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1 INTRODUO

1.1 O Setor Sucroalcooleiro A grande necessidade da utilizao de um combustvel renovvel e o anncio de que pases como Frana, Japo, Tailndia, Canad, Sucia, Mxico , ndia e Estados Unidos iniciaram programas de adio de lcool anidro gasolina impulsionaram a agro-indstria canavieira no Brasil. A produo de etanol no Brasil a partir da cana-de-acar considerada do ponto de vista tecnolgico como a mais avanada e mais rentvel atualmente, alem de ser considerada uma alternativa ecolgica, pois, cerca de 2,3 t de gs carbnico deixam de ser emitidas a cada tonelada de lcool combustvel utilizado. Esse cenrio favorvel motivou investimentos em novas unidades produtoras, atualizaes em unidades j existentes e investimentos em novas tecnologias em varias reas da produo e no plantio, investimentos esses que resultaram em sucessivas safras recordes. Esse aumento contnuo da produo de lcool conseqentemente causa o aumento do volume do principal efluente das destilarias de lcool, a vinhaa, tambm conhecida em algumas regies como restilo, vinhoto ou garapo, um liquido de composio varivel de acordo com o mosto utilizado (Tabela 1) que apresenta colorao parda clara, que a medida que se oxida se torna mais escuro.

Tabela1. Composio mdia da vinhaa nas regies Sudeste e Nordeste de acordo com o tipo de mosto.
Sudeste Nordeste Tipo de Mosto MELAO 0,8 0,1 5,5 2,3 1 6,4 57 120 23 3 CALDO 0,3 0,5 1,7 0,2 0,4 2 25 5 1 2 MISTO 0,4 0,6 2,66 0,6 0,5 1,6 32 47 2 3 MELAO 0,7 0,3 7,6 2,4 1,4 1,1 55 67 3 3

PARMETRO
CALDO

Tipo de Mosto MISTO 0,4 0,1 2,6 1,5 0,5 3,7 45 130 72 50

N P2O5 K2O CaO MgO SO4 M.O. Fe Cu Zn

Kg/m3 Kg/m3 Kg/m3 Kg/m3 Kg/m3 Kg/m3 Kg/m3 ppm ppm ppm

0,4 0,1 1,2 0,8 0,3 0,6 35 110 24 2

Mn pH

ppm ppm

10 3,6

6 3,8

11 4,2

6 3,6

6 4

6 4,4

A vinhaa alem de ser o principal poluente das destilarias de lcool o mais poluente, sua demanda biolgica de oxignio (DBO) varia entre 20.000 e 35.000 mg/L e sua produo esta entre 10 e 18 L de vinhaa por litro de lcool produzido.(Rossetto, 1987 apud MELISSA A. S.). Esses dados enfatizam a vinhaa como um motivo de preocupao futuro para o setor e evidenciam a necessidade de se buscar alternativas viveis para se contornar esse problema. Uma das alternativas para se reduzir o volume de vinhaa o aumento o aumento do teor alcolico final da fermentao,sendo que, o aumento de 1% do grau alcolico do vinho diminui na mesma proporo o volume da vinhaa (PENATTI, 2007).Outras vantagens de se trabalhar com teores alcolicos mais elevados que indiretamente determina o tamanho e o custo das instalaes de fermentao, centrifugao e destilao alm de diminuir o consumo de energia para a destilao,pois, quanto maior o teor alcolico menor a quantidade de agua no mosto e no vinho alm de diminuir o consumo de energia para a destilao (FINGUERUT, 2006). No entanto trabalhar com teores alcolicos elevados no vinho acarreta alguns problemas inconvenientes na fermentao.

