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Prof. R. Velotta Dr. R.

Esposito

La fluorescenza
La spettroscopia di fluorescenza un potente strumento per lo studio delle strutture e delle dinamiche molecolari, in fisica, chimica e biologia. Sebbene la normale spettroscopia di fluorescenza a stato stazionario sia caratterizzata da unelevata sensibilit, informazioni pi dettagliate sul microambiente molecolare possono essere ottenute sfruttando la dipendenza temporale del segnale di fluorescenza.

La fotoluminescenza lemissione di luce da stati elettronici eccitati di una qualsiasi sostanza. La fotoluminescenza si distingue in fluorescenza o fosforescenza: Nella fluorescenza, lemissione avviene dallo stato di singoletto, nel quale lelettrone eccitato accoppiato con spin opposto allelettrone dello stato fondamentale. Il ritorno allo stato fondamentale una transizione permessa per spin ed avviene rapidamente con lemissione di un fotone. Il rate di emissione della fluorescenza tipicamente di 108 s-1. Nella fosforescenza invece lemissione avviene dallo stato di tripletto, nel quale lelettrone ha la stessa orientazione di spin dello stato fondamentale. Le transizioni allo stato fondamentale sono proibite; pertanto il rate di emissione di fosforescenza piuttosto lento (103 s-1).

I fluorofori sono le sostanze che emettono la radiazione di fluorescenza e possono essere classificati come intrinseci ed estrinseci: i fluorofori intrinseci (feninlananina, tyrosina, triptofano, fad) sono ampiamente diffusi nei tessuti biologici ed emettono fluorescenza in modo naturale. Quando la fluorescenza intrinseca non sufficientemente intensa per la realizzazione di certi esperimenti, come ad esempio nel caso del DNA e dei lipidi, lemissione di fluorescenza viene ottenuta per mezzo dei fluorofori estrinseci (fluoresceina, rodamina etc.). Questi si accumulano prevalentemente in cellule e tessuti affetti da patologie; pertanto, in seguito allesposizione a luce di opportuna lunghezza donda, la patologia risulter evidenziata dalla comparsa di un segnale di fluorescenza maggiore rispetto a quello emesso dal tessuto circostante.

Diagramma di Jablonski
La relazione tra lassorbimento di luce e lemissione di fluorescenza viene generalmente illustrata per mezzo del cosiddetto diagramma di Jablonski
ABS = assorbimento IC = conversione interna CQ= quenching collisional ISC = inter-system crossing FL = fluorescenza PH = fosforescenza IC
Internal conversion ki ~ 1012 s-1

IC

Inter-system crossing kx ~ 104 1012 s-1

Fluorescence kf ~ 107 109 s-1

ABS

FL PH Phosphorescence kph < 106 s-1

La fluorescenza osservata se kf ~> ki + kx

Il tempo speso da una molecola in uno suo stato eccitato determinato dalla somma delle costanti cinetiche di tutti i processi di diseccitazione

Cosa si intende per vita media di un fluoroforo?


I processi di assorbimento e di emissione sono quasi sempre studiati su popolazioni di molecole e le propriet di un singolo membro della popolazione sono dedotte dalle propriet mascroscopiche del processo. In generale il comportamento di una popolazione di fluorofori eccitati descritto dalla familiare rate equation:

dn* (t ) = k n* (t ) dt
Che descrive la variazione per unit di tempo delle molecole eccitate allistante t

Integrando si ottiene:

(t ) = n *(0) exp (- k t ) n
*

La vita media uguale a k -1


Se una popolazione di fluorofori eccitata, la vita media il tempo richiesto perch il numero di molecole eccitate decada a 1/e o del 36.8% dal valore iniziale, essendo:

n (t ) t / =e * n (0)

La costante di diseccitazione k la somma delle costanti di tutti i possibili canali di diseccitazione:

k = kf + ki + kx + kET + = kf + knr
kf la costante di decadimento di fluorescenza, ki di decadimanto per conversione interna, kx la costante di decadimento per inter-system crossing, kET la costante di trasferimento di energia inter-molecolare e knr la somma delle costanti dei decadimenti non radioativi

Processi non radioativi: Molecole isolate in fase gassosa subiscono solo conversione interna e inter-system crossing Nella fase condensata si aggiungono ulteriori meccanismi dovuti allinterazione con il microambiente: reazioni chimiche allo stato eccitato, trasferimento di energia,

