). Cuando in vivo se produzca la
conjugación de Jun con ubicuitina, el fragmento N-terminal de la Yellow Fluorescent
Protein se unirá al fragmento C-terminal de la Cyan Flurescent Protein y se observará
fluorescencia en el área subcelular donde este proceso haya ocurrido.
Una vez puesta a punto esta técnica en nuestro sistema, se insertará la secuencia de
GAP-43 en el sitio donde se encuentra de secuencia de Jun para poder realizar los
estudios propuestos.
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English:
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INTRODUCCIÓN
El sistema nervioso es una red de tejidos altamente especializada. El
componente principal de esta red son las neuronas, células conectadas entre sí de forma
compleja, que poseen la característica de transmitir una enorme variedad de estímulos
dentro del tejido nervioso, utilizando señales electroquímicas, y hacia el resto de los
tejidos, coordinando así múltiples funciones del organismo. Se subdivide en el sistema
nervioso central y el sistema nervioso periférico. Este último está constituido por los
nervios, craneales y espinales, procedentes del sistema nervioso central, y por los
ganglios periféricos, que contienen los únicos cuerpos neuronales fuera del sistema
nervioso central. El sistema nervioso central, constituido por el cerebro, el cerebelo, el
tronco cerebral y la médula espinal, está protegido por las meninges, tres membranas
que lo recubren. En su interior existe un sistema de cavidades, con el nombre de
ventrículos, por los cuales circula el líquido cefalorraquídeo.
Las células que forman el sistema nervioso central están distribuidas de tal forma que
dan lugar a dos formaciones muy características: la sustancia blanca, compuesta
principalmente por las prolongaciones nerviosas, las dendritas y los axones. Las
funciones del axón son el transporte tanto de organelas como de otros componentes
celulares y la conducción del impulso nervioso. La sustancia gris está formada por los
cuerpos neuronales.
El grupo de investigación que dirige actualmente la Dra. A. Adamo hace unos años se
interesó por estudiar la importancia de la Ub en la degradación de proteínas en el
sistema nervioso central (SNC) ya que parecía tener una gran importancia en el
desarrollo de ciertas enfermedades neurodegenerativas. La función de una proteína
puede alterarse por cambios en su conformación, su localización o por interacción con
otras moléculas. Un camino eficiente para llevar a cabo este cometido, es su
modificación post-traduccional, a través de la adición de otras moléculas. Una de estas
modificaciones post-traduccionales es la ubicuitinización de una proteína que consiste
en la adición de varias moléculas de ubicuitina (Ub) a dicha proteína. La Ub es un
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polipéptido de 76 aminoácidos, altamente conservado que se expresa en todas las
células eucarióticas. El sistema Ubicuitina-proteasoma es un camino proteolítico
caracterizado por su alto grado de especificidad y selectividad. Este sistema está
involucrado en:
- La regulación del ciclo celular
- La diferenciación y el desarrollo
- La respuesta celular a efectos extracelulares y al estrés
- La modulación de los receptores de superficie celular y canales iónicos
- La reparación del ADN
- La regulación de la respuesta inmune e inflamatoria
- La biogénesis de organelas
Este sistema de degradación proteica mediado por la ubicuitina y el proteosoma es
sumamente complejo y está integrado por un conjunto de enzimas conocidas como
E1 o enzima ligadora de ubicuitina, una familia de enzimas E2 o enzimas
conjugantes y la familia de E3, ligasas, que son las que les confieren la especificidad
a este sistema proteolítico, dado que reconocen al sustrato que se conjugará con
ubicuitina para ser degradado por el proteasoma.
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Fluorescent Protein se unirá al fragmento C-terminal de la Cyan Fluorescent Protein y
se podrá observar fluorescencia en el área subcelular donde se produzca esa unión.
Una vez puesto a punto este sistema, se reemplazará la secuencia de la proteína Jun por
la de la GAP-43 y se caracterizará la conjugación de la GAP-43 a la ubicuitina. Estos
estudios se realizarán mediante la transfección de ambos plásmidos a la línea de
fibroblastos NIH-3T3 y permitirá confirmar la conjugación de ubicuitina a la GAP-43
caracterizando el sitio celular donde este proceso ocurre.
Parte Experimental
Amplificación de los Plásmidos:
Utilizamos los plásmidos pFLAG-CMV2 (Sigma) (A), que contiene la secuencia que
codifica para ubicuitina fusionada al fragmento N-terminal de la enhanced yellow
fluorescent protein (YN-Ub), y el plásmido pECFP (Clontech) (B), que contiene la
secuencia que codifica para la proteína Jun (2-319) fusionada al fragmento C-terminal
de la enhanced cyan fluorescent protein (Jun-CC).
(A)
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(B)
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(C)
NaCl, disueltos en 1 litro de agua) sin antibiótico y se incubó durante una hora a 37ºC,
con agitación. Por último, se sembraron 50 μl de la suspensión de bacterias
transformadas en placas de LB/agar en presencia de ampicilina 20 μg/ml y en presencia
de kanamicina 10 μg/ml según corresponde para cada plásmido como se muestra en la
figura (C)
Las placas se incubaron durante aproximadamente 12 hrs. a 37ºC.