A produo de etanol no Brasil em sua grande maioria feita pela fermentao de mosto a base de caldo de cana-de-acar,que, compreende na transformao bioqumica dos acares presentes no mosto em etanol, gs carbnico e biomassa, converso essa realizada pela levedura Saccharomyces cerevisiae. Atualmente o processo de fermentao mais utilizado no Brasil o de batelada com reciclo do fermento, processo este que consiste basicamente na adio do fermento na dorna, fermento este denominado p-de-cuba, adio do mosto, e aps o trmino da fermentao, realizada a separao do fermento do vinho por centrifugao, que, aps um tratamento com cido e alguns casos antibiticos, reutilizado no processo . Este processo de fermentao se mostrou mais vantajoso em relao a outros por permitir melhor assepsia dos equipamentos, reutilizao do fermento, diminuio do tempo de fermentao, maior rendimento da fermentao e como desvantagens apresenta, alto custo de instalao e automao, necessidade de maior gasto com trocadores de calor para manter a temperatura controlada a

at 35C, temperatura essa, de difcil controle devido a alta velocidade da fermentao, grande concentrao de levedo nas dornas e teores alcolicos mais altos fatores esses, que causam um rpido desprendimento de energia trmica pela levedura. Atualmente a temperatura ideal da fermentao de 30 at 35C, se a temperatura ficar acima disso as condies favorecem o aparecimento de bactrias, leveduras contaminantes e diminuio da viabilidade do fermento, fatores estes que causam perdas no rendimento fermentativo final. Uma das solues provveis para essa perda a seleo de microrganismos mais resistentes aos fatores de estresse do processo como alto teor de etanol e alta temperatura, juntamente com o desenvolvimento de tcnicas de controle de contaminao e conscientizao da necessidade de um controle operacional rigoroso. 1.2 Mutao H alguns anos atrs a seleo de leveduras resistentes a alta temperatura no se justificava como uma soluo tcnica vivel devido a contaminao se tornar incontrolvel (AMORIM et al., 1981). Porm atualmente com novas tcnicas e informaes obtidas sobre a microbiologia do processo temos maior entendimento e confiabilidade no monitoramento para o controle da contaminao da fermentao e conscincia da necessidade de um controle microbiolgico rigoroso e da busca constante por novos mtodos que controlem a contaminao . Uma das alternativas para a seleo de novos microrganismos de interesse industrial a induo de mutao. A mutao um processo biolgico que caracteriza a evoluo da vida desde seus primrdios, a mutao caracterizada quando ocorre uma alterao no gene de qualquer organismo, podendo ser reversveis ou no. As mutaes genicas so raras, portanto para a seleo de microrganismos mutantes necessrio que se aumente essa taxa de mutao utilizando agentes qumicos ou fsicos que induzam essas mutaes acima das taxas ambientais normais, agentes esses chamados de mutgenos. Um dos agentes mutgenos fsicos radiao UV. A radiao UV a um comprimento de onda de 260 nm absorvida fortemente pelas bases do DNA (SOARES, 2001) podendo causar alteraes gnicas no DNA do organismos, essas alteraes no entanto podem ser revertidas por uma enzima ativada pela luz visvel a fotolase.

2 OBJETIVOS Este trabalho teve como objetivo a induo de mutao por radiao UV e seleo de linhagens mutantes de Saccharomyces cerevisiae resistentes alta temperatura, realizando: a

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seleo de colnias mutantes que apresentaram crescimento em temperatura seletiva, testes preliminares de potencial fermentativo terico medidos pela liberao de CO2 e selecionando as leveduras mutantes que possuem os melhores potenciais fermentativos para testes fermentativos em escala que reproduzem a fermentao industrial.

3 MATERIAIS E MTODOS 3.1 Linhagens de Saccharomyces cerevisiae Utilizadas.

Foram utilizadas 2 linhagens selecionadas de Saccharomyces cerevisiae, CAT-1 e PE-2 liofilizadas gentilmente cedidas pela Usina Santa Elisa.

3.2 Hidratao das Linhagens Liofilizadas. A reidratao das linhagens foram feitas utilizando gua destilada temperatura ambiente.