Coumarine in etanolo ha una vita media di 4 ns

Isoalloxazina in acqua ha una vita media di 4.5 ns

La vita media del triptofano nelle proteine varia da ~0.1 ns a ~8 ns

La vita media radioativa r = kf-1 praticamente costante per una data molecola La vita media di fluorescenza = k-1 = (kf + knr)-1 dipende dal microambiente attraverso knr. Quantum yield di fluorescenza:

proporzionale alla vita media di fluorescenza Laggiunta di un ulteriore percorso di decadimento non radioativo aumenta knr diminuisce e quindi QY. Lintensit di fluorescenza I (t) = kf n*(t) proporzionale a n*(t) e vice versa

Come si misura la vita media di fluorescenza?


Dominio del tempo
Il decadimento di fluorescenza reale una convoluzione con il profilo dellimpulso di eccitazione

I R (t ) = I (t ) P(t )
Il decadimento di fluorescenza misurato la convoluzione del decadimento reale con la risposta del rivelatore

Le molecole sono eccitate da un impulso molto breve(prossimo ad una ) allistante t = 0. Si misura lintensit del decadimento di fluorescenza solitamente tramite un sistema Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC)

I M (t ) = I R (t ) R (t ) I M (t ) = I (t ) P(t ) R(t ) = I (t ) iREF (t )


La funzione di risposta dello strumento iREF tipicamente misurata come la risposta dello strumento allimpulso di eccitazione.

I(t) = exp ( - t / )

Dominio del tempo


I M (t ) = [ exp ( - t / )] iREF (t )
La funzione di risposta dello strumento iREF i tipicamente misurata come la risposta dello strumento allimpulso di eccitazione.

I parametri di I(t) sono usualmente ottenuti da un fitting non lineare combinato con una procedura di deconvolution.

La deconvoluzione non necessaria quando limpulso di eccitazione molto breve rispetto alla vita media e/o la precisione delle determinazione della vita media non richiesta.

Decadimento mono-esponenziale

Decadimento multi-esponenziale (almeno due vite medie distinte)

I (t ) = exp(t / )

I ( t ) = i e
i

Unanalisi analoga effettuata nel caso di decadimento multi-esponenziale per estrarre le vite medie i e le frazioni i. Un aumento del numero dei parametri nel fitting costituisce un aumento del rischio di artefatti (pi di 3 vite medie non sono raccomandate). In alternativa il metodo della massima entropia pu essere usato per analizzare distribuzioni continue di vite medie.

i
Mean lifetime il tempo che mediamente una molecola spende nel suo stato eccitato

m=

i
i

La fluorescenza del FAD


Il FAD, Flavina Adenina Dinucleotide, un importante coenzima ossido riduttivo che funge da accettore di elettroni e protoni. Le due basi azotate che lo compongono sono la flavina (o gruppo isoalloxazinico) e ladenina, legati a due zuccheri, rispettivamente il ribitolo e il ribosio, formando cos i due nucleosidi, la riboflavina e ladenosina, tenuti insieme da un pirofosfato mediante due legami fosfoesterici.

exc = 405 nm

L'anello di isoalloxazina responsabile dell'emissione di fluorescenza del FAD nello spettro del visibile secondo tempi di decadimento che sono influenzati dalla sua interazione con l'anello aromatico di adenina.

Schematicamente che la FAD esiste in due distinte conformazioni: una conformazione aperta in cui la molecola ben distesa una conformazione chiusa in cui l'isoalloxazina e l'adenina sono impilate l'una sull'altra.

La fluorescenza del FAD dipende dal pH della soluzione acquosa. In soluzione acquosa a pH neutro, il decadimento di fluorescenza bi-esponenziale 1 = 80 % 1 = 300 ps per la forma chiusa 2 = 20 % 2 = 2800 ps per la forma aperta Per pH < 4 e pH > 8, lequilibrio si sposta verso la forma aperta (minore attrazione dipolare tra isoalloxazina e adenina)

2 2 pH

Apparato strumentale

La strumentazione usata nell'esperienza principalmente costituita da : un laser impulsato con frequenza di ripetizione di 40 Mhz, potenza media 2 mW, larghezza nominale dell'impulso 80 ps, lunghezza d'onda = 405 nm. Un rivelatore veloce basato sulla tecnica time-correlated single photon counting (TCSPC) in grado di seguire l'evoluzione temporale dei fenomeni di fluorescenza con tempi di vita media da 50 ps a 50 ns circa.