Seleccionamos 2 colonias aisladas de cada placa, las colocamos en el medio de cultivo
LB con el antibiótico correspondiente para cada caso y las dejamos incubando durante
toda la noche a 37ºC.
Para controlar que las bacterias se transformaron correctamente, se purificaron los
plásmidos a partir de las mismas. Se tomaron 1,5 ml de cada uno de los cultivos de las
bacterias y se centrifugaron a 10000 x g durante 2 minutos.
Digestión Enzimática:
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Electroforesis:
Se evaluó la presencia de los plásmidos mediante una electroforesis en un gel de
azarosa 1% (0,5gr de agarosa, 50ml de buffer TBE [2,7gr Tris, 1,3075 de ácido bórico,
1ml de EDTA 0,5 molar pH 8]) y 4μl de Bromuro de Etidio.
(F). Se observó la presencia de ambos
plásmidos en las preparaciones evaluadas.
(F)
Midiprep:
Cultivo Celular:
Las células 3T3 se cultivaron a 37ºC, bajo atmósfera de 5% de CO2 en DMEM alta
glucosa conteniendo suero fetal bovino 10% v/v, antibióticos penicilina 50 U/ml y
estreptomicina 50 mg/ml (medio completo). Esta línea celular crece formando una
monocapa que se la evalúa según el grado de confluencia de la misma. Cuando esta
monocapa alcanza aproximadamente el 70-80 % de confluencia se realizan los
subcultivos (H). Se descartó el medio en el cual están creciendo y se trató la monocapa
con 2 ml de una solución de Hanks, pH
7.4 conteniendo tripsina 0.25% (P/V) y
EDTA 1mM. Se incubó durante no más
de 5 minutos, se puede observar,
macroscópicamente, el desprendimiento
de la monocapa. Luego se neutraliza la
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tripsina con 1ml de suero fetal bovino.
Posteriormente se tomó el medio resultante y se disgregaron las células mediante
pasajes a través de una pipeta de 10 ml. La suspensión celular se centrifugó a 800 xg
durante 5 minutos y el pellet conteniendo las células se resuspendió en el medio de
cultivo. Alícuotas de esta suspensión se sembraron en placas o frascos T75 según el
requerimiento de posteriores experimentos.
(H)
Transfección de Células:
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de fluorescencia (Olympus Optical CO, LTD, Japón) y se capturó la imagen de las
mismas ya que este posee una cámara acoplada Olympus BX50.
(H)
(I)
Resultados
Transformación de las Bacterias con los Plásmidos YN-Ub y Jun-CC:
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antibiótico, formaron colonias (Figura 1). Se observaron colonias en las placas con las
bacterias transformadas con el plásmido YN-Ub pero solo unas pocas colonias dispersas
se observaron en las placas con las bacterias transformadas con el plásmido Jun-CC.
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Tabla 1:
Cultivo Celular:
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Visualización de los conjugados de Jun con ubicuitina. Las imágenes fluorescentes
fueron tomadas 30 hs después de la transfección.
Conclusiones
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Electroforesis:
Determinamos la concertación de ADN en las muestras. Esto nos sirvió para conocer la
concentración de los plásmidos y realizar así una correcta transfección a las células, ya
que la misma requiere que haya una relación ADN/Lipofectamina óptima para que la
eficiencia de transfección sea la mayor posible.
Transfección
Se pudo obtener una visualización directa de los conjugados de Jun con ubicuitina en
las células transfectadas con las distintas construcciones. Como se puede observar en la
imagen de la figura 4, las células transfectadas con ambos plásmidos son fluorescentes
y sorprendentemente esta fluorescencia se observa principalmente en pequeñas
estructuras citoplasmáticas, visualizadas como un puntillado. La localización de estas
estructuras es perinuclear. Por otro lado, las células transfectadas con los plásmidos
solos no muestran una fluorescencia marcada y la distribución de la misma es diferente
a la de las células cotransfectadas.
Este resultado confirma la factibilidad de la metodología, la identificación de
conjugados de Jun con ubicuitina en células “in vivo” y sugiere que la ubicuitinización
de Jun causa un transporte de esta proteína nuclear hacia estructuras citoplasmáticas
como fue descripto por Deyu y colaboradores.
Conclusión final:
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K. Kerppola es una herramienta útil para la visualización de proteínas ubicuitinizadas
en células in vivo. Una vez puesto a punto este sistema, el mismo podrá ser utilizado
para la localización de conjugados de ubicuitina de cualquier proteína de interés.
Teniendo en cuenta los antecedentes del grupo de trabajo, este sistema podrá ser
utilizado para caracterizar la conjugación de GAP-43 a la ubicuitina.
Además, cabe destacar que en esta monografía se utilizaron técnicas de biología
molecular siendo esta una herramienta muy útil para el estudio y compresión de
diversos procesos celulares.
Bibliografía:
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