3.3 Reativao das Linhagens Liofilizadas. A reativao das linhagens foi feita inoculando-se uma gota da levedura hidratada em erlenmeyer s contendo 30 ml de meio YEPD (Tabela 1) , que em seguida, foram incubadas durante 24h temperatura de 35C. Aps a reativao as linhagens foram estriadas em placas de Petri, com meio YEPDA(Tabela 2) com 100 L de antibitico para cada 10 ml de meio e novamente inoculadas por 24h 35C. Aps o crescimento foram selecionadas colonias isoladas, que foram inoculadas em 10 ml de meio YEPD, durante 24h, 35C, sob agitao de 100 rpm que aps o crescimento foram adicionados 1,5 ml de glicerol estril e estocadas em tubos de fundo cnicos de 2 ml em freezer 70 C.

Tabela 2. Composio do meio de cultura YEPD.

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Componente Glicose Peptona Extrato de Levedura gua Destilada 20g 10g 10g

Quantidade

1000ml (q.s.p)

Tabela 3. formulao do meio de cultura YEPDA utilizado.

Componente Glicose Peptona Extrato de Levedura gar gua Destilada 20g 10g 10g 15g

Quantidade

1000 ml (q.s.p)

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3.4 Contagem de Leveduras.

A contagem das leveduras foram feitas em microscpio tico em lente objetiva de 40x,utilizando-se cmara de Neubauer e corante azul de metileno com sais para determinao de viabilidade.

3.5 Diluio Seriada e Plaqueamento por Espalhamento.

Aps a contagem do nmero de clulas contidos na amostra foi usado o mtodo de diluio seriada para adequao do volume da suspenso a ser plaqueada de forma a adequar o crescimento de colonias isoladas de forma que a contagem de UFC's (unidades formadoras de colnia)posterior se tornasse possvel e mais precisa, na qual as amostras foram diludas em soluo salina (tabela 3) para a obteno de aproximadamente 10 clulas/ml e plaqueadas por espalhamento em placas de Petri contendo meio YPDA para posterior contagem de UFC's.

Figura 1. Mtodo de diluio seriada.

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Tabela 4. Soluo salina utilizada nas diluies.

Componente Cloreto de Sdio gua destilada

Quantidade 8,5g 1000 ml (q.s.p)

3.6 Caixa para Irradiao.

Para a irradiao das linhagens foi construda uma caixa de madeira com plataforma interna de altura regulvel com dimenses de 62 cm de largura e comprimento e 80 cm de altura equipada com luz UV com comprimento de onda de 260 nm e interruptor externo. Para realizao das irradiaes a luz UV era ligada por 15 min para esterilizao da caixa e a altura da plataforma regulada para 16 cm de distancia da lmpada.

3.7 Determinao do Tempo de Irradiao. Foi determinado que a mutao por irradiao UV ocorre quando 5% da populao sobrevive ao tempo irradiado. Para determinao desse tempo, as amostras obtidas no item 2.5 foram expostas a irradiao em tempos diferentes em cmara escura de Luz UV, que aps as irradiaes foram manipuladas no escuro e embrulhadas em papel alumnio para evitar a ativao do mecanismo de reparo da mutao e ento incubadas 35C durante 48h. Aps esse procedimento foi realizada contagem de UFC's nas placas e determinado o tempo em que houve os 5% de sobrevivncia. Os experimentos foram realizados em triplicata.

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3.8 Irradiao e Seleo de Mutantes. As linhagens crescidas em meio YEPD foram plaqueadas em triplicata por espalhamento, sem diluio e expostas radiao no tempo previamente determinado para a seleo dos mutantes. Aps a irradiao as placas eram manipuladas no escuro para evitar ativao da enzima de reparo de DNA, embrulhadas em papel alumnio e incubadas temperatura seletiva de 47C durante 48h. As colnias que apresentaram um crescimento maior que a levedura selecionada PE-2 utilizada como controle por apresentar timos rendimentos industriais, foram repicadas, devidamente identificadas, crescidas em meio YEPD e armazenadas em tubos de fundo cnicos de 2 ml -70C.

3.9 Testes de Fora Fermentativa. A medio da fora fermentativa terica da levedura baseada na estequiometria da fermentao etanlica:

C6H12O6 ------------> 2 C2H5OH + 2 CO2

Observa-se que teoricamente, para cada molcula de acar consumida so produzidas 2 molculas de etanol e 2 molculas de gs carbnico. Partindo dessa teoria a liberao de CO2 , se medida, pode determinar o potencial de produo de etanol da linhagem. Para a quantificao do CO2 liberado pela levedura foi utilizado um equipamento que quantifica a liberao de CO2 que foi montado conforme figura 2 .

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Figura 2. Esquema representativo do medidor de fora fermentativa utilizando 2 bales de fundo chato de 1000 ml, banho com controle de temperatura e proveta graduada de 1000 ml.

Os testes fermentativos foram conduzidos adicionando-se no balo 1 300 ml de meio de cultura(Tabela 4), colocando-o em banho em temperatura de 40C por cerca de 15 min para igualao da temperatura e no balo 2 foram adicionados 1000 ml de soluo cida de dicromato de potssio (Tabela 5). Logo aps foi realizada a adio do fermento (suspenso de 5 g de massa mida de levedura em 100 ml H2O destilada) ao balo 1, o sistema foi fechado e o tempo comeou a ser contado procedendo leitura do volume da soluo contida no balo 2 deslocada para a proveta com intervalos de 30 min at completar um total de 150 min.

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Tabela 5. Meio de cultura utilizado nos testes feitos com o equipamento de fora fermentativa.

Componente Sacarose Peptona gua Destilada

Quantidade 400g 2g 300ml (q.s.p.)

Tabela 6. Soluo cida de dicromato de potssio utilizada no balo 2.

Componente Dicromato de Potssio cido Sulfrico gua destilada

Quantidade 2g 0,5 ml 1000 ml (q.s.p.)

4 RESULTADOS E DISCUSSO 4.1 Tempo de Irradiao. O tempo de irradiao em que ocorreu os 5% de viabilidade determinado inicialmente para ser utilizado para a induo de mutao das linhagens selecionadas foi de 9 min. Entretanto aps nova tentativa de induo de mutao as linhagens passaram a no resistir a 9 min de exposio a radiao UV, novos testes para determinao de novo tempo de irradiao no foram feitos e as linhagens utilizadas nos testes seguintes foram obtidas 9 min de irradiao.

4.2 Mutantes Selecionadas. Aps a incubao de 48h temperatura seletiva de 47 C as placas foram abertas e foram selecionadas 5 colnias com aparncia perolada brilhante e de tamanho maior em relao as

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outras como possveis linhagens resistentes temperatura mais alta que foram devidamente isoladas e identificadas como: S.C.1, S.C.2, S.C.3, S.C.4 e S.C.5. 4.3 Teste de Fora Fermentativa. Os resultados obtidos nos testes das linhagens mutantes em comparao para a PE-2 para , liberao de CO2 em funo do tempo esto apresentados nas tabelas 6 a 12, os grficos de liberao de CO2 nos grficos 1 a 6, o grfico de comparao de liberao de CO2 de todas linhagens no grfico 7 e grfico comparativo das F.F. no grfico 8 . Os clculos de F.F. (Fora Fermentativa) esto disponibilizados abaixo dos grficos das linhagens respectivas, onde a frmula utilizada para os clculos foi:

F.F.= t120 - t60 m

onde: t120= ml de CO2 liberados em 120 minutos. t60= ml de CO2 liberados em 60 minutos. m = massa mida de levedura.

O valor da F.F. dado em ml de CO2 / g . h

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Tabela 7. Liberao de CO2 da linhagem PE-2. PE-2 Tempo (min) 0 30 60 90 120 150 CO2 (mL) 0 0 4 70 280 580

P
7 6 5 C O 2 ( m l) 4 3 2 1 0 - 1 00 0 2 0 4 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

- 2

F.F.= 112,1 ml de CO2 / g . h

8 T e m

0 p o

1 ( m

0 in )

Figura 3. Liberao de CO2 pela linhagem PE-2.

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Tabela 8. liberao de CO2 pela linhagem S.C.1. S.C.1 Tempo (min) 0 30 60 90 120 150 CO2 (mL) 0 9 110 300 550 850

S
1 0 0 0 8 0 0 C O 2 (m l) 6 0 0 4 0 0 2 0 0 0 0 - 2 0 0 2 0 4 0 6 0 T

.C

.1

8 0 e m p o

1 0 0 ( m i n )

1 2 0

1 4 0

1 6 0

Figura 4. liberao de CO2 pela linhagem S.C.1.

Utilizando 5 g de massa mida de levedura.

F.F.=109,3 ml de CO2 / g . h

20

Tabela 9. liberao de CO2 pela linhagem S.C.2. S.C.2 Tempo (min) 0 30 60 90 120 150 CO2 (mL) 0 0 40 210 520 820

S
1 0 0 0 8 0 0 C O 2 (m l) 6 0 0 4 0 0 2 0 0 0 0 - 2 0 0 2 0 4 0 6 0 T

.C

.2

8 0 e m p o

1 0 0 ( m i n )

1 2 0

1 4 0

1 6 0

Figura 5. liberao de CO2 pela linhagem S.C.2.

Utilizando 4,1 g de massa mida de levedura.

F.F.=147,3 ml de CO2 / g . h

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Tabela 10. liberao de CO2 pela linhagem S.C.3. S.C.3 Tempo (min) 0 30 60 90 120 150 CO2 (mL) 0 0 30 260 480 780

S
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 4 0 6 0 T

.C

.3

C O 2 (m l)

- 1 0 00

8 0 e m p o

1 0 0 ( m i n

1 2 0 )

1 4 0

1 6 0

Figura 6. liberao de CO2 pela linhagem S.C.3.

Utilizando 4,9 g de massa mida de levedura.

F.F.=106,1 ml de CO2 / g . h

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Tabela 11. liberao de CO2 pela linhagem S.C.4. S.C.4 Tempo (min) 0 30 60 90 120 150 CO2 (mL) 0 40 200 560 980

S
1 1 C O 2 ( m l) 8 6 4 2 2 0 0 0 0 0 0 0 2 0 4 0 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0

. C

. 4

8 T e m

0 p o

1 ( m

0 in )

Figura 7. liberao de CO2 pela linhagem S.C.4.

Utilizando 5,4 g de massa mida de levedura.

Na linhagem mutante S.C.4 a liberao CO2 o clculo de fora fermentativa no foi considerado pois a liberao de CO2 no t120 no pode ser medido devido ao esgotamento do liquido do balo 2 do equipamento medidor de fora fermentativa.

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Tabela 12. liberao de CO2 pela linhagem S.C.5. S.C.5 Tempo (min) 0 30 60 90 120 150 CO2 (ml) 0 0 70 340 610 930

S
1 0 0 0 8 0 0 C O 2 (m in ) 6 0 0 4 0 0 2 0 0 0 0 - 2 0 0 2 0 4 0 6 0 T

.C

.5

8 0 e m p o

1 0 0 ( m l )

1 2 0

1 4 0

1 6 0

Figura 8. liberao de CO2 pela linhagem S.C.5.

Utilizando 4,7 g de massa mida de levedura F.F.=126,6 ml de CO2 / g . h

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F 1 5 0 1 0 0 O 2 5 0 0

. F

. F

- S2

. C S. 1 . C L i n

S2 . C . h a g

S. 3 . C e m

S. 4 . C

. 5

Figura 9. F.F. das linhagens testadas. A linhagem S.C.4 no se encontra plotada no grfico por circunstancias descritas na discusso do grfico 5.

5 CONCLUSO As linhagens S.C.2 e S.C.5 apresentaram uma F.F. superior ao da PE-2 levedura utilizada como comparativo por ser uma das leveduras mais usadas na industria alcooleira atualmente, partindo desses resultados as linhagens S.C.2, S.C.4 e S.C.5 foram consideradas aptas aos testes fermentativos em escala simulando o processo fermentativo industrial.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.

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